專利名稱：抗體片段修飾的微梁制備方法和基于抗體片段修飾的微梁免疫傳感檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體片段，具體地是Fab片段修飾的微懸臂梁(以下也簡稱為微梁)，及其制備方法。本發(fā)明還公開了基于所述抗體片段修飾的微梁的免疫傳感檢測系統(tǒng)和檢測方法，所述系統(tǒng)和方法可應(yīng)用于食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究和生產(chǎn)制造等領(lǐng)域的監(jiān)控和檢測。
背景技術(shù)：
免疫傳感技術(shù)的原理是基于檢測抗原抗體的特異性配對反應(yīng)，即針對需要檢測的某種靶標(biāo)分子(抗原)，通過生物免疫(把抗原注入小動物體內(nèi)產(chǎn)生的)方法,產(chǎn)生出相應(yīng)的探針分子(抗體)，提取、純化出這種探針分子，再利用抗原抗體的特異性結(jié)合去檢測樣品中的靶分子。已有的免疫傳感技術(shù)如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA，原理是利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)與酶標(biāo)的催化放大來進(jìn)行)和免疫熒光法(IF，原理是用熒光片段標(biāo)記抗原或抗體)，均需要標(biāo)記物來示蹤抗原抗體的反應(yīng)結(jié)果，就是說僅有抗體，并不能建立相應(yīng)的檢測方法，還需要有酶標(biāo)物或熒光標(biāo)記物或蛋白復(fù)合物。而一些難制備的靶標(biāo)分子的標(biāo)記物價格昂貴，或幾乎不可能制備或購買。同時酶聯(lián)免疫試劑盒和蛋白芯片的檢測從原理操作上都要求每一步反應(yīng)完后進(jìn)行清洗，標(biāo)記過程繁瑣耗時，是事后的檢測，不能實時，原位、在線的檢測?；诒砻鎽?yīng)力檢測的微懸臂梁免疫傳感技術(shù)是近年出現(xiàn)的一種新的免疫生化傳感方法[1]，其原理是把探針(抗原或抗體)分子用直接或間接的方式固定(修飾)到微梁一側(cè)的鍍金層上，當(dāng)被檢測樣品液中的靶分子與微梁金表面上的探針分子發(fā)生免疫生化反應(yīng)時，會使微梁表面應(yīng)力改變，從而導(dǎo)致微梁彎曲變形，通過光學(xué)或電學(xué)方法檢測這種變形的過程，可得到免疫生化反應(yīng)的實時信息。基于免疫特異性識別建立的微梁免疫傳感技術(shù)與傳統(tǒng)的需要標(biāo)記物的免疫傳感方法相比，它無需使用任何酶標(biāo)、熒光物質(zhì)和放射性作為反應(yīng)示蹤劑，消除了標(biāo)記過程的影響，靈敏度高(比酶聯(lián)免疫試驗高數(shù)倍[2_4])，還可以通過監(jiān)測微梁變形來實時、定量的監(jiān)測抗原抗體的反應(yīng)過程，得到更豐富的免疫生化反應(yīng)的信息。經(jīng)過這些年的發(fā)展，微梁傳感被作為一種新興技術(shù)，在生物工程和環(huán)境污染監(jiān)測技術(shù)等方面與傳統(tǒng)的方法進(jìn)行對比研究，如RNA轉(zhuǎn)錄因子、酶、汞排放及揮發(fā)性化合物等，優(yōu)于常規(guī)的酶聯(lián)免疫方法。但即使如此，微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的檢測靈敏度還不足以在成本方面獲得相對于常規(guī)酶聯(lián)免疫法的巨大優(yōu)勢，即如果微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的靈敏度或檢測極限只比酶聯(lián)免疫法高數(shù)倍，而微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的設(shè)備成本與酶聯(lián)免疫相對較高，使得微懸臂梁免疫傳感技術(shù)難以商業(yè)化。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的方法主要是利用具有雙功能基團(tuán)的疏基化試劑的疏基(-SH)抓住微梁表面的金表面，和另一功能團(tuán)抓住抗體，實現(xiàn)抗體在微梁鍍金表面上的固定。例如先將巰基化試劑11-羧酸硫醇結(jié)合到微梁的金表面，活化其上的羧基，使之與抗體上的氨基結(jié)合來固定抗體(圖2)?；蛴靡环N巰基化試劑鹽酸硫醇亞胺，通過與抗體反應(yīng)，使抗體連接一個帶巰基的分子基團(tuán)，再通過這個巰基 將抗體聯(lián)結(jié)到微梁的金表面上(中國專利CN101407548)(見圖3)。這些方法固定抗體，存在如下共同的問題，(I)Y字形抗體(見圖
I)的Fe段或Fab段的頂端部，會等概率的被固定在金表面上，沒有方向性[5]。而當(dāng)Fab段的頂端被固定在金表面上時，結(jié)合位點被遮擋，限制了抗體的抗原結(jié)合位點與抗原的充分結(jié)合，從而降低了微梁傳感靈敏度；(2)抗體與微梁之間存在不同數(shù)目C原子的單鏈分子，降低了抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的應(yīng)力傳遞到梁上的效率。由此可見，中國專利CN101407548中公開的方法的靈敏度與酶聯(lián)免疫法相比僅提高數(shù)倍，還無法達(dá)到商業(yè)化或用于極微量被分析物的檢測。因此，在本領(lǐng)域中存在著改進(jìn)微梁表面與抗體的結(jié)合和設(shè)計從而進(jìn)一步提高微梁免疫傳感靈敏度和效率的需求。

發(fā)明內(nèi)容
綜上所述，在已有的微梁免疫傳感技術(shù)報道中，最突出的問題就是檢測靈敏度。影響微梁免疫傳感器靈敏度的因素主要有三個方面①抗體的靈敏度(或抗體與抗原結(jié)合的親和性)、②微梁上抗體的固定方法和③微梁的設(shè)計與信號讀出。由于抗體的靈敏度和微梁的規(guī)格與信號讀出方式在微梁免疫傳感器系統(tǒng)成型之后就無法改變，唯一可變的是微梁表面抗體的固定方法。一種合適的微梁表面抗體的修飾方法，能使固定在微梁表面的抗體與樣品溶液中的抗原充分結(jié)合，并能高效地將抗原抗體結(jié)合所產(chǎn)生的應(yīng)力變化傳遞到微梁表面?？贵w在微梁表面固定的方向性、密度、活性以及抗體與微梁表面之間的聯(lián)接分子的長度與剛性都有可能影響最終檢測的靈敏度。鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明用于解決上述問題的技術(shù)方案是通過減少抗體上抗原分子結(jié)合位點以外其它部分的質(zhì)量和體積，來提高抗原結(jié)合位點在微梁表面的有效修飾密度，以及分子間反應(yīng)作用力傳遞到微梁上的效率，達(dá)到提高微梁免疫檢測方法的靈敏度目的?？贵wIg分子的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1，包括兩個相同的抗原結(jié)合片段(Fab)和一個可結(jié)晶片段(Fe), Fab和Fe通過中間的鉸鏈區(qū)連接,構(gòu)成Y字形結(jié)構(gòu)。Fab的頂端為與抗原分子的結(jié)合位點。在免疫球蛋白抗體分子的“Y”字形四肽鏈結(jié)構(gòu)(圖I)中，由兩條完全相同的重鏈和兩條完全相同的輕鏈以二硫鍵連接而成。對于Fe段修飾在微梁的鍍金表面上時(抗體修飾的定向性好)，抗體對稱(Fab段)的兩個上端部抗原結(jié)合位點與抗原結(jié)合后產(chǎn)生的應(yīng)力，通過抗體Y字型的腿部(Fe段)傳遞到鍍金微梁表面?？贵w(IgG)的分子量約150kDa，如果被檢測的抗原分子分子量為數(shù)百Da，抗體抗原質(zhì)量比近1000。參與抗原分子結(jié)合的位點由重鏈和輕鏈的高變區(qū)(VH和VL)構(gòu)成，其與抗原分子的質(zhì)量比約150，而抗體分子上不參加與抗原分子結(jié)合的Fe段，其與抗原分子的質(zhì)量比近400。因此我們設(shè)想，如果能夠減少結(jié)合位點以外的抗體分子質(zhì)量和體積，保持抗體的結(jié)合位點朝向固定表面的外法線方向，就能夠提高應(yīng)力的傳遞效率和抗體在微梁表面的有效修飾密度，從而提高微梁免疫傳感的靈敏度。為此，在第一個方面，本發(fā)明提供了一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟I)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成Fab片段和多個小分子片段，所述蛋白酶為能夠?qū)⒖贵w裂解成Fab片段的任何酶，優(yōu)選木瓜蛋白酶；3)固定步驟將包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)的巰基化試劑結(jié)合至微懸 臂梁的鍍金層表面上；4)聯(lián)結(jié)步驟將步驟2)獲得的Fab片段與步驟3)獲得的已經(jīng)結(jié)合在微懸臂梁上的巰基化試劑聯(lián)結(jié)在一起，得到鍍金層表面上固定有Fab片段的微懸臂梁。在第二個方面，本發(fā)明還提供了一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟I)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成Fab片段和多個小分子片段，所述蛋白酶為能夠?qū)⒖贵w裂解成Fab片段的任何酶，優(yōu)選木瓜蛋白酶；3)聯(lián)結(jié)步驟將步驟2)獲得的Fab片段與包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)的疏基化試劑聯(lián)結(jié)在一起；4)固定步驟將步驟3)獲得的一端與Fab片段聯(lián)結(jié)的所述巰基化試劑的另一端結(jié)合至微懸臂梁的鍍金層表面上，得到鍍金層表面上固定有Fab片段的微懸臂梁。在第三個方面，本發(fā)明提供了一種應(yīng)力傳感元件，其包括基于應(yīng)力的微懸臂梁，所述微懸臂梁的鍍金層上固定有抗體的Fab片段。所述微懸臂梁優(yōu)選通過本發(fā)明的方法制備。在第四個方面，本發(fā)明提供了一種基于應(yīng)力的微懸臂梁免疫傳感檢測系統(tǒng)，其包括本發(fā)明的應(yīng)力傳感元件。在第五個方面，本發(fā)明提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成Fab片段和多個小分子片段，所述蛋白酶為能夠?qū)⒖贵w裂解成Fab片段的任何酶，例如木瓜蛋白酶；3)固定步驟將包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)的巰基化試劑結(jié)合至微懸臂梁的鍍金層表面上；4)聯(lián)結(jié)步驟將步驟2)獲得的Fab片段與步驟3)獲得的已經(jīng)結(jié)合在微懸臂梁上的所述巰基化試劑聯(lián)結(jié)在一起，得到鍍金層表面上固定有Fab片段的微懸臂梁。5)將步驟4)獲得的固定有Fab片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中；6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。在第六個方面，本發(fā)明還提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成Fab片段和多個小分子片段，所述蛋白酶為能夠?qū)⒖贵w裂解成Fab片段的任何酶，例如木瓜蛋白酶；3)聯(lián)結(jié)步驟將步驟2)獲得的Fab片段與包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)的疏基化試劑聯(lián)結(jié)在一起；4)固定步驟將步驟3)獲得的一端與Fab片段聯(lián)結(jié)的所述巰基化試劑的另一端結(jié)合至微懸臂梁的鍍金層表面上，得到鍍金層表面上固定有Fab片段的微懸臂梁；5)將步驟4)獲得的固定有Fab片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中；6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。本發(fā)明的有益效果鑒于微梁免疫傳感檢測技術(shù)中抗體固定的重要性及巰基化試劑參與抗體固定的復(fù)雜性，本發(fā)明提出在微梁鍍金表面上修飾抗體片段Fab方法來實現(xiàn)微梁免疫檢測。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的微梁免疫方法相比較具有以下優(yōu)點l)Fab片段相對于完整抗體，其體積與質(zhì)量要小，因此固定到微梁表面后，具有更高的抗原結(jié)合位點的密度。2)減少抗體結(jié)合位點以外的質(zhì)量和體積，從而減少了抗體的抗原結(jié)合位點到梁表面距離，提高應(yīng)力的傳遞效率。


圖I為抗體分子結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為羧酸硫醇類化合物和雙功能交聯(lián)劑法固定抗體示意圖。圖3為鹽酸硫醇亞胺法固定抗體示意圖。圖4為木瓜蛋白酶水解抗體形成抗體片段得到Fab示意圖。圖5圖示了先將Fab與鹽酸硫醇亞胺反應(yīng)在Fab上連接一個巰基基團(tuán)，再通過這個巰基來固定Fab到金表面的示意圖。圖6圖示了先將硫醇類巰基化試劑連接到梁上，再通過該硫醇類巰基化試劑連接Fab的示意圖。圖7為抗人參皂苷GS-Re巰基化抗體修飾微梁，檢測不同濃度抗原時微梁尖端的時間位移曲線。圖8為用硫醇修飾抗人參皂苷GS-Re抗體Fab片段修飾微梁，檢測不同濃度抗原時微梁尖端的時間位移曲線。
具體實施例方式定義抗體抗體(antibody)指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。典型的抗體分子具有4條多肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)，包括2條較長、相對分子量較大的相同的重鏈(H鏈)；2條較短、相對分子量較小的相同的輕鏈(L鏈)。鏈間由二硫鍵和非共價鍵聯(lián)結(jié)形成一個由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子。輕鏈有K和λ兩種,重鏈有μ、δ、Y、ε和α五種。整個抗體分子可分為恒定區(qū)和可變區(qū)兩部分。在給定的物種中，不同抗體分子的恒定區(qū)都具有相同的或幾乎相同的氨基酸序列?？勺儏^(qū)位于"Y"的兩臂末端。在可變區(qū)內(nèi)有一小部分氨基酸殘基變化特別強(qiáng)烈，這些氨基酸的殘基組成和排列順序更易發(fā)生變異區(qū)域稱高變區(qū)。高變區(qū)位于分子表面，最多由17個氨基酸殘基構(gòu)成，少則只有2 3個。高變區(qū)氨基酸序列決定了該抗體結(jié)合抗原的特異性。一個抗體分子上的兩個抗原結(jié)合部位是相同的，位于兩臂末端稱抗原結(jié)合片段(antigen-binding fragment,Fab)。" Y"的柄部稱結(jié)晶片段(crystalline fragment, Fe),糖結(jié)合在 Fe 上。從結(jié)構(gòu)上來說，在本發(fā)明中，提及抗體時均指全抗體，即包括4條鏈和Fe段的抗體結(jié)構(gòu)(見圖I)。此外，從功能上來說，本發(fā)明中的“抗體”或“抗體片段”是指對靶抗原特異的抗體或抗體片段，即與抗原具有特異結(jié)合能力的抗體或抗體片段，如未特別說明，本發(fā)明中的抗體一般指單克隆抗體，抗體片段包括半抗體片段、F(ab’ )2片段、Fab’片段和Fab
坐寸ο半抗體片段通過二硫鍵還原劑將全抗體拆分成各自帶有巰基的對稱的片段，每個半抗體片段包含一條完整的輕鏈和一條完整重鏈以及Fe片段。F(ab’)2 :Ig (immunoglobulin,免疫球蛋白)被胃蛋白酶水解在鉸鏈區(qū)重鏈間二硫鍵近C處切斷，形成一個雙價抗原結(jié)合片段簡稱F(ab’)2片段和一些小片段pFc'。由于F(ab’)2片段保留了結(jié)合相應(yīng)抗原的生物學(xué)活性，又避免了 Fe片段的抗原性可能引起的副作用，因而被廣泛用作生物制品。如白喉抗霉素和破傷風(fēng)抗霉素，經(jīng)胃蛋白酶水解后，因去掉了 Fe片段的抗原性而減少了超敏反應(yīng)的發(fā)生。pFc'片段最終被降解，無生物學(xué)活性。Fab (fragment of antigen binding):木瓜蛋白酶使Ig在鉸鏈區(qū)重鏈間二硫鍵近N端處切斷，形成兩個相同的單價抗原結(jié)合片段簡稱Fab段(如圖I中所示)，一個可結(jié)晶的片段簡稱 Fe (fragment crystallizable)段。Fab’ 是帶巰基的單價抗原結(jié)合片段?？乖Y(jié)合位點如圖I中所示，抗體分子與抗原相結(jié)合的部位，由Ig輕、重鏈的CDR1、CDR2 和 CDR3 組成?？乖且活惸苷T導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物(抗體或效應(yīng)細(xì)胞)發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖哂忻庖咴院头磻?yīng)原性兩種性質(zhì)。根據(jù)抗原性質(zhì)分為兩類完全抗原和不完全抗原。完全抗原(complete antigen)是一類既有免疫原性，又有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒、細(xì)菌外毒素等都是完全抗原。不完全抗原，即半抗原(hapten)是只具有免疫反應(yīng)性，而無免疫原性的物質(zhì)，故又稱不完全抗原。巰基化試劑具有巰基的能連接抗體與金的雙功能交聯(lián)試劑。二硫鍵還原劑二硫鍵又稱S-S鍵，是2個SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的鍵。在巰基乙胺(2-MEA)、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等的硫化合物存在下能與之發(fā)生作用，還原成巰基(-SH)。這些硫化物就是本發(fā)明中所說的二硫鍵還原劑。在微量的二硫鍵還原劑存在的情況下抗體的重鏈間的二硫鍵被還原而其它的二硫鍵不被破壞。微懸臂梁(微梁)典型的微懸臂梁由氮化硅制成，如商品化的三角形微懸臂梁(Veeco Instruments)(尺寸長200um,腿寬20um,厚O. 6um)，單側(cè)鍍有60nm的金；抗體通常通過巰基化試劑的巰基(-SH)與金的共價結(jié)合以及巰基化試劑的另外一端(含有-COOH或-NH2等活性基團(tuán))與抗體結(jié)合來固定到微梁表面?；诒砻鎽?yīng)力檢測的微懸臂梁免疫傳感系統(tǒng)微懸臂梁免疫傳感系統(tǒng)主要由激光器、分光鏡、微懸臂梁、光電位置敏感器(PSD)、溫度控制系統(tǒng)、蠕動泵、反應(yīng)池以及數(shù)據(jù)分析處理裝置組成。典型的微懸臂梁免疫檢測方法的步驟如下將微懸臂梁固定到反應(yīng)池中，以螺動泵控制流動緩沖液通過反應(yīng)池，待反應(yīng)池中氣泡排凈后以O(shè). lmL/min的速度流動緩沖液通過反應(yīng)池。反應(yīng)池的溫度控制在37 ±0.01 °C，室溫控制在27 ±0.01 °C。激光器發(fā)出一束激光經(jīng)分光鏡后照射在微懸臂梁的尖端，經(jīng)微懸臂梁反射后再經(jīng)分光鏡反射后照在PSD的靶面上。當(dāng)微懸臂梁的位移信號穩(wěn)定后，加入緩沖液稀釋的樣品溶液，PSD實時記錄微懸臂梁的尖端位移。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案在本發(fā)明中，抗體類型可以包括IgM、IgG、IgA、IgD、IgE。此外，抗體可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法制備，包括但不限于免疫法、雜交瘤法、化學(xué)合成法、基因工程法等。所述抗體還可以是基因工程修飾的雜合抗體，諸如人源化抗體，駱駝源化抗體等針對某種哺乳動物改造的抗體，例如人-鼠雜合抗體等。本發(fā)明中提到的待測樣品可以是生物樣品，例如來自于哺乳動物尤其是人的樣品，包括組織樣品(如病理組織切片、活檢、毛發(fā)、拭子等)、細(xì)胞樣品(如細(xì)胞涂片、血液涂片等)、體液樣品(如血液、尿液、腦脊液、唾液等)、排泄物(例如嘔吐物、汗液、糞便等)。所述待測樣品還可以是環(huán)境樣品，諸如土壤樣品、水樣、浮塵等；其他生產(chǎn)領(lǐng)域中獲得的樣品，諸如污水樣品、食品樣品等。本發(fā)明中所提及的抗原包括但不限于完全抗原和半抗原，其可以是在本發(fā)明中所提到的待測樣品中可能存在的本領(lǐng)域中所知曉的需要檢測的任何類型的抗原。在本發(fā)明中，在酶解步驟中使用的蛋白酶可以根據(jù)要被水解的抗體的種類或其他因素任意地選擇，只要其水解產(chǎn)物中包括Fab片段?？蛇x的蛋白酶諸如木瓜蛋白酶，因為木瓜蛋白酶的反應(yīng)條件相對溫和，因此對抗體的抗原結(jié)合活性的影響較小。在本發(fā)明中，采用蛋白酶水解抗體Ig的方法和反應(yīng)條件是本領(lǐng)域公知的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)要水解的抗體的種類來確定合適的蛋白酶和相應(yīng)的水解條件。例如，當(dāng)選擇木瓜蛋白酶時，木瓜蛋白酶可以發(fā)揮其活性的環(huán)境，一般是指PH 3 9. 5和在25 60°C下的環(huán)境。木瓜蛋白酶的最適pH和最適溫度根據(jù)其來源而定,一般為pH 6. 0-8. O左右和37 55°C左右(可以根據(jù)市售產(chǎn)品的要求來確定)。在本發(fā)明中可以使用的木瓜蛋白酶的來源不受限制，只要其可以將抗體分子裂解為Fab片段。在本發(fā)明中，抗體或抗體片段與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比不受限制，只要足以將抗體或抗體片段充分地水解為Fab片段。兩者的質(zhì)量比可以根據(jù)常規(guī)方法來選擇，也可以同時參考所選擇木瓜蛋白酶的活性、所選擇的抗體類型等因素，一般可以在10 : I 200 : I的范圍內(nèi)選擇。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明中使用的巰基化試劑不受限制，只要其可以與抗體的Fab片段聯(lián)結(jié)，并且可以被固定在微梁的鍍金層上。巰基化試劑與Fab的聯(lián)結(jié)的步驟以及固定至微梁的鍍金層上的步驟的次序不受限制，可以先用巰基化試劑聯(lián)結(jié)抗體將抗體巰基化后與金表面固定，也可以先將巰基化試劑固定在金表面上后再與抗體聯(lián)結(jié)。本發(fā)明中使用的巰基化試劑包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)，其中該試劑一端的巰基用于通過自組裝固定在金表面上(參見圖5)，另一端的羧基或氨基(也可以通過活化被暴露)用于與抗體的氨基或羧基末端發(fā)生反應(yīng)(參見圖6)。本發(fā)明可用的巰基化試劑包括硫醇類化合物，例如11-羧酸硫醇，2-氨基乙硫醇(AET)和3-巰基丙酸(MPA);鹽酸硫醇亞胺；磺基烴基琥珀酰亞胺基_6-(3’ 2-吡啶二硫-丙酰胺)_乙酸酯(Sulfo-LC-SPDP);和3，3’ -二硫雙磺基琥珀酰亞胺丙酸酯(DTSSP)等。在本發(fā)明中使用的微梁可以根據(jù)本領(lǐng)域中的公知方法自行制備，也可以購買市售商品，對此在本發(fā)明中并無任何限制。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但需要說明的是下面的實施例不限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例I在微梁鍍金層上固定抗體片段Fab實驗I抗體片段Fab的制備I.準(zhǔn)確稱取人參皂苷GS-Re單克隆抗體(購自美國USBiological公司)10. Omg溶于I. OmL O. IM Tris-HCl (含2. OmM EDTA, ρΗ8· O)中得到濃度為10. Og/L的抗體溶液；2.稱取1.5mg木瓜蛋白酶(購自美國Sigma公司)溶于I. OmL水中得到濃度為1.5g/L的木瓜蛋白酶溶液；3.將I. OmL上述步驟I的抗體溶液和I. OmL上述步驟2的木瓜蛋白酶溶液混合，37°C反應(yīng)I小時。得倒抗體Fab片段。用甘油等體積稀釋后-20°C保存。實驗2微梁表面抗體Fab片段的固定I.硫醇自組裝將洗凈并用氮氣吹干的鍍有金層的微梁(購自美國Veeco公司)放入酶標(biāo)板小孔中，加入200 μ I濃度為IOmM 11_羧酸硫醇，封口室溫12小時；2.清洗用鑷子小心取出微梁，用去離子水清洗微梁三次；3.活化將清洗過的微梁加入新的板孔中，加入O. 2Μ的EDC(l-(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和O. 05M的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)各75 μ I活化梁40分鐘；4.清洗用鑷子小心取出微梁，用去離子水清洗微梁三次；5.固定抗體將清洗過的微梁放入新的板孔之中，加入150 μ L上述實驗I獲得的抗人參皂苷GS-Re單克隆抗體Fab片段，37°C溫育I. 5小時，得到固定有抗體片段Fab的微
M
ο實驗3直接競爭ELISA方法評價Fab抗體片段與微梁金表面的結(jié)合情況具體步驟如下I.清洗用鑷子小心取出上述實驗2固定了抗體片段的微梁，用洗滌液(每IL洗滌液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、I. OmL Tween-20，其余為水)沖洗數(shù)次，氮氣吹干；2.封閉將氮氣吹干后的微梁分別放入酶標(biāo)板中，加入100 μ L質(zhì)量百分含量為5%的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37°C溫育30分鐘；3.清洗用鑷子小心取出微梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮氣吹干；4.競爭將氮氣吹干后的微梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中(做好標(biāo)記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L經(jīng)樣品稀釋液(含有終濃度為O. Imo 1/L ρΗ7. 5的PBS、
O.I %體積百分含量的吐溫-20和O. I %質(zhì)量百分含量的明膠)稀釋的濃度為100mg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購自美國Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L樣品稀釋液作為對照；然后再分別加入濃度為I. Omg/L的人參皂苷GS-Re過氧化物酶聯(lián)結(jié)物(購自美國Sigma公司)，37°C溫育30分鐘；5.清洗用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，
氮氣吹干。
6.顯色將氮氣吹干后的兩根微梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中，每孔加入100 μ L顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩沖液按I : 9的體積比混勻，每IOmL上述混合液中加入4. Omg過氧化脲)，室溫顯色；7.終止15分鐘后，每孔加入50uL終止液(2. OM的硫酸溶液)終止反應(yīng)，取出微梁，450nm波長處分別讀取OD值。實驗設(shè)上次重復(fù)，結(jié)果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長下的吸光度值分別為O. 113和O. 841，說明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab片段能有效結(jié)合微梁的金表面上并具有活性。實驗4微梁傳感器效果監(jiān)測I.清洗無水乙醇、丙酮和PBS分別流經(jīng)微梁傳感系統(tǒng)，流速O. 5mL/min ；2.固定微梁將實驗2中固定有抗人參皂苷GS-Re抗體Fab片段的微梁固定到微梁傳感系統(tǒng)的反應(yīng)池中，流動PBS通過反應(yīng)池子。排除反應(yīng)池中的氣泡后以O(shè). lmL/min流動 PBS。3.調(diào)節(jié)光路調(diào)節(jié)激光器與PSD(光電位置敏感器)的位置使激光器發(fā)出的激光照在微梁的尖端反射后被PSD接收。4.樣品測定當(dāng)PSD接收的微梁偏轉(zhuǎn)信號穩(wěn)定后，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過PSD實時記錄微梁尖端位移信息。檢測了三個濃度20ng/mL、lng/mL、0. 05ng/mL ;的樣品得到的位移量分別約為80、45和20nm(圖8)。不同濃度的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品可以產(chǎn)生不同程度的微梁位移，說明抗人參皂苷GS-Re抗體片段Fab能有效結(jié)合到微梁的金表面上并能對人參皂苷GS-Re進(jìn)行定量檢測。實施例2在微梁鍍金層上固定抗體片段Fab實驗I抗體片段Fab的制備I.準(zhǔn)確稱取人參皂苷GS-Re單克隆抗體(購自美國USBiological公司)10. Omg溶于I. OmL O. IM Tris-HCl (含2. OmM EDTA, ρΗ8· O)中得到濃度為10. Og/L的抗體溶液；2.稱取1.5mg木瓜蛋白酶(購自美國Sigma公司)溶于I. OmL水中得到濃度為1.5g/L的木瓜蛋白酶溶液；3.將I. OmL上述步驟⑴的抗體溶液和I. OmL上述步驟⑵的木瓜蛋白酶溶液混合，37°C反應(yīng)I小時。得倒抗體片段。用甘油等體積稀釋后_20°C保存。實驗2利用鹽酸硫醇亞胺將抗體片段Fab巰基化I.稱取I. Omg鹽酸硫醇亞胺(購自美國sigma公司)溶于I. OmL蒸懼水中得到濃度為I. Og/L的巰基化試劑(現(xiàn)配現(xiàn)用)；2.將I. OmL上述實驗I中的抗體片段Fab和45. 8 μ L上述實驗I的巰基化試劑混合，室溫條件下輕微攪拌反應(yīng)Ih ；3.用 20mM 的 PBS 緩沖液(含 O. 15M NaCl 和 I. OmM EDTA, Ph7. 2)對上述步驟 2 的反應(yīng)液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到巰基化抗體片段溶液實驗3微梁表面巰基化抗體Fab片段的固定將洗凈并用氮氣吹干的鍍有金膜的微梁(購自美國Veeco公司)放入酶標(biāo)板小孔中，加入150 μ L用PBS稀釋50倍后的上述實驗2制得的巰基化抗體Fab片段溶液，放在37°C水浴箱中2小時，即得到固定有抗體Fab片段的微梁。實驗4ELISA直接競爭法效果檢測I.清洗用鑷子小心取出上述固定了抗體片段Fab的微懸臂梁，用洗滌液(每IL洗滌液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、I. OmL Tween-20，其余為水)沖洗數(shù)次，氮氣吹干；2.封閉將氮氣吹干后的微懸臂梁分別放入酶標(biāo)板中，加入100μ L質(zhì)量百分含量為5%的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37°C溫育30分鐘；3.清洗用鑷子小心取出微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮氣吹干；4.競爭將氮氣吹干后的微懸臂梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中(做好標(biāo)記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L經(jīng)樣品稀釋液(含有終濃度為O. lmol/L pH7. 5的PBS,O. I %體積百分含量的吐溫-20和O. I %質(zhì)量百分含量的明膠)稀釋的濃度為IOOmg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購自美國Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L樣品稀釋液作為對照；然后再分別加入濃度為I. Omg/L的人參皂苷GS-Re過氧化物酶聯(lián)結(jié)物(購自美國Sigma公司)，37°C溫育30分鐘;5.清洗用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮氣吹干；6.顯色將氮氣吹干后的兩根微懸臂梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中，每孔加入100 μ L顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩沖液按I : 9的體積比混勻，每IOmL上述混合液中加入4. Omg過氧化脲)，室溫顯色；7.終止15分鐘后，每孔加入50 μ L終止液(2. OM的硫酸溶液)終止反應(yīng)，取出微懸臂梁，450nm波長處分別讀取OD值。實驗設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長下的吸光度值分別為O. 156和O. 944，說明巰基化后的抗人參皂苷GS-Re抗體Fab片段能有效結(jié)合微懸臂梁的
金表面上。實驗5微梁傳感器效果檢測I.清洗無水乙醇、丙酮和PBS分別流經(jīng)微梁傳感系統(tǒng)，流速O. 5mL/min ；2.固定微梁將實驗3中修飾有抗人參皂苷GS-Re抗體Fab片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感系統(tǒng)的反應(yīng)池中，流動PBS通過反應(yīng)池子。排除反應(yīng)池中的氣泡后以
O.lmL/min 流動 PBS。3.調(diào)節(jié)光路調(diào)節(jié)激光器與PSD(光電位置敏感器)的位置使的激光器發(fā)出的激光照在微梁的尖端并被PSD接收。4.樣品測定當(dāng)PSD接收的微梁偏轉(zhuǎn)信號穩(wěn)定后，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過PSD實時記錄微梁尖端位移信息。檢測了三個濃度20ng/mL、l. 0ng/mL、0. 05ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為95、50和25nm(圖8);不同濃度的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品可以產(chǎn)生不同程度的微懸臂梁位移，說明抗人參皂苷GS-Re抗體fab片段能有效結(jié)合到微懸臂梁的金表面上并能對人參皂苷GS-Re進(jìn)行檢測。結(jié)論以人參皂苷GS-Re抗原抗體分子為例，用本發(fā)明的抗體片段Fab修飾和完整抗體
1修飾的微梁進(jìn)行實驗測試對比，檢測不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時，微梁尖端的時間位移響應(yīng)曲線(圖8和圖7)顯示，在微梁位移響應(yīng)為20納米左右時，抗體Fab片段修飾和完整抗體修飾的檢測人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為O. 5ng/mL和O. 05ng/mL，靈敏度提高了約10倍。(圖7為利用鹽酸硫醇亞胺做為巰基化試劑來巰基化抗體后將抗體固定到梁上(中國專利CN101407548)對人參皂苷進(jìn)行檢測的結(jié)果)。通過上述非限制性的實施例，可以看出，本發(fā)明的方法和通過本發(fā)明的方法制備的微懸臂梁在免疫傳感檢測技術(shù)中與現(xiàn)有技術(shù)的微梁法相比可以提高20-40倍，相當(dāng)于常規(guī)酶聯(lián)免疫法的200-400倍，實現(xiàn)了本發(fā)明的目的，即在食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究和生產(chǎn)制造等領(lǐng)域中監(jiān)控和檢測極微量被分析物的可能性和實用性，完全可以實現(xiàn)實際的商業(yè)化應(yīng)用。參考文獻(xiàn)[l]Koutilya R. Buchapudi, Xin Huang, Xin Yang，HaiFeng Ji and ThomasThundat, Microcantilever biosensors for chemicals and bioorganisms. Analyst,2011，136，1539-1556[2]Weiming Tan，Yuan Huang，Tiegui Nan，Changguo Xue,Zhaohu Li，QingchuanZhang, and BaominWang, Development of Protein A Functionalized MicrocantileverImmunosensors for the Analyses ofSmaII Molecules at part per trillion Levels.Analysis Chemistry,2010，82(2)，615-620[3]Hongwei Zhao ；Changguo Xue ；Tiegui Nan ；Guiyu Tan ；Zhaohu Li ；QingX. Li ；Qingchuan Zhang ；Baomin Wang，Detection of Copper Ions UsingMicrocantileverImmunosensors and Enzyme-linked Immunosorbent Assay, Analytica Chimica Acta,2010,676,81-86,[4]Changguo Xue, Hongwei Zhao, Yanyun Chen, Baomin Wang, QingchuanZhang, Xiaoping Wu, Development of suIfhydrylated antibodyfunctionalizedmicrocantilever immunosensor for taxol， Sensors and Actuators B，2011，156，863-866[5] A. Kausai te-Minkst imi ene，A. Ramanav i c i ene，J. Kirlyte , andA. Ramanavicius. Comparative Study of Random and Oriented Antibody ImmobilizationTechniques on the Binding Capacity of Immunosensor. Analysis Chemistry，2010，82，6401-6408。
權(quán)利要求
1.一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成Fab片段和多個小分子片段，所述蛋白酶為能夠?qū)⒖贵w裂解成Fab片段的任何酶，優(yōu)選木瓜蛋白酶；3)固定步驟將包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)的巰基化試劑結(jié)合至微懸臂梁的鍍金層表面上；4)聯(lián)結(jié)步驟將步驟2)獲得的Fab片段與步驟3)獲得的已經(jīng)結(jié)合在微懸臂梁上的巰基化試劑聯(lián)結(jié)在一起，得到鍍金層表面上固定有Fab片段的微懸臂梁。
2.一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成Fab片段和多個小分子片段，所述蛋白酶為能夠?qū)⒖贵w裂解成Fab片段的任何酶，優(yōu)選木瓜蛋白酶；3)聯(lián)結(jié)步驟將步驟2)獲得的Fab片段與包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)的巰基化試劑聯(lián)結(jié)在一起；4)固定步驟將步驟3)獲得的一端與Fab片段聯(lián)結(jié)的所述巰基化試劑的另一端結(jié)合至微懸臂梁的鍍金層表面上，得到鍍金層表面上固定有Fab片段的微懸臂梁。
3.一種應(yīng)力傳感元件，其包括基于應(yīng)力的微懸臂梁，所述微懸臂梁的鍍金層上固定有抗體的Fab片段。
4.一種基于應(yīng)力的微懸臂梁免疫傳感檢測系統(tǒng)，其包括權(quán)利要求3的應(yīng)力傳感元件。
5.一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟1)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成Fab片段和多個小分子片段，所述蛋白酶為能夠?qū)⒖贵w裂解成Fab片段的任何酶，例如木瓜蛋白酶；3)固定步驟將包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)的巰基化試劑結(jié)合至微懸臂梁的鍍金層表面上；4)聯(lián)結(jié)步驟將步驟2)獲得的Fab片段與步驟3)獲得的已經(jīng)結(jié)合在微懸臂梁上的所述巰基化試劑聯(lián)結(jié)在一起，得到鍍金層表面上固定有Fab片段的微懸臂梁。5)將步驟4)獲得的固定有Fab片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中；6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。
6.一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟1)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成Fab片段和多個小分子片段，所述蛋白酶為能夠?qū)⒖贵w裂解成Fab片段的任何酶，例如木瓜蛋白酶；3)聯(lián)結(jié)步驟將步驟2)獲得的Fab片段與包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)的巰基化試劑聯(lián)結(jié)在一起；4)固定步驟將步驟3)獲得的一端與Fab片段聯(lián)結(jié)的所述巰基化試劑的另一端結(jié)合至微懸臂梁的鍍金層表面上，得到鍍金層表面上固定有Fab片段的微懸臂梁；5)將步驟4)獲得的固定有Fab片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中；6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法、應(yīng)力傳感元件或免疫傳感檢測系統(tǒng)，其特征在于所述巰基化試劑選自硫醇類化合物，例如11-羧基硫醇、2-氨基乙硫醇和3-巰基丙酸；鹽酸硫醇亞胺；磺基烴基琥珀酰亞胺基_6-(3’ 2-吡啶二硫-丙酰胺)_乙酸酯；3，3’ - 二硫雙磺基琥珀酰亞胺丙酸酯中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法、應(yīng)力傳感元件或免疫傳感檢測系統(tǒng)，其特征在于所述抗體為IgM、IgG、IgA、IgD、IgE中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗體片段修飾的微懸臂梁，其鍍金表面上固定有抗體Fab片段，通過減少抗體上抗原分子結(jié)合位點以外其它部分的質(zhì)量和體積，來提高抗原結(jié)合位點在微梁表面的有效修飾密度，以及分子間反應(yīng)作用力傳遞到微梁上的效率，達(dá)到提高微梁免疫檢測方法的靈敏度目的。本發(fā)明還公開了所述微懸臂梁的制備方法、基于所述抗體片段修飾的微懸臂梁的免疫傳感檢測系統(tǒng)和檢測方法。
文檔編號B81B3/00GK102951599SQ20111023891
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月19日
發(fā)明者張青川, 吳尚犬, 伍小平 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)