專利名稱：陽離子化當(dāng)歸多糖納米粒基因傳遞系統(tǒng)及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及當(dāng)歸多糖和涉及基因傳遞系統(tǒng)，具體涉及一種陽離子化當(dāng)歸多糖納米粒基因傳遞系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
基因治療已打開了其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景，可用于治療遺傳性疾病和后天性疾病如血友病、囊性纖維病、婦科疾病等[參見Jay Lozier. Gene therapy of the hemophilias. Seminars in Hematology, 2004, 41 (4) :287 296. Uta Griesenbach, A. Christopher Boyd. Pre—clinical and clinical endpoint assays for cystic fibrosis gene therapy. Journal of Cystic Fibrosis, 2005, 4 (2) :89^100. Memy H, Hassan, Essam E, Othman, Daniela Hornung, Ayman Al-Hendy. Gene therapy of benign gynecological diseases. Advanced Drug Delivery Reviews, 2009,61 (10)822^835.]?；蛑委熂夹g(shù)的關(guān)鍵在于能夠有效地將外源基因傳遞進(jìn)細(xì)胞核并使其高效的表達(dá)[參見I· Yudovin-Farberj A. J. Domb. Cationic polysaccharides for gene delivery. Materials Science and Engineering: C，2007，27 (3) :595 598·]。目前，基因傳遞技術(shù)被分為三大類電穿孔、顯微注射和載體介導(dǎo)的基因傳遞系統(tǒng)(gene delivery systems, GDS)[參見Patrick Wunderbaldingerj Alexei BogdanovJrj Ralph Weissleder. New approaches for imaging in gene therapy. European Journal of Radiology, 2000，34 (3) :156 165. Mari Dezawaj Masahiko Takanoj Hisanari Negishij Xiaofen Mo， Toshiyuki Oshitarij Hajime Sawada. Gene transfer into retinal ganglion cells by in vivo electroporation: a new approach. Micron, 2002， 33 (1) : 1 6· Yoichiroh Hosokawaj Seriya lguchi， Ryohel Yasukuni， Yuji Hirakij Chisa Shukunamij Hiroshi Masuhara. Gene delivery process in a single animal cell after femtosecond laser microinjection. Applied Surface Science, 2009, 255 (24) : 9880 9884.]，而后者已成為基因治療技術(shù)的研究熱點(diǎn)。常用的GDS包括病毒載體和非病毒載體兩大類，雖然前者表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率但其潛在的致瘤性、誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)、裝載容量有限、代價(jià)高等局限性制約了其在基因治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。而非病毒載體的安全、低毒、無免疫原性、特異性和裝載容量大等特點(diǎn)已受到該技術(shù)領(lǐng)域廣大研究者的青睞。常見的非病毒載體有陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體[參見=Maureen D. Brown, Andreas G. . Schatzleinj ljeoma F. Uchegbu. Gene delivery with synthetic (non viral) carriers. International Journal of Pharmaceutics, 2001, 229 (1 2) 廣21.]。目前人們研究較多的陽離子聚合物是聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI), 精胺修飾的復(fù)合物，和乙二胺及其衍生物交聯(lián)的復(fù)合物[參見St印hmie Werth, Beata Urban-Klein, Lige Daij Sabrina Hobelj Marius Grzelinskij Udo Bakowskyj Frank Czubaykoj Achim Aigner. A low molecular weight fraction of polyethylenimine(PEI) displays increased transfection efficiency of DNA and siRNA in fresh or lyophilized complexes. Journal of Controlled Release, 2006， 112 (2) : 257 270. Lane V. Christensenj Chien-Wen Chang, James W. Yockmanj Rafe Connersj Heidi Jackson, Zhiyuan Zhongj Jan Feijenj David A. Bull, Sung Wan Kim. Reducible poly(amido ethylenediamine) for hypoxia-inducible VEGF delivery. Journal of Controlled Release, 2007， 118 (2) : 254 261. Toshihiro Kushibikij Natsuki Nagata-Nakajima, Manabu Sugaij Akira Shimizuj Yasuhiko Tabata. Enhanced anti-fibrotic activity of ρlasmid DNA expressing small interference RNA for TGF- β type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release, 2006，110 (3) :610 617.]等。PEI 具有較為廣泛的分子量，從25KD 的大分子量支鏈PEI到400K的小分子量直鏈PEI都已成為眾多學(xué)術(shù)者研究的熱點(diǎn)[參見 Rui Deng, Yanan Yuej Fan Jinj Yangchao Chen, Hsiang-Fu Kungj Marie C. Μ. Linj Chi Wu. Revist the complexation of PEI and DNA - How to make low cytotoxic and highly efficient PEI gene transfection non-viral vectors with a controllable chain length and structure Journal of Controlled Release, 2009， 140 (1): 40 60. Stephanie Werthj Beata Urban-Klein, Lige Dai， Sabrina Hobelj Marius Grzelinskij Udo Bakowskyj Frank Czubaykoj Achim Aigner. A low molecular weight fraction of polyethylenimine (PEI) displays increased transfection efficiency of DNA and siRNA in fresh or lyophilized complexes. Journal of Controlled Release, 2006，112 (2) :257 270.]。通過化學(xué)修飾方法，使載體分子帶上正電荷，通過靜電作用與帶有負(fù)電荷的DNA質(zhì)粒絡(luò)合，形成穩(wěn)定的陽離子聚合物-質(zhì)粒復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用，將外源基因?qū)氚邢蚣?xì)胞核參與遺傳物質(zhì)的復(fù)制和表達(dá)。隨著基因傳遞技術(shù)的深入發(fā)展，陽離子多糖已逐漸成為非病毒載體基因傳遞系統(tǒng)的強(qiáng)有力競爭者。中藥多糖天然、無毒、生物相容、生物可降解以及其易于修飾，便于優(yōu)化理化性質(zhì)等特點(diǎn)為其在基因治療領(lǐng)域的發(fā)展提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[參見Igor A. Schepetkin, Mark Τ. Quinn. Botanical polysaccharides: Macrophage immunomodulation and therapeutic potential. International Immunopharmacology, 2006, 6 (3)
:317 333.]。當(dāng)歸多糖具有良好的藥用療效，其免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、 抗凝血等生物活性已受到醫(yī)藥界的廣泛重視和關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從傘形科植物當(dāng)歸(Angelica sinensis)的根中提取出水溶性多糖，經(jīng)分離純化，以及胺化修飾得到三種帶有正電荷的陽離子化當(dāng)歸多糖，通過靜電作用，使其與帶有負(fù)電荷的DNA質(zhì)粒絡(luò)合形成穩(wěn)定的納米粒復(fù)合物。電泳、電鏡、干細(xì)胞粘附性以及干細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，三種陽離子化當(dāng)歸多糖納米?；騻鬟f系統(tǒng)均能安全、有效的將外源基因傳遞入細(xì)胞核參與靶向細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制與表達(dá)，小分子PEI修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖效果最佳，具體工藝流程圖參加圖1。
本發(fā)明采用化學(xué)修飾的方法，提供了一種基于陽離子化當(dāng)歸多糖的安全、高效、便捷的新型基因傳遞系統(tǒng)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種陽離子化當(dāng)歸多糖納米粒基因傳遞系統(tǒng)，它是一種用胺類化合物修飾的當(dāng)歸多糖結(jié)合DNA質(zhì)粒的基因傳遞系統(tǒng)，當(dāng)歸多糖的分子量分布為3CT50KD和8(T100KD，其中按質(zhì)量比計(jì)，陽離子化當(dāng) 歸多糖DNA質(zhì)粒=廣200:1，陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的粒徑為21-77nm，所述的胺類化合物為精胺、乙二胺或數(shù)均分子量為600Da-2000Da的聚乙烯亞胺。一種制備陽離子化當(dāng)歸多糖納米粒基因傳遞系統(tǒng)的方法，它包括以下步驟 步驟1.陽離子化當(dāng)歸多糖的制備
A.聚乙烯亞胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖的制備
取0.廣Ig精制的當(dāng)歸多糖，溶于5 20ml磷酸鹽緩沖液(pH=7);將活化羥基的連接劑溶解于5ml 二氯甲烷中，所述的活化羥基的連接劑可以是N，N’ -羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N，N’- 二琥珀酰亞胺基硫酸酯中的任一種，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，首先在多糖液中加入催化劑三乙胺，再將活化羥基的連接劑的二氯甲烷溶液緩慢加入多糖溶液中，勻速攪拌，在2(Tl00min內(nèi)加完，加完之后，室溫反應(yīng)9(Tl50min，獲得活化的多糖溶液；將數(shù)均分子量為600Da-2000Da的聚乙烯亞胺(PEI)溶于l_20ml磷酸鹽緩沖液中，多糖與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為0. 5 4:1，加入催化劑三乙胺，在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫條件下緩慢加入到活化的多糖溶液中，在9(Tl50min內(nèi)加完，避光、室溫下反應(yīng)10h，整個(gè)反應(yīng)在勻速攪拌下進(jìn)行； 反應(yīng)完成之后的溶液經(jīng)透析(截取分子量>3500Da)、凍干之后，得到PEI修飾的當(dāng)歸多糖。B.精胺或乙二胺修飾的陽離子化的當(dāng)歸多糖的制備 (1)氧化當(dāng)歸多糖的制備
取0. 2 lg精制的當(dāng)歸多糖，溶解于2(Tl00ml雙蒸水中，加入KI04，KIO4與多糖中單糖單位的摩爾比為0. 5 5:1，迅速放到暗室，磁力攪拌，室溫反應(yīng)72h ；反應(yīng)液加入廣20ml乙二醇終止反應(yīng)，按前述條件繼續(xù)反應(yīng)30min ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)， 在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到氧化當(dāng)歸多糖0. Γ1. 5g。(2)精胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖的制備
稱取0. Γ0. 5g氧化當(dāng)歸多糖，溶解于l(T50ml雙蒸水中；稱取精胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)，精胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0. 5 5:1 ；將含有精胺的硼酸鹽溶液緩慢加入到當(dāng)歸多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)24h ； 然后，向反應(yīng)液中加入0. rig硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入 0. rig硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質(zhì)量與氧化多糖的質(zhì)量之比為0.5 4:1，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)24h ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到精胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖0. Γ0. Sg。(3)乙二胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖的制備
稱取0. Γ0. 5g氧化當(dāng)歸多糖，溶解于l(T30ml雙蒸水中；稱乙二胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)，乙二胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0. 5^5:1 ；將含有乙二胺的硼酸鹽溶液緩慢滴加入當(dāng)歸多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)24h ； 之后，向反應(yīng)液中加入0. Γ1. Og硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0. Γι. Og硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質(zhì)量與氧化多糖的質(zhì)量之比為0.5 4:1，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)24h ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到乙二胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖0. Γ0. 7g。步驟3.分別配制濃度為0.0廣10mg/ml的三種陽離子化當(dāng)歸多糖水溶液，取 1(Γ20μ 1陽離子當(dāng)歸多糖水溶液和1(Γ20μ 1含0. Γ2μδ DNA質(zhì)粒溶液，分別在55°C加 熱 3(T60min ；立即混合，渦旋l(T60s，即得到陽離子化當(dāng)歸多糖納米?；騻鬟f系統(tǒng)。有益效果
1.當(dāng)歸多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老和抗凝血等多種生物活性，與傳統(tǒng)的病毒載體和其他非病毒載體基因傳遞系統(tǒng)相比，其安全、無免疫原性、生物可降解，制備工藝簡單，經(jīng)濟(jì)、 簡便。2.電泳實(shí)驗(yàn)和干細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)說明，三種陽離子化當(dāng)歸多糖均有良好的DNA質(zhì)粒結(jié)合作用及基因傳遞表達(dá)作用。與糖鏈結(jié)合的伯、腫、叔胺基基團(tuán)所帶有的正電荷能夠有效地與帶有負(fù)電荷的DNA質(zhì)粒通過靜電作用結(jié)合，從而保護(hù)質(zhì)粒免受細(xì)胞內(nèi)外各種酶的降解。3.小分子PEI修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖具有最佳的干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，電泳、電鏡、 黏附性、轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)說明其對(duì)干細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖作用，并對(duì)DNA具有很好的包裹和釋放效果，適宜的粒徑分布易于被細(xì)胞吞噬，生物可降解，使外源基因更為有效的釋放和參與靶向細(xì)胞的蛋白表達(dá)，無免疫原性、安全、高效等多重優(yōu)勢(shì)，為陽離子化當(dāng)歸多糖基因傳遞系統(tǒng)開拓了廣泛的應(yīng)用前景。


圖1陽離子化當(dāng)歸多糖制備工藝流程圖。圖2陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA納米粒電泳圖。圖2A乙二胺-當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米粒電泳圖，其中
孔道 1 裸 pTGFi3-l ；
孔道2 8 乙二胺-當(dāng)歸多糖pTGFi3-l質(zhì)量比依次為2:1 ；5:1 ；10:1 ；30:1 ； 50:1 ； 70:1 ;100:1。圖2B PEI-當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米粒電泳圖，其中
孔道 Γ8 :PEI-當(dāng)歸多糖:pTGF^-l 質(zhì)量比依次為1:1 ；5:1 ；10:1 ；20:1 ；30:1 ； 50:1 ；70:1 ；100:1。圖2C精胺-當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米粒電泳圖，其中
孔道 1 裸 pTGFi3-l ；
孔道2 8 精胺-當(dāng)歸多糖pTGFi3-l質(zhì)量比依次為1:1 ;5:1 ；10:1 ；30:1 ；50:1 ； 70:1 ;100:1。圖3陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA納米粒的透射電鏡圖。圖4陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA納米粒的粒徑分布圖。圖5陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA納米粒轉(zhuǎn)染干細(xì)胞效果圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例所采用的材料和儀器
實(shí)驗(yàn)材料當(dāng)歸(干燥根，鎮(zhèn)江市芝林大藥房)；95%乙醇(山東廣源醫(yī)藥有限公司)；無水乙醇、丙酮、乙醚、乙二醇、三氯乙酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DEAE-52纖維素樹脂 (Whatman 公司，英國);S印hadexG-100 凝膠樹脂(Shanghai RiChu Bioscience 有限公司)； KIO4 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙二胺(Sigma-Aldrich，美國);精胺(Biosharp公司， 美國)；PEI (Sigma-Aldrich,美國)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(康為世紀(jì))；Rat TGF-β 1 ELISA Kit (煙臺(tái)賽爾斯生物技術(shù)有限公司)。實(shí)驗(yàn)器材磁力攪拌器(金壇大中儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph公司，德國)；透析袋(Biosharp公司，美國);超低溫高速離心機(jī)(Heareus，德國);CHRIST冷凍干燥干機(jī)(BMH 公司，德國)；H66025超聲清洗機(jī)(無錫超聲電子設(shè)備廠)；DY602S穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(南京新校園生物技術(shù)研究所)；JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子)。精制的當(dāng)歸多糖的制備
取當(dāng)歸干燥根，粉碎，水提醇沉(按如下工藝熱水浸提料液比1 :5 20，提取溫度 6(T9(TC，提取時(shí)間2飛h/次，提取次數(shù)2次。合并兩次提取液之后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原提取液體積的1/5-1/10，再將95%的乙醇加入到濃縮液中，至乙醇終濃度為65%-85%)，冷凍干燥，得當(dāng)歸粗多糖，三氯乙酸法去除蛋白，透析(截取分子量>3500Da)；依次使用DEAE-52 纖維素樹脂(洗脫液雙蒸水和0. 05、. 5mol/LNa0H)和S印hadexG-100葡聚糖凝膠樹脂(洗脫液0. Imol/LNaCI)對(duì)其進(jìn)行分離純化，分離產(chǎn)物用凝膠色譜法測(cè)定分子量分布，得到數(shù)均分子量為3CT50KD和8(T100KD的兩種具有生物學(xué)活性的當(dāng)歸多糖。實(shí)施例一
取0. 2g精制的當(dāng)歸多糖，溶于IOml磷酸鹽緩沖液(pH=7)；將活化羥基的連接劑羰基咪唑0. 2g溶解于5ml 二氯甲烷中，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，首先在多糖液中加入催化劑三乙胺 0. 05ml，再將羥基連接劑的二氯甲烷溶液緩慢加入多糖溶液中，勻速攪拌，在60min內(nèi)加完，加完之后，室溫反應(yīng)120min，獲得活化的多糖溶液；將3g小分子量PEI溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，加入催化劑三乙胺，在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫條件下緩慢加入到活化的多糖溶液中，在120min內(nèi)加完，避光、室溫下反應(yīng)10h，整個(gè)反應(yīng)在勻速攪拌下進(jìn)行；反應(yīng)完成之后的溶液經(jīng)透析(截取分子量>3500Da)、凍干，得到PEI修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖。配制濃度為0. lmg/ml的PEI修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖水溶液，取20 μ 1該溶液和 20 μ 1含2 μ g DNA質(zhì)粒溶液，分別在55°C加熱45min ；立即混合，渦旋45s，即得到PEI修飾的當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)。實(shí)施例二
取0. Sg精制的當(dāng)歸多糖，溶于20ml磷酸鹽緩沖液(pH=7)；將活化羥基的連接劑N， N’-羰基二咪唑(Aldrich，美國)3g溶解于5ml 二氯甲烷中，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，首先在多糖液中加入催化劑三乙胺0. 8ml，再將羥基連接劑的二氯甲烷溶液緩慢加入多糖溶液中，勻速攪拌，在45min內(nèi)加完，加完之后，室溫反應(yīng)90min，獲得活化的多糖溶液；將30g小分子量PEI溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，加入催化劑三乙胺，在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫條件下緩慢加入到活化的多糖溶液中，在150min內(nèi)加完，避光、室溫下反應(yīng)10h，整個(gè)反應(yīng)在勻速攪拌下進(jìn)行；反應(yīng)完成之后的溶液經(jīng)透析(截取分子量>3500Da)、凍干，得到PEI修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖。
配制濃度為8mg/ml的PEI修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖水溶液，取20 μ 1上述溶液和 20 μ 1含1 μ g DNA質(zhì)粒溶液，分別在55°C加熱30min ；立即混合，渦旋60s，即得到PEI修飾的當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)。按上述實(shí)施例二相同的步驟，但用苯并三唑碳酸酯(Aldrich，美國)或N，N’-二琥珀酰亞胺基硫酸酯(Aldrich，美國)替代N，N’ -羰基二咪唑得到的結(jié)果與上述結(jié)果相同。實(shí)施例三
取0. 3g精制的當(dāng)歸多糖，溶解于20ml雙蒸水中，加入0. 4g KIO4,迅速放到暗室，磁力攪拌，室溫反應(yīng)72h ；反應(yīng)液加入2ml乙二醇終止反應(yīng)，按前述條件繼續(xù)反應(yīng)30min ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到氧化當(dāng)歸多糖。取0. 2g氧化當(dāng)歸多糖，溶解于20ml雙蒸水中；稱0. 4g精胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)；將含有精胺的硼酸鹽溶液緩慢加入到當(dāng)歸多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)24h ；之后，向反應(yīng)液中加入0. 3g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0. 3g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)24h ；收集反應(yīng)液于雙蒸水中透析48h (截取分子量>3500Da)；冷凍干燥，得到精胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖。配制濃度為5mg/ml的精胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖水溶液，取20 μ 1該溶液和 20 μ 1含1 μ g DNA質(zhì)粒溶液，分別在55°C加熱30min ；立即混合，渦旋40s，即得到精胺修飾的當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)。實(shí)施例四
取0.9g精制的當(dāng)歸多糖，溶解于50ml雙蒸水中，加入l.Og KIO4,迅速放到暗室，磁力攪拌，室溫反應(yīng)72h ；反應(yīng)液加入IOml乙二醇終止反應(yīng)，按前述條件繼續(xù)反應(yīng)30min ；將反應(yīng)液裝入透析袋，在雙蒸水中透析48h (截取分子量>3500Da)；透析液凍干，得到氧化當(dāng)歸多糖。取0. 5g氧化當(dāng)歸多糖，溶解于20ml雙蒸水中；稱0. 7g精胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)；將含有精胺的硼酸鹽溶液緩慢加入到當(dāng)歸多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)24h ；之后，向反應(yīng)液中加入0. 4g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0. 4g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)24h ；收集反應(yīng)液于雙蒸水中透析48h (截取分子量>3500Da)；冷凍干燥，得到精胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖。配制濃度為lmg/ml的精胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖水溶液，取20 μ 1該溶液和 20 μ 1含1 μ g DNA質(zhì)粒溶液，分別在55°C加熱30min ；立即混合，渦旋20s，即得到精胺修飾的當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)。實(shí)施例五
取0. 2g精制的當(dāng)歸多糖，溶解于20ml雙蒸水中，加入0. 3g KIO4,迅速放到暗室，磁力攪拌，室溫反應(yīng)72h ；反應(yīng)液加入4ml乙二醇終止反應(yīng)，按前述條件繼續(xù)反應(yīng)30min ；收集反應(yīng)液于雙蒸水中透析48h (截取分子量>3500Da)；冷凍干燥，得到氧化當(dāng)歸多糖。取0. Ig氧化當(dāng)歸多糖，溶解于IOml雙蒸水中；稱0. 12ml乙二胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)；將含有乙二胺的硼酸鹽溶液緩慢滴加入當(dāng)歸多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)24h ；之后，向反應(yīng)液中加入0. Ig硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0. Ig硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)24h ；收集反應(yīng)液于雙蒸水中透析48h (截取分子量>3500Da)，冷凍干燥，得到乙二胺修飾的陽離子化當(dāng)歸
多糖。 配制濃度為2mg/ml的乙二胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖水溶液，取20 μ 1該溶液和 20 μ 1含1 μ g DNA質(zhì)粒溶液，分別在55°C加熱30min ；立即混合，渦旋20s，即得到乙二胺修飾的當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)。實(shí)施例六
取0. 8g精制的當(dāng)歸多糖，溶解于50ml雙蒸水中，加入2. 5g KIO4,迅速放到暗室，磁力攪拌，室溫反應(yīng)72h ；反應(yīng)液加入IOml乙二醇終止反應(yīng)，按前述條件繼續(xù)反應(yīng)30min ；收集反應(yīng)液于雙蒸水中透析48h (截取分子量>3500Da)；冷凍干燥，得到氧化當(dāng)歸多糖。取0. 5g氧化當(dāng)歸多糖，溶解于20ml雙蒸水中；稱2ml乙二胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)；將含有乙二胺的硼酸鹽溶液緩慢滴加入當(dāng)歸多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)24h ；之后，向反應(yīng)液中加入0. 7g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0. 7g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)24h ；收集反應(yīng)液于雙蒸水中透析48h (截取分子量>3500Da)，冷凍干燥，得到乙二胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖。配制濃度為5mg/ml的乙二胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖水溶液，取20 μ 1上述溶液禾口 20 μ 1含1 μ g DNA質(zhì)粒溶液，分別在55°C加熱60min ；立即混合，渦旋45s，即得到乙二胺修飾的當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)。實(shí)施例七
1.制備1%瓊脂糖凝膠，加入0. 5 μ g/ml溴化乙啶，鋪板，加樣，在80V電泳1. 5h后采
用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。結(jié)果顯示陽離子化當(dāng)歸多糖能夠穩(wěn)定的滯留DNA質(zhì)粒，有效的結(jié)合質(zhì)粒。瓊脂糖DNA電泳步驟
步驟1.制備1%瓊脂糖凝膠稱取0. 4g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入40ml 0. 5 X TBE, 瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即得到1. 0%瓊脂糖凝膠液。步驟2.膠板制備將電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽和制膠槽洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板，將內(nèi)槽放入卡槽內(nèi)，并在固定位置放好梳子。待瓊脂糖凝膠溶液冷卻到65°C左右， 向其中加0. 5μ g/ml溴化乙錠，混勻，小心地倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，是凝膠液緩慢展開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下，靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶， 將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。步驟3.加樣在點(diǎn)樣板上混合DNA復(fù)合物樣品和上樣緩沖液，用10 μ 1微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)。步驟4.電泳加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓70-100V，樣品由正極(紅色)向負(fù)極(黑色)方向移動(dòng)。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板前沿約Icm處時(shí)，停止電泳。步驟5.電泳完畢后，取出凝膠，清水漂洗lOmin。步驟6.觀察照相在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出橙紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存?？梢婈栯x子化當(dāng)歸多糖對(duì)DNA質(zhì)粒具有明顯的結(jié)合包裹作用。實(shí)施 例八
以TGFii-I質(zhì)粒為報(bào)告基因，按照實(shí)施例一、二、三所述制備三種陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米?；騻鬟f系統(tǒng)。96孔板中培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞濃度達(dá)到2 X 105/ml完全培養(yǎng)基/ ？L，孵育24-48h后，用無血清培養(yǎng)基置換原培養(yǎng)基，分別加入三種陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000-DNA質(zhì)粒復(fù)合物、游離質(zhì)粒，使每孔質(zhì)粒DNA量均為0.2yg，并以空白細(xì)胞為陰性對(duì)照，孵育4h后，將無血清培養(yǎng)基置換成新鮮的含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育72h，Rat TGF-β 1 ELISA Kit檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示，游離質(zhì)?？譚GF-β 1表達(dá)水平最低，精胺及乙二胺修飾的當(dāng)歸多糖-DNA納米復(fù)合物孔TGF- β 1表達(dá)效果顯著高于游離質(zhì)粒孔并與Lipofectamine 2000-DNA質(zhì)粒復(fù)合物的表達(dá)水平相近，而小分子PEI修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率最高，TGF-β 1的表達(dá)水平明顯高于Lipofectamine 2000-DNA質(zhì)粒復(fù)合物的表達(dá)水平。 實(shí)施例一和二所得PEI-當(dāng)歸多糖-DNA復(fù)合物納米基因傳遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率最高，實(shí)施例三和四所得的精胺-當(dāng)歸多糖-DNA復(fù)合物納米基因傳遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率居中，實(shí)施例五和六所得的乙二胺_當(dāng)歸多糖-DNA復(fù)合物納米基因傳遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率較低。由此可見，小分子PEI修飾的陽離子當(dāng)歸多糖是上述基因傳遞載體的最佳選擇。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟
步驟1.干細(xì)胞分離及培養(yǎng)將SD大鼠拉頸處死，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡3-5min， 無菌條件下取出脛骨和股骨；將其兩端干骺端切除，露出骨髓腔，用無菌注射器吸取適量 PBS徹底沖洗骨髓腔；反復(fù)吹打沖出骨髓；使骨髓細(xì)胞充分分散；所獲得的骨髓單細(xì)胞懸液沿管壁緩慢滴加于預(yù)置的Percoll分離液(相對(duì)體積質(zhì)量1. 073)的離心管中，骨髓單細(xì)胞懸液與分離液的體積比為1 :1 ；2000rpm，離心20min，吸取中間云霧狀細(xì)胞層，用PBS洗滌3 次；用完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM)重懸細(xì)胞，置于培養(yǎng)瓶中，于37°C 含有體積分?jǐn)?shù)為5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。步驟2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
取乙二胺修飾的陽離子當(dāng)歸多糖-DNA復(fù)合物(質(zhì)粒含量為0. 2 μ g/孔)分別加至96孔板中(2X105/ml完全培養(yǎng)基/孔)并輕輕搖晃使其均勻混合；放置37°C，5%C02培養(yǎng)箱孵育 72h，以 Lipofectamine 2000-DNA 質(zhì)粒復(fù)合物作為陽性對(duì)照，Rat TGF- β 1 ELISA Kit 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。取精胺修飾的陽離子當(dāng)歸多糖-DNA復(fù)合物(質(zhì)粒含量為0. 2 μ g/孔)分別加至96 孔板中(2X105/ml完全培養(yǎng)基/孔)并輕輕搖晃使其均勻混合；放置37°C，5%C02培養(yǎng)箱孵育 72h，以 Lipofectamine 2000-DNA 質(zhì)粒復(fù)合物作為陽性對(duì)照，Rat TGF-β 1 ELISA Kit 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。取小分子量PEI修飾的陽離子當(dāng)歸多糖-DNA復(fù)合物(質(zhì)粒含量為0. 2μ g/孔)分別加至96孔板中(2XlO5Ail完全培養(yǎng)基/孔)并輕輕搖晃使其均勻混合；放置37°C，5%C02培養(yǎng)箱孵育72h，以Lipofectamine 2000-DNA質(zhì)粒復(fù)合物作為陽性對(duì)照，Rat TGF- β 1 ELISA Kit檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。
權(quán)利要求
1.一種陽離子化當(dāng)歸多糖納米?；騻鬟f系統(tǒng)，其特征是它是一種用胺類化合物修飾的當(dāng)歸多糖結(jié)合DNA質(zhì)粒的基因傳遞系統(tǒng)，當(dāng)歸多糖的分子量分布為3(T50KD和 8(T100KD，其中按質(zhì)量比計(jì)，陽離子化當(dāng)歸多糖DNA質(zhì)粒=廣200:1，陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的粒徑為21-77nm，所述的胺類化合物為精胺、乙二胺或數(shù)均分子量為600Da-2000Da的聚乙烯亞胺。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的陽離子化當(dāng)歸多糖納米?；騻鬟f系統(tǒng)的方法，其特征是它包括以下步驟步驟1.陽離子化當(dāng)歸多糖的制備A.聚乙烯亞胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖的制備取0.廣Ig精制的當(dāng)歸多糖，溶于5 20ml磷酸鹽緩沖液(pH=7);將活化羥基的連接劑溶解于5ml 二氯甲烷中，所述的活化羥基的連接劑可以是N，N’ -羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N，N’- 二琥珀酰亞胺基硫酸酯中的任一種，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，首先在多糖液中加入催化劑三乙胺，再將活化羥基的連接劑的二氯甲烷溶液緩慢加入多糖溶液中，勻速攪拌，在2(Tl00min內(nèi)加完，加完之后，室溫反應(yīng)9(Tl50min，獲得活化的多糖溶液；將數(shù)均分子量為600Da-2000Da的聚乙烯亞胺(PEI)溶于l_20ml磷酸鹽緩沖液中，多糖與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為0. 5 4:1，加入催化劑三乙胺，在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫條件下緩慢加入到活化的多糖溶液中，在9(Tl50min內(nèi)加完，避光、室溫下反應(yīng)10h，整個(gè)反應(yīng)在勻速攪拌下進(jìn)行； 反應(yīng)完成之后的溶液經(jīng)透析(截取分子量>3500Da)、凍干之后，得到PEI修飾的當(dāng)歸多糖；B.精胺或乙二胺修飾的陽離子化的當(dāng)歸多糖的制備(1)氧化當(dāng)歸多糖的制備取0. 2^1g精制的當(dāng)歸多糖，溶解于2(Tl00ml雙蒸水中，加入KI04，KIO4與多糖中單糖單位的摩爾比為0. 5 5:1，迅速放到暗室，磁力攪拌，室溫反應(yīng)72h ；反應(yīng)液加入廣20ml乙二醇終止反應(yīng)，按前述條件繼續(xù)反應(yīng)30min ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)， 在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到氧化當(dāng)歸多糖0. Γ1. 5g ；(2)精胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖的制備稱取0.廣0.5g氧化當(dāng)歸多糖，溶解于l(T50ml雙蒸水中；稱取精胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)，精胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0. 5 5:1 ；將含有精胺的硼酸鹽溶液緩慢加入到當(dāng)歸多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)Mh ； 然后，向反應(yīng)液中加入0. rig硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入 0. rig硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質(zhì)量與氧化多糖的質(zhì)量之比為0. 5 4:1，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)Mh ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到精胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖0. Γ0. 8g ；(3)乙二胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖的制備稱取0. Γ0. 5g氧化當(dāng)歸多糖，溶解于l(T30ml雙蒸水中；稱乙二胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)，乙二胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0. 5^5:1 ；將含有乙二胺的硼酸鹽溶液緩慢滴加入當(dāng)歸多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)24h ； 之后，向反應(yīng)液中加入0. Γ1. Og硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入 0. Γ1. Og硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質(zhì)量與氧化多糖的質(zhì)量之比為0.5 4:1，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)Mh ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到乙二胺修飾的陽離子化當(dāng)歸多糖0. Γ0. 7g ；步驟3.分別配制濃度為0. OriOmg/ml的三種陽離子化當(dāng)歸多糖水溶液，取10~20 μ 1 陽離子當(dāng)歸多糖水溶液和10 20μ 1含0.廣2yg DNA質(zhì)粒溶液，分別在55 °C加熱 3(T60min ；立即混合，渦旋l(T60s，即得到陽離子化當(dāng)歸多糖納米?；騻鬟f系統(tǒng)。
全文摘要
一種陽離子化當(dāng)歸多糖納米粒基因傳遞系統(tǒng)，它是一種用胺類化合物修飾的當(dāng)歸多糖結(jié)合DNA質(zhì)粒的基因傳遞系統(tǒng)，當(dāng)歸多糖的分子量分布為30~50KD和80~100KD，其中按質(zhì)量比計(jì)，陽離子化當(dāng)歸多糖:DNA質(zhì)粒=1~200:1，陽離子化當(dāng)歸多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的粒徑為21-77nm。本發(fā)明的特點(diǎn)是1.當(dāng)歸多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老和抗凝血等多種生物活性，安全、無免疫原性、生物可降解，制備工藝簡單，經(jīng)濟(jì)、簡便。2.三種陽離子化當(dāng)歸多糖均有良好的DNA質(zhì)粒結(jié)合作用及基因傳遞表達(dá)作用。與糖鏈結(jié)合的伯、仲、叔胺基所帶有的正電荷能夠有效地與帶有負(fù)電荷的DNA質(zhì)粒通過靜電作用結(jié)合，從而保護(hù)質(zhì)粒免受細(xì)胞內(nèi)外各種酶的降解。
文檔編號(hào)B82Y5/00GK102154351SQ20101061360
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者余江南, 徐希明, 曹霞, 王淼, 鄧紋紋 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)