專(zhuān)利名稱(chēng)：稀土納米粒子的制作方法
稀土納米粒子
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本申請(qǐng)要求2006年8月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/837, 807的優(yōu)先權(quán)。
關(guān)于聯(lián)邦贊助研究的聲明
依據(jù)National Institutes of Hea 1 th 4受予的4受卄又號(hào)CA78383和 HL70567用政府資助作出本發(fā)明。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。 背景
本文涉及與納米粒子(例如稀土納米棒)有關(guān)的方法和材料。例 如，本文涉及與釹、釤、銪、釓和鋱納米粒子有關(guān)的材料和方法。
么
納米技術(shù)正快速擴(kuò)展到生物醫(yī)學(xué)研究中。納米生物技術(shù)在生物成 ( bioimaging )、醫(yī)學(xué)i貪斷和疾病治療中開(kāi)啟新的途徑。使用無(wú)枳^ 熒光納米粒子探針的生物成像法最近在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中引起廣 泛關(guān)注。
發(fā)明概述
本文提供了與稀土粒子如稀土納米棒(例如，無(wú)機(jī)鑭系元素氫氧 化物納米棒)有關(guān)的方法和材料。例如，本文提供了氫氧化釹 [Ndm(0H)3〗、氫氧化釤[Smm(0H)3]、氬氧化鉺[Eu111(0[！)3]、氫氧化釓 [Gdm(OH)3]和氫氧化鋱[Tb"'(OH)3]納米棒?？梢圆捎煤?jiǎn)單、快速、清 潔、有效、經(jīng)濟(jì)、無(wú)毒且生態(tài)友好的微波技術(shù)制備這些納米棒。本文 中提供的氫氧化銪納米棒可以是熒光的，可以進(jìn)入細(xì)胞，并且一旦進(jìn) 入細(xì)胞可以保留它們的熒光性質(zhì)。此外，本文中提供的氬氧化銪納米 棒可用于以成像、治療和/或診斷為目的直觀顯現(xiàn)附著在納米棒上的 藥物或生物分子內(nèi)化到細(xì)胞中的情況。本文中提供的氫氧化銪納米棒 可以是無(wú)毒的、熒光的、無(wú)機(jī)的氫氧化銪(III )納米棒，并可以在體內(nèi)用作促血管生成藥。
通過(guò)由預(yù)存脈管系統(tǒng)生長(zhǎng)新的血管，血管生成過(guò)程在胚胎發(fā)生、 傷口愈合和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。本文中提供的氫氧化銪納米棒可用 于促進(jìn)組織如缺血性組織中的血管生成。在一些情況下，氫氧化銪無(wú)
機(jī)熒光納米棒可代替血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(BFGF)或與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(BFGF)結(jié)合用作促血管生成藥。本文中提供的氬氧化銪納米 棒可以是通過(guò)細(xì)胞增殖化驗(yàn)、細(xì)胞周期化驗(yàn)和/或CAM化驗(yàn)觀察到的 無(wú)毒納米棒，并可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。本文中提供的氫氧化銪納米 棒可用于治療人體內(nèi)的心臟或肢體缺血性組織。類(lèi)似Eum(0Hh納米 棒，如通過(guò)細(xì)胞增殖化驗(yàn)觀察到，Nd111,3、 Smm(0H)3和Tbm(OH)3 納米棒是無(wú)毒的。
與有機(jī)染料(熒光素、Texas Red 、麗絲胺若丹明B、四曱基若 丹明等)和熒光蛋白質(zhì)(綠色熒光蛋白質(zhì)，GFP)相比，本文中提供 的無(wú)機(jī)熒光氫氧化銪納米棒可以具有幾種獨(dú)特的光學(xué)和電子性質(zhì)，如 從可見(jiàn)光到紅外波長(zhǎng)的大小與組成可調(diào)的發(fā)射、大的斯托克斯頻移、 對(duì)稱(chēng)發(fā)射光謙、多種熒光色的同時(shí)激發(fā)、極高亮度和耐光性。
通常，本文的一方面展現(xiàn)了制造氬氧化銪納米棒的方法。該方法 包括，或基本由下列步驟構(gòu)成微波加熱Lnm(N03)3 (其中Ln = Nd、 Sm、 Eu、 Gd或Tb)和氬氧化銨水溶液的混合物。該鑭系元素氬氧化 物[Lnt"(0H)3]納米棒可以為10至500納米長(zhǎng)。該鑭系元素氬氧化物 納米^f奉的直徑可以為1至100納米。
另一方面，本文展現(xiàn)了長(zhǎng)度為100至500納米且直徑為1至100 納米的鑭系元素氫氧化物納米棒，其中該納米棒促進(jìn)血管生成。
另一方面，本文展現(xiàn)了促進(jìn)血管生成的方法，其中該方法包括或 基本由下列步驟構(gòu)成使細(xì)胞與氬氧化銪納米棒接觸。該氫氧化銪納 米棒可以為10至500納米長(zhǎng)。該氫氧化銪納米棒的直徑可以為1至 100納米。
除非另行定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明 所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管可以使用與本文 所述的那些類(lèi)似或?qū)Φ鹊姆椒ê筒牧蠈?shí)施本發(fā)明，下面描述了合適的 方法和材料。本文中提到的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其它參考文獻(xiàn)全文經(jīng)此引用并入本文。在沖突的情況下，以本說(shuō)明書(shū)，包括定 義為準(zhǔn)。此外，該材料、方法和實(shí)例僅是示例性的，而不是限制。
在下文的附圖和描述中闡述了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的 細(xì)節(jié)。從該描述和附圖以及從權(quán)利要求中清楚看出本發(fā)明的其它特 征、目的和優(yōu)點(diǎn)。
附圖描述
圖1是描繪在不同反應(yīng)時(shí)間下微波輔助的、合成后未經(jīng)處理的氫
氧化銪[Eum(0H)3]的XRD圖譜的圖(a)5分鐘、(b)10分鐘、(c) 20分鐘、(d) 40分鐘和(e ) 6G分鐘。
圖2是描繪微波輔助的、合成后未經(jīng)處理的氫氧化釹[Ndm (OH) 3]、 氫氧化釤[Smm(0H)3]、氫氧化釓[Gd"(OH)3]和氫氧化鋱[Tb'"(OH)3] 在微波加熱60分鐘后的XRD圖譜的圖。
圖3含有微波輔助的、合成后未經(jīng)處理的氫氧化銪納米棒的熱解 重量分析圖(TGA;區(qū)域A和C)和差示掃描量熱(DSC)圖(區(qū)域B 和D)。區(qū)域A和B: 5分鐘樣品。區(qū)域C和D: 60分鐘樣品。
圖4含有微波輔助的、合成后未經(jīng)處理的氫氧化釹[Nd'"(0H)3](區(qū) 域A)、氫氧化釤[Sm"'(0H)3](區(qū)域B)、氫氧化釓[Gd川(0H)3](區(qū) 域C)和氫氧化鋱[lV"(0H)3](區(qū)域D)在微波加熱60分鐘后的熱解 重量分析圖(TGA)。
圖5含有合成后未經(jīng)處理的Eu'"(0H)3納米棒在各種微波加熱時(shí) 間下的TEM圖像5分鐘(區(qū)域A) 、 IO分鐘(區(qū)域B) 、 20分鐘(區(qū) 域C) 、 40分鐘(區(qū)域D) 、 60分鐘(區(qū)域E;在低放大率下)和60 分鐘(區(qū)域F;在更高放大率下)。
圖6含有合成后未經(jīng)處理的氫氧化釹[Nd"1 (OH) 3]納米棒在微波加 熱下列時(shí)長(zhǎng)后的TEM圖像1分鐘(區(qū)域A) 、 5分鐘(區(qū)域B) 、 10 分鐘(區(qū)域C) 、 20分鐘(區(qū)域D) 、 40分鐘(區(qū)域E)和60分鐘(區(qū) 域F)。
圖7含有合成后未經(jīng)處理的氬氧化釤[Sm"1 (OH) 3]納米棒在微波加 熱下列時(shí)長(zhǎng)后的TEM圖像1分鐘(區(qū)域A)、 5分鐘(區(qū)域B)、 10 分鐘(區(qū)域C) 、 20分鐘(區(qū)域D) 、 40分鐘(區(qū)域E)和60分鐘(區(qū) 域F)。
圖8含有合成后未經(jīng)處理的Gdm(0H)3(區(qū)域A)和lV"(0H)3(區(qū)域B)納米粒子在微波加熱60分鐘后的TEM圖像，該粒子中的一些是 納米棒。
圖9,區(qū)域A和B,含有兩個(gè)微波輔助的、合成后未經(jīng)處理的Eu (OH) 3 的激發(fā)光譜圖。區(qū)域B中的圖是區(qū)域A中圖的更高放大圖。圖9C包 括微波輔助的、合成后未經(jīng)處理的Eu'"(0H)3的發(fā)射光譜圖。
圖10是描繪在用下列濃度納米棒處理過(guò)的內(nèi)皮細(xì)胞中的 Eum(0H)3納米棒的發(fā)射光譜的圖a = 5微克/毫升，b = 10微克/ 毫升，c = 20微克/毫升，d =50微克/毫升和e = 100微克/毫升。 對(duì)照實(shí)驗(yàn)沒(méi)有發(fā)射峰。
圖11包括含納米棒和不含納米棒的HUVEC的DIC顯^(效圖片。區(qū) 域A:未經(jīng)處理的對(duì)照HUVEC;沒(méi)有觀察到納米棒。區(qū)域B-D:用下列 濃度的Eu(0H)3納米棒處理過(guò)的HUVEC。區(qū)域B: 20微克/毫升，區(qū)域 C: 50微克/毫升和區(qū)域D: 100微克/毫升。在一些地方用白色箭頭(區(qū) 域B-D)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的納米棒。
圖12含有內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的熒光(左側(cè)區(qū)域)和相應(yīng)相位圖 像(右側(cè)區(qū)域)。區(qū)域A含有未經(jīng)處理的對(duì)照內(nèi)皮細(xì)胞的圖像。在圖 A中淡綠色歸因于自體熒光。區(qū)域B和C含有用20微克/毫升(區(qū)域 B)或5 0微克/毫升(區(qū)域C)的Eu(0H)3納米棒處理過(guò)的內(nèi)皮細(xì)胞的 共焦顯微圖像。箭頭指示位于細(xì)胞內(nèi)部的粒子的焚光。
圖13含有在內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室內(nèi)的Eu"'(OH)3納米棒的TEM 照片。在用20微克/毫升(區(qū)域A-C)或50微克/毫升(區(qū)域D-F) 的納米棒處理過(guò)的HUVEC的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室內(nèi)，通過(guò)TEM使該納米棒的圖 像直觀化。區(qū)域B和C包括來(lái)自區(qū)域A的放大圖像。區(qū)域E和F包括 來(lái)自區(qū)域D的放大圖像。
圖14含有在內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室內(nèi)的Tb"'(0H)3納米棒的TEM 照片。在用50微克/毫升的納米棒處理過(guò)的HUVEC的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室內(nèi)部， 通過(guò)TEM使該納米棒的圖像直觀化。區(qū)域B、 C和D含有來(lái)自區(qū)域A 的放大圖像。
圖15含有描繪不同濃度的氫氧化銪納米棒對(duì)血清饑餓HUVEC的 作用的圖，該作用使用。H]胸腺嘧啶并入化驗(yàn)法觀察并表示為激勵(lì)倍 數(shù)。Eu-20、 -50、 -IOO表示分別用20、 50和100微克/毫升的氫氧化 銪處理過(guò)的細(xì)胞。VF表示用VEGF ( 10納克/毫升)處理過(guò)的細(xì)胞。數(shù)
6據(jù)表示激勵(lì)倍數(shù)，并表示為一式三份進(jìn)行的三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均±
SD。當(dāng)p《0. 05時(shí)該數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)上有意義。
圖16含有描繪不同濃度的氫氧化釹納米棒對(duì)血清饑餓HUVEC的 作用的圖，該作用使用。H]胸腺嘧啶并入化驗(yàn)法觀察并表示為激勵(lì)倍 數(shù)。Nd-10、 -20、 -50表示分別用10、 20和50微克/毫升的氫氧化釹 處理過(guò)的細(xì)胞。
圖17含有描繪不同濃度的氫氧化釤納米棒對(duì)血清饑餓HUVEC的 作用的圖，該作用使用PH]胸腺嘧啶并入化驗(yàn)法觀察并表示為激勵(lì)倍 數(shù)。Sm-20、 -50、 -IOO表示分別用20、 50和100微克/毫升的氬氧化 釤處理過(guò)的細(xì)胞。
圖18含有描繪不同濃度的氫氧化鋱納米棒對(duì)血清饑餓HUVEC的 作用的圖，該作用使用PH]胸腺嘧啶并入化驗(yàn)法觀察并表示為激勵(lì)倍 數(shù)。Tb-20、 -50、 -IOO表示分別用20、 50和100微克/毫升的氫氧化 鋱?zhí)幚磉^(guò)的細(xì)胞。TbN表示用濃度為20微克/毫升的硝酸鋱?zhí)幚磉^(guò)的 細(xì)胞。
圖19含有經(jīng)受Tunnel細(xì)胞凋亡化驗(yàn)法的HUVEC的照片。區(qū)域A-C 含有在37。C下用喜樹(shù)堿處理4小時(shí)以誘發(fā)細(xì)胞凋亡的HUVEC的圖像。 喜樹(shù)堿處理過(guò)的細(xì)胞充當(dāng)正對(duì)照物。HUVEC的TMR紅-染色細(xì)胞核因存 在凋亡細(xì)胞(區(qū)域A)而呈現(xiàn)紅色。DAPI-染色細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色(區(qū)域 B)。區(qū)域C含有區(qū)域A和B的合并圖。區(qū)域D-F含有未處理的HUVEC 的圖像。區(qū)域G-I含有用50微克/毫升Eum(0H)3處理過(guò)的HUVEC在 37。C下培育20小時(shí)的圖像。區(qū)域J-L含有用100微克/毫升Eum(OH)3 處理過(guò)的HUVEC在37。C下培育20小時(shí)的圖像。第一列(區(qū)域A、 D、 G和J)中所示的HUVEC的細(xì)胞核用TMR紅染色。由于不存在凋亡細(xì) 胞，沒(méi)有觀察到紅色染色。第二列(區(qū)域B、 F、 H和K)中所示的細(xì) 胞的DAPI-染色細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。第三列的每一行(區(qū)域C、 F、 I和 L)含有相同行的第一和第二列中兩個(gè)圖像的合并圖像。
圖20是在不同劑量的Eum(OHh納米棒(0-100微克/毫升)存在 下內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的細(xì)胞周期分析的圖。S-期(S)'在50微克/毫 升Eum(OH)3納米棒的濃度下最高。數(shù)據(jù)表示為一式三份進(jìn)行的三個(gè) 單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均土SD,并當(dāng)p《0. 05時(shí)在統(tǒng)計(jì)上有意義。
圖21含有分析磷酸化絲裂原活化蛋白激酶和總絲裂原活化蛋白
7激酶的蛋白質(zhì)印跡。由用Eu"'(0H)3納米棒(50微克/毫升)處理所示 時(shí)間(5分鐘至6小時(shí))或用VEGF ( 10納克/毫升)處理5分鐘(區(qū) 域A)的HUVEC制備溶菌產(chǎn)物。區(qū)域B含有在模擬處理的(對(duì)照物) 或用20微克/毫升(E20)或50微克/毫升(E50)的Eu(0H)3納米棒 處理24小時(shí)的HUVEC中分析磷酸化絲裂原活化蛋白激酶和總絲裂原 活化蛋白激酶的蛋白質(zhì)印跡。
圖22含有用于分析活性氧(ROS)的HUVEC圖像。區(qū)域A-C含有 對(duì)照的未處理的HUVEC的圖像。區(qū)域D-F含有用作為正向ROS誘發(fā)劑 的100微摩/毫升過(guò)氧化氬叔丁基(TBHP)處理的HUVEC的圖像。區(qū) 域G-L含有用20微克/毫升(區(qū)域G-1)或50微克/毫升(區(qū)域J-L) 的Eu'"(0H)3納米棒處理的HUVEC的圖像。
圖23含有用TE (Tris-EDTA)緩沖液(區(qū)域A) 、 VEGF ( 50納克； 區(qū)域B)或1微克或10微克在TE緩沖液中的納米棒(區(qū)域C和D) 處理的雞絨毛尿嚢膜(CAM)的照片。區(qū)域E含有描繪CAM化驗(yàn)結(jié)果 的圖。通過(guò)從三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的最少10個(gè)試樣計(jì)數(shù)由三級(jí)血管生成的 分支點(diǎn)來(lái)量化血管生成。
發(fā)明詳述
本文提供了與稀土粒子如稀土納米棒有關(guān)的方法和材料。例如， 本文提供了稀土 (例如，鑭系元素)粒子，如釹(Nd)、釤(Sm)、 銪(Eu)、釓(Gd)和鋱(Tb)氬氧化物納米棒，制造稀土粒子(例 如，釹、釤、銪、釓和鋱氫氧化物納米棒)用的方法和材料，以及使 用稀土粒子(例如，釹、釤、銪、釓和鋱氫氧化物納米棒)作為成像 劑和/或促進(jìn)血管生成用的方法和材料。
本文中提供的鑭系元素(例如，釹、釤、銪、釓和鋱)氫氧化物 納米粒子(例如，納米棒)可以具有任何尺寸。例如，本文中提供的 氫氧化銪納米棒可以具有50納米至500納米(例如，100納米至400 納米、150納米至350納米和200納米至300納米)的長(zhǎng)度，并可以 具有10納米至100納米(例如，20納米至9Q納米、25納米至75納 米或30納米至50納米)的厚度?？梢允褂萌魏魏线m的方法制造鑭系 元素氫氧化物納米粒子。例如，如本文所述的微波技術(shù)可用于制造鑭 系元素(例如，釹、釤、銪、釓和鋱)氫氧化物納米棒。
在一些情況下，本文中提供的鑭系元素氬氧化物納米粒子可以與
8藥物或其它用于輸送至哺乳動(dòng)物(例如，人類(lèi))的治療劑結(jié)合。例如， 藥物可以共價(jià)連接到氫氧化銪納米粒子(例如，納米棒)上。在此情 況下，該氫氧化銪納米粒子(例如，納米棒)可用于追蹤藥物在哺乳 動(dòng)物體內(nèi)的位置和/或濃度?？梢耘c鑭系元素氫氧化物納米粒子結(jié)合
的治療劑的實(shí)例包括但不限于多肽、抗體、C225、吉西他濱、順鉑和 含有活性官能團(tuán)的有機(jī)藥物分子。
可以使用任何合適的方法將鑭系元素氫氧化物納米粒子與治療 劑結(jié)合。例如，治療劑可以共軛到鑭系元素氫氧化物納米粒子上。在 將治療劑(例如，藥物分子)與鑭系元素氫氧化物納米粒子(例如， 氬氧化銪納米棒)共輒前，該納米粒子(例如，納米纟奉)的表面可以 用活性官能團(tuán)(例如，氨基或巰基)改性。例如，如別處(Feng等人， ^朋/. C力e瓜，75:5282-5286 (2003))所述，可以使用氨丙基三曱氧 基硅烷(APTMS)或巰基丙基三甲氧基硅烷(MP頂S)將該鑭系元素氫 氧化物納米棒的表面官能化。在某些情況下，可以用如本文所述的微 波技術(shù)將該納米粒子(例如，納米棒)官能化。表面改性的鑭系元素 氫氧化物納米粒子可以通過(guò)生成共價(jià)鍵與不同的治療劑(例如，有機(jī) 藥物分子、多肽或抗體)結(jié)合。
如本文中所述，鑭系元素氫氧化物納米粒子，如氫氧化銪納米棒 可用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血管生成。例如，哺乳動(dòng)物可以被確認(rèn)為 需要促血管生成藥。 一旦確認(rèn)，可以將本文中提供的鑭系元素氫氧化 物納米粒子給藥于哺乳動(dòng)物。此類(lèi)給藥可以是全身或局部給藥。例如， 氫氧化銪納米棒可以直接注射到需要血管生成的組織中。在給藥后， 可以監(jiān)控哺乳動(dòng)物以確定是否促進(jìn)了血管生成，或確定是否需要另外 給藥。
在下列實(shí)施例中進(jìn) 一 步描述本發(fā)明，其不限制權(quán)利要求中所述的 本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
實(shí)施例1 材料
六水合硝酸釹(Neodium) (III) ( 99. 9% )、六水合硝酸釤(111 ) (99.99%)、水合硝酸銪(in) [Eu(N03)3. xH20， 99.99%]、六水合硝 酸釓(III) ( 99.999°/。)、六水合硝酸4<( 111 ) ( 99. 999°/。)和氬氧 化銨水溶液[aq.麗山H， 28-30%]購(gòu)自Aldrich(USA)，且不經(jīng)進(jìn)一步提纟屯而使用。[力]胸腺嘧咬購(gòu)自Amersham Biosciences ( Piscataway, NJ)。不含鉀和鎂的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)購(gòu)自CellgroMediatech， Inc. (Herndon, VA )。不含抗微生物劑的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM )、 胰蛋白酶/EDTA (0.25毫克/毫升)、胰蛋白酶中和溶液(TNS)和一 組5%的牛胎兒血清(FBS ) 、 0. 4°/。的牛腦提取物與0. 1%的艮他霉素硫 酸鹽兩性霉素-B獲自Cambrex Bio Science Inc. ( Walkersvi 1 le, MD ) 并用于制造EBM完全培養(yǎng)基。Falcon組織培養(yǎng)皿購(gòu)自Beckon Dickinson Labware (Beckon Dickinson and Company, NJ, USA)。 Tunnel化驗(yàn)中所用的原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒、TMR紅購(gòu)自Roche( Cat. No. #12 156 792 910 )。單克隆鼠IgG (Cat. No# OP72-100UG)、抗 磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(兔多克隆IgG， Cat. No. # 07-467 )抗 體和抗-鼠IgG或抗兔IgG-HRP (Cat.# Sc-2301 )購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA USA ) 。
Image-iT LIVE Green Reactive Oxygen Species( R0S )才企測(cè)試劑盒(136007 )購(gòu)自Invitrogen Molecular Probes (Eugene, OR)。
實(shí)施例2 氳氧化銪[Eu(0H)3]]納米棒的微波輔助合成 鑭系元素硝酸鹽和氫氧化銨水溶液(28-30% A. C. S試劑)分別購(gòu) 自Aldrich Co.和Sigma-Aldrich，且不經(jīng)進(jìn)一步提純而原樣使用。 通過(guò)在大氣壓下在開(kāi)放的回流體系中微波加熱Ln (III)硝酸鹽水溶 液與匪40H水溶液的混合物來(lái)制備Ln"'(OH)3納米棒，其中Ln = Nd、 Sm、 Eu、 Gd或Tb。在典型的合成中，將10毫升NH40H水溶液添加到 在100毫升圓底燒瓶中的20毫升0. 05M的Ln( III )硝酸鹽水溶液(pH =5.5)中。在將NH40H添加到Ln ( III )硝酸鹽溶液中時(shí)獲得沒(méi)有任 何特殊形態(tài)的膠體沉淀物。反應(yīng)前后溶液的pH值分別為9. 4和7. 5。 用60%的儀器功率(開(kāi)/關(guān)輻射周期比為3/2)照射樣品1至60分鐘 以控制反應(yīng)和降低溶劑過(guò)熱的風(fēng)險(xiǎn)。如別處描述的那樣(Matsumura Inoue爭(zhēng)乂， C力e瓜， 2443 (1994)),微波回流裝置是輸出功 率為2.45GHz的改良的家用樣么波爐(GOLD STARR 1000 W， LA Electronics, Inc., Huntsville, AL)。在反應(yīng)后的處理中，收集 所得產(chǎn)物，以15000rpm離心，用蒸餾水洗滌數(shù)次，隨后在室溫下在 真空下干燥整夜。對(duì)于所有鑭系元素氫氧化物納米粒子，制成產(chǎn)物的 收率超過(guò)95%。進(jìn)行上述試驗(yàn)數(shù)次，并表現(xiàn)出良好的再現(xiàn)性。實(shí)施例3 實(shí)4企程序
進(jìn)行下列細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)微分干涉差(DIC)顯微術(shù)、共焦顯微 術(shù)、活性氧(ROS)檢測(cè)、tunnel化驗(yàn)法(細(xì)胞凋亡)、焚光光譜學(xué)、 透射光譜學(xué)和錐蟲(chóng)藍(lán)拒染試驗(yàn)。
將人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)細(xì)胞在六孔板中在EBM完全培養(yǎng)基中 在37。C和5。/。C02下以105個(gè)細(xì)胞/2毫升培養(yǎng)大約24小時(shí)。為了研究細(xì) 胞定位，將細(xì)胞接種在玻璃蓋玻片上并在六孔板中生長(zhǎng)至90%匯合， 然后用Eu"、0H)3納米棒以20-100微克/毫升的濃度范圍培養(yǎng)。在培 養(yǎng)24小時(shí)后，將蓋玻片用磷酸鹽緩沖鹽水充分漂洗，并將細(xì)胞用新 制成的在PBS中的4%低聚甲醛在室溫下固定15分鐘，然后用PBS再 水合。 一旦所有細(xì)胞固定，將帶有細(xì)胞的蓋玻片用Fluor Save封片 劑封片到載玻片上并使用DIC和共焦顯微術(shù)檢查。為了研究活性氧
(ROS )的形成，根據(jù)制造商的指示使用Image-iT LIVE Green Reactive Oxygen Species 4企觀'H式劑盒(Cat. No. #136007; Molecular Probes, USA)，處理過(guò)和未處理的細(xì)胞最終用Fluor Save封片劑封 片到載玻片上，并使用共焦顯微術(shù)檢查。對(duì)于tunnel化驗(yàn)，用含DAPI
(4'-6-二脒基-2-苯基吲哚)的封片劑將細(xì)胞固定到載玻片上，并使 用共焦顯微術(shù)根據(jù)制造商的指示檢查(Roche, Cat. No. # 12 156 792 910)。
在另一組中，將HUVEC細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/ 2毫升)在六孔板中培 養(yǎng)并在無(wú)蓋玻片的情況下在EBM完全培養(yǎng)基中用Eu"、0H)3或 Tbm(0H)3納米棒處理。在用納米棒培養(yǎng)24小時(shí)后，將細(xì)胞用PBS洗 滌，胰蛋白酶化，并中和。將該細(xì)胞通過(guò)離心洗滌，再懸浮在PBS中， 并使用熒光光譜學(xué)和TEM檢查。通過(guò)用錐蟲(chóng)藍(lán)染色，檢測(cè)另一組細(xì)胞 的細(xì)胞存活力，并使用血球計(jì)計(jì)數(shù)細(xì)胞。
i耽遞存活力^勿i^增遂試-發(fā),'如別處所述(Basu等人，y^^#ei/., 7: 569 ( 2001 ))使用[3H]胸腺嘧咬并入化驗(yàn)法進(jìn)行在增殖抑制方面對(duì) 正常內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的體外毒性分析。簡(jiǎn)言之，將內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC; 2 xlO"接種在24孔板中，在EBM中培養(yǎng)1天，血清饑餓(0. 1%血清) 24小時(shí)，然后用不同濃度(0、 20、 50或100微克/毫升)的Eu'"(OH)3 (圖15) 、 Smm(0H)3 (圖17)或Tbm(0H)3 (圖18 )處理。HUVEC也 用不同濃度(0、 10、 20和50微克/毫升)的N(^"(0H)3處理(圖16 )。在24小時(shí)后，在每孔中加入l^Ci [力]胸腺嘧啶。4小時(shí)后，將細(xì)胞 用冷PBS洗滌，用100%冷曱醇固定，并收集以測(cè)量三氯乙酸-可沉淀 放射性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
勿^敏源亡必-發(fā)法.'為了進(jìn)行tunnel細(xì)胞凋亡化驗(yàn)法，將細(xì)胞以 每孔105個(gè)細(xì)胞/2毫升培養(yǎng)基的密度接種到6孔板中，并在蓋玻片上 生長(zhǎng)整夜。將細(xì)胞用不同濃度的Eum(0H)3納米棒培養(yǎng)，用含DAPI
(4'-6-二脒基-2-苯基吲哚)的Fluor Save封片劑封片到載玻片上， 并使用共焦顯微術(shù)根據(jù)制造商的指示(Roche， USA， Cat. No. # 12 156 792 910 )檢查。使用顯微鏡目測(cè)紅色凋亡細(xì)胞，計(jì)數(shù)(每樣品6個(gè) 視場(chǎng))，并使用數(shù)字焚光照相機(jī)照相。
勿/^y^湊z根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行細(xì)胞周期分析。在用碘化丙啶
(PI)將細(xì)胞染色后測(cè)量DNA含量。在EuH'(0H)3納米棒處理后，將 HUVEC細(xì)胞在PBS ( 3X)中洗滌并在95%乙醇中固定1小時(shí)。使細(xì)月包再 水合，在PBS中洗滌，并用RNaseA ( 1毫克/毫升)處理，然后用PI
(100微克/毫升)染色。用對(duì)照細(xì)胞(無(wú)Eu"'(0H)3納米棒)進(jìn)行類(lèi) 4以實(shí)馬t。通過(guò)FACScan ( Becton—Dickinson )進(jìn)4亍DNA的;危式血纟田月包 計(jì)數(shù)量化，并使用Modfit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
^襲^活^f ^浚錄碌^^的f ^,伊遂,將收取的HUVEC細(xì)胞 用冷PBS洗滌兩次，并用含新加入的0. 01%蛋白酶抑制劑混合物
(Sigma)的水冷放射免疫沉淀(RIPA)緩沖劑溶解。在冰上培養(yǎng)10 分鐘后，將細(xì)胞在4。C下以13， 000 rpm離心10分鐘。在使用光度測(cè) 定法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度后，將20微克蛋白質(zhì)在還原條件下在10%
(Tris-HCl)制備聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并通過(guò)濕印跡法轉(zhuǎn)移到硝 基纖維素膜上。將膜切成條，在tris-緩沖鹽水中的5%奶粉中阻斷1 小時(shí)，用單克隆鼠IgG (Cat. No# OP72-100UG )培養(yǎng)整夜以測(cè)定總絲 裂原活化蛋白激酶，或用抗-磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(兔多克隆 IgG, Cat. No. # 07-467 )抗體培養(yǎng)，然后用HRP-結(jié)合的二抗(抗鼠 IgG或抗兔IgG-HRP ( Cat. # Sc-2301 ))在37°C下培養(yǎng)40分鐘。使 用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行檢測(cè)。
必-發(fā)法,如別處所述(Vlahakis等人，/A'oA C力e瓜， 282 (20): 15187-15196 ( 2007 ))，將雞蛋保持在潮濕的39。C培育器
(Lyon Electric, CA )中。將含0. 5%曱基纖維素+重組人VEGF-A ( 50ng)或bFGF (150 ng )的丸粒放在10天大小雞的無(wú)病原體的晶胚的 CAM' s上(SPAFAS; Char les Ri ver Laborator ies, Wi lmington, MA )。 通過(guò)在蛋殼上切割小窗，暴露出CAM' s以利于丸粒施加。在用VEGF 多肽刺激后24小時(shí)，將相關(guān)抗體或激動(dòng)劑/拮抗劑化合物施加到該位 置。在一些情況下，使用微注射器施加氫氧化銪納米棒在Tris-EDTA 緩沖劑中的懸浮液。在固定和切除后13天或用實(shí)時(shí)活體成像，用連 接到Zeiss立體顯微鏡上的數(shù)碼照相機(jī)(Canon Supershot6 )將CAMs 成像。通過(guò)從三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的最少10個(gè)試樣計(jì)數(shù)由三級(jí)血管生成的 分支點(diǎn)來(lái)量化血管生成。
實(shí)施例4 表征技術(shù)
采用下列技術(shù)表征Eu"' (OH) 3納米棒。
f #4'/^^ n^ 乂 .'通過(guò)使用Bruker AXS D8 Advance粉末X 射線(xiàn)衍射儀(使用CuKaX =1.5418 A射線(xiàn))的X射線(xiàn)衍射(XRD)分 析測(cè)定合成后未經(jīng)處理的樣品的結(jié)構(gòu)和相純度。
趟席重JYrC和i^M5^吝:f";^ ("/^C為、^f.'使用METTLER TOLEDO TGA/STDA 851在氮?dú)饬飨乱?0°C/分鐘的加熱速率從30。C至700。C進(jìn) 行合成后未經(jīng)處理的樣品的TGA。在巻邊鋁坩堝中使用氮?dú)饬?20毫 升/分鐘)以4。C/分鐘的加熱速率從3(TC至600。C在METTLER TOLEDO TC15上進(jìn)行合成后未經(jīng)處理的樣品的DSC分析。
遽#冶子^4雙術(shù)'("7^#>>^1^; 在以80KV運(yùn)行的FEI Technai 12 上用TEM檢查粒子形態(tài)(樣品的微觀結(jié)構(gòu))。為了使用TEM觀察粒子 在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室內(nèi)的內(nèi)化，遵循別處所述的程序(McDowell和 Trump, ^rc力，戶(hù)"力，#ed ， 1 00: 405 ( 1976)和Spurr， /, b. ， 26:31 ( 1969 ))。
在配有氙燈作為單色儀激發(fā)源的Fluorolog-3熒光分 光光度計(jì)(HORIBA J0BINYV0N， Longjumeau， France)上記錄激發(fā)和 發(fā)射(熒光)光諳。
在細(xì)胞固定在蓋玻片上后，將細(xì)胞 用Fluor Save封片劑封片到載玻片上并檢查DIC。通過(guò)使用AXIOVERT 135 TV顯微鏡的AXIOCAM高分辨率數(shù)碼照相機(jī)(ZEISS, Germany)獲 取相片。
^i/〃(^^入^^煮炎^_^微j、 77//7e/ /A-發(fā)法和t ^SV使用帶有C-Apochromat 63 X/ NA 1.2水浸透鏡的LSM 510共焦激光掃描顯微 鏡(Carl Zeiss, Inc., Oberkochcn, Germany )連同氬離子激光器 (488納米激發(fā))收集二維共焦熒光顯微圖像。通過(guò)515納米長(zhǎng)波通 截止濾光片收集Eum(0H)3納米棒、未處理的細(xì)胞和用EuH',3納米 棒處理過(guò)的細(xì)胞的焚光發(fā)射。
對(duì)于tunnel化驗(yàn)，在將細(xì)胞用DAPI封片到載玻片上后，使用帶 有C-Apochromat 63 X/ 1. 2na水浸透鏡的LSM 510共焦激光掃描顯 微鏡(Carl Zeiss, Inc., Oberkochcn, Germany)收集圖像。對(duì)于 DAPI染色的藍(lán)色細(xì)胞核，通過(guò)385-470納米帶通濾波器連同364納米 的氬離子激光激發(fā)收集熒光發(fā)射。對(duì)于TMR紅染色的凋亡細(xì)胞核，通 過(guò)560-615納米帶通濾波器連同543納米的HeNel離子激光激發(fā)收集 熒光發(fā)射。
對(duì)于R0S,使用帶有C-Apochromat 63 X/l. 2na水浸透鏡的LSM 510 共焦〗敫光掃描顯孩"竟(Carl Zeiss, Inc., Oberkochcn, Germany) 收集圖像。通過(guò)505-550納米帶通濾波器連同488納米氬離子激光激 發(fā)收集綠色熒光(羧基-H2DCFDA的氧化產(chǎn)物)發(fā)射。通過(guò)385-470納 米帶通濾波器連同364納米的氬離子激光激發(fā)收集Hoechst 33342染 色的藍(lán)色細(xì)胞核的藍(lán)色熒光發(fā)射。
實(shí)施例5 -無(wú)機(jī)熒光納米棒及其促血管生長(zhǎng)性質(zhì) /-射錄^f射^f^::遽dX-射線(xiàn)衍射(XRD)分析法確認(rèn)合成后未 經(jīng)處理的材料的晶體結(jié)構(gòu)(圖1A-E)。圖1中的曲線(xiàn)a-、 b-、 c-、 d-和e-分別指示了通過(guò)硝酸銪(III)與氫氧化銨在作為溶劑的水中的 相互作用，在MW照射5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘 后獲得的合成后未經(jīng)處理的氫氧化銪Eu'"(0H)3的形成的XRD圖譜。 在不同時(shí)間合成的合成后未經(jīng)處理的材料的XRD圖謙表明，產(chǎn)物是結(jié) 晶的。所有反射可以清楚指派給Eum(0H)3材料的純六方相。對(duì)于所 有反射，衍射峰與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)文件(JCPDS卡號(hào)No. 01-083-2305 ) —致。 類(lèi)似地，通過(guò)X-射線(xiàn)衍射(XRD)分析微波輔助的、合成后未經(jīng)處理 的產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)(在60分鐘微波照射后)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖2 )表 明，該鑭系元素氫氧化物產(chǎn)物Ndm(0H)3 (曲線(xiàn)-a) 、 Sm'"(0H)3(曲 線(xiàn)-b) 、 Gdm(0H)3 (曲線(xiàn)-c)和Tbm(0H)3 (曲線(xiàn)-d)是結(jié)晶的。
希ZVG為了測(cè)定微波輔助的、合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物(60
14分鐘微波照射時(shí)間)的化學(xué)性質(zhì)(氫氧化銪或氧化銪)，進(jìn)行TGA和
DSC。獲得合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物的代表性TGA-DSC圖(圖3A-B)。合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物的TGA圖譜(圖3A)表現(xiàn)出在30。C至600。C之間分三步發(fā)生的三次明顯的重量損失，總重量損失為16.1%。該DSC圖譜也表現(xiàn)出在相同溫度范圍內(nèi)的三個(gè)階段的三個(gè)明顯的吸熱峰。DSC曲線(xiàn)(圖3A)中的在30。C至200。C溫度范圍內(nèi)的第一個(gè)寬吸熱峰與物理吸附在合成后未經(jīng)處理的材料表面上的2.4重量°/。殘留水的釋放相關(guān)，TGA中的第二次8. 87重量％重量損失(與8. 9%的理論重量損失相比)在大約200。C開(kāi)始并在38(TC終止，并在相同溫度區(qū)域內(nèi)觀察到在333。C下具有尖銳峰的相應(yīng)的界限分明的吸熱峰(圖3B)。這種第二次重量損失可以歸因于在六方Eu(0H)3脫水時(shí)Eu(0H)3向EuO(OH)的轉(zhuǎn)化(公式-i ) 。 TGA中4. 8重量％ (與4. 9%的理論重量損失相比)的第三次重量損失在大約380。C開(kāi)始并在600。C終止，并在相同溫度區(qū)域內(nèi)觀察到在444 。C下具有尖銳峰的相應(yīng)的界限分明的吸熱峰(圖3B)。這種第三次重量損失可以歸因于EuO(OH)分解成Eu203(公式-ii)。這些第二和第三步可以如下示意性表示
2Eu(OH)3 2Eu00H + 2H20fEE ..(i)
2EuOOH Eu203 + H20 t白..(ii)
對(duì)于在微波加熱5分鐘、IO分鐘、20分鐘和40分鐘后獲得的其它合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物，也觀察到類(lèi)似性能。XRD、 DSC和TGA的結(jié)果的結(jié)合表明合成后未經(jīng)處理的材料是氬氧化銪(III) [Eu(0H)3]。
類(lèi)似地，其它鑭系元素氫氧化物產(chǎn)物(在60分鐘微波照射后)的熱解重量分析顯示在圖4A-D中。這些結(jié)果表明，該產(chǎn)物是Nd111 (OH) 3(圖4A ) 、 Smm (OH) 3 (圖4AB ) 、 Gd111 (OH) 3 (圖4C )和Tbni (OH) 3 (圖4D)。
韻^捧^邊射鬯子^M凝^:,通過(guò)TEM表征在微波加熱不同時(shí)間后獲得的合成后未經(jīng)處理的氫氧化銪(III) [Eu(0H)3]材料的形態(tài)(圖5A-F)。圖5A、 5B、 5C、 5D和5E分別含有在5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘微波加熱后獲得的合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物的圖像。圖5F是圖5E的高放大圖。合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物的TEM圖像表明，Eu"、0H)3材料(圖5A-F)完全由直徑為35至50納米且長(zhǎng)度為200至300納米的納米纟奉構(gòu)成。
通過(guò)TEM表征在微波加熱不同時(shí)間后獲得的合成后未經(jīng)處理的氫氧化Nd(III) [Nd川(0H)3]材料的形態(tài)(圖6A-F)。圖6A、 6B、 6C、 6D、6E和6F分別含有在1分鐘、5分鐘、IO分鐘、2G分鐘、40分鐘和60分鐘微波加熱后獲得的合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物的圖像。合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物的TEM圖像表明，Nd'u(0H)3材料(圖6A-F)由直徑為35至50納米且長(zhǎng)度為200至300納米的納米棒構(gòu)成。
通過(guò)T E M表征在微波加熱不同時(shí)間后獲得的合成后未經(jīng)處理的氫氧化Sm(III) [Smm(OH)3]材料的形態(tài)(圖7A-F )。圖7A、 7B、 7C、 7D、7E和7F分別含有在1分鐘、5分鐘、1Q分鐘、2Q分鐘、40分鐘和60分鐘微波加熱后獲得的合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物的圖像。合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物的TEM圖像表明，Sm"'(OH)3材料(圖7A-F )由直徑為35至50納米且長(zhǎng)度為200至300納米的納米棒構(gòu)成。
通過(guò)TEM表征在微波加熱60分鐘后獲得的合成后未經(jīng)處理的氫氧化Gd(III) [Gd'"(OH)3]和氫氧化Tb(III) [Tb'"(OH)3]材料的形態(tài)(圖8A-B )。圖8A和8B分別含有在微波加熱60分鐘后獲得的合成后未經(jīng)處理的氬氧化Gd(III)和氬氧化Tb(III)納米材料的圖像。合成后未經(jīng)處理的產(chǎn)物的TEM圖像表明，Gdm(OH)3(圖8A)和Tbm(OH)3材料(圖8B)由納米粒子與少數(shù)納米棒的混合物構(gòu)成。
處^^謬夢(mèng),EuH'(OH)3納米棒中EZ離子的激發(fā)和發(fā)射光i普來(lái)自4f層內(nèi)的電子躍遷。氬氧化銪的熒光發(fā)射和激發(fā)光鐠顯示在9A-B中。在616納米的發(fā)射波長(zhǎng)后，在394納米(主要)、415納米(次要)、464納米和525納米(次要)下觀察激發(fā)光譜(圖9A )。在任何上述波長(zhǎng)下的激發(fā)后，在592納米、616納米、690納米和697納米中觀察Eu(0H)3的主要發(fā)射光語(yǔ)(圖9B)。發(fā)射光語(yǔ)(圖9B)由E^+發(fā)射譜線(xiàn)的5D。-7F』(J = 1， 2， 3， 4) manifold構(gòu)成，允許50。-、躍遷(588納米)的磁偶極子是最主要的發(fā)射諳線(xiàn)。
為了確定這些Eu'"(0H)3納米棒的熒光活性是否甚至在細(xì)胞內(nèi)也保持不變，在用PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)充分洗滌后在Fluorolog-3分光熒光計(jì)上記錄用各種濃度(5-100微克/毫升)的這些納米棒培養(yǎng)24小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)射(熒光)光鐠。圖10的曲線(xiàn)a-、 b-、 c-、
16d-和e-表明用Eu"'(0H)3納米棒分別在5微克/毫升(曲線(xiàn)-a) 、 10微克/毫升(曲線(xiàn)-b) 、 20微克/毫升(曲線(xiàn)-c) 、 20微克/毫升(曲線(xiàn)-d)和100微克/毫升(曲線(xiàn)-e)濃度下處理的內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)射光譜。在所有情況下觀察到焚光發(fā)射。由于這些納米棒在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出它們明顯的熒光性質(zhì)，間接證實(shí)，這些納米棒在細(xì)胞內(nèi)(這通過(guò)TEM直接證實(shí))。
使用許多方法，如微分干涉差(DIC)顯微術(shù)、共焦顯微術(shù)和透射電子顯微術(shù)(TEM)測(cè)定納米棒的細(xì)胞軌道。
"/C;微分干涉差(DIC)顯微圖(圖11A-D)表明對(duì)照細(xì)胞(圖11A)與用各種濃度的Eum(OH)3納米棒處理過(guò)的細(xì)胞(圖11B-D)之間顯著的對(duì)比差。這些結(jié)果間接證實(shí)Eu"'(0H)3納米棒可以進(jìn)入細(xì)胞。
^,橫j凝^:;載有無(wú)機(jī)焚光EuH'(0H)3納米棒的HUVEC的熒光性質(zhì)和通過(guò)共焦顯微術(shù)檢測(cè)的其相應(yīng)相位圖像分別顯示在圖12A-C的第一和第二列中。對(duì)照細(xì)胞(第一行，圖12A)和用Eu"'(0H)3納米^f奉以20微克/毫升(第一行，圖12B)和50微克/毫升(第一行，圖12C)濃度處理過(guò)的細(xì)胞的熒光(第一列)及其相應(yīng)相位圖像(第二列)分別顯示在圖12A-C中。Eu"'(0H)3納米棒在394納米、415納米、464納米和525納米波長(zhǎng)下具有有效激發(fā)，在394納米下具有最大強(qiáng)度。Eu'"(0H)3納米棒在任何上述波長(zhǎng)(它們與共焦顯微鏡中可得的激光激發(fā)波長(zhǎng)不匹配)下的激發(fā)分別在592納米、616納米、649納米、690納米和697納米下產(chǎn)生發(fā)射峰。在此研究中，使用帶有C-Apochromat63 X/ NA 1.2水浸透鏡的Zeiss LSM 510共焦激光掃描顯微鏡，連同氬離子激光器(488納米激發(fā))收集細(xì)胞的共焦焚光顯微圖像和相位圖像。使用100X顯微鏡目鏡收集熒光發(fā)射，然后使用515納米長(zhǎng)波通截止濾光片進(jìn)行光鐠過(guò)濾。通過(guò)共焦激光掃描顯微術(shù)(在人=488納米下激發(fā))的分析表明，在用納米棒處理過(guò)的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室中，由Eum(0H)3納米棒內(nèi)存在Eu3+離子引起的鮮綠色熒光的存在(圖12B-C)分散。圖12A中的對(duì)照HUVEC細(xì)胞(無(wú)任何納米棒)表明由于自體熒光，細(xì)胞內(nèi)幾乎沒(méi)有綠色熒光?？傮w而言，在對(duì)照細(xì)胞和用這些納米棒處理過(guò)的細(xì)胞之間存在顯著的熒光差異。這些結(jié)果證實(shí)，Eu"'(0H)3納米^奉在HUVEC細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化。因此，這些納米棒可用在用于藥物檢測(cè)和定位的成像中。
17勿/想力^韻^/4W 7^#iv Eum(0H)3納米棒在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)部分內(nèi)部?jī)?nèi)化的直接證據(jù)是用各種濃度的這些納米棒處理過(guò)的細(xì)胞的TEM圖像。圖13A-C含有用20微克/毫升Eum(0H)3納米棒處理過(guò)的HUVEC
(在橫切后)在不同放大率下的TEM圖像。區(qū)域B和C中所示的圖像是區(qū)域A中所示圖像的更高放大圖。圖13D-F含有用50微克/毫升Eum(0H)3納米棒處理過(guò)的HUVEC (在橫切后)在不同放大率下的TEM圖像。區(qū)域E和F中所示的圖像是區(qū)域D中所示圖像的更高放大圖。在HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室內(nèi)觀察這些納米棒。細(xì)胞形態(tài)清楚證明，細(xì)胞在這些材料內(nèi)化后是健康的(圖13)。這些細(xì)胞表現(xiàn)出球形形態(tài)
(圖13A和13D),因?yàn)樵摷?xì)胞在TEM之前被胰蛋白酶化，用TNS中和，并在Trumps溶液中固定(McDowel 1和Trump，力/c力.^a6.100: 405 ( 1976 )，和Spurr， /. "/"a",〃"，， 26:31
(1969 ))。圖13A和13D也表明這些納米棒在多數(shù)細(xì)胞中吸收。用熒光納米棒培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和這些納米棒隨后內(nèi)化到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室中改變了納米棒的形態(tài)。這可能是由于早期和晚期核內(nèi)體的極低pH值(3, 5 )。
圖14A-D含有用Tbm (OH) 3納米棒處理過(guò)的HUVEC (在橫切后)在不同放大率下的T訓(xùn)圖像。在HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室內(nèi)觀察納米棒。細(xì)胞形態(tài)證明，細(xì)胞在這些材料內(nèi)化后是健康的(圖14)。區(qū)域B、C和D中所示的圖像是區(qū)域A中所示圖像的更高放大圖。
總之，來(lái)自熒光光譜學(xué)、DIC、共焦顯微術(shù)和TEM的結(jié)果表明這些熒光納米棒可以在細(xì)胞體系中內(nèi)化，并容易通過(guò)顯微術(shù)直觀化。這
針。' " 口 '、"
勿/^^f遂;^存;-力試,,在使用無(wú)機(jī)納米棒作為進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)內(nèi)的熒光標(biāo)簽之前，在用Eum(0H)3納米棒以從20-100微克/毫升的不同濃度處理并培養(yǎng)1-2天后測(cè)試HUVEC的存活力以觀察細(xì)胞凋亡。如通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)拒染化驗(yàn)法評(píng)估的那樣，在對(duì)照細(xì)胞(無(wú)處理)和用這些納米棒處理的細(xì)胞之間沒(méi)有細(xì)胞死亡差異。這些結(jié)果表明，這些納米棒與細(xì)胞生物相容，因?yàn)樗鼈冊(cè)?4-48小時(shí)內(nèi)不影響細(xì)胞存活力。
使用[3H]胸腺嘧啶并入化驗(yàn)法(Kang等人，/.力瓜,
1813: 806-816 ( 2002 ))在增殖抑制方面檢查EuIII (OH) 3納米棒對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的體外毒性。這些納米棒對(duì)HUVEC無(wú)毒(圖15)。有跡象表明，與某些納米材料的接觸可能造成不利的生物效應(yīng)，這似乎取決于材料的化學(xué)和物理性質(zhì)(Gao等人，^ //7. WWec/ /^/.,16:63 ( 2005 )和Derfus等人，^"o. Ze〃. ， 4:11 ( 2004 ))。伴力#'^是決定熒光探針是否被管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人臨床應(yīng)用的因素。來(lái)自使用HUVEC的三氯乙酸可沉淀放射性的胸腺嘧啶并入化驗(yàn)法
(Basu等人，7K^^么，7: 569 ( 2001 ))的結(jié)果(圖15 )清楚表明，這些納米棒以劑量依賴(lài)方式(20-100微克/毫升)誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在50微克/毫升濃度下觀察到最大增殖，且這些納米棒在高濃度
(100微克/毫升)下略微毒性。當(dāng)HUVEC細(xì)胞用硝酸銪(""溶液(在TF緩沖劑中50微克/毫升)處理時(shí)，沒(méi)有觀察到增殖。實(shí)際上，該溶液被觀察到對(duì)細(xì)胞略微毒性。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。這些結(jié)果證明，Eu111 (0H) 3納米棒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)毒并具有誘發(fā)細(xì)胞增殖的 一 些特殊性質(zhì)。
NdH'(0H)3納米棒也被觀察到對(duì)HUVEC無(wú)毒(圖16)。來(lái)自使用HUVEC進(jìn)行的胸腺嘧咬并入化驗(yàn)法的結(jié)果(圖16)表明該納米棒(10-50微克/毫升)不以劑量依賴(lài)方式誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的顯著增殖。
Smm(0H)3納米棒也被觀察到對(duì)HUVEC無(wú)毒(圖17)。來(lái)自使用HUVEC進(jìn)行的胸腺嘧。定并入化驗(yàn)法的結(jié)果(圖17)表明該納米棒
(20-100微克/毫升)不以劑量依賴(lài)方式誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的顯著增殖。
Tb"'(0H)3納米棒也被觀察到對(duì)HUVEC無(wú)毒(圖18)。來(lái)自使用HUVEC進(jìn)行的胸腺嘧啶并入化驗(yàn)法的結(jié)果(圖18)表明這些納米棒不以劑量依賴(lài)方式(20-100微克/毫升)誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的顯著增殖。將Tb'"(0H)3納米棒與濃度20微克/毫升的硝酸鋱進(jìn)行比較。
勿/敏源亡z根據(jù)tunnel基細(xì)胞凋亡化驗(yàn)法，紅色細(xì)胞核是tunnel陽(yáng)性的(圖19A-C)。它們用DAPI雙重染色以清楚顯示細(xì)胞核。作為正對(duì)照，將細(xì)胞用2.5 mM喜樹(shù)石成處理4小時(shí)。100%紅色染色細(xì)胞核可見(jiàn)(圖19A)。對(duì)照未處理的細(xì)胞(圖19D-F)與用50微克/毫升
(圖19G-1 )或100微克/毫升(圖19J-L)的氫氧化銪納米棒處理過(guò)的細(xì)胞之間紅色染色細(xì)胞核的數(shù)量沒(méi)有差別(0%)。與對(duì)照未處理的細(xì)胞相比，在納米棒處理過(guò)(以100微克/毫升；圖19J-K)的細(xì)胞中，大約10%的紅色染色的細(xì)胞可見(jiàn)。這些結(jié)果證明，高達(dá)50微克/毫升濃度的納米棒處理沒(méi)有誘發(fā)HUVEC中的細(xì)胞凋亡。
另一團(tuán)體(Kirchner等人，Ze〃. ， 5: 331 ( 2005 ))表明，穩(wěn)定納米材料的細(xì)胞毒性主要?dú)w因于Cd元素的聚集而非釋放。但是，本文提供的研究使用與鎘基材料完全不同材料的納米棒。因此Eum(0H)3納米棒的作用模式很可能不同于Cd基材料，這正是觀察到的情況。
勿應(yīng)^歡,為了研究在Eu"'(0H)3納米棒存在下的HUVEC細(xì)胞增殖機(jī)制，進(jìn)行細(xì)胞周期分析(圖20)。真核細(xì)胞中的細(xì)胞周期大致分成四個(gè)階段，復(fù)制用染色體的Gl-生長(zhǎng)和制備；DNA和中心體的S-合成；用于有絲分裂的G2-制備；和M-有絲分裂，細(xì)胞分成兩個(gè)子細(xì)胞，各自具有一組完整的染色體。因此，HUVEC細(xì)胞的增殖應(yīng)該反映在細(xì)胞周期中。在S-期中預(yù)計(jì)有較高的數(shù)量，并在Gl-期中預(yù)計(jì)有較低的數(shù)量(BhaUacharya等人，,^5^5/ ， /義1692-1694 ( 2005 ))。在HUVEC細(xì)胞中使用PI染色的細(xì)胞周期分析表明S-期中細(xì)胞百分比的增加和在50微克/毫升Eum(0H)3納米棒濃度下與對(duì)照細(xì)胞(無(wú)處理；圖20)相比的顯著增加。相反，在100微克/毫升Eum(0H)3納米棒濃度下S-期中細(xì)胞百分比降低。這些細(xì)胞周期結(jié)果確證了由增殖化驗(yàn)法獲得的結(jié)果。
^襲^法/Af ^浚癉碌^^,為了進(jìn)一步證實(shí)由細(xì)胞增殖化驗(yàn)法和細(xì)胞周期分析獲得的結(jié)果，進(jìn)行對(duì)照HUVEC細(xì)胞(未處理)和用50微克/毫升濃度的Eu"、0H)3納米棒處理不同時(shí)間(例如，5分鐘至24小時(shí))的HUVEC細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析。在正對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用10納克/毫升濃度的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)處理HUVEC細(xì)胞5分鐘(Bhattacharya等人，腸"e〃. ， 4 (12): 2479-2481 ( 2004 ))。
圖21A和21B含有來(lái)自用Eu"'(OH)3納米棒(50微克/毫升)處理不同時(shí)長(zhǎng)(區(qū)域A)或用不同濃度的Eum(0H)3納米棒(0、 20或50微克/毫升)處理24小時(shí)(區(qū)域B)的HUVEC細(xì)胞中的絲裂原活化蛋白激酶磷酸化的蛋白質(zhì)印跡分析的數(shù)據(jù)。Eu111 (OH) 3納米棒的處理以時(shí)間依賴(lài)性方式上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶磷酸化(圖21A)。在15分鐘和30分鐘發(fā)生最大絲裂原活化蛋白激酶磷酸化，這比VEGF處理的樣品更大上調(diào)。在30分鐘后，絲裂原活化蛋白激酶磷酸化隨時(shí)間下降。水平在24小時(shí)處恢復(fù)原狀，表明其雙相性質(zhì)。相反，隨著Eum(0H)3納米棒濃度提高(20-100微克/毫升)，絲裂原活化蛋白激酶磷酸化提高，在50微克/毫升時(shí)達(dá)到最大。絲裂原活化蛋白激酶磷酸化在100微克/毫升時(shí)降低。這些結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞增殖化驗(yàn)結(jié)果。因此，推斷出在用這些納米棒處理后HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞增殖可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶磷酸化途徑進(jìn)行。
^ 5V沒(méi)有綠色熒光(圖22A-C)，表明在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有ROS形成。對(duì)于ROS的正對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將HUVEC細(xì)胞用1 juM過(guò)氧化氫叔丁基(TBHP)誘導(dǎo)1小時(shí)(圖22D-F)。綠色熒光(圖22D-F)表明形成羧基-H2DCFDA的氧化產(chǎn)物，這表明細(xì)胞中ROS的減少。將細(xì)胞用Hoechst 33342雙重染色以清楚顯示細(xì)胞核為藍(lán)色。圖22G-1和圖22J-L分別表明在20和50微克/毫升濃度的Eum(0H)3納米棒存在下生成R0S。圖22的第三列(區(qū)域C、 F、 I和L)顯示第一列(綠色)和第二列(藍(lán)色)的匯合圖像。這些實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)皮細(xì)胞可能通過(guò)ROS介導(dǎo)的磷酸化絲裂原活化蛋白激酶途徑增殖。
f韻^在f^力謬,Afi4, . 為了測(cè)定體外研究結(jié)果的體內(nèi)相關(guān)性，進(jìn)行小雞CAM化驗(yàn)法以測(cè)量納米粒子誘導(dǎo)的血管生成。進(jìn)行僅用TE (tris-EDTA)緩沖液處理CAMs的對(duì)照實(shí)驗(yàn)(圖23A)。與納米粒子賦形劑處理的CAMs相比，1微克/毫升和10微克/毫升的Eu"'(0H)3納米棒誘發(fā)顯著的血管生成(圖23C-D)。這種血管生成響應(yīng)是用已知VEGF-A促血管生成刺激物觀察到的結(jié)果的大致一半(圖23B)。在更高納米粒子劑量(20微克/毫升)下，發(fā)現(xiàn)在CAM上形成斑塊，這阻礙了血管分支點(diǎn)的精確分析。在許多情況下，注意到遠(yuǎn)離該斑塊的血管生成。這些結(jié)果證明，Eu'"(0H)3納米棒可以發(fā)揮顯著的體內(nèi)血管生成作用，驗(yàn)證了體外研究結(jié)果。使用納米棒的血管生成化驗(yàn)法(CAM化驗(yàn))的量化數(shù)據(jù)也呈現(xiàn)為直方圖(圖23E)。
總之，通過(guò)簡(jiǎn)單、快速、清潔、有效、經(jīng)濟(jì)、無(wú)毒且生態(tài)友好的微波技術(shù)制備可用作無(wú)機(jī)焚光材料的氫氧化銪(III)納米棒。該氫氧化銪(III)納米棒即使在內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)內(nèi)部仍保持其熒光性質(zhì)。它們通過(guò)焚光光鐠學(xué)、微分干涉差顯微術(shù)(DIC)、共焦顯微術(shù)和透射電子顯微術(shù)(TEM)表征。作為生物學(xué)中的熒光標(biāo)簽，該納米棒具有超越傳統(tǒng)有機(jī)染料的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，通過(guò)。H]胸腺嘧。定并入化驗(yàn)法和細(xì)胞周期化驗(yàn)法觀察到，這些納米棒可以促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖。此外，使用成熟且廣泛用作檢查血管生成和抗血管生成的模型的
CAM化驗(yàn)法發(fā)現(xiàn)Eu(0H)3納米棒的促血管生成性質(zhì)。
本文中提供的氫氧化銪納米棒可以用作(a)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中穩(wěn) 定和明亮的熒光標(biāo)簽，(b)體內(nèi)系統(tǒng)中的促血管生成材料，和(c) 共輒到藥物分子上后用作藥物輸遞載體。此外，本文中提供的無(wú)毒氫 氧化銪納米棒可以用在人類(lèi)的心臟或四月支缺血性組織上。
實(shí)施例6
將18只棵鼠(雄性)隨機(jī)分成三組，每組6個(gè)動(dòng)物，通過(guò)IP給 藥途徑接受Q (用Tris-EDTA溶液注射的對(duì)照組)、在Tris-EDTA中 的20 ( 1毫克 千克—1 天—])或100微克(5毫克'千克_1 天—')氫 氧化銪[Eu"1 (OH) 3]納米棒1周。在用氫氧化銪納米棒常規(guī)注射的這周 內(nèi)，每天一次將小鼠稱(chēng)重并檢查任何負(fù)面作用或臨床體征。使用克他 命/曱苯噻。秦的混合物麻醉小鼠以利于操作。對(duì)于生物化學(xué)和血液學(xué) 毒性分析，在殺死小鼠時(shí)收集血液和血清。對(duì)照組的小鼠與相應(yīng)實(shí)驗(yàn) 組的小鼠同時(shí)殺死以與對(duì)照動(dòng)物相比評(píng)測(cè)氫氧化銪納米棒在這些小 鼠中的作用。在血液收集后使用二氧化碳吸入法殺死小鼠。血液學(xué)被 分析物包括無(wú)區(qū)分血紅蛋白的CBC、血細(xì)胞比容、紅血球、平均紅細(xì) 胞血紅蛋白濃度(MCV) 、 RBC分布寬度、白血球和血小板計(jì)數(shù)。血液 化學(xué)被分析物包括堿性磷酸鹽，S(ALP)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酸肝(CR)、膽紅素總-S ( TBLI ) 和血液尿素氮(BUN)。
在7日毒性研究中，在Tris-EDTA緩沖劑中的氫氧化銪納米棒(1 毫克 千克—1 天—'和5毫克'千克—1 .天-。的靜脈注射表現(xiàn)出正常血 液學(xué)(表1)和血板化學(xué)(表2)。這些結(jié)果表明，在上述劑量?jī)?nèi)， 氫氧化銪納米棒在體內(nèi)模型中表現(xiàn)為非毒性。
表1
在血液中用0(負(fù)對(duì)照，0. 1毫升TE緩沖劑)、1毫克.千克—.天 —1 ( 0. 1毫升)和5毫克 千克—1 .天_1 ( 0. 1毫升)懸浮在TE緩沖劑 中的氫氧化銪納米棒靜脈注射的小鼠的血液學(xué)，在7日取樣。每次測(cè) 量使用6個(gè)動(dòng)物，且所有值在正常范圍內(nèi)。
22試驗(yàn)名對(duì)照20微克在1GG微升100微克在100微
(IOO微升TE緩沖中(5毫克 千克升中(5毫克 千
劑)克—1 天—')
無(wú)區(qū)分血紅蛋白的CBC
(g/dL)9. 5 ± 3. 811. 9 ± 1. 311.5 ± 1.2
血細(xì)胞比容(W32 ± 4. 935. 3 ± 3. 834. 9 ± 3. 1
紅血球[xlO(12)/L]6. 3 ± 0. 97. 1 ± 0. 66. 7 ± 0. 8
MCV ( f L)50.5 ± 3.649.6 ± 2.651.9 ± 1.7
RBC分布寬度(W15.5 ± 1.216.2 ± 0.815.1 ± 0.4
白血球[xlO(9)/L]1.3 ± 0. 91. 0 ± 0. 40. 7 ± 0. 2
血小板計(jì)數(shù)[xlO(9)/L]599.6 ± 389.3480.7 ± 317.4476. 0 ± 376. 1
表2
在血液中用0(負(fù)對(duì)照，0. 1毫升TE緩沖劑)、1毫克.千克_1 '天 —(0. 1毫升)和5毫克 千克—1 .天—(0. 1毫升)懸浮在TE緩沖劑 中的氫氧化銪納米棒靜脈注射的小鼠的血清臨床化學(xué)，在7日取樣。 每次測(cè)量使用6個(gè)動(dòng)物，且所有值在正常范圍內(nèi)。
試驗(yàn)名對(duì)照2 0微克在1Q(M鼓升100微克在1Q0微
(100微升TE緩中(5毫克 千克升中(5毫克 千克
沖劑)-1 .天-')-',天—1)
堿性磷酸鹽，S ( U/L)143.2 ± 13.699. 3 ± 13. 791. 0 ± 4. 1
天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移
酶(U/L)140.5 ± 41.6184.0 ± 96.1209.7 ± 33.5
丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(U/L)32, 5 ± 6. 647.3 ± 12.739. 0 ± 5. 7
肌酸酐，P/S (mg/dL)0. 1 ± 0. 00. 1 ± 0. 00. 1 ± 0. 0
膽紅素總-S (mg/dL)0. 2 ± 0. 00. 1 ± 0. 00. 2 ± 0. 0
血液尿素氮(BUN)22.8 ± 2.422. 3 ± 0. 524. 3 ± 2. 4
其它實(shí)施方案
要理解的是，盡管已經(jīng)聯(lián)系其詳述描述了本發(fā)明，但前述描述旨在 例證而非限制由所附權(quán)利要求的范圍劃定的本發(fā)明的范圍。其它方面、 優(yōu)點(diǎn)和修改在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 制造鑭系元素氫氧化物納米粒子的方法，其中所述方法包括微波加熱鑭系元素硝酸鹽和氫氧化銨水溶液的混合物。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述鑭系元素是銪。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述納米粒子是氫氧化銪納米棒。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述氫氧化銪納米棒為10至500納 米長(zhǎng)。
5. 權(quán)利要求3的方法，其中所述氫氧化銪納米棒的直徑為1至 100納米。
6. 長(zhǎng)度為10至500納米且直徑為1至100納米的鑭系元素氫氧 化物納米粒子，其中所述納米棒促進(jìn)血管生成。
7. 權(quán)利要求6的鑭系元素氬氧化物納米粒子，其中所述鑭系元 素是銪。
8. 權(quán)利要求6的鑭系元素氫氧化物納米粒子，其中所述納米粒 子是氬氧化銪納米棒。
9. 促進(jìn)血管生成的方法，其中所述方法包括使細(xì)胞與鑭系元素 氳氧化物納米粒子接觸。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述鑭系元素是銪。
11. 權(quán)利要求9的方法，其中所述納米粒子是氫氧化銪納米棒。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述氬氧化銪納米棒為10至500 納米長(zhǎng)。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中所述氬氧化銪納米棒的直徑為1 至100納米。
全文摘要
本文提供了與稀土粒子如稀土納米棒(例如，無(wú)機(jī)鑭系元素氫氧化物納米棒)有關(guān)的方法和材料。例如，提供了稀土(例如，鑭系元素)粒子，如氫氧化銪納米棒、制造稀土粒子(例如，氫氧化銪納米棒)用的方法和材料、和使用稀土粒子(例如，氫氧化銪納米棒)作為成像劑和/或促進(jìn)血管生成用的方法和材料。
文檔編號(hào)B82B3/00GK101500938SQ200780030205
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2007年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月14日
發(fā)明者C·帕特拉, D·穆霍帕迪亞伊, N·E·弗拉哈基斯, P·穆赫爾吉, R·巴塔查亞 申請(qǐng)人:梅奧醫(yī)學(xué)教育和研究基金會(huì)