專利名稱：雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；?丁二酸1,4單酯-4)]-β-環(huán)糊精及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；?丁二酸1，4單酯-4) ] - β -環(huán)糊精 及制備方法和作為手性選擇劑在高效毛細(xì)管電泳(HPCE)中的應(yīng)用，即制備成手性HPCE電 泳柱和流動(dòng)相手性添加劑用于手性物質(zhì)的拆分。
背景技術(shù)：
生物的手性環(huán)境中，生命物質(zhì)分子，藥物分子，農(nóng)藥分子的手性不同會(huì)表現(xiàn)出截然 不同的生理、藥理、毒理作用。在醫(yī)藥工業(yè)中，已知藥物中約有30% -40%是具有光活性的 手性藥物。農(nóng)藥工業(yè)中，農(nóng)用天然殺蟲劑全為光學(xué)活性的；合成殺蟲劑中17%為手性殺蟲 劑。隨著生物化學(xué)和藥物化學(xué)的發(fā)展，對(duì)光學(xué)活性的手性藥物需求量越來越大，美國FDA在 1992年提出的法規(guī)就要求申報(bào)手性藥物時(shí)，應(yīng)對(duì)其不同對(duì)映體的作用敘述清楚。手性化合 物的拆分和對(duì)映體純度的測定將處于舉足輕重的地位。對(duì)映體的分離和測定在分離科學(xué)上曾被認(rèn)為是最困難的工作之一。目前，用于手 性拆分的方法主要有結(jié)晶法、酶法和色譜法等。結(jié)晶法用于工業(yè)制備，產(chǎn)物為外消旋體，不 能用于旋光度測定。酶法拆分得到的產(chǎn)物旋光純度很高，適合作各種生物活性和藥理實(shí) 驗(yàn)。隨著色譜科學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代色譜分析技術(shù)在對(duì)映體分離方面顯示出巨大的優(yōu)越性，色 譜法已逐漸成為目前手性分離的主要手段。其中主要有氣相色譜(GC)和高效液相色譜 (HPLC)、薄層色譜、超臨界流體色譜法、高效毛細(xì)管電泳法(HignPerformance Capillary Electrophoresis, HPCE)等。HPCE與傳統(tǒng)的分離方法相比，顯著特點(diǎn)是簡單、高效、快速和 微量。還具備了經(jīng)濟(jì)、清潔、易于自動(dòng)化、一機(jī)多用和環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)。所有這些使HPCE 迅速成為一種有效的分離技術(shù)，廣泛應(yīng)用于分離氨基酸、糖類、維生素、殺蟲劑、有機(jī)酸、無 機(jī)離子、染料、表面活性劑、藥物、多肽和蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、低聚核苷酸(RNA)和DNA片段 等。HPCE在手性化合物分離、藥物分析、DNA分析和環(huán)境分析等領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng) 用。在手性化合物的分離方面，相對(duì)于其它分離技術(shù)而言，HPCE具有可靈活選擇操作模式 和手性選擇劑、試劑及樣品用量少且對(duì)環(huán)境污染小、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等許多優(yōu)點(diǎn)。手性分離在非手性環(huán)境中是很難實(shí)現(xiàn)的。但在一些手性環(huán)境中，如光學(xué)活性試劑 和溶劑及在立體專一性的生物體系中，卻表現(xiàn)出很大的不同。所以，手性分離的關(guān)鍵是建 立手性環(huán)境。1、天然環(huán)糊精常用作HPCE的手性添加劑，既有優(yōu)點(diǎn)，又存在著缺點(diǎn)。(1)天然環(huán)糊精有α -⑶、β -⑶和Y -⑶三種α -⑶分子空穴小，通常只能包結(jié) 分子較小的客體物質(zhì)，應(yīng)用范圍窄；Y-CD的分子空穴大，能包結(jié)較大分子的客體，但Y-CD 的生產(chǎn)成本高，工業(yè)上不能大量生產(chǎn)；β-⑶的分子空穴大小適中使之包結(jié)范圍廣，而且生 產(chǎn)成本低，是目前唯一工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的環(huán)糊精產(chǎn)品，但β-CD在水中的溶解度低又限制了 其應(yīng)用范圍。(2) β-CD本身所引起的手性識(shí)別作用是有限的，原因是β-CD空腔內(nèi)部的幾 何對(duì)稱性。(3) β-CD本身不帶電，因此作為HPCE的手性添加劑不能分離中性物質(zhì)。(4)理論上，包結(jié)物的形成是⑶疏水的空腔與客體疏水部分相互作用形成，而⑶的手性部 分很少與客體的手性中心直接相互作用，這也是β "CD手性識(shí)別作用不強(qiáng)的另一個(gè)重要原 因。鑒于β-⑶的缺點(diǎn)通過衍生化反應(yīng)修飾β-⑶，可以達(dá)到以下目的(1)引入基團(tuán)增加水溶性，使得β -CD的衍生物作為HPCE添加劑具有較大的濃度 范圍供優(yōu)化分離。(2)在結(jié)合位點(diǎn)附近構(gòu)建立體幾何關(guān)系，形成特殊的手性位點(diǎn)，以提高手 性分離能力。(3)進(jìn)行三維空間修飾，增大結(jié)合空腔或者提供有特定幾何形狀的空間，與客 體分子有適宜的匹配。(4)引入帶電基團(tuán)，形成帶電⑶作為HPCE的添加劑以分離中性物 質(zhì)?？稍鰪?qiáng)CD的選擇性，故衍生化后的CD有更廣泛的應(yīng)用。2、各類β -⑶衍生物作為手性添加劑在HPCE中的應(yīng)用現(xiàn)有的作為HPCE流動(dòng)相手性添加劑β -⑶衍生物有(1)陰離子修飾⑶s，負(fù)電性 CD衍生物是最常用的手性選擇劑。大體上可分為磺烷基醚衍生化CDs、磺酸化CDs以及羧基 衍生化⑶S。(2)中性⑶s，這一類的衍生物主要有甲基化的⑶(Me-⑶)，羥丙基⑶(HP-⑶)， 羥乙基CD(HE-CD)。(3)陽離子修飾CDs，主要是含氨基和烷氧基的CDs。(4) 二元CD體 系，有人利用二元⑶體系，包括一種高磺化的(α-、β-、γ-HS⑶)和一種中性⑶，任何 一種七(2，3，6-3-0-甲基)-β-CD(TMCD)、七(2，6-雙-0-甲基)-β-CD(DMCD)或者羥丙 基-β -⑶(HP⑶)，能分離25不同酸-堿性質(zhì)的藥物(16種堿性藥物、8種酸性藥物、1種中 性藥物)結(jié)果顯示二元CD體系很有效的完成分離手性物質(zhì)而單獨(dú)使用HP-CD不能充分分 罔，3、其他手性選擇劑在毛細(xì)管電泳中的應(yīng)用Claudia Desiderio利用抗生素作為手性選擇劑分離手性物質(zhì)。JunHaginaka利用 蛋白質(zhì)作為手性選擇劑分離手性藥物，包括白蛋白(BSA、HSA)和其他種類的血清白蛋白， 糖蛋白等。還有利用人血清白蛋白作為手性選擇劑用于溴化十六烷基三甲胺涂布的HPCE 中分離布比卡因?qū)τ丑w。在CD上衍生帶電荷的基團(tuán)有利于中性和帶相反電荷對(duì)映體的拆 分，這一發(fā)現(xiàn)又進(jìn)一步的擴(kuò)大了 CD的應(yīng)用范圍，對(duì)于帶相反電荷的對(duì)映體由于增加了電荷 作用一般可提高拆分效果。所以帶正電荷的CD常用于拆分陰離子對(duì)映體，而帶負(fù)電荷的CD 常用于拆分陽離子對(duì)映體。4、對(duì)映體作用類型與分離意義手性藥物的藥理作用是通過與體內(nèi)的大分子之間嚴(yán)格的手性識(shí)別和匹配而實(shí)現(xiàn) 的。在許多情況下，化合物的一對(duì)對(duì)映體在生物體內(nèi)的藥理活性、代謝過程、代謝速率及毒 性等均存在顯著差異。另外，藥物的毒性綜合了許多因素，如對(duì)受體的選擇性、藥物及其代 謝物的體內(nèi)過程和代謝物對(duì)副作用的選擇性等，因此外消旋體與對(duì)映體、對(duì)映體與對(duì)映體 之間的毒性可有較大差異。應(yīng)該注意不同異構(gòu)體的藥理作用，并最好以單一對(duì)映體的形式 應(yīng)用。這些事實(shí)表明，手性藥物的研制和生產(chǎn)在臨床上有著十分重要的作用在藥理學(xué)上， 服用手性藥物可減小劑量和代謝的負(fù)擔(dān)，對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)及劑量能進(jìn)行更好地控制；在劑量 設(shè)定時(shí)幅度更寬，反應(yīng)較??；減少與其他藥物的相互作用，提高活性并減少劑量，提高專一 性、并降低由某對(duì)映體可能引起的副作用對(duì)制藥企業(yè)而言，生產(chǎn)手性藥物可以節(jié)省資源， 減少廢料排放，降低對(duì)環(huán)境的污染。因此，近年來許多國家的藥政部門對(duì)手性藥物的開發(fā)、 專利申請(qǐng)及注冊開始作出相應(yīng)的規(guī)定，對(duì)于含有手性因素的藥物傾向發(fā)展單一對(duì)映體產(chǎn)品，鼓勵(lì)把已在銷售的外消旋藥物轉(zhuǎn)化為手性藥物(手性轉(zhuǎn)換)。對(duì)于中請(qǐng)新的外消旋藥 物，則要求對(duì)兩個(gè)對(duì)映體都必須提供詳細(xì)的生理活性和毒理數(shù)據(jù)，不得作為相同物質(zhì)對(duì)待。 全球單一對(duì)映體藥物依然持續(xù)增長，1998年銷售額已達(dá)到964億美元，據(jù)2001年10月1 日美國化學(xué)與工程周刊報(bào)道，2000年的銷售額為1330億美元，并估計(jì)在2008年即將達(dá)到 2000億美元。按1998年的統(tǒng)計(jì)，全球最暢悄的500種藥物中。以單一異構(gòu)體銷售的手性藥 物占一半以上，占其總銷售額的52%。近年來，經(jīng)過消旋體轉(zhuǎn)換，即將過去以消旋體出售的 藥物轉(zhuǎn)化發(fā)展為以單-異構(gòu)體出售的手性藥物，創(chuàng)造出更為可觀的效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新型β -⑶衍生物雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺酰基_ 丁二酸 1，4單酯-4) ] - β -⑶(β -⑶-B2)及制備方法和用途。用β -⑶-B2作為HPCE流動(dòng)相手性添 加劑分離手性物質(zhì)苯甘氨醇及山莨菪堿、異丙腎上腺素和普羅帕酮，均可實(shí)現(xiàn)基線分離；用 該β -CD衍生物制備手性HPCE柱，可分離撲爾敏、布比卡因、普魯卡因、阿替洛爾、山莨菪 堿、普羅帕酮和洛貝林等手性物質(zhì)，均可實(shí)現(xiàn)基線分離，據(jù)此可建立多種手性物質(zhì)單一對(duì) 映體HPCE定量測定新方法。本發(fā)明提供了 一種新的含間羧基苯磺?；?OOCC6H5SO2)和丁 二酸酯 (00CCH2CH2C00H) 二種功能基團(tuán)的β-環(huán)糊精衍生物及制備方法。以正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)合成了 目標(biāo)衍生物，用順丁烯二酸酐雙取代β -環(huán)糊精A、D環(huán)上的6位碳上羥基氫后，再用間羧 基苯磺?；映傻巾樁∠┑碾p鍵上，且間羧基苯磺?；映稍诙《岬?位碳上而形成 的。用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，用半制備液相色譜HPLC對(duì)90%該衍生物進(jìn)一 步分離純化，收集產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。通過對(duì)紫外圖譜、傅立葉紅外圖譜、X射線粉末衍 射圖譜(XRD)、元素分析、核磁碳譜(13C NMR)、氫譜(1H NMR)、HMBC (1H檢測的異核多鍵相 關(guān)試驗(yàn))、HSQC(1H檢測的異核單量子相干試驗(yàn))以及質(zhì)譜分析，確定了其在CD環(huán)上的取 代基位置為C6位，確認(rèn)了雙取代的空間位置為β -⑶七個(gè)環(huán)中的1，4環(huán)取代結(jié)構(gòu)，從而 確定了目標(biāo)衍生物的空間結(jié)構(gòu)，命名為雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；?丁二酸1，4單 酯 _4) ] - β -CD ( β -CD-B2)。其分子式為=C64H84O49S2。將其作為HPCE流動(dòng)相手性添加劑分離手性物質(zhì)苯甘氨醇及五種手性藥物(山莨 菪堿、異丙腎上腺素、撲爾敏、布比卡因、普羅帕酮)，除撲爾敏和布比卡因未達(dá)到基線分離 外，其余藥物均達(dá)到基線分離的效果。將其用于制備手性HPCE柱，手性HPCE柱的制備方法是采用化學(xué)鍵合的方法把合 成的⑶-B2通過一個(gè)“手臂”與毛細(xì)管柱的內(nèi)表面連接成一個(gè)整體，制成開管柱，并用掃 描電鏡進(jìn)行表征，確定β-CD-B2鍵合在毛細(xì)管柱的內(nèi)表面上。，此制柱法未見文獻(xiàn)報(bào)道。用 不同濃度鍵合(5%,8%,12%,20%,25%,30% )的β-CD-B2HPCE柱，考察柱分離效能。撲 爾敏和布比卡因兩種手性藥物在此種新型手性HPCE柱上均達(dá)到基線分離，撲爾敏最大分 離度Rs達(dá)9. 98，布比卡因分離度Rs達(dá)17. 19,4min內(nèi)完成分離；并用對(duì)照品進(jìn)行定性。普 魯卡因分離度Rs達(dá)10. 20，山莨菪堿最大分離度Rs達(dá)1. 38，用對(duì)照品定性。阿替洛爾最大 分離度Rs達(dá)22. 04。普羅帕酮和洛貝林均可實(shí)現(xiàn)基線分離。分別與空白柱作對(duì)照，同樣條 件下空柱無法實(shí)現(xiàn)分離。說明此種制備HPCE柱的方法是有效的，可成功地把P-CD-B2S 生物鍵合到HPCE柱內(nèi)表面，也進(jìn)一步表明此種開管柱毛細(xì)管制備法是可行的，對(duì)多種手性
6物質(zhì)的拆分效果理想。該發(fā)明利用此衍生物作為手性選擇劑可建立多種手性物質(zhì)單一對(duì)映 體的HPCE定性定量新方法。經(jīng)中科院武漢科技查新咨詢檢索中心出具查新報(bào)告顯示，未見 文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明的技術(shù)方案為雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺酰基-丁二酸單酯-4)]_β-環(huán)糊精的分子式為 C62H84O49N2S2，結(jié)構(gòu)為 雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；鵢 丁二酸1，4單酯-4) ] - β -環(huán)糊精的制備方法， β -環(huán)糊精簡稱為β -⑶，其特征在于按以下步驟進(jìn)行⑴、將Imol苯甲酸粉末和I-IOmol 氯磺酸攪拌混勻，將溫度升至50-150°C，在此溫度下反應(yīng)3-10小時(shí)，冷卻后，得到白色固 體，過濾得間羧基苯磺酰氯沉淀；(2)、再用2-30mol順丁烯二酸酐和Imol β -⑶，60_120°C 加熱反應(yīng)得到雙(6-氧-丁烯二酸單酯)_β -⑶，簡稱β -⑶-A2 ； (3)、然后用Imol β -⑶-A2 和2-30mol間羧基苯磺酰氯溶于恒溫水浴50-150°C反應(yīng)4_8小時(shí)，加入有機(jī)溶劑，有機(jī)溶 劑為常用的有機(jī)溶劑，析出沉淀，抽濾得到雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；鵢 丁二酸1，4單 酯_4) ] - β -CD ( β -CD-B2)，反應(yīng)方程式如下 雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；鵢 丁二酸1，4單酯-4)]-β -環(huán)糊精作為手性選 擇劑在毛細(xì)管電泳(HPCE)中的應(yīng)用也就是制備成手性電泳柱或流動(dòng)相手性添加劑用于手 性物質(zhì)的拆分將β -CD-B2作為HPCE流動(dòng)相手性添加劑分離手性物質(zhì)苯甘氨醇及山莨菪 堿、異丙腎上腺素和普羅帕酮，均可實(shí)現(xiàn)基線分離；用該β-CD衍生物制備手性HPCE柱，可 分離撲爾敏、布比卡因、普魯卡因、阿替洛爾、山莨菪堿、普羅帕酮和洛貝林等手性物質(zhì)，均 可實(shí)現(xiàn)基線分離，據(jù)此可建立多種手性物質(zhì)單一對(duì)映體HPCE定量測定新方法。本發(fā)明所用的儀器與試劑分別為β-環(huán)糊精(CD)、馬來酸酐、苯甲酸均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、 氯磺酸為化學(xué)純(上海金山亭新化工試劑廠)；紫外可見分光光度計(jì)(PElabmda Bio35美 國)；Nicolet NEXUS-470傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片上海試劑廠)；Varian prostar 210高效液相色譜(美國)；日立D-7000高效液相色譜(日本)；API3200液相色譜串聯(lián)質(zhì) 譜儀(美國)；凍干機(jī)LABCONCO FreeZone ；(美國)Elementar vario EL III元素分析儀 (德國)；Varian Inova-600核磁共振儀(美國)；Bruker D8X射線粉末衍射儀(德國)。反應(yīng)條件的選擇1、雙加成衍生物β -⑶-B2原料配比的選擇分別選擇不同摩爾比，因衍生物是將帶有紫外吸收的苯環(huán)連接到⑶上，故可 通過紫外掃描圖譜來描述反應(yīng)進(jìn)行的程度。將不同摩爾比條件下得到的產(chǎn)物P-CD-B2K 成5X10_5mOl/L水溶液，以水為參比，得掃描圖1，衍生物在230nm處(間羧基苯磺酰氯的 K帶)吸收峰從一定程度上表征加成反應(yīng)進(jìn)行的程度，由圖可知，摩爾比在一定配比以上均 有間羧基苯磺酰氯的K帶(219nm)吸收峰出現(xiàn)，只是結(jié)構(gòu)上的差異使最大吸收峰有一定的 藍(lán)移(230nm)。2、正交試驗(yàn)在反應(yīng)溫度為40-120°C，將影響合成衍生物最主要的因素原料配比、溶劑吡唳 用量、反應(yīng)時(shí)間做正交試驗(yàn)。以下是L9(33)正交試驗(yàn)如表1:表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 各條件下得到衍生物紫外掃描如圖2所示，由圖可知，在230nm處有吸收，說明反 應(yīng)條件的不同，帶有苯環(huán)的基團(tuán)已加成到馬來酸酐的雙鍵上，只是取代度不同。采用分析型HPLC對(duì)所得不同取代度的產(chǎn)物(純度已達(dá)約90%)進(jìn)行分離，摸 索分離條件，如圖3a、圖3b、圖3c、圖3d、圖3e、圖3f、圖3g、圖3h、圖3i所示，分別為 正交實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)物的分離圖。色譜條件日立D-7000，PDA檢測器。各批次產(chǎn)物濃度為 1. 0 X IO-3Hiol化―1，進(jìn)樣量10 μ L，采用梯度洗脫模式，35-40%乙腈含量，40min洗脫時(shí)間，柱 溫30. 0°C，流速為0. 3ml · min—1，C18色譜柱，檢測波長230nm。由圖3a、圖3b、圖3c、圖3d、圖3e、圖3f、圖3g、圖3h、圖3i可以看出主成分 保留時(shí)間tK = 6. 21min為產(chǎn)物β-⑶-B2,選擇圖3c的反應(yīng)條件產(chǎn)物分離純化。利用半 制備色譜儀純化、收集純品，色譜條件=Varianprostar 210，UV檢測器，產(chǎn)物的濃度為 1. 0 X IO-2Hiol化―1，進(jìn)樣量20 μ L，采用梯度洗脫模式，35-40%乙腈含量，40min洗脫時(shí)間，柱 溫30. 0°C，流速為3ml · mirT1，C18色譜柱，檢測波長230nm。將收集到的樣品在42°C減壓蒸餾(確保樣品中無乙腈)，冷凍干燥，得到淡黃色固 體粉末，進(jìn)一步表征。雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺酰基_ 丁二酸單酯_4) ] - β -環(huán)糊精的表征1、紫外掃描圖譜配制ΙΧΙ ΤπιοΙ·!/1產(chǎn)物(水為參比)進(jìn)行紫外掃描，得到結(jié)果如圖4所示，由圖 4可以看出，在230nm波長處產(chǎn)物有明顯的紫外吸收，初步說明原料中帶苯環(huán)的基團(tuán)已經(jīng)連 接到產(chǎn)物上。2、紅外圖譜由圖 5 可知 β -CD-B2 υ 隱/cnT1 3359 (s，0Η)，2930 (w, CH2)，1715 (m, C = O), 1598， 1400 (m,苯環(huán) C = C), 1180 (w, ArSO2)。3、XRD 結(jié)果25°C下，β -CD、β -CD-A2、β -CD-B2 的衍射角(2 θ )是從 10-70°，氮?dú)獗Ｗo(hù)(Cu 靶)。β-⑶-Β2已提純。由圖6可知β-⑶出現(xiàn)很多的衍射峰，隨著反應(yīng)的進(jìn)行、-OH基團(tuán) 被取代，衍射峰明顯減少，同時(shí)也可看出β -⑶-Β2與β -⑶及β -⑶-Α2在結(jié)構(gòu)上有明顯差
已 升。4、元素分析由華中師范大學(xué)、中南民族大學(xué)、武漢科技大學(xué)三家單位測定的元素分析結(jié)果顯 示，C、H、S含量與理論值基本相符，因測定條件所限，未測定氧值。武漢科技大學(xué)所做元素 分析結(jié)果見表2。
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表2β-⑶-B2的元素分析結(jié)果 -未測產(chǎn)物的合成條件原料配比為1 30，25mL H20，8h，已提純。由表中數(shù)據(jù)可 以初步看出原料中含有S的基團(tuán)已合成上去，因產(chǎn)物極易吸水，實(shí)際分子式推測為 C64H84O49S2. 17H20o5、核磁圖譜對(duì)反應(yīng)原料β -⑶、β -⑶-A2和產(chǎn)物β -⑶-B2采用核磁共振手段對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步的 鑒定，包括13C NMRjH NMR以及HMBC (1H檢測的異核多鍵相關(guān)試驗(yàn))、HSQC (1H檢測的異核
單量子相干試驗(yàn))(H的編號(hào)與C的編號(hào)一致)。 圖7為 β-CD 的 13C NMR 核磁圖，可以得到 Cl :102. 573 C2 73. 693 C3 73.014 C4 82. 162 C5 ,12. 674 C6 60. 569，通過C的化學(xué)位移變化可以初步判斷取代反應(yīng)的位置。圖 8 為 β -CD-A2 的 13C NMR 核磁圖，可以得到 Cl 102. 615 C2 73. 707C3 73. 070 C4 82. 197 C5 -J2. 695 C6 60. 576 64. 220 -COOH 167. 514 -C = C- 130. 845，130. 845 C =0 167. 398，由以上數(shù)據(jù)可以看出，原料中的馬來酸酐的-C = C-、C = 0以及反應(yīng)產(chǎn)生后 的-COOH等基團(tuán)在圖中均有體現(xiàn)，可以判斷馬來酸酐取代反應(yīng)發(fā)生在C6位。圖9為β -⑶-B2的13C匪R核磁圖，可以得到與β _⑶上對(duì)應(yīng)的6個(gè)C的化 學(xué)位移:C1 102. 450 ；C2 :73· 955 ；C3 :73· 085 ；C4 -Jl. 393 ；C5 -J2. 646 ；C6 :61· 552，苯環(huán) Ar (C7-C12) 130.080，127.158，131.036，130. 448，130. 781，128. 906 長鏈 C13 167.295 ； C14 149. 225 ；C15 97. 571 ；C16 92. 965 ；C17 167. 663。圖10為β -⑶-B2的13C NMR核磁圖，可以得到苯環(huán)上的6個(gè)C被裂分成2s4d 6 條峰，C8、C12為s峰，C7、C9、CIO、Cll為d峰。圖2. 14可以得出，CD環(huán)上的Cl與Hl δ 4. 646直接相關(guān)，C2與Η2 δ 3. 573直接相關(guān)，C3與Η3 δ 3. 158直接相關(guān)，C4與Η4 δ 3. 301 直接相關(guān)，C5 與 Η5 δ 3. 250 直接相關(guān)，C6 與 H6a δ 3. 429 ；H6b δ 3. 573 直接相 關(guān)。芳環(huán)上含有4個(gè)C-H直接相關(guān)的碳:C7、C9、C10、C11分別與H7 δ 8. 158, Η9 δ 6. 271， HlO δ 7. 43-7. 48，Hll δ 7. 80-7. 89 直接相關(guān)，支鏈 C15 與 Η15 δ 4. 895，C16 與 Η16 δ 4. 895直接相關(guān)。由圖11可知由于⑶的椅式結(jié)構(gòu)及取代基團(tuán)的影響，⑶環(huán)上的Cl與Η5、Η4遠(yuǎn)程相關(guān)，C2與H5遠(yuǎn)程相關(guān)。芳環(huán)上C7與H9、H10、Hll遠(yuǎn)程相關(guān)，C9與H7、Hll遠(yuǎn)程相關(guān)， ClO與H7遠(yuǎn)程相關(guān)，Cll與H7、H9遠(yuǎn)程相關(guān)，C8與H10, Hll遠(yuǎn)程相關(guān)，C12與H10、H9遠(yuǎn)程 相關(guān)，C13與H7、H9、H10、H11遠(yuǎn)程相關(guān)。根據(jù)以上核磁圖譜給出的信息，可以進(jìn)一步確定苯環(huán)已加成上去。6質(zhì)譜表征得到的衍生物經(jīng)純化所做質(zhì)譜圖(圖12)中，可以得到以下信息1699為分子離 子峰，質(zhì)譜圖中存在的碎片峰為1212. 1,863. 1，486. 6，309. 9，242. 4，185. 4。取代基團(tuán)可能 斷裂的方式為下面所示兩條路徑所示第一種方式中的301，1213，243，185均能在質(zhì)譜圖 中找到；第二種方式中486，1213，350，863也能在質(zhì)譜圖中找到。 第一、二種方式取代基團(tuán)可能斷裂的方式上述分子離子碎片說明加成反應(yīng)時(shí)，苯環(huán)只可能加成到C16位上，氫到C15上，還 說明是雙取代。若是在C15位加成則應(yīng)有以下的的斷裂方式而m/z 257，1442碎片峰在質(zhì)
譜圖中未發(fā)現(xiàn)。 不可能的加成方式從以下第三種分裂過程可知，雙取代發(fā)生在β _⑶的1，4環(huán)上。第三種方式中486， 1213，350，863在質(zhì)譜圖中均有峰。β _⑶衍生物在質(zhì)譜中分裂的分子離子碎片較多，經(jīng)分 析，其他取代模式中1，2取代；1，3取代所需的碎片離子沒有出現(xiàn)。如1，2取代可能的碎片 離子m/z 810,889 ； 1，3取代可能的碎片離子m/z 1051，648均未在質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)。
1，3取代可能的碎片離子另一條件合成的產(chǎn)物13C NMR分離純化在有別與上述條件下合成的產(chǎn)物，以下是此產(chǎn)物的13C NMR。由圖 13 可以得到=Cl 99. 532 C2 :73· 771 C3 :73· 078 C4 :92· 979C5 -J2. 717 C6 :61.616，Ar(C7-C12) :129·946，127.166，133.660，130. 434，130. 993，128. 786，C13 166. 502，C14 :149· 423，C15 :97· 578，C16 :92· 979，C17 :167· 670，與圖13相比較，C原子的化學(xué)位移沒有明顯改變，說明兩者的結(jié)構(gòu)相同。即控制 合適條件可得取代度一致的衍生物。6 小結(jié)合成了雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；?丁二酸單酯_4)]-3-^(簡稱: β -⑶-B2)，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，用HPLC分離提純，通過對(duì)紅外譜圖、紫外譜圖、XRD、元素 分析、核磁、質(zhì)譜等譜圖的綜合分析可基本確認(rèn)目標(biāo)衍生物已合成，未見文獻(xiàn)報(bào)道。可以得 知雙_ [6-氧-(2-間羧基苯磺?；?丁二酸1，4單酯-4) ] - β -⑶的結(jié)構(gòu)式為 本發(fā)明提供了一種新型β -⑶衍生物雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；鵢 丁二酸 1，4單酯-4) ] - β -⑶(β -⑶-B2)及制備方法和用途。用β -⑶-B2作為HPCE流動(dòng)相手性添 加劑分離手性物質(zhì)苯甘氨醇及山莨菪堿、異丙腎上腺素和普羅帕酮，均可實(shí)現(xiàn)基線分離；用 該β -CD衍生物制備手性HPCE柱，可分離撲爾敏、布比卡因、普魯卡因、阿替洛爾、山莨菪 堿、普羅帕酮和洛貝林等手性物質(zhì)，均可實(shí)現(xiàn)基線分離，據(jù)此可建立多種手性物質(zhì)單一對(duì)映 體HPCE定量測定新方法。經(jīng)中科院武漢科技查新咨詢檢索中心出具查新報(bào)告顯示，未見文 獻(xiàn)報(bào)道。


圖1原料配比的影響的紫外掃描圖。圖2為不同條件下β -⑶-B2的紫外掃描圖。圖3a、圖3b、圖3c、圖3d、圖3e、圖3f、圖3g、圖3h、圖3i分別為不同條件下產(chǎn)物 β-⑶-B2液相色譜分離圖。圖4為IX 10-5mo 1 · Γ1產(chǎn)物紫外掃描圖。圖5為β -CD-B2的紅外圖。圖 6 為 β -CD、β -CD-A2、β -CD-B2 的 XRD 比較圖，其中 a_ β -CD、b_ β -CD-A2、 c-β -CD-B2。圖 7 為 β -CD 核磁圖(DMSO 150MHz)。圖 8 為 β -CD-A2 核磁圖(DMSO 150ΜΗζ) β -CD-A2 未經(jīng)提純。圖9為β-CD-B2核磁圖(DMSO 150MHz)，產(chǎn)物合成條件原料配比為1 30，25mL H20，8h，已提純。圖10為P-CD-B2 HSQC核磁圖，產(chǎn)物合成條件原料配比為1 30，25mL H20，8h，
已提純。圖11為β -CD-B2 HMBC核磁圖，產(chǎn)物合成條件原料配比為1 30，25mL H20，8h，
已提純。圖12為β -CD-B2的質(zhì)譜圖。圖13為產(chǎn)物13C NMR圖，產(chǎn)物合成條件原料配比為1 20，25mL H20，6h，已提純。圖14a為β -⑶-B2濃度為8% (1000倍)HPCE柱與空白柱的電鏡掃描圖。圖14 b β -OT-B2濃度12% (1000倍)HPCE柱與空白柱的電鏡掃描圖。圖14c未涂布β-OT-B2的空白柱(7500倍)HPCE柱與空白柱的電鏡掃描圖。圖15a為β -CD-B2濃度為8% 1000倍下HPCE柱的電鏡掃描圖。圖15 b β -CD-B2濃度8% 2000倍下HPCE柱的電鏡掃描圖。圖15c為β -CD-B2濃度為12% 5000倍下HPCE柱的電鏡掃描圖。圖16為β -⑶-B2濃度為12% 75000倍下電鏡掃描圖。(圖的左側(cè)為毛細(xì)管柱的 內(nèi)表面，右側(cè)為玻璃)圖17為進(jìn)樣時(shí)間IOmin時(shí)8%手性柱分離布比卡因HPCE圖。圖18為空白柱中分離布比卡因。圖19a為β -⑶-B2濃度8%手性柱中布比卡因的分離圖。
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圖19b為β -⑶-B2濃度12%手性柱中布比卡因的分離圖。圖19c為β -⑶-B2濃度20%手性柱中布比卡因的分離圖。圖20為β -⑶-B2作為手性固定相分離布比卡因圖。圖21為布比卡因的手性添加劑分離圖。圖22a為β -⑶-B2手性HPCE電泳柱中布比卡因分離圖。圖22b為空白電泳柱中分離布比卡因分離圖。圖23a為普魯卡因在12% β-CD-B2HPCE柱中的分離23b為普魯卡因在空白電泳柱中的分離圖。圖24a為進(jìn)樣150針后β -⑶-B2手性電泳柱分離布比卡因分離圖。圖24b為β -⑶-B2新柱子的電泳分離圖。圖25為撲爾敏的電泳分離圖。圖26為撲爾敏的手性添加劑電泳分離圖。圖27為山莨菪堿藥品的HPCE分離圖。圖28a為對(duì)照品β -⑶-B2濃度20%的HPCE柱中山莨菪堿的電泳分離圖。圖28b為對(duì)照品空白柱中山莨菪堿的電泳分離圖。圖29a為Tris_H3P04添加劑下DL-苯甘氨醇分離圖。圖29b為β -⑶手性添加劑下DL-苯甘氨醇分離圖。圖29c為β -⑶-A2手性添加劑下DL-苯甘氨醇分離圖。圖29d為β -⑶-B2手性添加劑下DL-苯甘氨醇分離圖。圖30a為硼砂緩沖液添加劑下普羅帕酮分離圖。圖30b為β -⑶手性添加劑下普羅帕酮分離圖。圖30c為β -⑶-A2手性添加劑下普羅帕酮分離圖。圖30d為β -⑶-B2手性添加劑下普羅帕酮分離圖。圖31a為硼砂緩沖液添加劑下異丙腎上腺素分離圖。圖31b為β -⑶手性添加劑下異丙腎上腺素分離圖。圖31c為β -⑶-A2手性添加劑下異丙腎上腺素分離圖。圖31d為β -⑶-B2手性添加劑下異丙腎上腺素分離圖。圖32a為Tris-檸檬酸添加劑下山莨菪堿分離圖。圖32b為β -⑶手性添加劑下山莨菪堿分離圖。圖32c為β -⑶-A2手性添加劑下山莨菪堿分離圖。圖32d為β -⑶-B2手性添加劑下山莨菪堿分離圖。
具體實(shí)施例方式雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；?丁二酸1，4單酯-4)]-β-環(huán)糊精的制備 β-環(huán)糊精簡稱為0-〔0，按以下步驟進(jìn)行(1)、將IOOg苯甲酸粉末和140g氯磺酸攪拌混 勻，將溫度升至120°C，在此溫度下反應(yīng)冷卻后，得到白色固體，過濾得間羧基苯磺酰氯沉 淀；(2)、再用22. 5g順丁烯二酸酐和13. 6gi3-⑶，80°C加熱反應(yīng)得到雙(6-氧-丁烯二酸 單酯)-β -⑶，簡稱β -⑶-A2 ； (3)、然后用Imol β -⑶-A2和25mol間羧基苯磺酰氯溶于恒 溫水浴100°C反應(yīng)8小時(shí)，加入吡啶有機(jī)溶劑，析出沉淀，抽濾得到雙_[6-氧-(2-間羧基苯
15磺?；鵢 丁二酸1，4單酯-4) ] - β -⑶(β -⑶-B2)，將制得的β -⑶-B2用于以下的實(shí)施例。實(shí)施例一 β -⑶-B2手性HPCE柱的制備及應(yīng)用效果用自己合成的新型手性分離材料——β _⑶-B2制備高效毛細(xì)管電泳HPCE柱，優(yōu)化 制備條件，用掃描電鏡，可確認(rèn)毛細(xì)管柱內(nèi)表面已經(jīng)鍵合上了 i3-CD-B2。具體方法結(jié)合物 理涂布，化學(xué)鍵合及制備整體柱的方法制備75 μ m的手性毛細(xì)管電泳柱。用靜態(tài)涂布的裝 置，用化學(xué)鍵合的方法預(yù)處理毛細(xì)管電泳柱，使管內(nèi)壁裸露出更多的硅羥基，根據(jù)溶膠-凝 膠的原理，選擇一個(gè)合適的“手臂”——偶聯(lián)劑，連接柱內(nèi)壁和手性選擇劑——⑶衍生 物，用β-CD-B2鍵合毛細(xì)管電泳柱。此制備手性毛細(xì)管柱的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。1、高效毛細(xì)管電泳柱的制備路線 2、主要儀器及試劑GC-900A氣相色譜儀(上?？苿?chuàng)色譜儀器公司)、高純N2 (四川天一科技股份有限 公司)、氣相色譜儀SP2305 (北京市宣武區(qū)儀表廠)、30m熔融石英毛細(xì)管(250 μ m, ID,永年 光纖廠，中國河北)、0. 22 μ m微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠)。甲醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)丙酮(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有 限公司)、β -⑶-B2 (8%、12%、20% )溶液⑶-B2與N、N-二甲基甲酰氨按質(zhì)量/體積 百分比所配制而成、鹽酸甲醇溶液(0. 5mol/LHCl與甲醇體積比為80/20)3、高效毛細(xì)管電泳柱的制備方法3. 1預(yù)處理毛細(xì)管柱截取約70cm長的熔融毛細(xì)管柱，用NaOH、HCl沖洗柱子，在氮?dú)庀赂稍铩?. 2鍵合偶聯(lián)劑用偶聯(lián)劑甲醇液填充柱，用橡膠墊封口，放到柱箱中控溫50°C反應(yīng)12個(gè)小時(shí)，后 用甲醇和丙酮分別沖洗，氮?dú)飧稍?
3. 3 鍵合 β-CD-B2把溶解有不同濃度的β -⑶-B2填充到預(yù)處理過的毛細(xì)管柱中，兩端封口，在70°C 溫度下加熱12h，后用甲醇和水沖洗，再用含HCl-甲醇的溶液壓(壓力約9000帕)到柱 中，使殘留的環(huán)氧基團(tuán)水解成二醇，用水沖洗。去除里面殘留的酸。在涂布好的毛細(xì)管柱末 端IOcm處用火焰燒蝕制作一個(gè)合適的觀測窗口，毛細(xì)管柱的有效長度為40cm.4、制備HPCE柱條件的優(yōu)化4. IHPCE電泳柱的表征將制備的⑶-B2濃度為8%、12%和空白HPCE柱送至華中師范大學(xué)物理與電 信工程學(xué)院，用JSM-6700F場發(fā)射掃描電鏡掃描分析，所得的電鏡掃描14a、圖14b、圖 14c。從圖14a、圖14b、圖14c中可知，1000倍鏡下，8%、12%的HPCE柱內(nèi)表面均有衍生物 層，因切管柱時(shí)的震動(dòng)使得衍生物層有部分剝落的現(xiàn)象，露出內(nèi)部的玻璃面。7500高倍鏡 下，空白柱的內(nèi)表面只有玻璃碎渣翹起。由圖15a、圖15b、圖15c可知，1000倍、2000倍、5000倍鏡下，可以清晰地看到HPCE 柱內(nèi)衍生物層斑駁的內(nèi)表面，即切管柱時(shí)震動(dòng)使衍生物層剝落的現(xiàn)象。由圖16可知，在75000倍下，可以看到HPCE柱內(nèi)表面有明顯翹起的衍生物層，進(jìn) 一步說明β -⑶-B2鍵合在HPCE柱的內(nèi)表面上。在CL1020型HPCE電泳儀(北京彩陸科學(xué)儀 器有限公司)上，8% β-CD-B2HPCE柱中，進(jìn)樣lOmin，分離電壓25kV，緩沖液濃度50mmol/L 硼酸-NaOH，pH= 10，檢測波長280nm，溫度20°C，得最佳電泳圖如圖17，用P/ACE MDQ型高 效毛細(xì)管電泳儀(美國BECKMAN)，在緩沖液50mmol/L硼酸_Na0H，pH10. 0，進(jìn)樣量1. 5psi， 15sec0分離電壓25kV，溫度20°C時(shí)空柱分離結(jié)果見圖18。用自行合成的β-CD-B2鍵合HPCE開管柱。預(yù)先處理HPCE柱的內(nèi)表面，然后在 β -⑶衍生物和柱內(nèi)表面之間用一個(gè)“手臂”連接，通過化學(xué)鍵合形成一個(gè)整體，使得β -⑶ 衍生物不易被洗脫下來。與空柱比增加了手性分離的因素，從圖17、圖18的對(duì)比中可以看 出，β -CD衍生物的HPCE手性開管柱可使布比卡因兩對(duì)映體達(dá)到基線分離。開管柱的優(yōu)點(diǎn) 是制備過程簡單、柱效高。將其用于HPCE中分離手性物質(zhì)，如藥物及生物物質(zhì)應(yīng)會(huì)是有意 義的工作。實(shí)施例二用手性β -⑶-B2 =柱分離卡因類手性藥物手性藥物鹽酸普魯卡因、鹽酸布比卡因是常見的局部麻藥及抗心律失常藥，Samir Cherkaoui等用不同β -CD衍生物涂布HPCE柱用HPCE-質(zhì)譜(MS)法分離布比卡因，利多 卡因、馬比佛卡因、克他命，12min內(nèi)實(shí)現(xiàn)四種藥物的手性分離。Ivanildo Joseda Silva等 用HPLC以自制化合物為固定相，正己烷/2-丙醇/乙腈/三乙胺為流動(dòng)相分離布比卡因， 在15分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)二對(duì)映異構(gòu)體的分離，分離度為3. 50。本實(shí)施例用制備的⑶-B2鍵合HPCE手性柱來分離鹽酸普魯卡因、鹽酸布比卡 因二種卡因類手性藥物。在8%、12%和20% β-⑶-B2電泳柱上鹽酸布比卡因?qū)崿F(xiàn)了基線 分離，8%柱分離度Rs最小，也可達(dá)14. 71。鹽酸普魯卡因在12%手性柱上實(shí)現(xiàn)了基線分罔。1、主要儀器及試劑1.1 儀器P/ACE MDQ型高效毛細(xì)管電泳儀(美國BECKMAN)；石英毛細(xì)管50cmX75ym(id)
17(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；有效長度40cm ;pHS-3c型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)；85_2型恒 溫磁力攪拌器(金壇市科興儀器廠)；ES-120J電子分析天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限 公司)；0. 22 μ m微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠)1.2 試劑鹽酸普魯卡因注射液(藥物，山東方明藥業(yè)股份有限公司)，鹽酸布比卡因注 射液(藥品，上海朝暉藥業(yè)有限公司)，注射液的輔料是注射用水(含有磷酸鹽，氯化銦 [1131η])，鹽酸布比卡因(對(duì)照品，IOOmg中國藥品生物制品檢定所)，硼酸、氫氧化鈉均為 分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)試驗(yàn)中所用水均為去離子水，所用溶液均用0. 22 μ m 微孔濾膜過濾。 鹽酸布比卡因 鹽酸普魯卡因2卡因類手性藥物的分離分別考察緩沖液離子強(qiáng)度、緩沖液pH值、分離電壓的變化鹽酸普魯卡因、鹽酸布 比卡因手性藥物的分離情況，摸索最佳條件。2.1實(shí)驗(yàn)方法鹽酸普魯卡因注射液QOg·!/1)、鹽酸布比卡因注射液(7.5β·Ι^)過濾，配置不 同濃度的硼酸-NaOH緩沖液，按分離所需調(diào)pH值，作為電泳的運(yùn)行介質(zhì).HPCE柱每次運(yùn)行之前用去離子水洗3min，0. Imol · L^1Hcl沖洗5min，去離子水 沖洗5min，背景電解質(zhì)沖洗5min，所用溶液均用0. 22 μ m微孔濾膜過濾。采用壓力進(jìn)樣， 0. 5psi進(jìn)樣5s，分離電壓為20kV，檢測波長為214nm，溫度20°C。2. 2結(jié)果與討論(一)條件實(shí)驗(yàn)(1)鹽酸布比卡因的條件實(shí)驗(yàn)鹽酸布比卡因又名麻卡因，丁比卡因，為長效局麻藥，適用于局部麻醉和手術(shù)后止 痛。布比卡因是左旋體和右旋體等混合的消旋體型，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟毒性主要來源 于右旋體。其布比卡因的左旋體s-(-)-體是酰胺類局部麻醉藥，是一種被廣泛用于脊髓麻 醉的持久局麻劑。左右旋布比卡因的分子結(jié)構(gòu)相同，但中樞神經(jīng)毒性及心臟毒性存在著明 顯不同，左旋布比卡因的毒性明顯較低。由于合成藥物大部分是以消旋體形式出售，而手性 藥物的對(duì)映體具有不同的藥理與毒理作用，有時(shí)甚至具有毒副作用。因此對(duì)手性藥物布比 卡因的分離研究具有重要意義。在50mmol/L硼砂緩沖液，β _⑶-B2濃度為8 %手性柱中，進(jìn)樣量為(1. 5psi， 15sec)，分離電壓為25kV，20°C的電泳條件下，緩沖液pH值10. 0，布比可因達(dá)到基線分離， 如電泳圖19c所示。在不同柱填料濃度下的最佳分離條件是不同的，如圖20所示，布比卡 因在20%柱中的分離度最大，Rs為157. 52 ；12%柱中為75. 02，8%柱中為17. 19。(二)對(duì)照試驗(yàn)
(1)與將β -環(huán)糊精衍生物作為手性添加劑分離布比卡因的對(duì)照試驗(yàn)在最佳分離條件下8%手性柱與β -CD-B2作為流動(dòng)相手性添加劑分離布比卡因 作比較，得電泳圖如下如圖21所示β -⑶-B2作為手性添加劑分離布比卡因分離度為Rsl. 30，沒有達(dá)到 基線分離，如圖20示8% β-CD-B2鍵合到毛細(xì)管柱的內(nèi)壁作為手性電泳固定相來分離布比 卡因分離度Rs達(dá)到17. 19，與⑶-B2作為手性添加劑分離布比卡因的分離效果比有明顯 優(yōu)越性。(2)與空白柱分離布比卡因的對(duì)照試驗(yàn)分別考察硼酸-NaOH緩沖液濃度(10，20，30，40，50mmol/L)、緩沖液pH值(pH6. 2， 8. 0,8. 5,9. 0,9. 5,10. 0,10. 5) > 進(jìn)樣 M (3. Osec, 0. 3psi ；5. Osec, 0. 5psi ；10. Osec, 1. Opsi ；15. Osec, 1. 5psi ；20. Osec, 2. Opsi)、分離電壓(15，20，25，30kV)的變化對(duì)布比卡 因手性藥物的分離情況，摸索最佳條件分離布比卡因得電泳圖22a、圖22b，與同一條件下 空柱比對(duì)。最佳分離條件在20% β -⑶-B2手性柱或空柱中，緩沖液濃度50mmol/L，進(jìn)樣 1. 5psi，15sec，ρΗΙΟ. 0，分離電壓25kV，檢測波長280nm，溫度20°C ·如圖22a所示，圖22b 空白電泳柱中分離布比卡因分離圖。(3)與空白柱分離普魯卡因的對(duì)照試驗(yàn)鹽酸普魯卡因在12%的β -⑶-B2HPCE柱中的對(duì)照試驗(yàn)，與同一條件下空柱比對(duì)。 12% β-⑶-B2HPCE柱中分離普魯卡因如圖23a所示，分離度Rs達(dá)10. 20。而空柱無法達(dá)到 基線分離如圖23b所示。(三)柱壽命在20% β -⑶-B2衍生物HPCE手性柱中，分離布比卡因(7. 5g/L)對(duì)映異構(gòu)體，相同 的條件(緩沖液濃度50mmol/L的硼酸-NaOH，進(jìn)樣1. 5psi，15sec，pH10. 0，分離電壓25kV, 檢測波長280nm)。進(jìn)樣150次后，得電泳圖如圖24a、圖24b所示，計(jì)算分離度RS為14. 71. 與新柱子的Rs = 157. 518比較，說明柱效有所流失，但二對(duì)映體分離度依然很大。用不同雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；鵢 丁二酸-1，4-單酯-4) -] - β -⑶衍生物 濃度制備鍵合的HPCE開管柱，同一緩沖液體系中，β -CD-B2衍生物作為手性固定相于HPCE 體系中分離卡因類藥物，得出最佳分離條件，并與空白柱做對(duì)照試驗(yàn)，分離度比空電泳柱有 所提高，布比卡因在4min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了手性異構(gòu)體的基線分離，分離度達(dá)到14. 71.與新涂布的 HPCE開管柱的柱效比較，在進(jìn)樣150次后，分離度又157. 14降為14. 71。普魯卡因在12% 柱中實(shí)現(xiàn)了基線分離，可建立定量測定布比卡因、普魯卡因的HPCE新方法。實(shí)施例三β -⑶-B2作為手性固定相在HPCE中分離手性藥物1主要儀器及試劑1.1儀器與前相同。1.2試劑撲爾敏注射液撲爾敏(藥品，湖北華中藥業(yè)有限公司，馬來酸氯苯那敏，對(duì)照品， IOOmg中國藥品生物制品檢定所)，山莨菪堿(藥品，杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；普羅帕 酮(藥品，江蘇云陽集團(tuán)藥業(yè)有限公司)；DL-苯甘氨醇(純度99% )(上海求德生物化工 有限公司)；D. L-苯甘氨醇(純度98· 5% )；三羥甲基氨基甲烷(Tris)AR，Amreso分裝； H3PO4AR(天津市津南化學(xué)試劑廠)；檸檬酸AR，(中國國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；硼酸 AR(中國云嶺化工廠)；NaOHAR(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)手性藥物結(jié)構(gòu)式如下 普羅帕酮撲爾敏 異丙腎上腺素山莨菪堿(Isoprenaline) (Anisodamine)手性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式2撲爾敏的分離撲爾敏左旋體和右旋體等混合的消旋體型，右旋撲爾敏主要用于防治蕁麻疹、藥 疹、哮喘、過敏性鼻炎、接觸性皮炎、枯草熱、蟲咬、皮膚瘙癢、感冒、血清病及預(yù)防輸血反應(yīng) 等。而左旋體對(duì)人體的毒性作用較大。由于合成藥物大部分是以消旋體形式出售，而手性 藥物的對(duì)映體具有不同的藥理與毒理作用，有時(shí)甚至具有毒副作用。因此對(duì)手性藥物布比 卡因的分離研究具有重要意義。2. 1實(shí)驗(yàn)方法以12% β -⑶-B2作為手性固定相，制備HPCE柱。把撲爾敏溶于超純水中(0. 4g/ L)過濾，配置不同濃度的Tris-磷酸緩沖液，按分離所需調(diào)pH值，作為電泳的運(yùn)行介質(zhì).毛 細(xì)管在每次運(yùn)行之前用去離子水洗3min，0. Imol -L^Hcl沖洗5min，去離子水沖洗5min，背 景電解質(zhì)沖洗5min，所用溶液均用0. 22 μ m微孔濾膜過濾。采用壓力進(jìn)樣，0. 5psi進(jìn)樣5s， 分離電壓為20kV，檢測波長為214nm，溫度20°C。2. 2結(jié)果討論(1)12% β-CD-B2 手性 HPCE 柱中的分離在40mmol/L Tris-磷酸緩沖液，12 % β -CD-B2手性柱中，ρΗ2· 5，進(jìn)樣量為 (0. 5psi，5sec)，分離電壓20kV，分離溫度為20 V的最佳電泳條件下，改變分離電壓以考察 其對(duì)分離情況的影響，得電泳圖如圖25所示。(2)與將β -CD-B2作為手性添加劑分離結(jié)果的對(duì)照試驗(yàn)與β -CD-B2作為手性添加劑分離撲爾敏作比較.β -CD-BJt為手性添加劑分離撲 爾敏的最佳條件為β -⑶-B2濃度為7g/L，緩沖液的濃度為50mM，pH2. 3，分離電壓25kV，溫 度20°C。電泳圖如圖26所示。β-CD-B2作為手性添加劑分離撲爾敏沒有達(dá)到基線分離， 12% β -⑶-B手性HPCE柱分離撲爾敏達(dá)到了基線分離。
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3、山莨菪堿的分離山莨菪堿為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，味苦。從植物山莨菪中提取或由呋喃 為原料人工合成制得。為阻斷M-膽堿受體的抗膽堿藥。臨床用于治療急性微循環(huán)障礙和 有機(jī)磷中毒。還用于治療感染中毒性休克、眩暈病及血管性疾病(腦血栓、腦血管痙攣)。 用于中毒性休克、血管性疾患、神經(jīng)痛、眼底視網(wǎng)膜病。3.1實(shí)驗(yàn)方法用20%的β -⑶-B2鍵合的HPCE柱。將山宕崑堿(0. 5g/L)過濾，配置不同濃度的 Tris-檸檬酸緩沖液，按分離所需調(diào)pH值，作為電泳的運(yùn)行介質(zhì).毛細(xì)管在每次運(yùn)行之前用 去離子水洗3min，0. Imol · L^1Hcl沖洗5min，去離子水沖洗5min，背景電解質(zhì)沖洗5min，所 用溶液均用0. 22 μ m微孔濾膜過濾。采用壓力進(jìn)樣，0. 5psi進(jìn)樣5s，分離電壓為20kV，檢測 波長為214nm，溫度20°C。3. 2結(jié)果討論(1)20% β-CD-B2 手性 HPCE 柱中的分離在50mM，pH2. 5Tris_檸檬酸緩沖液，進(jìn)樣量0. 8psi_8s，分離電壓為25kV，20°C的 電泳條件下，得藥品基線分離電泳圖如圖27所示。⑵對(duì)照實(shí)驗(yàn)在緩沖液的濃度為40mmol/LTriS-檸檬酸，pH4. 5，分離電壓25kV，進(jìn)樣量 0. 5psi-5s，溫度20°C的電泳條件下對(duì)照山莨菪堿的標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0. 5 μ g/mL。 從圖28a、圖28b可知所分離的山莨菪堿藥片里的成分和標(biāo)準(zhǔn)品里的成分是相同的。沒有 鍵合⑶-B2衍生物的空白柱對(duì)山莨菪堿沒有分離。實(shí)施例四β -⑶-B2作為HPCE流動(dòng)相手性添加劑分離DL-苯甘氨醇HPCE流動(dòng)相用β -CD-B2濃度為7g/L和Tris-H3PO4緩沖液濃度為50mmol/L組成， 分離電壓為25kV，檢測波長254nm，Rs達(dá)到5. 32，可定性定量分離分析DL-苯甘氨醇，得到 單一對(duì)映體和外消旋體各自的線性范圍。1、實(shí)驗(yàn)方法稱取一定量的β -⑶-B2溶于已配制的50mmo VLTris-H3PO4緩沖液中，作為運(yùn)行介 質(zhì)。毛細(xì)管在每次運(yùn)行之前用0. Imol -L-1NaOH沖洗5min，去離子水沖洗5min，背景電解質(zhì) 沖洗5min，采用壓力進(jìn)樣，0. 5psi進(jìn)樣5s，分離電壓為25kV，檢測波長為254nm，溫度25°C， D和L型單一對(duì)映體混合物，即DL-苯甘氨醇外消旋體(對(duì)照品，>99%),濃度為0. Imol/ L02、結(jié)果討論分別以β -⑶、β -⑶-Α2、β -⑶-B2作為手性添加劑以及純緩沖液分離DL-苯甘氨 醇，ρΗ4. 5, 50mmo VLTris-H3PO4緩沖液，手性添加劑的濃度均為7g/L。由圖29a、圖29b、圖 29c、圖29d可知純緩沖液對(duì)DL-苯甘氨醇沒有分離的跡象，β -⑶有部分分離，β -⑶-A2 的加入對(duì)DL-苯甘氨醇雖有分離，但是基線漂移嚴(yán)重，譜峰非線性嚴(yán)重，隨著P-CD-B2的加 入使DL-苯甘氨醇達(dá)到了基線的分離效果，分離度Rs為5. 22，峰1柱效N為2237/每米，峰 2柱效N為2237/每米。說明⑶-B2與苯甘氨醇之間的協(xié)同作用比前三種情況更適于對(duì) 映體的分離。據(jù)此可建立定量測定HPCE新方法。實(shí)施例五β -CD-B2作為流動(dòng)相手性添加劑基線分離手性藥物
將β -⑶-B2衍生物作為手性添加劑分離山莨菪堿、異丙腎上腺素和普羅帕酮3種 手性藥物，與純緩沖液、其他手性添加劑或標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)背景電解質(zhì)、緩沖液濃 度、PH值、手性選擇劑濃度、分離電壓等分離條件進(jìn)行優(yōu)化。普羅帕酮、山莨菪堿和異丙腎 上腺素可達(dá)到基線分離，已用對(duì)照品定性，可建立相關(guān)藥物的定量測定新方法。1、普羅帕酮的分離普羅帕酮亦稱丙胺苯丙酮；利他脈；羥丙苯丙酮；鹽酸丙酚酮；心律平。適應(yīng)癥 適用于預(yù)防或治療室性或室上性異位搏動(dòng)，室性或室上性心動(dòng)過速，預(yù)激綜合征，電轉(zhuǎn)復(fù)律 后室顫發(fā)作等，對(duì)冠心病、高血壓所引起的心律失常有較好的療效。普羅帕酮(PPF)為一抗 心律失常藥。臨床上以外消旋體給藥，但S-(+)-PPF、的毒性作用強(qiáng)于R-(-)-PPF。在人體 中其主要羥化代謝途徑是由CYP2D6催化，S-對(duì)映體優(yōu)先代謝，但是該酶與R-對(duì)映體有較 大親和力。兩對(duì)映體之間相互抑制，但R-對(duì)映體對(duì)S-對(duì)映體代謝的競爭性抑制更強(qiáng)，可減 弱其S-對(duì)映體的代謝消除，使S-型血藥濃度增高，易引起β受體阻斷的不良反應(yīng)。在人 肝CYP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和大鼠肝微粒體，普羅帕酮的N-脫丙基代謝主要由CYP3A4和CYP1A2介 導(dǎo)，(-)-R-普羅帖酮抑制(+)-S-普羅帕酮的代謝。R-普羅帕酮也比其S-對(duì)映體對(duì)丁呋心 定(bufuralol)代謝的抑制作用更強(qiáng)。1. 1實(shí)驗(yàn)方法以β -⑶-B2作為手性添加劑的硼砂緩沖液作為電泳的運(yùn)行介質(zhì)，毛細(xì)管在每次運(yùn) 行之前用0. Imol · L-1NaOH沖洗5min，去離子水沖洗5min，背景電解質(zhì)沖洗5min，所用溶液 均用0. 22 μ m微孔濾膜過濾。采用壓力進(jìn)樣，0. 3psi進(jìn)樣3s，分離電壓為25kV，檢測波長為 254nm，溫度 20°C。1.2結(jié)果討論1.2. 1對(duì)比實(shí)驗(yàn)以50mmol/L硼砂緩沖液及分別以β -⑶、β -⑶_Α2、β -⑶-B2作為手性添加劑對(duì) 分離普羅帕酮(10g/L)的對(duì)比試驗(yàn)，pH8.0，手性添加劑濃度為5g/L。由圖30a、圖30b、圖30c、圖30d可知以硼砂緩沖液及分別用β -CD、β _CD_A2、 β -CD-B2作為手性添加劑分離普羅帕酮的對(duì)比試驗(yàn)可知。圖30a圖和圖30b圖中，純緩沖 液和只加β "CD的條件下，只有一個(gè)強(qiáng)峰，圖30c中只添加了 β -CD-A2的緩沖液體系下不僅 出現(xiàn)非線性峰，還有雜峰。相比之下，只有圖30d中只加入⑶-B2添加劑的緩沖體系中， 兩峰達(dá)到了基線分離，分離度達(dá)到了 3. 36。2、異丙腎上腺素的分離異丙腎上腺素常用其鹽酸鹽，為白色或類白色結(jié)晶性粉末；無臭，味微苦，遇光和 空氣漸變色，在堿性溶液中更易變色。在水中易溶，在乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。適 應(yīng)癥(1)支氣管哮喘適用于控制哮喘急性發(fā)作，常氣霧吸入給藥，作用快而強(qiáng)，但持續(xù)時(shí) 間短。(2)心臟聚停用于治療各種原因溺水、電擊、手術(shù)意外和藥物中毒等引起的心跳驟 停。必要時(shí)，可與腎上腺素和去甲腎上腺素配伍用。(3)房室傳導(dǎo)阻滯。(4)抗休克可用 于心原性休克和感染性休克。(-)-異丙腎上腺素是β 1受體激動(dòng)劑，而其(+)_異構(gòu)體則以 大約相當(dāng)?shù)挠H和性作為(-)_體的競爭性拮抗劑。2. 1實(shí)驗(yàn)方法稱取一定量的β -⑶-B2加入硼酸和NaOH調(diào)制的50mmol/L硼砂緩沖液中，作為電泳的運(yùn)行介質(zhì)，毛細(xì)管在每次運(yùn)行之前用0. Imol · L-1NaOH沖洗5min，去離子水沖洗5min， 背景電解質(zhì)沖洗5min，所用溶液均用0. 22 μ m微孔濾膜過濾。采用壓力進(jìn)樣，0. 3psi進(jìn)樣 3s，分離電壓為25kV，檢測波長為280nm，溫度20°C。2. 2結(jié)果討論分別以β -⑶、β -⑶-Α2、β -⑶-B2作為手性添加劑以及純緩沖液分離異丙腎上腺 素(0. 5g/L)，pH9. 5，40mmol/L硼砂緩沖液，手性添加劑的濃度均為5g/L。從圖31a、圖31b、圖31c、圖31d中可以看出由分離異丙腎上腺素的對(duì)比試驗(yàn)可 知。不加添加劑和只加β -⑶的圖31a圖和圖31b圖，分離不理想。在有添加β -⑶衍生 物的緩沖液體系下，樣品出峰時(shí)間快且兩峰響應(yīng)信號(hào)均較強(qiáng)。圖31c圖顯示β-CD-A2衍生 物包夾異丙腎上腺素分子后，也有嵌合作用，β-CD-A2衍生物上的兩個(gè)羧基與異丙腎上腺 素上羥基0、仲胺N的氫鍵作用等，使之有一定分離，但峰未分開。圖31d圖顯示以β-⑶-B2 衍生物為添加劑的緩沖液條件下，兩峰達(dá)到了基線分離，且響應(yīng)信號(hào)較強(qiáng)，表明流動(dòng)相洗 脫強(qiáng)度大，且出峰時(shí)間無明顯增加。3、山莨菪堿的分離山莨菪堿又稱6-羥基莨菪堿，消旋山莨菪堿。為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，味 苦。從植物山莨菪中提取或由呋喃為原料人工合成制得。為阻斷M-膽堿受體的抗膽堿藥。 臨床用于治療急性微循環(huán)障礙和有機(jī)磷中毒。還用于治療感染中毒性休克、眩暈病及血管 性疾病(腦血栓、腦血管痙攣)。用于中毒性休克、血管性疾患、神經(jīng)痛、眼底視網(wǎng)膜病。制 劑有片劑，針劑。3. 1實(shí)驗(yàn)方法稱取一定量的β -⑶-B2溶于已配制的50mmol/L的Tris-檸檬酸緩沖液中，作為 運(yùn)行介質(zhì)。毛細(xì)管在每次運(yùn)行之前用0. Imol -L-1NaOH沖洗5min，去離子水沖洗5min，背景 電解質(zhì)沖洗5min，采用壓力進(jìn)樣，1. Opsi進(jìn)樣8s，分離電壓為25kv，檢測波長為254nm，溫度 20°C。4. 2結(jié)果討論分別以β-⑶、i3-CD_A2、β _⑶-B2作為手性添加劑以及純緩沖液分離山莨菪堿 (0. 5g/L)，pH2. 3,50mmol/LTris-檸檬酸緩沖液，手性添加劑的濃度均為0. 5g/L。由圖32a、圖32b、圖32c、圖32d可知，雖然在純Tris-檸檬酸的電泳介質(zhì)中，山 莨菪堿也有部分分離，但第一個(gè)峰較弱，第二個(gè)峰拖尾嚴(yán)重；以β -CD為手性添加劑，純粹 受β-CD空腔作用時(shí)第一個(gè)峰的洗脫強(qiáng)度明顯增大、第二個(gè)峰依舊拖尾且基線飄移嚴(yán)重； β-⑶-A2作為手性添加劑時(shí)，除⑶空腔與山莨菪堿分子的嵌合作用外，⑶_4上羧 基0與山莨菪堿分子中羥基0的氫鍵作用，使對(duì)映體也有分離，且兩峰洗脫強(qiáng)度相當(dāng)，峰型 對(duì)稱但未達(dá)到基線分離；以β-CD-BJt為手性添加劑時(shí)，有β-CD疏水空腔與山莨菪堿分 子的嵌合作用，還有β -CD-B2上羰基或羧基0、支鏈上S與山莨菪堿分子中羥基0的氫鍵作 用及偶極作用、β -CD-B2上苯環(huán)與山莨菪堿分子苯環(huán)的超共軛作用，使對(duì)映體分子9min前 就能完成基線分離。
權(quán)利要求
雙 [6 氧 (2 間羧基苯磺酰基 丁二酸1，4單酯 4)] β 環(huán)糊精(β CD B2)的分子式為C62H84O49N2S2，結(jié)構(gòu)為FSA00000232093100011.tif
2.雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺酰基-丁二酸1，4單酯-4)]-β -環(huán)糊精的制備方法， β -環(huán)糊精簡稱為β -⑶，其特征在于按以下步驟進(jìn)行⑴、將Imol苯甲酸粉末和I-IOmol 氯磺酸攪拌混勻，將溫度升至50-150°C，在此溫度下反應(yīng)3-10小時(shí)，冷卻后，得到白色固 體，過濾得間羧基苯磺酰氯沉淀；(2)、再用2-30mol順丁烯二酸酐和Imol β -⑶，60-120°C 加熱反應(yīng)得到雙(6-氧-丁烯二酸單酯)-β -CD，簡稱β -CD-A2 ； (3)、然后用Imol β -CD-A2 和2-30mol間羧基苯磺酰氯溶于恒溫水浴50-150°C反應(yīng)4-8小時(shí)，加入有機(jī)溶劑，析出沉 淀，抽濾得到雙_ [6-氧-(2-間羧基苯磺?；?丁二酸1，4單酯-4) ] - β -⑶(β -⑶-B2)，反 應(yīng)方程式如下
3.雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；?丁二酸1，4單酯-4) ] - β -環(huán)糊精作為手性選擇 劑在毛細(xì)管電泳(HPCE)中的應(yīng)用也就是制備成手性電泳柱或流動(dòng)相手性添加劑用于手性 物質(zhì)的拆分將β-CD-B2作為HPCE流動(dòng)相手性添加劑分離手性物質(zhì)苯甘氨醇及山莨菪堿、 異丙腎上腺素和普羅帕酮，均可實(shí)現(xiàn)基線分離；用該β-CD衍生物制備手性HPCE柱，可分離 撲爾敏、布比卡因、普魯卡因、阿替洛爾、山莨菪堿、普羅帕酮和洛貝林等手性物質(zhì)，均可實(shí)現(xiàn)基線分離，據(jù)此可建立多種手性物質(zhì)單一對(duì)映體HPCE定量測定新方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺?；?丁二酸1，4單酯-4)]-β-環(huán)糊精及制備方法和作為手性選擇劑在高效毛細(xì)管電泳(HPCE)中的應(yīng)用，即制備成手性電泳柱和流動(dòng)相手性添加劑用于手性物質(zhì)的拆分。確定了雙-[6-氧-(2-間羧基苯磺酰基-丁二酸1，4單酯-4)]-β-環(huán)糊精分子式為C64H84O49S2。用β-CD-B2作為HPCE流動(dòng)相手性添加劑分離手性物質(zhì)苯甘氨醇及山莨菪堿、異丙腎上腺素和普羅帕酮，均可實(shí)現(xiàn)基線分離；用β-CD-B2制備手性HPCE柱，可分離撲爾敏、布比卡因、普魯卡因、阿替洛爾、山莨菪堿、普羅帕酮和洛貝林等手性物質(zhì)，均可實(shí)現(xiàn)基線分離，據(jù)此可建立多種手性物質(zhì)單一對(duì)映體HPCE定量測定新方法。
文檔編號(hào)C25B7/00GK101928356SQ201010254099
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月12日
發(fā)明者沈靜茹 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)