一種多用途聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種多用途聚賴(lài)氨酸熒光自組裝載藥納米微球及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明采用納米自組裝技術(shù)制備了羅丹明標(biāo)記的聚賴(lài)氨酸熒光納米微球，并修飾了帶有二硫鍵的疊氮基團(tuán)側(cè)鏈，進(jìn)一步采用點(diǎn)擊化學(xué)方法將炔基修飾的藥物連接在熒光納米微球上。本發(fā)明所制備的鏈接藥物的聚賴(lài)氨酸納米自組裝微球可用于被修飾藥物在動(dòng)物以及細(xì)胞水平的示蹤成像分析。同時(shí)利用該微球還可以用于捕獲被修飾藥物的結(jié)合蛋白，并通過(guò)裂解二硫鍵可釋放出靶點(diǎn)結(jié)合蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白，可用于藥物作用靶點(diǎn)的研究。本發(fā)明提供了一種研究藥物作用靶點(diǎn)的簡(jiǎn)便快捷的工具和方法，該方法集合藥物示蹤、靶點(diǎn)定位、靶點(diǎn)蛋白捕獲及分離功能于一體，簡(jiǎn)便易行，在藥物作用機(jī)制研究以及靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)方面有很好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種多用途聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體及其制備方 法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種連接有熒光示蹤基團(tuán)的聚賴(lài)氨酸納米自 組裝微球載體的制備工藝，并進(jìn)一步采用點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)共價(jià)偶聯(lián)被修飾藥物的方法。以及 利用本發(fā)明所制備的載藥微球，對(duì)被修飾藥物進(jìn)行的整體動(dòng)物和細(xì)胞水平的示蹤成像分 析，藥物靶點(diǎn)定位，靶點(diǎn)蛋白捕獲分離方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] ε -聚賴(lài)氨酸（P〇ly-L-lySine，PL)是由25?30個(gè)賴(lài)氨酸殘基通過(guò)酰胺鍵依次連 接而成的同型單體直鏈狀聚合物。聚賴(lài)氨酸為白色或淡黃色粉末，吸濕性強(qiáng)，略有苦味，不 受pH值影響。ε -聚賴(lài)氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，其具有抑菌譜廣、水溶性大、熱穩(wěn) 定性好、可生物降解且對(duì)人和環(huán)境無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為優(yōu)良的食品防腐保鮮劑。ε -聚 賴(lài)氨酸能在人體內(nèi)分解為賴(lài)氨酸，而賴(lài)氨酸是人體必需的氨基酸，也是世界各國(guó)允許在食 品中強(qiáng)化的氨基酸。因此ε-聚賴(lài)氨酸是一種營(yíng)養(yǎng)型抑菌劑，安全性高于其他化學(xué)防腐劑， 其急性口服毒性為5 g/kg。ε_(tái)聚賴(lài)氨酸的抑菌譜廣，對(duì)于酵母屬中的尖銳假絲酵母、法紅 酵母、產(chǎn)膜畢氏酵母、玫瑰擲孢酵母；革蘭氏陽(yáng)性菌中的耐熱脂肪芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、 枯草芽孢桿菌；以及革蘭氏陰性菌中的產(chǎn)氣節(jié)桿菌、大腸桿菌等引起食物中毒與腐敗的菌 有強(qiáng)烈的抑制作用。分子量在3600?4300之間的ε-聚賴(lài)氨酸其抑菌活性最好，當(dāng)分子 量低于1300時(shí)，ε-聚賴(lài)氨酸則失去抑菌活性。
[0003] 此外，由于ε -聚賴(lài)氨酸帶正電，能與帶負(fù)電的物質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的靜電吸引力，易 通過(guò)生物膜且不易分解，可以有效降低藥物阻力提高藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。聚賴(lài)氨酸還具有 能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附以及促進(jìn)細(xì)胞發(fā)揮正常功能等作用，因此作為藥物的緩釋和靶向 載體ε-聚賴(lài)氨酸已被廣泛用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。作為生物高分子材料骨架，中國(guó)專(zhuān)利（申 請(qǐng)?zhí)枺?014100723354)公開(kāi)了一種可溶解凝血酶納米顆粒的制備方法，該納米顆粒以凝血 酶為核心，外殼是由水溶性直鏈淀粉與聚賴(lài)氨酸交聯(lián)形成的納米粒子；中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枺?2013107289643, 2013106763740)分別公開(kāi)了 ε -聚賴(lài)氨酸水凝膠的制備方法，以及由該發(fā) 明衍生的傷口組織愈合材料；中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枺?012101329801)提供了一種兩親性三嵌 段共聚物的納米載體制劑，該共聚物由包含聚乙二醇衍生物、聚賴(lài)氨酸和聚亮氨酸的線(xiàn)性 高分子化合物組成，在水溶液中可以自組裝形成具有三層結(jié)構(gòu)的納米載體，并能有效負(fù)載 小分子疏水性藥物、基因以及蛋白質(zhì)或多肽。
[0004] 作為藥物載體，中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枺?013106705336)提供了一種作為疏水性藥物的 載體的雙敏感響應(yīng)型聚合物納米膠束，其成分為正丁胺-聚賴(lài)氨酸（葉酸/2, 3-二甲基馬 來(lái)酸）-b_聚半胱氨酸；中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枺?004100680618)公開(kāi)了一種短肽修飾的聚賴(lài)氨 酸與聚乳酸共聚物納米粒，該納米粒包括藥物和由精氨酰一甘氨酰一天冬氨酰序列短肽、 修飾的聚賴(lài)氨酸一聚乳酸共聚物納米粒載體組成，可用于有機(jī)藥物、水溶性藥物或水不溶 性抗癌藥物；中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枺?004100466794)提供了一種應(yīng)用"成膠現(xiàn)象"合成半乳糖 化海藻酸鈉與多聚賴(lài)氨酸納米膠的制備方法，所得到的肝靶向性納米基因載體系統(tǒng)能為原 發(fā)性肝癌的靶向基因治療提供材料；此外，中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枺?013101802363)還公開(kāi)了一 種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體，其中雙敏感兩親性嵌段共聚物由還原敏感的二硫鍵 及pH敏感的碳氮雙鍵橋連親水性聚乙二醇和疏水性芐氧羰基保護(hù)的聚賴(lài)氨酸而成。該載 體制劑具有疏水雙分子膜及親水內(nèi)腔，疏水雙分子膜負(fù)載疏水藥物，親水內(nèi)腔負(fù)載親水藥 物，可有效利用腫瘤細(xì)胞中的還原環(huán)境及酸性環(huán)境使得載體制劑崩解釋放藥物實(shí)現(xiàn)靶向釋 藥。
[0005] 作為熒光成像納米材料的骨架，中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枺?012102228846)公開(kāi)了一種 功能性近紅外熒光納米微粒的制備方法。該納米微粒平均粒徑在15nm左右，以所裝載的 近紅外熒光染料作為發(fā)光中心，以殼聚糖、聚賴(lài)氨酸為基本骨架，經(jīng)海藻酸鈉自組裝包裹 成殼制備而成；中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枺?01310470907X)還提供了一種信號(hào)放大型免疫熒光探 針的制備方法。該探針的制備方法包括：在縮合劑的存在下，對(duì)苯二胺和均苯三甲酸經(jīng) 縮合反應(yīng)得到多羧基大分子，多羧基大分子經(jīng)活化后，依次加入抗體、聚賴(lài)氨酸進(jìn)行反應(yīng)， 再用熒光標(biāo)記物標(biāo)記制得所述的探針。該探針標(biāo)記有較多熒光標(biāo)記物，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可用于 熒光免疫檢測(cè)，具有檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、成本低等特點(diǎn)。此外，中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)枺?2013101802363)還公開(kāi)了一種兩親性三嵌段聚多肽ICG膠束，該膠束包括了分散有吲哚菁 綠并由聚亮氨酸形成的內(nèi)核，以及環(huán)繞內(nèi)核由聚賴(lài)氨酸形成的中間層及部分穿插于所述中 間層的由聚乙二醇形成的外殼。該膠束具備良好的空間穩(wěn)定性以及出色的熒光性能、光熱 轉(zhuǎn)換能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞或組織進(jìn)行光學(xué)成像和光熱治療。
[0006] 綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外均以聚賴(lài)氨酸或共混其他高分子材料為骨架進(jìn)行相關(guān)材料 的開(kāi)發(fā)。但尚未見(jiàn)以聚賴(lài)氨酸自身為骨架，一方面通過(guò)酰胺鍵共價(jià)連接熒光分子(羅丹明)， 并通過(guò)自組裝技術(shù)制備納米顆粒，另一方面采用點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)共價(jià)結(jié)合可釋放藥物分子； 同時(shí)可進(jìn)行被修飾藥物的體內(nèi)外示蹤成像分析，靶點(diǎn)定位以及靶點(diǎn)蛋白捕獲分離，集合上 述功能用途為一體的聚賴(lài)氨酸納米材料的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是利用納米自組裝技術(shù)，通過(guò)引入熒光基團(tuán)和可被裂解釋藥的二硫 鍵基團(tuán)制備聚賴(lài)氨酸載藥納米微球，并利用聚賴(lài)氨酸的生物相容性實(shí)現(xiàn)被修飾藥物在動(dòng)物 組織和細(xì)胞內(nèi)的示蹤，以及靶點(diǎn)蛋白及其相關(guān)蛋白的捕獲分離，提供一種多用途聚賴(lài)氨酸 熒光自組裝納米微球載體的制備方法與應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明可解決現(xiàn)有技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)的藥物示蹤和靶點(diǎn)捕獲一體化的問(wèn)題。并以含有 羥基或羧基的藥物為例，通過(guò)丙炔酸酯化或丙炔胺的酰胺化修飾引入炔基，并通過(guò)和微球 上修飾的疊氮基團(tuán)的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將藥物連接到微球載體上，運(yùn)用同一納米載藥微球，分 別實(shí)現(xiàn)了藥物體內(nèi)代謝示蹤、細(xì)胞內(nèi)定位、以及靶點(diǎn)蛋白捕獲分離等不同應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供了一種多用途聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體，該載體是在骨架材 料上共價(jià)連接有熒光標(biāo)記基團(tuán)和藥物分子制成；所述的骨架材料是由含有25?30個(gè)賴(lài)氨 酸殘基通過(guò)酰胺鍵依次連接而成的同型單體聚合物；所述骨架材料上的賴(lài)氨酸殘基同時(shí)修 飾了帶有二硫鍵的疊氮基團(tuán)側(cè)鏈以及熒光標(biāo)記物，能夠通過(guò)自組裝制備納米微球，并能用 于藥物分子的連接。
[0010] 所述的熒光標(biāo)記基團(tuán)是含有羅丹明的標(biāo)記分子。具體是通過(guò)市售的羅丹明活化酯 (NHS-羅丹明），與聚賴(lài)氨酸的氨基以酰胺鍵的形式和納米微球載體相連接。
[0011] 所述的帶有二硫鍵的疊氮基團(tuán)側(cè)鏈，具體是通過(guò)市售的疊氮化試劑 (Sulfo-SADP)，其一端是活化酯，通過(guò)聚賴(lài)氨酸的氨基以酰胺鍵的形式與納米微球載體相 連接。
[0012] 所述的藥物分子，是炔基修飾的藥物衍生物，通過(guò)丙炔酸與含有羥基的藥物進(jìn)行 酯化反應(yīng)引入炔基，或通過(guò)丙炔胺與含有羧酸的藥物進(jìn)行酰胺化反應(yīng)引入炔基，并進(jìn)一步 通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)的方法將其炔基修飾的藥物衍生物與含有疊氮側(cè)鏈納米微球載體相連接。
[0013] 具體制備方法如下： 第1、向含有1%至5% Span-80的由汽油和四氯化碳組成的混合有機(jī)相(汽油和四氯化 碳的體積比可為1:3至3:1)中加入NHS-羅丹明溶解，并再加入溶解有0. 2%-2%的聚賴(lài)氨 酸的水相溶液。其中有機(jī)相和水相的比例為1:1至5:1，NHS-羅丹明的用量為聚賴(lài)氨酸的 0. 5%至10%。10, 000至20, 000轉(zhuǎn)高速攪拌后得到乳化液。
[0014] 第2、將上述乳化液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分別加入上述體積比1:1至5:1的石油醚 以及水溶液，混合均勻后靜置分層，收集水相，離心棄去沉淀，上清液即為自組裝的聚賴(lài)氨 酸熒光納米微球； 第3、向第2步得到的納米微球溶液中加入疊氮化試劑Sulfo-SADP，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0. 5 小時(shí)至5小時(shí)，得疊氮修飾的納米微球，其中Sulfo-SADP的用量為聚賴(lài)氨酸用量的10%至 100% ； 第4、進(jìn)一步將炔基修飾的藥物緩慢滴入第3步得到的納米微球溶液中，攪拌條件下加 入點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的催化劑，室溫反應(yīng)〇. 5小時(shí)至5小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)超濾濃縮，即為連接有藥 物的熒光納米微球。其中炔基修飾藥物的用量為聚賴(lài)氨酸用量的10%至100% ;所述的炔基 修飾的藥物，是采用丙炔酸與含有羥基的藥物通過(guò)酯化的方式制備的丙炔酸酯，或采用丙 炔胺與含有羧基的藥物通過(guò)酰胺化的方式制備的丙炔酰胺衍生物。
[0015] 此外，本發(fā)明還提供了上述聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球在藥物示蹤與靶點(diǎn)蛋白 捕獲方面的應(yīng)用。其中包括被修飾藥物牛蒡子苷元的動(dòng)物以及細(xì)胞水平的成像分析；以 及利用甘草次酸修飾的納米微球捕獲甘草次酸靶點(diǎn)蛋白的過(guò)程，包括通過(guò)納濾分級(jí)截留分 離，裂解二硫鍵釋放出靶點(diǎn)蛋白的具體步驟。
[0016] 本發(fā)明提供的納米微球的應(yīng)用之一：在藥物示蹤方面的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明首先制備了載有牛蒡子苷元的聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球，并通過(guò)激光 粒度儀、透射電子顯微鏡分析了上述微球的粒徑和形狀；采用熒光光譜儀考察了其熒光特 性；并進(jìn)一步通過(guò)激光共聚焦顯微鏡以及小動(dòng)物活體成像技術(shù)評(píng)價(jià)了其在體和細(xì)胞水平的 分布情況。
[0018] 本發(fā)明提供的納米微球的應(yīng)用之二：靶點(diǎn)蛋白捕獲方面的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明中所述的靶點(diǎn)蛋白捕獲方面的應(yīng)用，利用超濾分級(jí)截留分離捕獲靶點(diǎn)蛋 白，包括以下步驟：孵育細(xì)胞、細(xì)胞裂解、離心、超濾除雜、洗滌、還原釋放蛋白、超濾洗脫等 步驟(附圖1)。具體操作如下： 向人肺上皮BEAS-2B細(xì)胞中加入連接甘草次酸的聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球，培 養(yǎng)48小時(shí)后，經(jīng)胰酶消化，超聲破碎，離心，得到結(jié)合有靶標(biāo)蛋白的聚賴(lài)氨酸納米微球懸濁 液。將上述含有納米微球的溶液加入到截留分子量為3 kD的超濾管中，離心棄去小分子， 將截留液加入到截留分子量為1〇〇 kD的超濾管中，離心棄去未結(jié)合的大分子蛋白，進(jìn)一步 向截留液中加入二硫蘇糖醇（DTT)溶液還原二硫鍵，再次加入到截留分子量為100 kD的超 濾管中，離心，收集濾液得到與甘草次酸結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白以及相關(guān)蛋白。
[0020] 綜上所述，本發(fā)明提供了一種研究藥物分布以及作用靶點(diǎn)所需要的簡(jiǎn)便快捷的載 體工具和方法，該聚賴(lài)氨酸載藥熒光納米微球，集靶點(diǎn)定位，靶點(diǎn)蛋白捕獲與分離功能于一 體，可用于藥物作用機(jī)制的研究。
[0021] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果： 本發(fā)明提供了一種制備多用途聚賴(lài)氨酸熒光納米自組裝載藥微球的新方法，并創(chuàng)新性 的同時(shí)引入羅丹明熒光標(biāo)記和可被還原裂解的二硫鍵的疊氮基團(tuán)，通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)連接 炔基修飾藥物。所制備的納米自組裝載藥微球呈球形，粒度分散均勻，平均粒徑為38 nm，具 有良好的膠體性質(zhì)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為600 nm，可以有效避免生物樣本自身的干擾，被突光檢 測(cè)和示蹤。同時(shí)該納米微球生物相容性好，有利于穿過(guò)細(xì)胞膜，可以順利地指示和捕獲靶點(diǎn) 蛋白，并通過(guò)裂解二硫鍵可釋放出靶點(diǎn)蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白。該方法制備工藝簡(jiǎn)便易行，所制 備的載藥納米微球集靶點(diǎn)示蹤定位，靶點(diǎn)蛋白捕獲及分離功能于一體，可用于被修飾藥物 的動(dòng)物和細(xì)胞水平的成像分析，以及靶點(diǎn)蛋白分離鑒定，在藥物作用機(jī)制的研究方面有很 好的應(yīng)用前景。
[0022]

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1是實(shí)施例1，2和3,疊氮修飾的聚賴(lài)氨酸熒光納米微球的合成路線(xiàn)圖； 圖2是實(shí)施例4,藥物分子牛蒡子苷元的炔基化修飾以及與聚賴(lài)氨酸熒光納米微球連 接路線(xiàn)示意圖； 圖3是實(shí)施例5,聚賴(lài)氨酸熒光納米自組裝載藥納米微球的形態(tài)學(xué)和熒光特性考察。其 中，A為納米微球溶液中分散狀況照片；B為納米微球的膠體特性示意圖；C為納米微球粒 徑分布圖；D為納米微球TEM透射電鏡的整體照片；E為納米微球TEM透射電鏡的放大照片； F為羅丹明溶液和聚賴(lài)氨酸熒光納米自組裝微球膠體溶液的熒光發(fā)射光譜圖； 圖4是實(shí)施例6,藥物分子甘草次酸的炔基化修飾以及與聚賴(lài)氨酸熒光納米微球連接 路線(xiàn)不意圖； 圖5是實(shí)施例7,牛蒡子苷元載藥的聚賴(lài)氨酸熒光納米微球的細(xì)胞成像圖和小鼠活體 成像示蹤圖片。A組為細(xì)胞加入實(shí)施例1所制備的聚賴(lài)氨酸熒光空白納米微球的陰性對(duì) 照，其中，A1為細(xì)胞DAPI染色圖片，A2為細(xì)胞熒光照片，A3為A1和A2的疊加照片；B組為 細(xì)胞加入實(shí)施例2所制備的牛蒡苷元修飾的聚賴(lài)氨酸熒光納米載藥微球的照片，其中，B1 為細(xì)胞DAPI染色圖片，B2為細(xì)胞熒光照片，B3為B1和B2的疊加照片；C組為實(shí)施例2所 制備的聚賴(lài)氨酸熒光納米載藥微球的小鼠活體示蹤圖片；其中，C1為給藥前0分鐘，C2為 給藥后60分鐘的活體成像圖片； 圖6是實(shí)施例8,聚賴(lài)氨酸納米載藥微球捕獲靶點(diǎn)蛋白的操作示意圖； 圖7是實(shí)施例8,實(shí)施例5所制備的甘草次酸載藥納米微球捕獲靶點(diǎn)蛋白的SDS-PAGE 電泳檢測(cè)圖。其中，第1泳道為蛋白Marker ;第2泳道為細(xì)胞裂解蛋白樣品；第3泳道為經(jīng) 過(guò)3 kD超濾管超濾的濾過(guò)液；第4泳道為濾液中截留蛋白；第5泳道為DTT還原后，經(jīng)過(guò) 100 kD超濾管超濾的截留液；第6泳道為DTT還原后，經(jīng)過(guò)100 kD的超濾管超濾后的濾過(guò) 液。
[0024]

【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1、聚賴(lài)氨酸高度熒光化修飾納米微球的制備與疊氮化修飾 取5 g聚賴(lài)氨酸鹽酸鹽溶于500 mL純水，上樣于活化的001X7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 (2X80cm)脫鹽，上樣速度為1 mL/分鐘。經(jīng)1500 mL純水平衡至流出液為中性后，用5%氨 水洗脫，收集洗脫液，減壓蒸餾，濃縮干燥，得白色至淡黃色固體1. 9 g。
[0026] 取上述脫鹽后的聚賴(lài)氨酸200 mg于10 mL純水中，攪拌使其完全溶解得水相溶 液；同時(shí)分別將13 mL汽油、12 mL四氯化碳以及1. 25mL Span-80混合，攪拌均勻獲得有機(jī) 相。向有機(jī)相中加入20 mg NHS-羅丹明（NHS_Rhodamine，Pierce 46406)，攪拌混勻，放置 備用。將上述水相迅速倒入有機(jī)相中，12, 000轉(zhuǎn)攪拌30秒，重復(fù)3次，得到均勻的乳化液， 轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。分別加入50 mL石油醚，室溫?cái)嚢?分鐘，再加入10 mL純水，繼續(xù)攪 拌5分鐘，靜置分層，收集水相，得到熒光納米微球粗品。將粗品12, 000轉(zhuǎn)離心10分鐘， 棄去沉淀，上清液即為聚賴(lài)氨酸熒光化修飾的納米自組裝微球。
[0027] 取上述2 mL聚賴(lài)氨酸熒光納米微球溶液，加入疊氮化試劑10 mg Sulfo-SADP (Pierce 21553)(0. 02 mmoL)，室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，得帶有二硫鍵并疊氮修飾的納米自組裝 聚賴(lài)氨酸納米微球，4 °C保存?zhèn)溆?。合成路線(xiàn)如圖1所示。
[0028] 實(shí)施例2、聚賴(lài)氨酸熒光納米微球的制備與疊氮化修飾 取上述實(shí)施例1脫鹽后的聚賴(lài)氨酸50 mg溶于10 mL純水中，得水相溶液；同時(shí)分別將 5mL汽油、15mL四氯化碳以及0.5 mL Span-80混合，攪拌均勻獲得有機(jī)相。向有機(jī)相中加 入0. 1 mg NHS-羅丹明（NHS-Rhodamine，Pierce 46406)，攪拌溶解，放置備用。將上述水相 迅速倒入有機(jī)相中，20, 000轉(zhuǎn)高速攪拌15秒，重復(fù)3次，得到均勻的乳化液，轉(zhuǎn)移至分液漏 斗中。分別加入20 mL石油醚，攪拌5分鐘，再加入10 mL純水，繼續(xù)攪拌5分鐘，靜置分 層，收集水相，得到熒光納米微球粗品。將粗品12, 000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄去沉淀，上清液即 為聚賴(lài)氨酸熒光納米自組裝微球。取上述聚賴(lài)氨酸熒光納米微球溶液2 mL，加入疊氮化試 劑50 mg Sulfo-SADP (Pierce 21553) (0· 1 mmoL)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，得到疊氮化修飾的 納米自組裝聚賴(lài)氨酸納米微球，4 °C備用。合成路線(xiàn)同圖1。
[0029] 實(shí)施例3、聚賴(lài)氨酸熒光納米微球的制備與高度疊氮化修飾 取上述實(shí)施例1脫鹽后的聚賴(lài)氨酸20 mg溶于10 mL純水中，得水相溶液；同時(shí)分別 將15 mL汽油、5 mL四氯化碳以及0.2mL Span-80混合，攪拌均勻獲得有機(jī)相。向有機(jī)相中 加入 2 mg NHS-羅丹明（NHS-Rhodamine，Pierce 46406) (0.002 mmoL)，攬祥溶解，放置備 用。將上述水相迅速倒入有機(jī)相中，10, 〇〇〇轉(zhuǎn)高速攪拌20秒，重復(fù)3次，得到均勻的乳化 液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。分別加入10 mL石油醚，攪拌5分鐘，再加入10 mL純水，繼續(xù)攪 拌5分鐘，靜置分層，收集水相，得到熒光納米微球粗品。將粗品12, 000轉(zhuǎn)離心10分鐘， 棄去沉淀，上清液即為聚賴(lài)氨酸熒光納米自組裝微球。取上述聚賴(lài)氨酸熒光納米微球溶液 4 mL，加入疊氮化試劑 200 mg Sulfo-SADP (Pierce 21553)(0.4 mmoL)，室溫?cái)嚢?5 小時(shí)， 可得到高度疊氮化修飾的納米自組裝聚賴(lài)氨酸納米微球，4 °C備用。合成路線(xiàn)同圖1。
[0030] 實(shí)施例4、牛蒡子苷元的炔基化修飾以及與聚賴(lài)氨酸熒光納米微球的連接 以含有酚羥基的藥物牛蒡苷元為例，通過(guò)與丙炔酸的酯化反應(yīng)進(jìn)行藥物的炔基化修 飾，進(jìn)一步通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與實(shí)施例1所制備的疊氮化修飾的聚賴(lài)氨酸熒光納米微球偶 聯(lián)，合成路線(xiàn)見(jiàn)圖2。具體實(shí)施如下： 向圓底燒瓶中分別加入〇. 372 g牛蒡子苷元（1 mmoL)，0. 198 g EDOHC1 (2 mmoL)， 以及5 mL預(yù)冷的CH2C12溶劑，磁力攪拌30分鐘，溶解后再依次加入0. 116 g N-羥基琥珀 酰亞胺（NHS，2 mm〇L)，0. 140 g丙炔酸（2 mmoL)，保持冰浴反應(yīng)4小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后， 向反應(yīng)液中加入15 mL CH2C12稀釋?zhuān)缓笠来斡?M HC1，5% NaHC03溶液，以及飽和食鹽水 洗滌。收集有機(jī)相，加入無(wú)水Na2S04干燥，過(guò)濾，減壓蒸餾濃縮，得到油狀物即為牛蒡子苷元 丙炔酸酯粗品。
[0031] 將粗品過(guò)硅膠柱純化，得到白色固體粉末，稱(chēng)重得牛蒡子苷元丙炔酸酯0. 196 g， 產(chǎn)率約為 47%。=0.7 (PE / EtOAc 1:1);屮 NMR [CDC13, 400 MHz] 6.98-6.94 (m, 1H), 6.79-6.75 (m, 2H), 6.68-6.65 (m, 1H), 6.58-6.50 (m, 2H), 3.84(s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.76-3.74 (m, 2H), 2.97-2.95 (m, 2H), 2.83 (s, 1H), 2.66-2.48 (m, 4H)。
[0032] 取上述所得的5 mg牛蒡子苷元丙炔酸酯（0. 01 mmoL)溶于100 μ L二甲基亞 砜（DMS0)中，并將其緩慢滴入實(shí)施例1制備的1 mL疊氮修飾的聚賴(lài)氨酸自組裝納米微球 溶液中，最后加入點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的催化劑（〇. 2 mmol/L Tris-triazoleamine，1.0 mmol/L &^04和2.0 mmol/L抗壞血酸鈉)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入到截留分子量為3 MilliporekD的超濾管中，3000轉(zhuǎn)離心30分鐘，棄去濾液，分別用0. 2 mmol/L磷酸鹽緩沖 液2 mL洗滌2次，收集截留液，即為連接有牛蒡子苷元的高度熒光化修飾的納米微球。
[0033] 實(shí)施例5、聚賴(lài)氨酸熒光納米微球的形態(tài)學(xué)與熒光特征 上述實(shí)施例3所制備的牛蒡子苷元修飾的聚賴(lài)氨酸熒光納米載藥微球在水溶液中呈 現(xiàn)橙黃色，且分散均勻（圖3 A)。通過(guò)線(xiàn)光源照射，能夠明顯看到丁達(dá)爾現(xiàn)象，證明是膠體溶 液，如圖3 B所示。經(jīng)激光粒度分析儀分析，其平均粒徑為38 nm (圖3 C)。采用TEM透射 電子顯微鏡進(jìn)行觀查，該聚賴(lài)氨酸納米微球的粒徑大小均勻，呈規(guī)則球狀（圖3 D)，進(jìn)一步 放大觀測(cè)顯示其內(nèi)部為空心狀，如圖3 E所示。
[0034] 采用熒光光譜儀分別對(duì)相同用量的羅丹明溶液和聚賴(lài)氨酸熒光納米微球進(jìn)行了 熒光光譜掃描，考察納米自組裝球的熒光特性。如圖3F所示，在507nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，羅丹 明溶液的最大發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm，而聚賴(lài)氨酸熒光納米微球的最大發(fā)射波長(zhǎng)接近600 nm。 但二者的熒光強(qiáng)度明顯不同，羅丹明溶液的熒光強(qiáng)度為625 a. u，而熒光納米微球的熒光強(qiáng) 度為1149 a. u幾乎增加了一倍。這是因?yàn)榫圪?lài)氨酸將熒光染料羅丹明較為集中地組裝到 納米微球的內(nèi)部，微球內(nèi)部的熒光量子效率提高導(dǎo)致熒光強(qiáng)度得到增強(qiáng)，符合近紅外熒光 探針的基本要求，可有效避免生物樣本的自身干擾，適合藥物分子的示蹤分析。
[0035] 實(shí)施例6、甘草次酸的炔基化修飾以及與聚賴(lài)氨酸熒光納米微球的連接 以含有羧酸的藥物甘草次酸為例，通過(guò)與丙炔胺的酰胺化反應(yīng)進(jìn)行藥物的炔基化修 飾，進(jìn)一步通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與實(shí)施例2所制備的高度疊氮化修飾的聚賴(lài)氨酸熒光納米微 球偶聯(lián)，合成路線(xiàn)見(jiàn)圖4。具體實(shí)施如下： 向圓底燒瓶中分別加入0. 941 g甘草次酸（2 mmoL)，0. 460 g EDOHC1 (2. 4 mmoL)， 0. 324 g HOBt (2.4 mmoL)，以及5 mL預(yù)冷的CH2C12溶劑，磁力攪拌30分鐘，溶解后滴加 三乙胺（TEA) 0.7g (約7 mmoL)，繼續(xù)攪拌30分鐘，加入0.165 g丙炔胺（3 mmoL)，保持 冰浴反應(yīng)過(guò)夜。待反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入15 ml CH2C12稀釋?zhuān)缓笠来斡?M HC1，5% NaHC03溶液，以及飽和食鹽水洗滌。收集有機(jī)相，加入無(wú)水Na2S04干燥，過(guò)濾，減壓蒸餾濃 縮，得到油狀物即為甘草次酸的丙炔酰胺衍生物粗品。
[0036] 進(jìn)一步采用中壓制備液相進(jìn)行純化，得到白色固體粉末，稱(chēng)重得丙炔酰胺化甘草 次酸產(chǎn)物 〇· 482 g,產(chǎn)率約為 48%。屮 NMR (400 MHz, CDC13) δ 5. 93 (t, / = 5. 0 Hz, 1H), 5.70 (s, 1H), 4.13 (ddd, /= 17.5, 5.4, 2.5 Hz, 1H), 4.03 (ddd, /= 17.5, 4.9, 2.5 Hz, 1H), 3.24 (dd, /= 10.5, 5.8 Hz, 1H), 2.80 (dt, /= 13.3, 3.3 Hz, 1H), 2.35 (s, 1H), 2.26 (t, / = 2. 5 Hz, 1H), 2.17 (dd, /= 12.2, 5.1 Hz, 1H), 2.11 - 2.00 (m, 2H), 1.96 (d, /= 10.4 Hz, 1H), 1.90 - 1.74 (m, 3H), 1.72 -1.58 (m, 4H), 1.51 - 1.43 (m, 2H), 1.42 - 1.37 (m, 6H), 1.25 - 1.18 (m, 1H), 1.18 - 1.12 (m, 9H), 1.05 - 1.00 (m, 4H), 0.96 (dd, /= 12.5, 4.7 Hz, 1H), 0.87 - 0.78 (m, 6H), 0.71 (d, /= 11.7 Hz, 1H) ;13C NMR (101 MHz, CDC13) δ ppm 200.18, 175.51, 169.09, 128.54, 79.78, 78.78, 71.67, 61.83, 54.95, 48. 04, 45. 37, 43. 54, 43. 19, 41. 77, 39. 16, 37. 35, 37. 08, 32. 76, 31. 90, 31. 44, 29.31, 28.40, 28.11, 27.28, 26.43, 23.35, 18.67, 17.48, 16.37, 15. 58〇
[0037] 取上述所得的甘草次酸丙炔酰胺衍生物100 mg(約0. 2 mmoL)溶于500 μ L DMS0 中，并將其緩慢滴入實(shí)施例2制備的4 mL疊氮修飾的聚賴(lài)氨酸自組裝納米微球溶液中， 最后加入點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的催化劑（2 mmol/L Tris_triazoleamine，15 mmol/L (]11304和30 mm〇l/L抗壞血酸鈉)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入到截留分子量為3 kD的Millipore 超濾管中，3000轉(zhuǎn)離心30分鐘，棄去濾液，分別用0. 2 mmol/L磷酸鹽緩沖液5 mL洗滌 3次，收集截留液，即為連接有甘草次酸藥物的熒光納米微球，可用于靶點(diǎn)蛋白的捕獲與分 離。
[0038] 實(shí)施例7、聚賴(lài)氨酸熒光納米微球應(yīng)用于細(xì)胞與活體成像 分別取上述實(shí)施例1和2所制備的聚賴(lài)氨酸熒光納米自組裝微球30 μ?，加入到人肺 上皮BEAS-2B的培養(yǎng)細(xì)胞中，采用共聚焦顯微鏡TCS SP5觀察，使用543 nm激發(fā)光，570 nm 發(fā)射光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的載藥納米微球的分布狀況。結(jié)果如圖5A所示，沒(méi)有連接藥物的納米 微球孵育3h后，將細(xì)胞用DAPI染色后，反復(fù)洗去游離的熒光染料，經(jīng)觀察只能看到細(xì)胞核 DAPI的藍(lán)色熒光，幾乎看不到羅丹明的紅色熒光。而偶聯(lián)有牛蒡子苷元的納米微球，同樣 經(jīng)3小時(shí)孵育后，進(jìn)行DAPI染色，并反復(fù)洗去游離的熒光染料，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核呈藍(lán) 色，而胞漿內(nèi)有著很強(qiáng)的紅色熒光，但細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)均沒(méi)有羅丹明的明顯紅色熒光（圖 5B)。結(jié)果表明，本專(zhuān)利所發(fā)明的載藥納米微球具有良好的生物相容性，可以有效地進(jìn)入靶 細(xì)胞內(nèi)，為進(jìn)一步靶點(diǎn)蛋白的捕獲與富集提供了可行性。
[0039] 為了進(jìn)一步觀測(cè)所制備的載藥納米微球在小鼠體內(nèi)的示蹤變化，取昆明小鼠并尾 靜脈注射100 μ?實(shí)施例2所制備的熒光納米微球，并采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀測(cè)納米微 球在小鼠體內(nèi)的分布情況。結(jié)果如圖5C所示，與給藥前0分鐘的對(duì)照組相比，給藥60分 鐘后小鼠的腹腔下部有著明顯的羅丹明熒光聚集，表明載藥聚賴(lài)氨酸熒光納米微球經(jīng)過(guò)小 鼠體液循環(huán)之后，被代謝并轉(zhuǎn)移到了小鼠的膀胱中。
[0040] 實(shí)施例8、甘草次酸靶點(diǎn)蛋白的捕獲與SDS-PAGE電泳分析 將培養(yǎng)的人肺上皮BEAS-2B細(xì)胞鋪于六孔板中，待融合度達(dá)到80%以上，密度達(dá)到105 以后，分別加入實(shí)施例5所制備的連接甘草次酸的聚賴(lài)氨酸熒光納米微球100 μ?。采用 DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；經(jīng)胰酶消化30秒，收集細(xì)胞并將細(xì)胞懸浮于PBS中，冰 浴中超聲處理，破碎細(xì)胞。4°C，10, 000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄去細(xì)胞碎片以及未破碎的細(xì)胞， 取上清得到包含有靶點(diǎn)蛋白的聚賴(lài)氨酸納米微球的混合溶液（圖6,步驟1)。
[0041] 將上述混合溶液加入到截留分子量為3 kD的Millipore超濾管中，3000轉(zhuǎn)離心， 經(jīng)生理鹽水混懸并再次離心棄去小分子，分別收集濾液1和截留液（圖6,步驟2);將截留液 加入到截留分子量為100 kD的Millipore超濾管中，3, 000轉(zhuǎn)離心，經(jīng)生理鹽水混懸并再 次離心棄去納米微球未結(jié)合的大分子蛋白，分別收集濾液2和截留液（圖6,步驟3);向截留 液中加入100 mM的DTT溶液100 μ?，靜置15分鐘后再次加入到截留分子量為100 kD的 Millipore超濾管中，3, 000轉(zhuǎn)離心，收集濾液3和截留液4 (圖6,步驟4);具體操作步驟 如圖6所示。
[0042] 分別收集上述的濾液和截留液，并采用10%SDS_PAGE電泳對(duì)捕獲效果進(jìn)行分析。 結(jié)果如圖7所示：第1泳道是蛋白Marker，第2泳道為細(xì)胞裂解液樣品；經(jīng)過(guò)3 kD的超濾 管超濾，濾液中幾乎沒(méi)有明顯的蛋白條帶，如第3泳道所示；而將截留液再上100 kD的超濾 管，濾液中可以檢測(cè)到大量的蛋白條帶，表明是未與納米微球結(jié)合的細(xì)胞可溶性蛋白（第4 泳道）；將截留液加入DTT還原之后，經(jīng)過(guò)100 kD的超濾管，得到的濾液即為與甘草次酸結(jié) 合的靶點(diǎn)蛋白以及相關(guān)蛋白(第6泳道);而剩余的截留液，包括沒(méi)有通過(guò)濾膜的納米微球中 幾乎檢測(cè)不到可溶性蛋白（第5泳道)。
[0043] 本實(shí)施例表明，本發(fā)明公開(kāi)的聚賴(lài)氨酸熒光納米自組裝載藥球，不但可以進(jìn)行靶 點(diǎn)蛋白的示蹤定位，還可以進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白的捕獲富集，在藥物作用機(jī)制的研究方面有很好 的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1. 一種多用途聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體，是在骨架材料上共價(jià)連接有熒光標(biāo) 記基團(tuán)和藥物分子制成；所述的骨架材料是由含有25?30個(gè)賴(lài)氨酸殘基通過(guò)酰胺鍵依次 連接而成的同型單體聚合物；所述骨架材料上的賴(lài)氨酸殘基同時(shí)修飾了帶有二硫鍵的疊氮 基團(tuán)側(cè)鏈以及熒光標(biāo)記物，能夠通過(guò)自組裝制備納米微球，并能用于藥物分子的連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體，其特征在于所述的熒光 示蹤標(biāo)記基團(tuán)是含有羅丹明的標(biāo)記分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體，其特征在于所述的含有 羅丹明的熒光標(biāo)記分子是通過(guò)羅丹明的活化酯，與聚賴(lài)氨酸的氨基以酰胺鍵的形式進(jìn)行連 接。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體，其特征在于所述的帶有 二硫鍵的疊氮基團(tuán)側(cè)鏈，其一端是活化酯，通過(guò)聚賴(lài)氨酸的氨基以酰胺鍵的形式與納米微 球載體相連接。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體，其特征在于所述的藥物 分子，是炔基修飾的藥物衍生物，并能夠通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)的方法將其與納米微球載體的疊氮 基團(tuán)側(cè)鏈相連接。
6. 權(quán)利要求1所述聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體的制備方法，其特征是該方法的 具體制備如下： 第1、向含有1%至5% Span-80的由汽油和四氯化碳組成的混合有機(jī)相中加入NHS-羅 丹明，其中汽油和四氯化碳的體積比可為1:3至3:1，溶解后再加入含有0. 2%-2%聚賴(lài)氨酸 的水溶液，10, 〇〇〇至20, 000轉(zhuǎn)高速攪拌后得到乳化液；其中有機(jī)相和水相的比例為1:1至 5:1，NHS-羅丹明的用量為聚賴(lài)氨酸的0. 5%至10% ; 第2、將上述乳化液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分別加入上述體積比1:1至5:1的石油醚以及 水溶液，混合均勻后靜置分層，收集水相，離心棄去沉淀，上清液即為自組裝的聚賴(lài)氨酸熒 光納米微球； 第3、向第2步得到的納米微球溶液中加入疊氮化試劑Sulfo-SADP，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0. 5 小時(shí)至5小時(shí)，得疊氮修飾的納米微球； 其中Sulfo-SADP的用量為聚賴(lài)氨酸用量的10%至100% ; 第4、進(jìn)一步將炔基修飾的藥物緩慢滴入第3步得到的納米微球溶液中，攪拌條件下加 入點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的催化劑，室溫反應(yīng)〇. 5小時(shí)至5小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)超濾濃縮，即為連接有藥 物的熒光納米微球；其中炔基修飾藥物的用量為聚賴(lài)氨酸用量的10%至100%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于第4項(xiàng)所述的炔基修飾的藥物，是采用丙炔 酸與含有羥基的藥物通過(guò)酯化的方式制備的丙炔酸酯，或采用丙炔胺與含有羧基的藥物通 過(guò)酰胺化的方式制備的丙炔酰胺衍生物。
8. 權(quán)利要求1所述的聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體的應(yīng)用，用于被修飾藥物在動(dòng) 物組織以及細(xì)胞水平的示蹤成像分析，以及靶點(diǎn)定位研究。
9. 權(quán)利要求1所述的聚賴(lài)氨酸熒光自組裝納米微球載體的應(yīng)用，用于在組織與細(xì)胞水 平捕獲靶點(diǎn)蛋白，通過(guò)裂解二硫鍵能夠釋放出靶點(diǎn)蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白。
【文檔編號(hào)】B82Y5/00GK104146964SQ201410391369
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】白鋼, 崔慶新, 侯媛媛, 姜民 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)