專利名稱：：用黃素蛋白給化石燃料脫硫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的
背景技術(shù)：
化石燃料的微生物脫硫方法成為活躍的研究領(lǐng)域已經(jīng)超過50年。這些研究的目的已經(jīng)被發(fā)展成基于從化石燃料如煤，原油和石油產(chǎn)物中在燃燒前除硫方法的生物技術(shù)。促進(jìn)脫硫方法發(fā)展的動(dòng)力是化石燃料中含硫量的增加和硫排出物控制力度的增加。Monticello等人，“‘石油生物脫硫方法的實(shí)際研究’，IGT第三屆‘天然氣，石油，煤和環(huán)境生物技術(shù)’方面的國際研討會(huì)”(Monticelloetal.，“PracticalConsiderationinBiodesulfurizationofPetroleum”，IGT’s3dIntl.Symp.onGas，Oil，CoalandEnv.Biotech.，(Dec.3-5，1990))，NewOrleans，LA。許多生物催化劑和方法已被開發(fā)用于化石燃料的脫硫，包括下列文獻(xiàn)所述的那些美國專利5,356,801、5,358,870、5,358,813、5,198,341、5,132,219、5,344,778、5,104,801、和5,002,888，這些文獻(xiàn)均在此引作參考。經(jīng)濟(jì)分析表明，對(duì)此項(xiàng)技術(shù)商業(yè)化的一個(gè)限制是改進(jìn)反應(yīng)率和生物催化劑如脫硫反應(yīng)所涉及的細(xì)菌和酶的特定活性。文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的反應(yīng)率和特定活性(除去的硫/小時(shí)/生物催化劑(克))比最優(yōu)的商業(yè)技術(shù)所需的要低得多。因此，需要改進(jìn)生物催化劑的壽命和特定活性。本發(fā)明概述本發(fā)明涉及一個(gè)新發(fā)現(xiàn)，即通過在生物催化劑中添加黃素蛋白可提高化石燃料脫硫反應(yīng)速率。本發(fā)明涉及提高含有機(jī)硫化合物化石燃料脫硫速率的方法，包括以下步驟a)將化石燃料與含有能夠裂解碳-硫鍵的生物催化劑和能夠提高反應(yīng)速率量的黃素蛋白的水相接觸，進(jìn)而形成化石燃料和水相的混合物；b)將步驟a)的混合物保持在用生物催化劑足以裂解有機(jī)硫分子中碳-硫鍵的條件下，進(jìn)而得到有機(jī)硫含量減少的化石燃料；以及c)將有機(jī)硫含量減少了的化石燃料從所得水相中分離出來。本發(fā)明還涉及含有一或多個(gè)重組DNA分子的重組微生物，該DNA分子編碼能夠?qū)⒑袡C(jī)硫分子的化石燃料脫硫的生物催化劑，及編碼黃素蛋白。本發(fā)明還涉及含有下列物質(zhì)的組合物(a)能夠?qū)⒑袡C(jī)硫分子的化石燃料脫硫的生物催化劑，和(b)黃素蛋白。附圖的簡(jiǎn)要說明圖1是添加黃素蛋白后通過紅球菌屬ATCC53968，IGTS8的提取物實(shí)現(xiàn)DBT到2-HBP的轉(zhuǎn)化的圖示說明。圖2是質(zhì)粒pEX16和pEX44的圖示說明，其中脫硫基因簇單獨(dú)存在或與黃素蛋白基因frp一起存在，或直接連接到dsz基因上，成為dsz基因簇之一部分。圖3說明當(dāng)使用質(zhì)粒共表達(dá)黃素蛋白時(shí)DBT的脫硫率增加。圖4是ATCC53968內(nèi)生黃素蛋白的洗脫曲線。圖5和圖6說明當(dāng)含有內(nèi)生黃素蛋白IGTS8的組分被加到從聚集dsz基因的大腸埃希氏桿菌分離的DSZ酶制劑中時(shí)DBT和DBT-磺內(nèi)酯的脫硫率的增加。本發(fā)明的詳細(xì)描述在石油的提取和精煉技術(shù)中術(shù)語“有機(jī)硫”通常被理解為指由一或多個(gè)硫原子(稱為雜原子)共價(jià)連接到烴骨架結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子。這些硫原子可以直接連接到烴骨架上，例如通過一或多個(gè)碳-硫鍵，或以取代基形式連接到分子的烴骨架上，例如磺?；?它含有碳-氧-硫共價(jià)鍵)。含有一或多個(gè)硫雜原子的有機(jī)分子的大類有時(shí)被稱作“有機(jī)硫化合物”。這些化合物的烴部分可以是脂肪族，芳香族或部分脂肪族和部分芳香族的化合物。通過芳香族碳-硫鍵將烴骨架中一或多個(gè)硫雜原子連接到鄰近的碳原子的環(huán)狀或稠合多環(huán)有機(jī)硫化合物被稱為“含硫雜環(huán)類”。對(duì)于其中含有硫雜原子的5-員芳香環(huán)，以多種含硫雜環(huán)形式存在的硫被稱作“噻吩硫”。最簡(jiǎn)單的含硫雜環(huán)是噻吩，其分子式為C4H4S。已知，含硫雜環(huán)對(duì)常規(guī)脫硫處理如加氫脫硫法(HDS)是穩(wěn)定的。含硫雜環(huán)既可以有相對(duì)簡(jiǎn)單也可以有相對(duì)復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在復(fù)雜雜環(huán)中可以存在多稠合芳香環(huán)，其中一個(gè)或多個(gè)可以是雜環(huán)。脫硫的難度隨分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性而增加，即耐火性是對(duì)復(fù)雜含硫雜環(huán)如二苯并噻吩(DBT，C12H8S)最著重強(qiáng)調(diào)的性質(zhì)。DBT是一種有稠合多芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的含硫雜環(huán)，在該芳香環(huán)結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)6-員芐基環(huán)位于5-員噻吩環(huán)的側(cè)面。在精煉中間體和可燃燒產(chǎn)物中，HDS過后殘留在化石燃料中的大部分有機(jī)硫是噻吩硫。這些殘余的噻吩硫主要在DBT及其含有一或多個(gè)烷基或芳基的衍生物中存在，所說烷基或芳基連到一個(gè)或兩個(gè)側(cè)芐基環(huán)中的一或多個(gè)碳原子上。DBT本身在相關(guān)技術(shù)中作為這類包括DBT的模型化合物說明是被接受的，其衍生物在涉及噻吩硫的反應(yīng)方面有時(shí)是可接受的。見Monticello和Finnerty，微生物學(xué)年報(bào)(AnnualReviewsinMicrobiology)39371-389(1985)，第372-373頁?？梢哉J(rèn)為DBT及其衍生物在特定原油，煤和瀝青的全部硫含量中占有相當(dāng)大比例。例如，已有報(bào)道，這些含硫雜環(huán)在德克薩斯西部(WestTexas)原油的全部硫含量中占至少70wt％，在某些中東(MiddleEast)原油的全部硫含量中可達(dá)40wt％。因此，DBT被認(rèn)為是特定地域的化石燃料如原油，煤或?yàn)r青，以及各種精煉的中間體和由它們所制造出的燃料產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的作為噻吩硫形式模型化合物的具體代表。同前(Id.)，DBT及其衍生物的另一個(gè)特性是化石燃料釋放到環(huán)境中去之后，這些含硫雜環(huán)仍然保持很長(zhǎng)時(shí)間而沒有明顯的生物降解。Gundlach等人，科學(xué)(Science)221122-129(1983)。因此，最普遍的自然產(chǎn)生的微生物并不能有效地代謝和破壞含硫雜環(huán)。適于本發(fā)明脫硫處理的化石燃料是含有有機(jī)硫的化石燃料。這樣的化石燃料被稱為“底物化石燃料”。富含噻吩硫的底物化石燃料尤其適用于本發(fā)明脫硫方法。這些底物化石燃料的實(shí)例包括CerroNegro或Orinoco重原油；Athabascan焦油和其它類型的瀝青；石油精煉組份如輕環(huán)油，重大氣汽油和1號(hào)柴油；以及由如Pocahontas#3，Lewis-Stock，AustralianGlencoe或Wyodak煤源制造的煤衍生液體。生物催化脫硫(生物催化法或BDS)是從有機(jī)硫化合物耐火有機(jī)硫化合物如含硫雜環(huán)中切除(放出或除去)硫的方法，是用生物催化劑有選擇地將所說化合物中碳-硫鍵氧化裂解的結(jié)果。BDS方法從耐火有機(jī)硫化合物產(chǎn)生出脫硫的可燃燒烴骨架，以及同時(shí)可以用已知技術(shù)如餾分蒸餾法或水提取法彼此分離的無機(jī)硫物質(zhì)。例如，如果采用BDS方法，DBT被轉(zhuǎn)化成羥基聯(lián)苯基。BDS采用一種或多種非人類生物體(如微生物)，該生物體能表達(dá)出可以直接、單獨(dú)、或彼此相互協(xié)同地有選擇地裂解有機(jī)硫化合物中的碳-硫鍵，從含有含硫雜環(huán)的所說化合物中除去硫一種或多種；還可以使用從這種微生物得到的一種或多種酶；或這種微生物和酶的混合物來完成該BDS。表現(xiàn)有生物催化活性的生物體在此稱為Dsz+。缺乏生物催化活性的生物體在此稱為Dsz-。本發(fā)明涉及改進(jìn)的從含有機(jī)硫化合物的化石燃料中除硫的方法，包括在能夠使化石燃料脫硫的生物催化劑中添加提高速率量的黃素蛋白，以促進(jìn)或提高向催化部位的電子轉(zhuǎn)移。這里所用能夠?qū)⒒剂厦摿虻纳锎呋瘎┮话闶潜绢I(lǐng)域已知的，包括微生物(生存的和非生存的，重組的和非重組的)和酶制劑。一些研究者已經(jīng)對(duì)將自然產(chǎn)生的細(xì)菌經(jīng)基因修飾成為能夠分解代謝DBT的突變株進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)。Kilbane，J.J.，Resour.Cons.Recycl.369-79(1990)，Isbister，J.D.和R.C.Doyle，美國專利4,562,156(1985)，和Hartdegan，F(xiàn).J.等人，Chem.Eng.Progress63-67(1984)。對(duì)于這些突變株的絕大部分它們并非特異性地進(jìn)行DBT脫硫，而是以小有機(jī)硫破碎產(chǎn)物的形式釋放硫。因此，經(jīng)過這種微生物作用DBT的燃燒價(jià)值有部分損失。Isbister和Doyle報(bào)告稱表現(xiàn)出能夠有選擇地從DBT放出硫的Pseudomonas突變株發(fā)生演變，但并沒有闡述其產(chǎn)生這種反應(yīng)活性的機(jī)理。Kilbane報(bào)告了混合細(xì)菌培養(yǎng)物的誘變，產(chǎn)生通過氧化途徑能夠從DBT有選擇地放出硫的一種突變株。這種培養(yǎng)物包括從天然物源如污水處理后的污泥、石油精煉后的廢水、花園土壤、煤焦油污染的土壤等得到的細(xì)菌、并維持在從存在的DBT中持續(xù)失去硫的培養(yǎng)條件下。然后將該培養(yǎng)物暴露于化學(xué)誘變劑l-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍。這種突變株培養(yǎng)物對(duì)DBT代謝的主要降解產(chǎn)物是羥基聯(lián)苯基；釋放出的硫?yàn)闊o機(jī)水溶性硫酸鹽形式，以及保持基本完整的烴部分是一羥基聯(lián)苯基。Kilbane，J.J.，Resour.Cons.Recvcl.369-79(1990)，其中的論述在此一并引作參考。Kilbane還從這種混合細(xì)菌培養(yǎng)物中分離出了紅球菌突變株。這種突變株IGTS8或ATCCNo.53968是本發(fā)明特別優(yōu)選的生物催化劑。該突變株的分離和特性在J.J.Kilbane的美國專利5,104,801中有所描述，其教導(dǎo)在此引作參考。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，這種微生物保存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，12301ParkLawnDrive，Rockville，Maryland，U.S.A.20852)，并被命名為ATCCDepositNo.53968。一種適宜的ATCCNo.53968生物催化制劑是活的微生物培養(yǎng)物及其突變株或衍生物，其制備一般按美國專利5,104,801所述方法進(jìn)行。一般按美國專利5,132,219和5,358,870所述從ATCCNo.53968或其突變株得到的無細(xì)胞酶制劑也可以使用。在生物催化脫硫(BDS)的常規(guī)方法中，ATCCNo.53968生物催化劑是用于連續(xù)的脫硫過程以處理石油液體，在該液體中HDS-耐火有機(jī)硫分子如芳香族含硫雜環(huán)占整個(gè)有機(jī)硫含量的絕大部分。至少有兩種可能的途徑使DBT釋放硫氧化和還原。優(yōu)選使用氧化(有氧)方法。在氧化方法中，被作用的微生物并且其制劑適合作為本發(fā)明生物催化劑的實(shí)例包括在Kilbane(1990)，3RESOUR.CONSERV.RECYCL.69-79中公開的微生物聯(lián)合體(幾種微生物的混合物)，由Kilbane在美國專利5,002,888(授權(quán)于1991年3月26日)，5,104,801(授權(quán)于1992年4月14日)，5,344,778，5,132,219，5,198,341，5,356,813，5,356,801，5,358,870[在Kilbane(1990)的BiodesulfurizationFutureProspectsinCoalCleaning(PROC，7THANN.INT’L.PITTSBURGHCOALCONF.373-382)一文中有所描述]和5,198,341(授權(quán)于1993年3月30日)中，以及Omori等人(1992)在DesulfurizationofdibenzothiophenebyCorynebacteriumsp.strainSY1，58APPL.ENV.MICROBIOL.(No.3)911-915中和Izumi等人在AppliedandEnvironmentalMicrobiology60223-226(1994)中公開的微生物，上述文獻(xiàn)均在此引作參考。上述各微生物在本發(fā)明中均可用作生物催化劑，因?yàn)樗鼈兙a(chǎn)生一種或多種酶(蛋白生物催化劑)進(jìn)行指定的化學(xué)反應(yīng)，使硫從耐火有機(jī)硫化合物中分離出來。Lehninger，PRINCIPLESOFBIOCHEMISTRY(WorthPublishers，Inc.，1982)，p.8-9；同時(shí)參考Zobell的美國專利2,641,564(授權(quán)于1953年6月9日)和Kern等人的美國專利5,094,668(授權(quán)于1992年3月10日)。上面美國專利所例舉的任何上述微生物的突變體或遺傳工程衍生物在此也可用作生物催化劑，條件是它們?nèi)员Ａ暨m當(dāng)?shù)纳锎呋δ?。其它適于用作此處所述脫硫方法的生物催化劑或生物催化劑源的微生物可以用已知技術(shù)從天然產(chǎn)物微生物衍生。如上所述，這些方法包括從天然源如污泥，石油精煉產(chǎn)生的廢水，花園土壤，或煤焦油污染的土壤中得到的微生物，在選擇的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)制備，在此條件下微生物在耐火有機(jī)硫化合物如作為單一硫源的含硫雜環(huán)存在下生長(zhǎng)；將微生物制劑暴露于化學(xué)或物理誘變劑；或?qū)⑦@些方法結(jié)合。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述Isbister和Doyle的美國專利4,562,156(授權(quán)于1985年12月31日)；Kilbane的3RESOUR.CONSERV.RECYCL.69-79(1990)，美國專利5,002,888，5,104,801和5,198,341；及Omori和合作者們的58Appl.ENV.MICROBIOL.(No.3)911-915(1992)，所有文獻(xiàn)在此引作參考。如上所述，酶是由活細(xì)胞制備的蛋白生物催化劑。酶促進(jìn)，引導(dǎo)或加速特定化學(xué)反應(yīng)或一系列反應(yīng)(稱作反應(yīng)途徑)的發(fā)生，而其自身并不作為產(chǎn)物而被損耗。酶可以包括其一種或多種非改性或者翻譯后的或合成改性的多肽鏈或片段或部分，其它輔酶，輔因子，或共同催化所需的反應(yīng)或一系列反應(yīng)的共反應(yīng)物。本發(fā)明這些反應(yīng)或一系列反應(yīng)終止于從耐火有機(jī)硫化合物如含硫雜環(huán)的烴骨架中分離出硫。前述耐火有機(jī)硫化合物的烴骨架保持基本完整。在本發(fā)明中用作生物催化劑的微生物或酶的好處是不將前述耐火有機(jī)硫化合物的烴骨架作為生長(zhǎng)碳源來消耗。結(jié)果，在BDS處理中的底物化石燃料的燃燒值沒有降低。盡管可以用活的微生物(如培養(yǎng)物)作為生物催化劑，但在本發(fā)明中不是必須的。用于本發(fā)明的生物催化酶制劑包括能夠起到所需催化作用的微生物溶解產(chǎn)物、提取物、組分、亞組分、或用常規(guī)方法得到的純化產(chǎn)物。一般而言，這些酶制劑基本無完整微生物細(xì)胞。例如，Kilbane和Monticello在美國專利5,132,219(授權(quán)于1992年7月21日)和5,358,870(申請(qǐng)日為1992年6月11日)公開的酶制劑就適用于本發(fā)明。Rambosek等人公開的重組微生物和酶制劑，通過基因工程由紅球菌屬ATCCNo.53968得到并公開于美國專利5,356,813的微生物，也適用于本發(fā)明。適用于本發(fā)明的酶生物催化劑可以任意與固體載體如膜，濾膜，聚合樹脂，玻璃顆粒或珠，或者陶瓷顆粒或珠結(jié)合使用。使用固定化酶制劑利于從處理過的已經(jīng)耗盡耐火有機(jī)硫化合物的化石燃料中分離生物催化劑。在生物催化脫硫階段含有含硫雜環(huán)的液體化石燃料與生物催化劑和黃素蛋白結(jié)合。調(diào)節(jié)生物催化劑和黃素蛋白與液體化石燃料的相對(duì)用量以適宜具體條件，或使處理后的深度脫硫的化石燃料中殘余的硫達(dá)到指定水平。要與給定量的液體化石燃料結(jié)合的生物催化劑的用量將受到所用具體生物催化劑的性質(zhì)，濃度和特定活性的影響，并且受到底物化石燃料中無機(jī)和有機(jī)硫化合物性質(zhì)和相對(duì)含量以及所要達(dá)到或可以接受的脫硫程度的影響。所給生物催化劑的具體活性是用每單位質(zhì)量生物催化活性衡量的。因此，特定生物催化劑的特定活性取決于所用微生物或用作生物催化酶源的性質(zhì)或本性，以及用來制備和/或存儲(chǔ)生物催化劑的方法。具體生物催化劑的濃度可調(diào)至具體使用環(huán)境所要求的濃度。例如，如果用活的微生物培養(yǎng)物(如ATCCNo.53968)作生物催化劑，缺少硫源而不是缺少含硫雜環(huán)的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可以用適當(dāng)?shù)奈⑸锝臃N和發(fā)酵直至達(dá)到所需的培養(yǎng)物密度。所得培養(yǎng)物可以用另外的培養(yǎng)基或其它適當(dāng)?shù)木彌_劑稀釋，或者，培養(yǎng)物中的微生物細(xì)胞例如可通過離心被取出，并以比原來的培養(yǎng)物更大的濃度重懸浮?？捎孟嗨频姆椒ㄕ{(diào)節(jié)微生物和酶生物催化劑的濃度。用該方法可以得到合適體積的有預(yù)定特定活性和/或濃度的生物催化劑?？捎糜诒景l(fā)明的黃素蛋白包括一般現(xiàn)有技術(shù)中已知的。黃素類包括黃素一核苷酸(FMN)或黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。黃素蛋白類包括黃素還原酶或FMN還原酶。對(duì)于黃素蛋白如黃素還原酶或更優(yōu)選的FMN還原酶，可以直接使用天然物質(zhì)(如含有黃素蛋白的微生物部分)，或其商業(yè)化產(chǎn)品，或兩者結(jié)合使用。例如，Lei等人在J.Bacter.176(12)3552-3558(1994)中所述的Vibrio黃素還原酶的DNA序列可用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗魑⑸铮驗(yàn)檫@是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并且，例如在美國專利5,356,801中討論過?；蛘?，黃素蛋白可以是生物催化脫硫反應(yīng)內(nèi)生的，如以下所述的無細(xì)胞組分。在另一個(gè)實(shí)例中，黃素蛋白可用脫硫微生物(如IGTS8)過度表達(dá)(overexpress)。例如，這可以通過誘變完成。適合的誘變劑包括輻射如紫外線輻射，和化學(xué)誘變劑如N-甲基-N’-亞硝基胍，羥胺，甲磺酸乙酯和亞硝酸。誘變反應(yīng)可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中通常已知的方法進(jìn)行。如果黃素蛋白是重組體，則該蛋白可以現(xiàn)場(chǎng)制備，例如，通過添加含有將黃素蛋白編碼的DNA序列的重組微生物完成。在特別優(yōu)選的實(shí)例中，編碼黃素蛋白的重組微生物也具有能夠?qū)⒒剂厦摿虻拿?。例如，編碼黃素蛋白DNA可被轉(zhuǎn)變成IGTS8或另一種能夠?qū)⒒剂厦摿虻奈⑸铩Ｔ诹硪粋€(gè)實(shí)例中，編碼黃素蛋白DNA被同時(shí)或分開轉(zhuǎn)化到具有編碼脫硫生物催化劑的DNA的常規(guī)宿主細(xì)胞。例如，編碼黃素蛋白的DNA可以在相同或不同啟動(dòng)子的控制之下進(jìn)行對(duì)能夠?qū)⒒剂厦摿虻纳锎呋瘎┑木幋a。在一個(gè)實(shí)例中，這種黃素蛋白DNA被摻入或連接到脫硫基因群或IGTS8的操縱子上。將提高效率量的黃素蛋白加到反應(yīng)混合物中。本發(fā)明將“提高效率量”定義為相對(duì)于最初所得可顯著增加生物催化劑脫硫效率的量。例如，如果生物催化劑是IGTS8、無細(xì)胞組分或純化的酶制劑，“提高效率量”的黃素蛋白是除了生物催化劑本身固有量之外還顯著增加了脫硫效率的黃素蛋白的量。例如，與只使用生物催化劑本身相比脫硫效率可能至少增加25％，50％或100％。綜上所述，一方面本發(fā)明描述涉及含有編碼黃素蛋白基因或基因簇的DNA分子或其片段，該基因能夠編碼黃素蛋白和/或能夠?qū)⒑杏袡C(jī)硫化合物的化石燃料脫硫的生物催化劑。該DNA分子或其片段可以是從例如天然源中被純化和分離得到的DNA，或者也可以是重組(雜交的或外來)的例如存在于非人體宿主生物體中的DNA。下面的討論，不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制，而只是為了解釋目的，詳細(xì)描述了從紅球菌屬ATCCNo.53968菌株分離編碼脫硫生物催化劑的DNA的方法，已知該菌株表達(dá)適當(dāng)生物催化活性。這種優(yōu)選的紅球菌菌株由美國專利5,104,801(授權(quán)于1992年)公開，并已在該文獻(xiàn)中被稱作IGTS8，有關(guān)論述在此引作參考。其它已知用于表達(dá)適當(dāng)生物催化活性并因此被認(rèn)為是本發(fā)明適合的DNA源的生物體包括美國專利5,002,888所述并在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)中稱作ATCCNo.53969的Bacillussphaericus菌株，和Omori等人在Appl.Env.Microbiol.58(3)911-915(1992)中所說的Corynebacterium菌株。不能裂解碳-硫鍵(Dsz-)的突變株紅球菌是通過在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的或已經(jīng)確定的適當(dāng)條件下將表現(xiàn)有生物催化活性的紅球菌菌株如ATCCNo.53968暴露于誘變劑來制備的。合適的誘變劑包括輻射如紫外線輻射，及化學(xué)誘變劑如N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(NTG)，羥胺，甲磺酸乙酯(EMS)和亞硝酸。如此形成的突變株允許在適當(dāng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并篩選出有碳-硫鍵裂解活性的。允許準(zhǔn)確檢測(cè)碳-硫鍵裂解活性的篩選方法適合于本發(fā)明方法。為此，合適的篩選方法包括將不同的突變株暴露于含碳-硫鍵的分子(如DBT)，并測(cè)量碳-硫鍵裂解情況。在優(yōu)選實(shí)例中將突變株暴露于DBT，因而產(chǎn)生破碎產(chǎn)物羥基聯(lián)苯(HBP)，它在短波長(zhǎng)紫外光下產(chǎn)生熒光。也可以通過HBP與吉布斯試劑作用的藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物用比色法檢測(cè)HBP。其它方法包括氣體和液體色譜，紅外線和核磁共振譜法。參見Kodama等人的AppliedandEnvironmentalMicrobiology，pp.911-915(1992)和Kilbane和Bielaga，F(xiàn)inalReportD.O.E.ContractNo.DE-AC22-88PC8891(1991)。一旦Dsz-突變株被識(shí)別和分離出來，就可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)繁殖它們的克隆并對(duì)其進(jìn)一步分析。在與上述培養(yǎng)物Dsz+生物體紅球菌的誘變同時(shí)，第二種同樣的Dsz+生物體培養(yǎng)物保留在培養(yǎng)物中。Dsz+生物體DNA是從紅球菌的培養(yǎng)物中提取出來的。各種DNA提取方法都適用于從這種生物體中分離DNA。適合的方法包括苯酚和氯仿萃取。參見Maniatis等人的MolecularCloning，ALaboratoryManual，2d，ColdSpringHarborLaboratoryPress，pg16.54(1989)，這里稱作Maniatis等人的論述。一旦DNA從紅球菌中提取出來，就將該DNA切割成不同千堿基長(zhǎng)度的片段，經(jīng)過克隆到適當(dāng)質(zhì)粒穿梭載體后收集制成DNA庫?？梢允褂脤⒓t球菌DNA分割成純DNA包括本發(fā)明的DNA的各種方法，例如酶化和機(jī)械方法。所有四-堿識(shí)別限制核酸內(nèi)切酶如TaQI或Sau3A適用于分割DNA。分割DNA的適當(dāng)方法可以在Maniatis等人的論述中找到。將多個(gè)DNA片段插到幾個(gè)紅球菌Dsz-突變株克隆中為的是分離出能給本發(fā)明生物催化劑編碼的DNA片段。從前述Dsz-突變株細(xì)胞到Dsz+轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化證明插入的DNA片段給生物催化劑編碼了。任何為了攝取和表達(dá)所說片段而將DNA插入紅球菌的方法都是適合的。在優(yōu)選實(shí)例中是用電穿孔法將DNA片段引入紅球菌的。參見Maniatis等人的論述。一旦轉(zhuǎn)化之后，即產(chǎn)生Dsz+突變株并被識(shí)別，編碼Dsz+生物催化劑的DNA片段就可以被識(shí)別和分離。這樣，就可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的和便于使用的各種方法以被分離的DNA制備被編碼的生物催化劑。此外，分離的DNA可用已知技術(shù)排序和復(fù)制和/或，例如，用Maniatis等人所述技術(shù)連接到編碼黃素蛋白的DNA上。如上所述，上述分離本發(fā)明DNA的方法可用于而非紅球菌微生物Dsz+生物體，例如ATCCNo.53068。因此，BacillussphaericuATCCNo.53969或Corynebacteriumsp.SY1也可以用作本發(fā)明DNA的生物體源。而且一旦分離后，本發(fā)明DNA就可以被轉(zhuǎn)化到非人體宿主生物體的非Dsz-突變株的生物體中。因此，本發(fā)明DNA可以被轉(zhuǎn)化到，例如，合適的大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)中。其它類型的非人體宿主生物體也可以使用，包括單細(xì)胞生物體(如酵母)和來自多細(xì)胞生物體的培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的細(xì)胞。其它分離本發(fā)明DNA的方法包括在上述基本原理基礎(chǔ)上的變化方法。例如，從IGTS8基因簇得到的序列片段就可用作雜交探針以識(shí)別類似的DNA分子。本發(fā)明所述技術(shù)也可以被用來分離和克隆給黃素蛋白如IGTS8內(nèi)生黃素蛋白編碼的DNA。本發(fā)明中所述的重組DNA分子或其片段將包括所有用化學(xué)或生物方法插入一個(gè)或多個(gè)給能夠有選擇地裂解碳-硫鍵和黃素蛋白的生物催化劑編碼的基因鏈中的DNA，所說基因原本并不存在于該鏈中。重組DNA包括所有用限制核酸酶，核酸雜交，DNA克隆，DNA合成或任何前述方法的結(jié)合方法而合成的DNA。構(gòu)建方法可以在Maniatis等人的論述中查到，也可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它方法。構(gòu)建本發(fā)明DNA質(zhì)粒或載體的方法包括Maniatis等人所述的和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它方法。術(shù)語“DNA質(zhì)?！焙汀拜d體”是要包括所有能夠?qū)⑼鈦砘蛲庠碊NA用化學(xué)或生物方法插入其中，并在轉(zhuǎn)化成適當(dāng)?shù)姆侨梭w宿主生物體后，表達(dá)插入的外來或外源DNA的產(chǎn)物(即，表達(dá)本發(fā)明生物催化劑和黃素蛋白)的復(fù)制感受態(tài)質(zhì)?；蜉d體。此外，所說質(zhì)粒或載體必須易于接受含有本發(fā)明基因或多種基因的DNA分子或其片段的插入，所說基因或多種基因給選擇性地裂解有機(jī)硫化合物中的碳-硫鍵的生物催化劑編碼。構(gòu)建DNA質(zhì)粒載體的方法包括Maniatis等人所述的和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它方法。本發(fā)明質(zhì)粒包括所有含有給黃素蛋白和/或選擇性地裂解有機(jī)硫化合物中的碳-硫鍵的生物催化劑編碼的基因或多種基因的任何DNA片段。術(shù)語“質(zhì)?！卑ㄋ蠨NA片段。該DNA片段應(yīng)該是可傳送的，例如，通過轉(zhuǎn)化或接合傳送到宿主微生物。構(gòu)建或提取DNA質(zhì)粒的方法包括Maniatis等人所述的和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的非人體宿主生物體可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法進(jìn)行。例如，可用Maniatis等人所述的電穿孔法。由術(shù)語“非人體宿主生物體”表示能夠攝取和表達(dá)外來、外源、或重組DNA的所有非人體宿主生物體。優(yōu)選的宿主生物體是細(xì)菌，尤其優(yōu)選假單胞菌(pseudonomad)。本發(fā)明化石燃料脫硫方法包括兩方面。第一，由此得到的宿主生物體或生物催化劑與要脫硫的化石燃料接觸。這項(xiàng)工作可以在任何適當(dāng)容器中進(jìn)行，可任意安裝攪拌或混合裝置。將混合物充分混合，并允許培養(yǎng)充分長(zhǎng)時(shí)間以使有機(jī)硫化合物中足夠數(shù)量的碳-硫鍵裂解，進(jìn)而產(chǎn)生脫硫的化石燃料。在一個(gè)實(shí)例中水乳液或微乳液由生物體或酶部分的水性培養(yǎng)物產(chǎn)生，而且，在表達(dá)的生物催化劑裂解碳-硫鍵時(shí)化石燃料允許生物體擴(kuò)散到乳液中。各種變量如溫度、混合速度、和脫硫效率將根據(jù)所用生物體生物催化劑和/或黃素蛋白變化。這些參數(shù)只需通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)途徑即可測(cè)定。監(jiān)測(cè)脫硫效率和程度的幾種恰當(dāng)技術(shù)是眾所周知的，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于采用的。基線和時(shí)間過程樣品可以從培養(yǎng)的混合物中收集，并用以測(cè)定化石燃料中的殘余有機(jī)硫。要進(jìn)行生物催化處理的樣品中的有機(jī)硫化合物如DBT中消失的硫的監(jiān)測(cè)可用，例如，X射線熒光(XRF)或原子發(fā)射譜(火焰譜)法。優(yōu)選地，樣品的分子部分首先用，例如氣體色譜法分離。本發(fā)明的方法和生物催化組合物(包括重組微生物)顯著地和意外地改進(jìn)了早期公開的脫硫方法。已經(jīng)表明，應(yīng)用黃素蛋白比未添加黃素蛋白的體系使反應(yīng)效率改善近100倍。這一點(diǎn)是近期文獻(xiàn)中討論的觀點(diǎn)尤其沒有預(yù)料到的，所說文獻(xiàn)認(rèn)為FAD直接連接到DSZC上(Denome等人，J.Bacteriol.，1766707-6716，1994)，并認(rèn)為NADH是該體系僅需的輔因子(Ohshiro等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.118341-344，1994)。在不受任何特殊機(jī)理限制的條件下，脫硫反應(yīng)的途徑被認(rèn)為如下在不受任何特殊理論限制的條件下，黃素蛋白被認(rèn)為是從NADH(或其它電子供體)傳遞還原等價(jià)物到酶，DSZC(或Sox.C)和/或DSZA(或Sox.A)的短電子傳輸鏈。酶DSZC被認(rèn)為負(fù)責(zé)DBT到DBTO2氧化反應(yīng)的生物催化作用。酶DSZA被認(rèn)為負(fù)責(zé)DBTO2到苯酚-苯基亞硫酸酯(PPS)的反應(yīng)。因此，特別優(yōu)選將輔因子FMN以及電子供體，DADH或NADPH加到反應(yīng)介質(zhì)中。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道NADH或NADPH的選擇取決于黃素蛋白的選取。在下面實(shí)施例中，當(dāng)使用Vibrio黃素蛋白時(shí)就用NADPH。另外，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法添加NADH或NADPH再生系統(tǒng)以將NAD+轉(zhuǎn)化成NADH是優(yōu)選的?，F(xiàn)在，我們將用下列實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明。本發(fā)明的最佳實(shí)施例實(shí)施例1FMN提高DSZ體外活性材料和方法將15ml生長(zhǎng)在30℃到約10A600的堿性鹽培養(yǎng)基中的IGTS8細(xì)菌用離心方法收集，并重新懸浮于pH7.5的4ml0.1M磷酸鈉緩沖液中。兩次通過17,000psi的弗氏壓碎器裂解這些細(xì)胞。在細(xì)胞裂解液中加入去垢劑CHAPS使最終濃度達(dá)到0.1％。然后將混合物放于冰上15分鐘，以15,000xg離心15分鐘。上清液用于無細(xì)胞酶分析。酶反應(yīng)混合物含有下列全部或部分成分1.0mMDBT，3.2mMNADH，1％卵磷脂(以增加DBT在水性混合物中的溶解性)，5μMFAD或FMN，和上述濃度為0.1-1.0mg/ml的細(xì)胞蛋白提取物。反應(yīng)物總體積為0.6ml。將反應(yīng)物在30℃培養(yǎng)同時(shí)搖動(dòng)1小時(shí)，停止前加入1ml乙腈。將混合物離心，并用HPLC對(duì)一部分上清液進(jìn)行分析，對(duì)比已知的2-HBP標(biāo)準(zhǔn)。蛋白質(zhì)濃度用Biorad(Hercules，CA)的蛋白分析試劑盒測(cè)定。結(jié)果如Ohshrio等人(FEMSMicrobiol.Lett.18341-344(1994))所示，DBT到2-HBP的轉(zhuǎn)化取決于在NADH體外反應(yīng)混合物過程中以NADH形式添加的還原等價(jià)物(表1)。然而，這些作者報(bào)告說沒有任何其它輔因子在該反應(yīng)中起作用。表1用IGTS8進(jìn)行黃素單核苷酸(FMN)DBT脫硫的要求<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="808">產(chǎn)物添加的化學(xué)物質(zhì)DBT亞砜(μg)DBT砜(μg)2-HBP(μg)NADHa0017.0NADH00.40NADH+FAD000FMN000NADH+FMN002.5</table></tables>a除了蛋白質(zhì)濃度為1.6mg/ml以外其它反應(yīng)條件如上所述。如果將上述制備的IGTS8蛋白質(zhì)粗提取物稀釋到約0.16mg/ml蛋白質(zhì)濃度，則該提取物將損失其從只有NADH化學(xué)物質(zhì)中的DBT產(chǎn)生2-HBP的能力。在這種情況下向反應(yīng)混合物中添加FMN(黃素單核苷酸)可恢復(fù)這種能力。添加FAD(黃素二核苷酸)無用(表1)。透析提取物有相同的作用(損失脫硫活性，添加FMN和NADH可以恢復(fù))。這些結(jié)果表明NADH和FMN均參與了脫硫過程，而且表明為使反應(yīng)進(jìn)行它們必須同時(shí)存在。實(shí)施例2純的異源NADPH依賴的FMN還原酶提高IGTS8提取物的Dsz活性實(shí)施例1所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，含有還原酶的黃素(如FMN)參與了由IGTS8催化的脫硫反應(yīng)。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們?cè)谟屑儺惙NFMN還原酶存在下進(jìn)行了DBT至2-HBP的反應(yīng)。材料和方法基本上按照實(shí)施例1所述制備IGTS8細(xì)胞的粗蛋白溶胞液。在該提取物中蛋白質(zhì)的濃度為12.7mg/ml。為了測(cè)量提取物的脫硫活性，將67μMDBT和5mMNADPH與不同量的從Vibrioharveyi(Lei等人，Supra)純化的NADPH依賴的FMN還原酶加到300μl該提取物中。這里所用的一單位還原酶將催化每分鐘1微摩爾用NADPH作為底物的還原反應(yīng)。結(jié)果如果在300μl上述反應(yīng)混合物中加入0-0.090單位V.harveyi還原酶，則還原酶對(duì)脫硫活性有很強(qiáng)的刺激作用。加入0.09單位將增加活性2倍以上(圖1)。這些結(jié)果表明，在此處所說的脫硫反應(yīng)中提取物對(duì)催化反應(yīng)的總體能力主要通過添加含有還原酶的黃素來加以改善。實(shí)施例3Dsz表型在大腸埃希氏桿菌中的表達(dá)依賴于FRP材料和方法dsz表達(dá)載體pEX16的構(gòu)建質(zhì)粒pEX16包含在大腸埃希氏桿菌tac啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄控制下的dszABC基因。該質(zhì)粒經(jīng)過下列步驟構(gòu)建合成的雙螺旋DNA低聚核苷酸銜接頭序列被連接到已經(jīng)被核酸內(nèi)切酶EcoRI和HindIII消化的質(zhì)粒pUC19(Yanisch-Perron等人，Gene33103-119(1985))上，得到質(zhì)粒pEX13。然后將pEX13用核酸內(nèi)切酶Nsil和Bsiwl消化。將從含有dszABC結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒pTOXil(美國專利5,356,801)得到的4.5kbNsil/Bsiwl限制片段分離，再連接到消化后的pEX13DNA上，形成質(zhì)粒pEX14。將得自pEX14的4.5kbpBglii/Spel片段和BAMHl/Spel切斷的質(zhì)粒pT3XI-2[Hale，K.含有四環(huán)素抵抗基因和tac啟動(dòng)子的pKK223-3(Pharmacia)衍生物]的混合物連接，使得tac啟動(dòng)子取向?yàn)橹苯愚D(zhuǎn)錄dszABC。該質(zhì)粒稱為pEX16(圖2)。編碼DSZABC和frp的質(zhì)粒的構(gòu)建用下列步驟將含有frp(黃素還原酶)基因Vibrioharveyi(Lei等人，J.Bacteriology1763552-3558(1994))的0.9kbpDNA片段加到質(zhì)粒pEX16中。用限制核酸內(nèi)切酶Earl消化質(zhì)粒pFRPI(Lei等人，(1994))，并用dNTP和DNA聚合酶大片段(Klenow)做成平端。將雙鏈Spel接頭片段(N.E.Biolabs)通過連接加到上述平端上；接著用Spel消化。然后將質(zhì)粒pEX16在位于dszABC基因簇3’端的獨(dú)特Spel處消化，并與以Spel為端點(diǎn)的frp基因片段連接。所形成的含有受tac啟動(dòng)子控制的含有frp基因和dszABC的克隆被稱作pEX44(圖2)。細(xì)胞溶胞液的制備和載有pEX16或pEX44的大腸埃希氏桿菌提取物中Dsz活性的測(cè)定通過加入0.1mM(最終濃度)IPTG誘發(fā)已經(jīng)在37℃YT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)了的大腸埃希氏桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物(50ml)進(jìn)行克隆基因表達(dá)誘導(dǎo)。離心收集細(xì)胞，并重新懸浮于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中。兩次通過17,000psi的弗氏壓碎器使細(xì)胞裂解。將細(xì)胞溶胞液以15,000xg離心15分鐘，留下上清液部分進(jìn)行酶分析。反應(yīng)混合物含有0.1M磷酸鹽緩沖液、5μMFMN、0.67mMDBT、3mMNADPH、蛋白提取物(12mg/ml)，最終體積為300μl。結(jié)果在以DBT為唯一硫源的大腸埃希氏桿菌的生長(zhǎng)依賴于DSZABC和frpIGTS8將在DBT作為唯一硫源的條件下生長(zhǎng)。野生型大腸埃希氏桿菌將不能在該條件下生長(zhǎng)。而且，當(dāng)載有質(zhì)粒pEX16和表達(dá)dszABC基因的E.coli菌株被置于如上定義的含有DBT作為唯一硫源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中時(shí)，盡管全部三種基因產(chǎn)物強(qiáng)烈表達(dá)該菌株也不生長(zhǎng)，但是，載有質(zhì)粒pEX44并表達(dá)dszABC和frp的同樣菌株卻會(huì)在該條件下生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明黃素還原酶蛋白顯著提高了Dsz表型的異種表達(dá)。按照上述說明來制備含有質(zhì)粒pEX16或pEX44的大腸埃希氏桿菌菌株提取物，并測(cè)定DBT到2-HBP的轉(zhuǎn)化。示于圖3的結(jié)果表明frp基因和NADPH依賴的FMN還原酶的表達(dá)產(chǎn)物的提取物的存在使轉(zhuǎn)化有所提高。實(shí)施例4IGTS8內(nèi)生黃素蛋白的分離方法與材料細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)30℃溫度下IGTS8在以250rpm搖震的BSM/Hunter培養(yǎng)基[Denome等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiology59(9)2837-2843(1993)]中生長(zhǎng)到出現(xiàn)早期穩(wěn)定期(典型的約85小時(shí))。將含有編碼DSZA的質(zhì)粒pSAD267-1(Denome等人，J.Bact.1766707-6716(1994))的大腸埃希氏桿菌MZ1在補(bǔ)充下列物質(zhì)的BSM/Hunter培養(yǎng)基中生長(zhǎng)0.4mg/ml生物素，組氨酸、異亮氨酸和纈氨酸各50mg/ml，100μg/ml氨芐青霉素和1.5mMNa2SO4。將從新鮮瓊脂平板上取下的單個(gè)菌落接種到50ml已在30℃搖震(250rpm)過夜的液體培養(yǎng)物中。將10ml培養(yǎng)物的等份試樣接種到500ml相同培養(yǎng)基上，并生長(zhǎng)達(dá)到OD600約為0.4。這時(shí)，通過將溫度增至39℃2小時(shí)誘發(fā)DSZA表達(dá)，然后回到30℃直到OD600達(dá)到約3。典型的是將3L細(xì)胞培養(yǎng)物用于純化。將含有編碼DSZC的質(zhì)粒pSAD269-2A(Denome等人，(1994))的大腸埃希氏桿菌MZ1按照上面對(duì)MZ1∷pSAD267-1所述的方法在補(bǔ)充100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。柱色譜整個(gè)色譜分析過程在4℃或在冰上進(jìn)行。將離心收集的IGTS8細(xì)胞用含有1mMEDTA和1mMDTT的25mMEPPSpH8(緩沖液A)洗滌一次，然后重新懸浮于25mMEPPSpH8、1mMEDTA、1mMDTT、100mMNaCl、10mMMgCl2和0.15mMPMSF的混合物中。加入DNase和RNase固體。通過40,000psiAminco弗氏壓碎器破碎細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮液通過弗氏壓碎器兩次，然后在4℃以39,800xg離心30分鐘。將未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞碎片構(gòu)成的細(xì)胞粒丟棄，同時(shí)將上清液裝入PharmaciaQ-SepharoseFastFlow柱(2.6cm×14cm)，用5％含有緩沖液B(緩沖液A+2MNaCl)的緩沖液A以2ml/min流速平衡。用相同緩沖液以5ml/min流速徹底洗滌該柱，直到洗脫液的OD280接近于0，再用線性梯度從5％到30％的緩沖液B(相當(dāng)于100mM-600mMNaCl)洗滌180分鐘。洗脫出的約240mMNaCl有些黃的流出液顯示NADH∶DCPIP氧化還原酶活性。從大腸埃希氏桿菌純化DSZA按下述步驟完成。將如上所述生長(zhǎng)的大腸埃希氏桿菌細(xì)胞通過以6,000rpm離心10分鐘來收集，然后在緩沖液A中洗滌兩次。將細(xì)胞重新懸浮于包括100mMNaCl，10mMMgCl2，0.15mMPMSF和DNase及RNase在內(nèi)的同一緩沖液(體積等于細(xì)胞的濕重量)，然后在20,000psi弗氏壓碎器中破碎。在39,800xg速度下離心溶胞物以除去未破碎細(xì)胞和細(xì)胞碎片。以1ml/min流速將上清液裝入PharmaciaQ-SepharoseFastFlow柱(2.6cm×14cm)，用5％緩沖液B洗滌該柱，直到洗脫液的OD280接近于基線，再用線性梯度從5％到25％的緩沖液B以5ml/min流速洗滌120分鐘。將含有DSZA的流出液(用SDS-PAGE測(cè)定)合并，并在4℃對(duì)緩沖液A滲析過夜。將滲析液裝入通過導(dǎo)管連到PharmaciaResourseQ柱上的PharmaciaBlueSepharose-6FastFlow柱內(nèi)，用緩沖液A平衡。在達(dá)到穩(wěn)定基線后斷開與BlueSepharose柱的連接，并用線性梯度2.5-25％的緩沖液B以3ml/min流速洗滌60分鐘。將含有DSZA的流出液(用SDS-PAGE判定)合并，加入甘油至10％(w/v)，并貯存于-20℃。該方法的結(jié)果得到95％純的DSZA。DSZC的純化過程如下。在該例中，緩沖液A為含有1mMEDTA的10mMBES(pH7.09)。在室溫下用4mg/ml溶菌酶處理細(xì)胞1.5小時(shí)使其溶解。溶胞緩沖液包括75mMNaCl，1mMDTT和0.1mg/mlPMSF。溶胞完成后加入MgCl2至5mM，并加入DNase和RNase。上清液首先以6,000rpm離心15分鐘，棄去離心沉淀，然后再將上清液以39,000xg離心1.5小時(shí)。接著將上清液倒入，用緩沖液A+3％緩沖液B(緩沖液A+2MNaCl)平衡過的PharmaciaResourseQ柱，再用10倍柱容積的相同緩沖液洗滌。然后用線性梯度60-500mM的NaCl(相當(dāng)于3-25％緩沖液B)以3ml/min流速洗滌23分鐘。將含有DSZC的流出液(用SDS-PAGE測(cè)定，約350mMNaCl洗脫)合并，并用AmiconCentriprep30(MWCO30kDa)濃縮至約0.7ml。將0.25ml濃縮部分在PharmaciaSuperose12凝膠過濾柱上進(jìn)一步色譜分離，用10mMBESpH7作為流動(dòng)相(流速為0.3ml/min)。將含DSZC部分合并，然后凍干并貯存于-20℃。酶分析依賴于NADH的DCPIP還原反應(yīng)的測(cè)定如下所述。反應(yīng)混合物(1ml，在一個(gè)直徑為1cm的試管中)為含有100nmolDCPIP和50nmolFMN的25mMEPPS緩沖液(pH8)。DCPIP的還原與600nm處的吸收減少相關(guān)。攪拌的混合物的吸收用Beckman7500二極管陣列分光光度計(jì)于600nm處監(jiān)測(cè)。約30秒后加入300nmolNADH，觀察到有還未有進(jìn)行酶還原反應(yīng)的DCPIP。再30秒后注射1-10μL需要試驗(yàn)的樣品引起反應(yīng)。酶化活性表示為-OD600/min或μM還原的DCPIP/min(用ε600＝21mM-1cm-1表示)。依賴NADH的cytc還原反應(yīng)可用類似方法測(cè)定，除了吸收在550nm處監(jiān)測(cè)和混合物中用50nmolcytc代替DCPIP之外。鐵細(xì)胞鉻(ferricytochrome)c到亞鐵細(xì)胞鉻(ferrocytochrome)c的還原與550nm處的吸收增加相關(guān)。DBT到DBTO、DBTO2、和HBP，以及DBT-磺內(nèi)酯到BHBP的轉(zhuǎn)化可用上述HPLC進(jìn)行分析，用SynchropakRPC18反向柱(100×4.6mm)和H2O∶乙腈為1。在pH7.5的100mMNaPi中的反應(yīng)混合物含有1ml3μmolNAD(P)H，25nmolFMN(或FAD)，粗溶胞物或純DSZC(A)和100nmol底物。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(每10分鐘)除去100μL，加入100μL乙腈以淬滅反應(yīng)，并對(duì)底物和產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果在IGTS8中含還原酶的黃素的識(shí)別用陰離子交換色譜分離IGTS8粗溶胞物后就可以分辨出幾種清晰的色素(黃素和棕色)部分。正如圖4所示，NADH還原DCPIP的反應(yīng)發(fā)生在以25號(hào)峰(約240mMNaCl)為中心的周圍幾部分。典型地，這些部分的顏色稍微有些黃，表明它們含有黃素蛋白。為了得到全部氧化還原酶活性必須將外源黃素加到該反應(yīng)混合物中，以便在分離過程中指出是否已經(jīng)失去外源黃素。添加黃素(在此為FMN)可以提高DCPIP還原反應(yīng)的效率和反應(yīng)程度。這些部分還催化偶聯(lián)到氧化NADH的cytc還原反應(yīng)。用黃素蛋白還原酶活化DSZA和C當(dāng)DSZA或C從大腸埃希氏桿菌純化時(shí)，在典型的1小時(shí)分析中二者均不催化它們各自的反應(yīng)。圖5表示如果來自黃色部分的黃素蛋白氧化還原酶與純的大腸埃希氏桿菌DSZA在FMN和NADH存在下結(jié)合，則發(fā)生DBT-磺內(nèi)酯向BHBP的完全轉(zhuǎn)化。當(dāng)黃色部分與DSZC、FMN和NADH結(jié)合時(shí)(只是底物改為DBT，且產(chǎn)物是DBTO2)可以看到相同的圖形(圖6)。這些數(shù)據(jù)將說明為了使脫硫反應(yīng)進(jìn)行，不僅必須存在DSZA、B、和C蛋白，至少還要有第三種蛋白包括在反應(yīng)過程中，該蛋白使用黃素作為輔因子并且負(fù)責(zé)氧化NADH。等價(jià)物不必采用超出常規(guī)的實(shí)驗(yàn)途徑，本領(lǐng)域技術(shù)人員都將知道或能夠確定可用于本發(fā)明所述的具體實(shí)例的很多等價(jià)物。這些及所有其它等價(jià)物都將包括在下列權(quán)利要求中。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱EnergyBioSystemsCorporation(B)街道4200ResearchForestDrive(C)城市TheWoodlands(D)州/省Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77381(G)電話(713)364-6100(H)傳真(713)364-6110(i)申請(qǐng)人/發(fā)明人(A)名稱CharlesH.Squires(B)街道66LazyLane(C)城市TheWoodlands(D)州/省Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77381(i)申請(qǐng)人/發(fā)明人(A)名稱WanJi(B)街道2TownsendPlace(C)城市TheWoodlands(D)州/省Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77381(i)申請(qǐng)人/發(fā)明人(A)名稱LeiXi(B)街道159WestSterlingPondCircle(C)城市TheWoodlands(D)州/省Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77381(i)申請(qǐng)人/發(fā)明人(A)名稱BeatriceC.Ortego(B)街道17003KettleCreekDriVe(C)城市Spring(D)州/省Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77379(i)申請(qǐng)人/發(fā)明人(A)名稱OlgaS.Pogrebinsky(B)街道12611Pinerock(C)城市Houston(D)州/省Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77024(i)申請(qǐng)人/發(fā)明人(A)名稱KeVinA.Gray(B)街道3500Tanglebrush，No.177(C)城市TheWoodlands(D)州/省Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77381(i)申請(qǐng)人/發(fā)明人(A)名稱JohnD.Childs(B)街道33HollyCreekCourt，No.1202(C)城市TheWoodlands(D)州/省Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77381(ii)發(fā)明題目用黃素蛋白給化石燃料脫硫的方法(iii)序列號(hào)2(iv)通訊地址(A)地址Hamilton，Brook，Smith&amp;Reynolds，P.C.(B)街道TwoMilitiaDrive(C)城市Lexington(D)州/省Massachusetts(E)國家USA(F)郵政編碼02173(v)計(jì)算機(jī)可讀方式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，#1.30版(vi)以前申請(qǐng)情況(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/351,754(B)遞交日1994年12月8日(C)分類(viii)律師/代理人情況(A)名稱Brook，DavidE.(B)注冊(cè)號(hào)22，592(C)參考/摘要號(hào)EBC94-08PCT(ix)電訊信息(A)電話(617)861-6240(B)傳真(617)861-9540(2)序列識(shí)別編號(hào)信息1(i)序列特征(A)長(zhǎng)度77個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)絞鏈情況雙股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置31..54(xi)序列的描述序列識(shí)別號(hào)1AATTCAGATCTGATCGAGGAGGATGATTAAATGACTCAACAACGACAAATGCAT54MetThrGlnGlnArgGlnMetHis15CTGATACGTACGACTAGTAAGCT77(2)序列識(shí)別編號(hào)信息2(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列的描述序列識(shí)別號(hào)2MetThrGlnGlnArgGlnMetHis1權(quán)利要求1.一種提高含有機(jī)硫化合物的化石燃料的脫硫速率的方法，包括以下步驟a)將化石燃料與含有能夠裂解碳-硫鍵的生物催化劑和能夠提高反應(yīng)速率量的黃素蛋白的水相接觸，進(jìn)而形成化石燃料和水相的混合物；b)將步驟a)的混合物保持在用生物催化劑足以裂解有機(jī)硫分子中碳-硫鍵的條件下，進(jìn)而得到有機(jī)硫含量減少的化石燃料；以及c)將有機(jī)硫含量減少了的化石燃料從所得水相中分離出來。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中黃素蛋白是黃素還原酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中黃素蛋白是FMN還原酶。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，還包括添加NADH或NADPH。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中化石燃料是液體烴。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中化石燃料是液化烴。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中能夠裂解碳-硫鍵的生物催化劑和FMN還原酶是固定化的。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中碳-硫鍵的裂解是通過氧化途徑完成。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中能夠裂解碳-硫鍵的生物催化劑是微生物。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中微生物含有給能夠裂解碳-硫鍵的一種或多種酶編碼的重組DNA分子。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中重組DNA分子從紅球菌屬ATCC53968衍生。12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中能夠裂解碳-硫鍵的生物催化劑是無細(xì)胞組分。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中生物催化劑是紅球菌屬ATCC53968無細(xì)胞組分。14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中的生物催化劑包括從能夠裂解碳-硫鍵的微生物衍生出來的一種或多種酶或酶組分。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中微生物是紅球菌屬ATCC53968。16.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中黃素蛋白是重組黃素還原酶。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中能夠裂解碳-硫鍵的生物催化劑和重組黃素還原酶由單一微生物產(chǎn)生。18.一種DNA分子，它含有給黃素蛋白編碼的DNA和給能將含有機(jī)硫分子的化石燃料脫硫的生物催化劑編碼的DNA。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的DNA分子，其中黃素蛋白是黃素還原酶。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的DNA分子，其中黃素還原酶是FMN還原酶。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的DNA分子，其中DNA分子含有從紅球菌屬ATCC53968衍生的DNA。22.一種含有重組DNA分子的微生物，它編碼a)黃素蛋白；以及b)能夠?qū)⒑袡C(jī)硫分子的化石燃料脫硫的生物催化劑。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的微生物，其中黃素蛋白是黃素還原酶。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的微生物，其中重組DNA質(zhì)粒含有從紅球菌屬ATCC53968衍生的DNA。25.一種組合物，它包括a)黃素蛋白；以及b)能夠?qū)⒑袡C(jī)硫分子的化石燃料脫硫的生物催化劑。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中黃素蛋白是黃素還原酶。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中黃素蛋白是FMN還原酶。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中生物催化劑是紅球菌屬ATCC53968或其酶。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，還含有NADH或NADPH。全文摘要本發(fā)明涉及一個(gè)新發(fā)現(xiàn)，即通過在生物催化劑中添加黃素蛋白可提高化石燃料脫硫反應(yīng)速率。本發(fā)明涉及提高含有機(jī)硫化合物的化石燃料脫硫速率的方法，包括以下步驟a)將化石燃料與含有能夠裂解碳-硫鍵的生物催化劑和能夠提高反應(yīng)速率量的黃素蛋白的水相接觸，進(jìn)而形成化石燃料和水相的混合物；b)將步驟a)的混合物保持在用生物催化劑足以裂解有機(jī)硫分子中碳-硫鍵的條件下，進(jìn)而得到有機(jī)硫含量減少的化石燃料；及c)將有機(jī)硫含量減少了的化石燃料從所得水相中分離出來。本發(fā)明還涉及含有一或多個(gè)重組DNA分子的重組微生物，該DNA分子給能夠?qū)⒑袡C(jī)硫分子的化石燃料脫硫的生物催化劑編碼，并給黃素蛋白編碼。本發(fā)明還涉及含有下列物質(zhì)的組合物(a)能夠?qū)⒑袡C(jī)硫分子的化石燃料脫硫的生物催化劑，和(b)黃素蛋白。文檔編號(hào)C10G32/00GK1169159SQ95196710公開日1997年12月31日申請(qǐng)日期1995年12月5日優(yōu)先權(quán)日1994年12月8日發(fā)明者查爾斯·H·司夸爾斯,紀(jì)宛,奚雷,比崔斯·C·沃特高,沃爾加·S·帕格瑞賓斯基,科文·A·格雷,約翰·D·蔡爾德斯申請(qǐng)人:能量生物系統(tǒng)公司