專利名稱：：一種血清自身抗體用于食管鱗癌診斷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和驗證了一種新的食管鱗癌(ESCC)腫瘤標(biāo)志物一血清CDC25B自身抗體，并建立了反向ELISA技術(shù)檢測血清CDC25B自身抗體的方法，用于食管鱗癌的診斷。
背景技術(shù)：
：食管鱗癌(ESCC)是食管癌中最常見的類型，是我國第四大引起死亡的腫瘤。早期診斷是提升癌癥治愈率的關(guān)鍵"但由于早期臨床癥狀不明顯，且缺乏好的早期診斷指標(biāo)和篩查技術(shù)，一般確診時食管鱗癌都為晚期。目前，依據(jù)腫瘤早期，腫瘤細胞產(chǎn)生的極微量抗原(目前還未有好的技術(shù)能夠檢測到)，但可被機體免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生特異的腫瘤抗原抗體，因此檢測此抗體(通過免疫系統(tǒng)的放大作用，很容易檢測到)可間接反應(yīng)腫瘤抗原存在。許多研究也表明腫瘤患者針對腫瘤抗原產(chǎn)生的自身抗體是腫瘤早期診斷的最好的指標(biāo)，早期診斷的靈敏度和特異性均要優(yōu)于目前臨床上使用的腫瘤細胞產(chǎn)生的腫瘤標(biāo)志物。在食管鱗癌患者血清中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p53，cytokeratins，myomegalin，TRIM21等蛋白自身抗體，其中對血清中P53抗體的研究較深，發(fā)現(xiàn)其可以作為食管癌早期診斷和預(yù)后指標(biāo)。最近，通過血清學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)在ESCC患者血清中篩選出peroxiredoxinVI自身抗體，此抗體在ESCC中的檢出率為50%，可作為食管癌早期診斷指標(biāo)。目前，基于腫瘤抗原引發(fā)的體液免疫反應(yīng)尋找腫瘤標(biāo)志物有多種方法，血清學(xué)蛋白質(zhì)組是一種有效和可靠的技術(shù)，其優(yōu)勢在于確定的腫瘤蛋白抗原為自然狀態(tài)下的腫瘤組織或腫瘤細胞的腫瘤抗原。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明應(yīng)用血清學(xué)蛋白組技術(shù)篩選食管磷癌患者血清中腫瘤抗原自身抗體。首先，用2-DPAGE電泳分離ESCC組織中的蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用病人血清和健康人血清做為一抗，westernblot檢測腫瘤蛋白反應(yīng)點，挑選只與腫瘤病人血清反應(yīng)而不與正常人血清反應(yīng)的蛋白點，質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列。利用此技術(shù)，從食管磷癌患者血清中首次篩選出CDC25B自身抗體，并驗證其特異性。并證實CDC25B自身抗體可作為食管磷癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。最后建立了簡便的反向ELISA技術(shù)檢測血清CDC25B自身抗體的方法。具體實施方式(實驗中所用組織及血清來源于中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院)1.發(fā)現(xiàn)和驗證了一種新的食管鱗癌(ESCC)腫瘤標(biāo)志物一血清CDC25B自身抗體1).篩選針對食管癌鱗組織腫瘤蛋白抗原產(chǎn)生的自身抗體采用蛋白質(zhì)組技術(shù)用患者自身血清(含腫瘤抗原的抗體)篩選食管鱗癌組織(ESCC)中的腫瘤抗原。首先，2D電泳平行分離15份腫瘤組織蛋白，一份銀染(圖1力和^久一份電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別與自身血清與PVDF膜上蛋白反應(yīng)(圖1C，一個患者血清)，同時15份正常人血清作為陰性對照(圖1D，一個正常人血清)。在15份食管鱗癌患者血清中7份標(biāo)本中在同一位置出現(xiàn)一個強反應(yīng)的點，而15份對照血清中沒有一個在此位置出現(xiàn)蛋白反應(yīng)點。該蛋白點的分子量估計為64.0kDa，PI為6.0(圖.10。7例血清陽性患者包含食管鱗癌I期2例，1I期3例，m期2例，說明該抗體可在食管鱗癌早期出現(xiàn)。2).鑒定與食管鱗癌血清反應(yīng)的蛋白為CDC25B抗原從銀染的膠上切下該點，胰酶消化后，MALDI-TOF質(zhì)譜分析，鑒定其為CDC25B蛋白(NCBIaccessionno.P30305)，分子量64.89kDa，PI為6.0(圖.2)。進一步腫瘤組織蛋白二維電泳后，使用CDC25B多克隆抗體進行westernblotting驗證，圖3A顯示該蛋白點與病人血清和多抗反應(yīng)，證實其為CDC25B蛋白抗原。圖3B為7個食管鱗癌抗體陽性病人的血清從1:100到1:1600稀釋，Westernblot測定血清中CDC25B抗體滴度，滴度最高的達1:1600(l例)，4例滴度為1:800，l例滴度為1:400，l例滴度為1:200。3)CDC25B在ESCC組織和腫瘤細胞系中的高表達我們先驗證CDC25B是否在食管鱗癌細胞株和組織中表達。通過westernblotting和免疫組化研究3個食管鱗癌細胞系和腫瘤組織中CDC25B的表達，結(jié)果顯示在Eca-109,TE-1,和TE-10這3個細胞系中CDC25B都高表達，并且Eca-109中的表達水平最高，在腫瘤組織中CDC25B也有高表達，正常對照組織未見CDC25B的表達(圖.4力)。15個腫瘤組織與癌旁組織的匹配標(biāo)本中的表達見圖.，CDC25B在14/15例的腫瘤組織中高表達，癌旁組織不表達，或表達極低。血清中CDC25B抗體陽性的病人腫瘤組織中CDC25B的表達(T)與癌旁組織(N)比較(T/N)3.1-11.2，而血清中CDC25B抗體陰性的病人CDC25B(T/N)為0.8-5.4。免疫組化也證實CDC25B在食管鱗癌組織高表達。圖5力j顯示在正常分層食管鱗狀上皮不表達CDC25B。同時，血清CDC25B抗體陰性的病人，CDC25B著色主要在細胞核，胞漿染色弱或看不見(圖.5C-Z)。而血清中CDC25B-抗體陽性的病人，其腫瘤細胞的胞質(zhì)和胞核中CDC25B染色強陽性(圖.5E-月.這些結(jié)果與其他文獻中CDC25B在ESCC中過表達的結(jié)果是相符的，并且說明產(chǎn)生CDC25B抗體的病人CDC25B在腫瘤組織中的表達水平顯著升高。4)血清中CDC25B抗體可做為食管鱗癌的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用CDC25B抗體反相捕獲的Eca-109中的CDC25B蛋白作為包被抗原，間接ELISA測定102例正常對照血清、124例經(jīng)病理確定的ESCC患者血清和150例其他消化道腫瘤患者血清中的CDC25B抗體。102例健康對照組，平均吸光度0D為0.12±0.07;抗體陽性定義為OD值大于或等于健康對照組的均值+3SD之和，即域值設(shè)定0D為0.33。124例ESCC病人中，45份(36.29%)CDC25B抗體陽性;結(jié)腸癌8.0%(4/50)陽性，胃癌12.0%(6/50)陽性，肝癌6.0%(3/50)陽性，102份健康對照組無一例陽性，說明CDC25B可作為食管鱗癌診斷的腫瘤標(biāo)志物(表1)。表lcdc25b自身抗體在ESCC和其他類型的消化系統(tǒng)癌癥的陽性表達對比<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.建立反向ELISA技術(shù)檢測血清CDC25B自身抗體的方法用CDC25B單抗(購于SANTA公司)包被ELISA板，加入食管鱗癌細胞株Eca-109(此細胞株高表達CDC25B)裂解后上清蛋白液，CDC25B抗體捕獲腫瘤細胞中的CDC25B抗原，作為包被抗原，洗去未結(jié)合的雜蛋白，BSA封閉后，加入待檢血清，血清中的CDC25B抗體可與CDC25B抗原結(jié)合，洗去雜質(zhì)，加入HRP標(biāo)記的抗人IgG，形成CDC25B-抗CDC25B抗體-HRP-抗人IgG復(fù)合物，洗滌后，加入TMB顯色，酶標(biāo)儀檢測。具體方法如下(1)細胞培養(yǎng)食管癌細胞株Eca-109(購于ATCC公司)，RPMI1640培養(yǎng)基含10%新生胎牛血清，5%C02，37°C培養(yǎng)。培養(yǎng)至107細胞。(2)CDC25B抗原制備收集107Eca-109細胞，用生理鹽水離心洗滌3次，去上清，加入300W的裂解緩沖液(2%NP40,4%CHAPS,1%DTT，蛋白酶抑制劑PMSF)，冰上作用30分鐘，再反復(fù)吹打20—30次，12000rpm，4'C離心20分鐘，收集上清液。Bradford法蛋白定量。(3)反向ELISA技術(shù)檢測血清CDC25B自身抗體1)用0.01MpH9.0碳酸鹽包被緩沖液將CDC25B抗體稀釋至1ug/100u1。在每個ELISA板的反應(yīng)孔中加100ul,4'C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗(1XTBS-T，配制方法見表2，下同)3次，每次3分鐘。2).每孔加10014食管磷細胞株Eca-109裂解后上清蛋白液(20Pg/孔，100|4/孔)，4。C過夜孵育。3).在每個反應(yīng)孔中加5%BSA(粉劑購于SIGMA公司)200W，并用封口膜封閉ELISA板，4°C，過夜。4).用洗滌緩沖液洗4次，每次3分鐘。5).ELISA板每孔加入l:100稀釋的樣品血清100W(陽性對照為CDC25B抗體，陰性對照為westernblot驗證CDC25B抗體陰性的正常人血清)，室溫孵育2小時，洗滌緩沖液洗4次，每次3分鐘。6).ELISA板加入羊抗人IgG-HRP(購于SANTA公司)(1:5000)，孔，室溫孵育45分鐘，用洗滌緩沖液洗5次，每次3分鐘。7).加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入TMB底物A、B液(購于中杉金橋公司)各50ul，37。C避光，1015分鐘。8).終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸50ul。9).酶標(biāo)儀(BIO-TEX公司ELX800)450nm測OD值。表2洗滌緩沖液的配制:10XTBS(pH7,6>腿TBS,7.5)化2L.1L歸g銀4g2.4.2g320g湖g幼g36%HC1調(diào)雖pH7.6吸Ol,ml;IXPBS200ml;吐溫-22ml《或2&S4吐溫10ml》(臨時加入)，濯勾*圖1.蛋白質(zhì)組技術(shù)用食管鱗癌組織蛋白篩選食管鱗癌患者血清中的腫瘤抗原抗體其中A.2D膠腫瘤組織蛋白銀染B.2D膠腫瘤組織蛋白銀染局部放大C.2D電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF，一個患者血清的westernblot檢測D.2D電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF，一個正常人血清的westernblot檢測圖2.MALDI-T0F質(zhì)譜分析食管鱗癌血清反應(yīng)的蛋白為CDC25B蛋白圖3A.a.局部銀染。b.食管癌血清westernblot,c.CDC25B抗體westernblot圖3B.7例食管鱗癌抗體陽性病人的血清中CDC25B抗體滴度圖4A.westernblotting檢測3種食管鱗癌細胞系中CDC25B的表達圖4B.15個腫瘤組織與癌旁組織的匹配標(biāo)本中CDC25B的表達圖5.免疫組化CDC25B在食管鱗癌組織高表達(A，C，E為200X;B,D,F為400X)其中A和B.正常對照組織未見CDC25B的表達C和D.血清CDC25B抗體陰性的病人，CDC25B著色主要在細胞核，胞漿染色弱或看不見E和F.血清中CDC25B-抗體陽性的病人，其腫瘤細胞的胞質(zhì)和胞核中CDC25B染色強陽性。權(quán)利要求1.血清CDC25B自身抗體作為食管鱗癌診斷標(biāo)志物。2.反向ELISA檢測血清CDC25B自身抗體的方法，按照以下步驟進行用CDC25B單抗包被ELISA板，加入食管鱗癌細胞株Eca-109裂解后上清蛋白液，CDC25B抗體捕獲腫瘤細胞中的CDC25B抗原，作為包被抗原，洗去未結(jié)合的雜蛋白，BSA封閉后，加入待檢血清，血清中的CDC25B抗體可與CDC25B抗原結(jié)合，洗去雜質(zhì)，加入HRP標(biāo)記的抗人IgG,形成CDC25B-抗CDC25B抗體-HRP-抗人IgG復(fù)合物，洗滌后，加入TMB顯色，酶標(biāo)儀檢測。全文摘要本發(fā)明公開了一種血清自身抗體用于食管鱗癌診斷的方法，應(yīng)用血清學(xué)蛋白組技術(shù)篩選食管鱗癌患者血清中腫瘤抗原自身抗體。首先，用2-DPAGE電泳分離ESCC組織中的蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用病人血清和健康人血清作為一抗，westernblot檢測腫瘤蛋白反應(yīng)點，挑選只與腫瘤病人血清反應(yīng)而不與正常人血清反應(yīng)的蛋白點，質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列。利用此技術(shù)，從食管鱗癌患者血清中首次篩選出CDC25B自身抗體，并驗證其特異性。并證實CDC25B自身抗體可作為食管鱗癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。文檔編號G01N33/574GK101435822SQ20081021891公開日2009年5月20日申請日期2008年11月5日優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日發(fā)明者劉萬里,宋立兵,曾木圣申請人:廣州市搏克生物技術(shù)有限公司