專利名稱：高分子-納米顆粒共軛物及使其穩(wěn)定的方法、分析系統(tǒng)及治療劑載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域的高分子功能化納米材料。特別地，本發(fā)明涉及寡核苷酸-金納米顆粒共軛物和寡核苷酸-銀納米顆粒共軛物。
背景技術(shù)：
由于米爾金(Mirkin)及其同事開發(fā)出的寡核苷酸-納米顆粒共軛物的示例，這種共軛物已引起了相當(dāng)大的興趣；其中米爾金及其同事在1990年代使用寡核苷酸-金納米顆粒(AuNP)共軛物展示了 DNA比色檢測(cè)技術(shù)。寡核苷酸提供靶序列特異性識(shí)別能力，AuNP對(duì)與靶標(biāo)的雜交作出反應(yīng)、給予溶液顏色變化。由于其典型的表面等離子體共振(SPR)吸收帶(吸收峰約為520nm)，分散的寡核苷酸-AuNP共軛物呈紅色。一旦與靶標(biāo)雜交，兩組共軛 物的交聯(lián)導(dǎo)致顆粒團(tuán)聚(particle aggregation),顆粒間距離的下降引起SPR吸收帶的紅移，因此溶液顏色變?yōu)樽仙?。替代性地，前?Maeda)及其同事設(shè)計(jì)了非交聯(lián)方法當(dāng)單組共軛物在適當(dāng)?shù)柠}濃度(即O. 5-2. 5M氯化鈉(NaCl))下與完全互補(bǔ)的靶標(biāo)雜交后，其發(fā)生團(tuán)聚。使用特別設(shè)計(jì)的序列(例如，DNA酶和適配子)，寡核苷酸-AuNP共軛物用于檢測(cè)許多非核酸分析物，包含金屬離子、小分子、蛋白質(zhì)和細(xì)胞。作為另一示例，寡核苷酸-銀納米顆粒(AgNP)共軛物也用于高靈敏度的比色檢測(cè)，這是由于其消光系數(shù)比AuNP更大。除了診斷以外，已證實(shí)這些寡核苷酸-納米顆粒共軛物、尤其AuNP對(duì)治療(例如基因和化學(xué)藥物的傳遞)以及DNA-模板化納米結(jié)構(gòu)的建立非常有用。制備寡核苷酸-AuNP共軛物和寡核苷酸-AgNP共軛物最常見的方法是將單硫醇修飾的寡核苷酸化學(xué)吸附到納米顆粒的表面。但已知的是，化學(xué)吸附的寡核苷酸對(duì)熱解吸和含硫醇的小分子的置換反應(yīng)較敏感；所述含硫醇的小分子例如酶促反應(yīng)緩沖液中經(jīng)常使用的成分——二硫蘇糖醇(DTT)和巰基乙醇。如果沒有解決的話，這一穩(wěn)定性問題將嚴(yán)重限制其應(yīng)用。例如，當(dāng)很大一部分的寡核苷酸從AuNP表面解吸時(shí)，將發(fā)生顆粒團(tuán)聚，并因此使得溶液顏色甚至在缺少任何靶標(biāo)的情況下變?yōu)樽仙?。在O. IM DTT中，這在幾分鐘內(nèi)發(fā)生。為了解決這一問題，米爾金及其同事制備了具有類固醇環(huán)狀二硫化物(steroid cyclicdisulfide)和硫醇三己酯錨定物(trihexylthiol anchor)的共軛物,其對(duì)DTT體現(xiàn)出極為增強(qiáng)的穩(wěn)定性(分別在2小時(shí)和8小時(shí)內(nèi)無團(tuán)聚)。但是，由于這些寡核苷酸的合成需要非標(biāo)準(zhǔn)的、具有較低偶聯(lián)收率(coupling yield)的亞磷酰胺,這些寡核苷酸昂貴許多。鑒于此，格拉漢姆(Graham)及其同事報(bào)導(dǎo)了合成硫辛酸修飾的寡核苷酸通過標(biāo)準(zhǔn)3’-氨基-修飾C7可控孔度玻璃固體載體和具有硫辛酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯的合成；而劉(Liu)及其同事報(bào)導(dǎo)了通過氨基修飾的寡核苷酸與二硫化碳之間的反應(yīng)合成二硫代氨基甲酸鹽修飾的寡核苷酸。這兩種鍵合有二硫化物(disulfide-linked)的共軛物在DTT中具有與鍵合有類固醇環(huán)狀二硫化物的共軛物相似的穩(wěn)定性。與硫醇-金(S-Au)鍵相似的是，硫醇修飾的寡核苷酸可通過硫醇-銀(S-Ag)鍵與AgNP結(jié)合、但具有較低的結(jié)合親和力。三環(huán)二硫化物和硫辛酸成功地用于增強(qiáng)寡核苷酸-AgNP共軛物的穩(wěn)定性。
就熱解吸而言，S-Au鍵和S-Ag鍵是熱不穩(wěn)定的。對(duì)單硫醇鍵合的寡核苷酸-AuNP共軛物而言，寡核苷酸解吸容易在高于70°C的溫度發(fā)生。這抑制了它們?cè)诟邷靥幚碇械膽?yīng)用。一個(gè)示例即為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其是使特定DNA序列擴(kuò)增使用最廣泛的方法，且在許多應(yīng)用中起到重要作用，所述許多應(yīng)用包含臨床診斷、環(huán)境監(jiān)督、食品監(jiān)管、法醫(yī)分析、生物戰(zhàn)劑檢測(cè)以及生物學(xué)研究。它涉及三個(gè)溫度下的重復(fù)循環(huán)，即用于模板/擴(kuò)增子變性的94°C、用于引物退火的約55°C以及用于引物延伸的72°C。特定序列的數(shù)量在每個(gè)熱循環(huán)中加倍，因此單拷貝的模板以百萬計(jì)(20個(gè)循環(huán))至十億計(jì)(30個(gè)循環(huán))拷貝的擴(kuò)增子結(jié)束。已報(bào)導(dǎo)了采用寡核苷酸-AuNP共軛物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行高靈敏度的比色檢測(cè)。但是，由于共軛物無法耐受熱循環(huán)過程，在擴(kuò)增后期開管添加共軛物是無法避免的，這造成較高風(fēng)險(xiǎn)的攜帶污染。與PCR期間寡核苷酸解吸相關(guān)聯(lián)的是，Taq DNA聚合酶非特性吸附到暴露的AuNP表面，并因此抑制了擴(kuò)增反應(yīng)。鑒于前述穩(wěn)定性問題、以及本領(lǐng)域中可用溶液的復(fù)雜性和高成本，明顯需要一種易于實(shí)現(xiàn)且低成本的、使寡核苷酸-AuNP共軛物和寡核苷酸-AgNP共軛物穩(wěn)定的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種易于使用、有效且成本低的使寡核苷酸與AuNP或AgNP間的共軛物穩(wěn)定的方法。作為本發(fā)明的另一目標(biāo)，提供了高度穩(wěn)定的寡核苷酸-AuNP共軛物和寡核苷酸-AgNP共軛物，其能夠在各種苛刻條件下使用(例如苛刻的化學(xué)條件和高溫)，并對(duì)特定應(yīng)用而言是必需的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供使高分子與納米顆粒間的共軛物穩(wěn)定的方法，包括以下步驟(a)將多個(gè)高分子化學(xué)吸附/吸附到納米顆粒的表面；以及(b)當(dāng)高分子已經(jīng)化學(xué)吸附/吸附到納米顆粒的表面上之后，在顆粒表面包覆(coating)薄的加強(qiáng)層(reinforcement layer)/包封層(entrapment layer)(單層或數(shù)層)。對(duì)寡核苷酸-AuNP共軛物和寡核苷酸-AgNP共軛物而言，加強(qiáng)層優(yōu)選為使用(3-巰丙基)三甲氧基硅烷(之后表示為“MPTMS”)形成的二氧化硅層。如果必要的話，可使高分子功能化，以便其能夠充分化學(xué)吸附/吸附到納米顆粒表面；例如，對(duì)寡核苷酸進(jìn)行硫醇修飾。在結(jié)合此方法所公開的本發(fā)明中，寡核苷酸作為高分子而金(Au)和銀(Ag)作為納米顆粒材料表現(xiàn)為用于闡述本發(fā)明原理的示例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)可發(fā)現(xiàn)其他高分子和納米顆粒材料。例如，可使用其他生物聚合物(例如，適配子、小干擾RNA(siRNA)和多肽/蛋白質(zhì))和合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))，連同一起可使用其他金屬、金屬氧化物(例如氧化鐵)和半導(dǎo)體的(例如CdSe/ZnS核/殼)納米顆粒。只要使用的高分子可化學(xué)吸附/吸附/鍵合/依附到使用的納米顆粒上，并且該依附需要是穩(wěn)定的，那么本發(fā)明的方法是可適用的。示例性的鍵包含硫醇-Au、氨基-Au、硫醇-Ag、二元醇-氧化鐵、氨基-氧化鐵、羧基-氧化鐵和硫醇-CdSe/ZnS。應(yīng)該注意的是，本發(fā)明適用于不同形狀/形式的納米材料，例如納米顆粒、核/殼、納米殼和納米棒。本發(fā)明的中心在于，加強(qiáng)層/包封層以與納米顆粒表面的高結(jié)合親和力為特征，并且其形成了高分子-納米顆粒共軛物表面的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。以使用MPTMS形成的二氧化硅層為例，MPTMS分子的巰基基團(tuán)化學(xué)吸附到AuNP/AgNP空缺的表面位點(diǎn)(即沒有由高分子占據(jù)的位置)，隨后三甲氧基硅烷基團(tuán)水解和縮聚，形成單個(gè)或數(shù)個(gè)二氧化硅單層。這一薄的交聯(lián)二氧化硅網(wǎng)絡(luò)包封并加強(qiáng)了化學(xué)吸附的寡核苷酸的S-Au/Ag鍵，從而增強(qiáng)共軛物的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。本發(fā)明中采用MPTMS形成的二氧化硅層的厚度小于-(CH2)6-(OCH2CH2)6-間隔段的長(zhǎng)度，優(yōu)選小于5nm。事實(shí)上，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可設(shè)想出其他加強(qiáng)型化學(xué)品。此處給定兩種通用類型的加強(qiáng)前體分子來闡釋該概念。第一個(gè)與MPTMS前體相似，具有以下結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種使高分子與納米顆粒間的共軛物穩(wěn)定的方法，其特征在于，包括以下步驟 Ca)將多個(gè)高 分子化學(xué)吸附或吸附到納米顆粒的表面；以及 (b)當(dāng)所述高分子已經(jīng)化學(xué)吸附或吸附到所述顆粒的所述表面上之后，在所述顆粒的所述表面包覆至少一個(gè)加強(qiáng)層。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述加強(qiáng)層是使用MPTMS形成的二氧化硅。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟(c):在所述步驟(a)之前使所述高分子功能化，以便能夠使所述高分子吸附到所述納米顆粒的所述表面上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)是對(duì)AuNP和AgNP的硫醇修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述高分子選擇自由寡核苷酸、適配子、siRNA、多肽、蛋白質(zhì)和PEG組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述納米顆粒是金屬材料、金屬氧化物材料或半導(dǎo)體材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述金屬納米顆粒是金納米顆?；駻uNP。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述金屬納米顆粒是銀納米顆?；駻gNP。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述高分子是寡核苷酸。
10.一種高分子-納米顆粒共軛物，其特征在于，包括 (a)具有外表面的納米顆粒； (b)覆蓋所述納米顆粒的所述外表面的加強(qiáng)層，以及 (c)多個(gè)高分子，所述多個(gè)高分子是與所述納米顆粒的所述表面直接吸附的鏈的形式，以便所述高分子的鏈的一部分在所述加強(qiáng)層內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的共軛物，其特征在于，所述高分子是生物分子或聚合物，所述納米顆粒是金屬、金屬氧化物或半導(dǎo)體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的共軛物，其特征在于，所述生物分子是寡核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的共軛物，其特征在于，所述金屬是金或銀。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的共軛物，其特征在于，所述加強(qiáng)層是采用MPTMS形成的二氧化硅。
15.一種分析系統(tǒng)，其特征在于，包括酶和權(quán)利要求10的共軛物，所述共軛物用于顯示所述酶催化的反應(yīng)的進(jìn)展。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分析系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)還包括DNA引物，其中所述酶是Taq DNA聚合酶，所述共軛物是寡核苷酸_AuNP，以及所述DNA引物具有與所述寡核苷酸-AuNP共軛物互補(bǔ)的序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分析系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)還包括DNA引物，其中所述酶是Taq DNA聚合酶，所述共軛物是寡核苷酸_AgNP，以及所述DNA引物具有與所述寡核苷酸-AgNP共軛物互補(bǔ)的序列。
18.一種治療劑載體，其特征在于，包括治療劑和權(quán)利要求10的共軛物，所述共軛物用于運(yùn)載所述治療劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的治療劑載體，其特征在于，所述共軛物是寡核苷酸-AuNP，所述治療劑與AuNP、或所述寡核苷酸、或與所述寡核苷酸-AuNP互補(bǔ)的序列連接或鍵合。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的治療劑載體，其特征在于，所述共軛物是寡核苷酸-納米顆粒，所述納米顆粒是金屬氧化物材料或半導(dǎo)體材料，所述治療劑與所述寡核苷酸-納米顆粒連接或鍵合。
21.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述加強(qiáng)層是由低聚物形成的交聯(lián)聚合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求10所述的共軛物，其特征在于，所述加強(qiáng)層是由低聚物形成的交聯(lián)聚合物。
全文摘要
一種使高分子與納米顆粒間的共軛物穩(wěn)定的方法，通過在高分子鏈已經(jīng)吸附到納米顆粒表面后在納米顆粒表面形成薄的加強(qiáng)層來實(shí)現(xiàn)。穩(wěn)定的共軛物可在大范圍的應(yīng)用中使用，例如體外診斷、體內(nèi)成像和治療，這些應(yīng)用需要在各種苛刻條件或嚴(yán)酷條件下進(jìn)行。
文檔編號(hào)B82B3/00GK102887479SQ20121025440
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者李銘鴻, 黃冠鋒, 葉社平 申請(qǐng)人:香港理工大學(xué)