專利名稱：基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物手性研究的方法
技術領域：
一種基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物手性研究的方法，屬于材料化學技術領域。
背景技術：
納米材料的自組裝是納米技術的一個研究熱點，原因在于自組裝納米材料能夠表現(xiàn)出不同于單分散的納米粒子的獨特的光學、電學、磁學和化學性質，通過研究自組裝材料的性質可以更好地理解宏觀材料的物理和化學性質。鏈狀組裝體在光電和生物傳感器設備上有很大的應用前景，一般的組裝方法為模板法或者分子連接法，但后期的物理或化學處理對粒徑間的間距以及組裝體的空間排布有不可預計的影響。聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction),是分子生物學中應用的基礎實驗手段，是上世紀80年代中期發(fā)展起來的一種體外特定核酸序列擴增技術。它具有特異性強、擴增效率高、快速、簡便、重復性好、易實現(xiàn)自動化等優(yōu)點。納米技術與生物技術相結合產(chǎn)生的納米生物技術憑借其獨特的性質得到了廣泛的研究發(fā)展，被越來越多的科研人士所青睞。而金納米粒子，由于其獨特的物理、化學性質及生物相容性，在生物電化學、材料學及生物醫(yī)學等領域都有很廣泛的應用。將納米材料結合到PCR過程中已成為近年來的研究熱點，對于提高PCR的特異性和效率和組裝結構手性性質的研究有很大的作用。本發(fā)明首次通過PCR方法進行了大金和小金的鏈狀可控組裝，并首先對鏈的手性性質進行了研究和探討。圓二色譜(CD)的原理是由不對稱分子組成的物質是光學各向異性的，物質對R和L兩種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象稱為圓二色性。這種吸收程度的不同與波長的關系稱圓二色譜，是一種測定分子不對稱結構的光譜法?？梢杂脠A二色譜研究某些立體結構，對PCR組裝后不同長度鏈狀結構體的手性進行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于聚合酶鏈反應的大金和小金的鏈狀可控組裝，并對組裝產(chǎn)物的手性性質進行研究。本發(fā)明的技術方案:基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物的手性研究方法，包括大金納米粒子和小金納米粒子的合成，其表面的引物修飾，金納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定修飾，不同長度的鏈狀可控組裝，組裝產(chǎn)物的手性性質表征。具體步驟:(I) 25nm金納米粒子合成采用朽1檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子。(2) IOnm金納米粒子合成采用單寧酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子。(3)金納米粒子和引物的偶聯(lián)
將新合成的25nm金納米粒子和巰基修飾的上游引物F-primer偶聯(lián)，新合成的IOnm金納米粒子和巰基修飾的下游引物R-primer偶聯(lián),分別形成金納米粒子_引物偶聯(lián)物。F-primer (50bp):5，-SH-(CH2) 6-TGGCTGACCCTGATGAGTTCG_3，，R-primer (50bp):5’ -SH-(CH2) 6-GGGCCATGATTACGCCAGTT_3’。(4)金納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定將金納米粒子-引物偶聯(lián)物和巰基修飾的聚乙二醇(PEGicicici)反應，以達到穩(wěn)定金納米粒子的作用。(5)鏈狀可控組裝以λ DNA為模板，通過優(yōu)化PCR擴增條件，將金納米粒子-引物偶聯(lián)物在PCR體系中進行不同循環(huán)數(shù)下的組裝，離心濃縮，得組裝產(chǎn)物。(6)組裝產(chǎn)物的TEM和手性性質表征組裝產(chǎn)物進行TEM和⑶表征。所述不同粒徑金納米粒子合成:25nm金納米粒子合成:將47.5mL的超純水加入到潔凈的三角燒瓶中，攪拌條件下加入2.5mL的濃度為2g/L的氯金酸，加熱攪拌，達沸騰，緊接著加入0.9mLl%的檸檬酸三鈉溶液，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡紫色變成紅色，反應持續(xù)6-8min以使檸檬酸三鈉完全沉降；溶液冷卻至4°C保藏，即制得粒徑為25nm的金納米粒子；IOnm金納米粒 子合成:配制lmLl%的氯金酸于79mL的超純水中，混合均勻即為A溶液；將4mLl%檸檬酸三鈉溶液、0.lmLl%的單寧酸溶液和0.1mL濃度為25mM的碳酸鉀混于15.8mL的超純水中，即為B溶液；將A和B溶液分別加熱到60°C，在高速攪拌下把B溶液迅速加到A溶液中，反應液在60°C下繼續(xù)攪拌反應，然后溶液加熱回流2min，形成亮紅色的溶液，最終冷卻至室溫合成粒徑在IOnm的金納米粒子。所述金納米粒子和引物的偶聯(lián):( i )將步驟(2)中制備好的lmL2nM25nm金納米粒子及ImLlOnMlOnm金納米粒子分別以7000rpm、13000rpm離心lOmin，棄上清，分別重懸在100 μ L的超純水中，4°C保藏、待用；(ii) 25nm金納米粒子和上游引物F-primer偶聯(lián):取(i )制備好的50 μ L25nm金納米粒子加入50 μ L200nM的F-primer，混勻，室溫反應12h ；(iii) IOnm金納米粒子和下游引物R-primer偶聯(lián):取(i )制備好的50 μ LlOnm金納米粒子加入50 μ LI μ M的R-primer，混勻，室溫反應12h ；(iv)將上述(ii )和(iii)步驟中反應溶液分別在7000rpm、13000rpm離心lOmin,棄
上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，4°C保藏、待用；所述金納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定:將步驟(3)中的金納米粒子-引物偶聯(lián)物中加入2μ LlOOyM的PEGicicici，反應12h，反應后的溶液在8000rpm離心lOmin，棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，4°C保藏、待用。所述鏈狀可控組裝:(a)PCR:以λ DNA為模板,采用制得的25nm金納米粒子-F-Primer及IOnm金納米粒子-R-Primer 進行 PCR，PCR 反應體系:dNTPsl μ L，0.5 μ L 的 Taq DNA 聚合酶，λ DNA 模板質粒0.5 μ L, PCR反應緩沖液5 μ L,分別取25nm金納米粒子-F_Primer4 μ L和IOnm金納米粒子-R_Primer4y L,加滅菌水至總體積為50μ L ；(b)擴增程序為:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，2 20個循環(huán)；72°C再延伸IOmin ; 10°C保存，得PCR產(chǎn)物。所述組裝產(chǎn)物的TEM和手性性質表征:取500 μ L PCR產(chǎn)物進行8000rpm離心lOmin，棄上清，沉淀用100 μ L的超純水分
散，進行TEM和⑶表征。其中:dNTPs (購自上海生工)，Taq DNA聚合酶(購自上海生工)，λ DNA模板質粒(購自寶成生物工程有限公司)，PCR反應緩沖液(購自上海生工)。表I模板、上下游引物和模板序列及長度
權利要求
1.一種基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物手性研究的方法，其特征在于包括大金納米粒子和小金納米粒子的合成，其表面的引物修飾，金納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定，不同長度的鏈狀可控組裝，組裝產(chǎn)物的手性性質表征； 具體步驟: (1)25nm金納米粒子合成 采用朽1檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子； (2)IOnm金納米粒子合成 采用單寧酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子； (3)金納米粒子和引物的偶聯(lián) 將新合成的25nm金納米粒子和巰基修飾的上游引物F-primer偶聯(lián),新合成的IOnm金納米粒子和巰基修飾的下游引物R-primer偶聯(lián),分別形成金納米粒子-引物偶聯(lián)物；F-primer:5’ -SH-(CH2) 6-TGGCTGACCCTGATGAGTTCG_3，，擴增長度為 50bp ；R-primer:5’ -SH-(CH2) 6-GGGCCATGATTACGCCAGTT_3’，擴增長度為 50bp ； (4)金納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定 將金納米粒子-引物偶聯(lián)物和巰基修飾的聚乙二醇PEG.反應，以穩(wěn)定金納米粒子； (5)鏈狀可控組裝 以λ DNA為模板，通過優(yōu)化PCR擴增條件，將金納米粒子-引物偶聯(lián)物在PCR體系中進行不同循環(huán)數(shù)下的可控組裝，離心濃縮，得組裝產(chǎn)物； (6)組裝產(chǎn)物的TEM和手性性質表征 組裝產(chǎn)物進行TEM和⑶表征。
2.根據(jù)權利要求1所述基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物手性研究的方法，其特征在于不同粒徑金納米粒子合成: 25nm金納米粒子合成:將47.5mL的超純水加入到潔凈的三角燒瓶中，攪拌條件下加入2.5mL的濃度為2g/L的氯金酸，加熱攪拌，達沸騰，緊接著加入0.9mLl%的檸檬酸三鈉溶液，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡紫色變成紅色，反應持續(xù)6-8min以使檸檬酸三鈉完全沉降；溶液冷卻至4°C保藏，即制得粒徑為25nm的金納米粒子； IOnm金納米粒子合成:配制lmLl%的氯金酸于79mL的超純水中，混合均勻即為A溶液；將4mLl%檸檬酸三鈉溶液、0.lmLl%的單寧酸溶液和0.1mL濃度為25mM的碳酸鉀混于15.8mL的超純水中，即為B溶液；將A和B溶液分別加熱到60°C，在高速攪拌下把B溶液迅速加到A溶液中，反應液在60°C下繼續(xù)攪拌反應，然后溶液加熱回流2min，形成亮紅色的溶液，最終冷卻至室溫合成粒徑在IOnm的金納米粒子。
3.根據(jù)權利要求1所述基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物手性研究的方法，其特征在于金納米粒子和引物的偶聯(lián): (i )將步驟(2)中制備好的lmL2nM25nm金納米粒子及ImLlOnMlOnm金納米粒子分別以7000rpm、13000rpm離心lOmin，棄上清，分別重懸在100 μ L的超純水中，4°C保藏、待用；( ) 25nm金納米粒子和上游引物F-primer偶聯(lián):取(i )制備好的50 μ L25nm金納米粒子加入50 μ L200nM的F-primer，混勻，室溫反應12h ； (iii) IOnm金納米粒子和下游引物R-primer偶聯(lián):取(i )制備好的50 μ LlOnm金納米粒子加入50 μ LI μ M的R-primer ，混勻，室溫反應12h ；(iv)將上述(ii )和(iii)步驟中反應溶液分別在7000rpm、13000rpm離心IOmin,棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀,4°C保藏、待用。
4.根據(jù)權利要求1所述基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物手性研究的方法，其特征在于金納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定: 將步驟(3)所得的金納米粒子-引物偶聯(lián)物中加入2μ LlOOyM的PEGicitltl，室溫反應12h，反應后的溶液在8000rpm離心lOmin，棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，4°C保藏、待用。
5.根據(jù)權利要求1所述基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物手性研究的方法，其特征在于鏈狀可控組裝: (a)PCR:以λ DNA為模板,采用制得的25nm金納米粒子-F-Primer及IOnm金納米粒子-R-Primer 進行 PCR，PCR 反應體系:dNTPsl μ L, Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，λ DNA 模板質粒0.5 μ L, PCR反應緩沖液5 μ L,分別取25nm金納米粒子-F-Primer4 μ L和IOnm金納米粒子-R_Primer4 μ L,加滅菌水 至總體積為50 μ L ; (b)擴增程序為:94°C預變性3min;94°C變性30s，60。。退火30s，72。。延伸lmin，2 20個循環(huán)；72°C再延伸IOmin ; 10°C保存，得PCR可控組裝產(chǎn)物。
6.根據(jù)權利要求1所述基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物手性研究的方法，其特征在于組裝產(chǎn)物的TEM和手性性質表征: 取500yL PCR產(chǎn)物進行8000rpm離心lOmin，棄上清，沉淀用100 μ L的超純水分散，進行TEM和⑶表征。
全文摘要
基于聚合酶鏈反應的大小金鏈狀可控組裝產(chǎn)物手性研究的方法，屬于材料化學技術領域。本發(fā)明主要內(nèi)容為首先合成不同粒徑25nm和10nm的金納米粒子，通過對金納米粒子表面引物偶聯(lián)量的可控修飾，達到金納米粒子在PCR體系中的穩(wěn)定性，并對金納米粒子-引物偶聯(lián)物用PEG1000進行修飾。在合適的PCR條件下，進行大小金的鏈狀可控組裝，并對可控組裝產(chǎn)物進行TEM表征和CD信號研究比較。本發(fā)明首次通過PCR方法進行了大金和小金的鏈狀可控組裝，并首次對不同循環(huán)數(shù)下PCR組裝的不同長度鏈狀組裝產(chǎn)物的手性性質進行了研究和探討。
文檔編號B82Y40/00GK103212706SQ201310080609
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權日2013年3月13日
發(fā)明者王利兵, 趙媛, 胥傳來, 馬偉, 徐麗廣, 匡華, 劉麗強, 宋珊珊, 胡擁明, 丁利 申請人:江南大學