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本發(fā)明通常涉及生物介導(dǎo)的反應(yīng)的用途，所述生物介導(dǎo)的反應(yīng)能改變化合物的氧化態(tài)，特別是給定化合物中的碳原子的氧化態(tài)。更特別地，本發(fā)明涉及改進(jìn)的電化學(xué)生物反應(yīng)器模塊(ebm)及其用于制造所需產(chǎn)品的用途。

背景技術(shù)：

在化學(xué)反應(yīng)中，還原是由特定化學(xué)物質(zhì)得到電子，并且氧化是從特定化學(xué)物質(zhì)失去電子。通用術(shù)語“氧化還原”反應(yīng)是氧化-還原反應(yīng)的簡寫。氧化還原反應(yīng)涉及電子從一種化學(xué)物質(zhì)向另一種化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。電化學(xué)電池被定義為利用氧化還原反應(yīng)組合的系統(tǒng)，以產(chǎn)生有用的電能，或利用電能來驅(qū)動有用的氧化還原反應(yīng)的組合(silberberg,martin(2009)《化學(xué)：分子物質(zhì)的性質(zhì)和變化(chemistry:themolecularnatureofmatterandchange)》(第五版)紐約，紐約麥格希出版)。

電化學(xué)電池包括稱為陽極和陰極的兩個電極。電子從電極向化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是還原反應(yīng)，發(fā)生在陰極；電子從化學(xué)物質(zhì)向電極的轉(zhuǎn)移是氧化反應(yīng)，發(fā)生在陽極。為了平衡電子在陰極的消耗以及電子在陽極的累積，電子必須以電化學(xué)電池外部的某種方式(即通過電線或一些允許電子移動的其他材料)從陽極流動到陰極。該電子的流動就是電流，并可經(jīng)利用以執(zhí)行工作，例如驅(qū)動電子設(shè)備。反之，電子從陽極向陰極的流動可由外部能源驅(qū)動，如電池或電動勢(emf)，造成發(fā)生在陽極或陰極或兩者處的有用的化學(xué)反應(yīng)。

電化學(xué)電池可被構(gòu)建用于產(chǎn)生電流，即來源于在陽極和陰極進(jìn)行的自發(fā)的氧化還原反應(yīng)的通過傳導(dǎo)性的元件(如電線)的單向的電子流，或其也可被構(gòu)建用于消耗由外部來源(如電池或emf)提供的電流，以驅(qū)動陽極和陰極處的非自發(fā)反應(yīng)。在后一種情況下，該電力驅(qū)動的、非自發(fā)的反應(yīng)可被稱為電合成。

電化學(xué)電池要求發(fā)生兩個反應(yīng)，一個發(fā)生在陽極，一個發(fā)生在陰極，在各電極發(fā)生的反應(yīng)被稱為半電池反應(yīng)，或半反應(yīng)。不論電化學(xué)電池是消耗還是產(chǎn)生電流，半電池反應(yīng)都必然在陽極和陰極處同時進(jìn)行。

半電池反應(yīng)被認(rèn)為具有正或負(fù)的還原/氧化電勢，稱為氧化還原電勢；這是半電池反應(yīng)的氧化和還原的物質(zhì)之間的平衡常數(shù)，以伏特表示，且相對于氫被解離為質(zhì)子和電子，其被認(rèn)為具有零伏特的氧化還原電勢。

在環(huán)境氧化還原電勢比給定的半電池反應(yīng)的氧化還原電勢更正的條件下，會使半電池反應(yīng)朝向反應(yīng)的氧化的物質(zhì)。在環(huán)境氧化還原電勢比給定的半電池反應(yīng)的氧化還原電勢更負(fù)的條件下，會使半電池反應(yīng)朝向半電池反應(yīng)的還原的物質(zhì)。

通過從外部源提供電子，即，從外部電源(例如電池)對電化學(xué)電池的陰極施加負(fù)電壓，可使陰極附近的環(huán)境的氧化還原電勢變得更負(fù)。該效應(yīng)可用于使半電池反應(yīng)產(chǎn)生還原的物質(zhì)。為了平衡這一點，半電池反應(yīng)必須以相應(yīng)的正電壓在陽極進(jìn)行，從而使陽極的半電池反應(yīng)產(chǎn)生氧化的物質(zhì)。

因此，電化學(xué)電池的陰極室中提供到環(huán)境中的電子會導(dǎo)致半電池反應(yīng)以從基質(zhì)產(chǎn)生還原的物質(zhì)。

任何導(dǎo)致特定化學(xué)物質(zhì)的還原或氧化的反應(yīng)都可提供有用的半電池反應(yīng)。這包括生命系統(tǒng)，其中所需的半反應(yīng)存在于對有機化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化的代謝途徑，并被酶催化。如前所述，半電池反應(yīng)通常被稱為氧化還原反應(yīng)；因此催化這樣的半反應(yīng)的酶通常被稱為氧化還原酶。典型但非排他地，氧化還原酶需要稱為輔酶或輔因子的其他生物組分，這些輔酶或輔因子在催化對給定的生物系統(tǒng)中的半電池反應(yīng)(氧化還原反應(yīng))的各種氧化還原酶之間物理傳輸電子。

為了使氧化還原酶催化氧化還原反應(yīng)，輔因子或輔酶必須處于合適的氧化或還原形式。在活細(xì)胞中，這在代謝過程中被完成。為了氧化給定的碳原子，微生物或其他細(xì)胞的代謝過程必須從感興趣的碳原子去除電子，且為了還原給定的碳原子，代謝過程必須向感興趣的碳原子提供電子。

在氧化的情況下，容易通過如下方式來實現(xiàn)：使用來自環(huán)境(例如，來自空氣)的分子氧作為電子的“阱(sink)”，且在該過程中，氧分子通過電化學(xué)方式被還原，通常產(chǎn)生兩個水分子。

在還原的情況下，微生物中的代謝過程必須氧化一些其他化學(xué)物質(zhì)以提供電子，用于進(jìn)行所需的還原。在生長于碳源如碳水化合物上的微生物的情況中，最常見的是，還原當(dāng)量通過將部分碳水化合物完全氧化為co2來產(chǎn)生，也就是說，一些提供給微生物的碳水化合物犧牲式地被氧化，來向微生物提供電子，以在生產(chǎn)更大程度上被還原的有機分子的代謝過程中使用。盡管產(chǎn)生的電子對微生物而言是需要且有用的，但丟失了因氧化為co2而犧牲的碳原子。

類似計算也適用于所有犧牲了輸入含碳物質(zhì)中的一些以向所需代謝過程提供電子的代謝過程。

如果電子可由外部源(也即，電流)提供，則消除了犧牲輸入含碳物質(zhì)以提供電子的需要，且個體氧化還原酶可被用作常規(guī)催化劑，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而不需要活細(xì)胞，并與生物系統(tǒng)或過程如活性發(fā)酵相關(guān)聯(lián)。

顯著改進(jìn)的化學(xué)過程可通過如下系統(tǒng)實現(xiàn)，該系統(tǒng)能在和標(biāo)準(zhǔn)催化的化學(xué)過程類似的過程中使用過剩的氧化還原酶。在發(fā)酵液中去除活性代謝的細(xì)胞的方面將使更高的底物濃度的使用、非生理條件、以及所需產(chǎn)物的容易分離和純化成為可能。例如，已經(jīng)報道了使用電化學(xué)方法來使對bayer-villiger氧化進(jìn)行催化的p450單加氧酶的黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)輔因子再生(schmid等，《美國化學(xué)學(xué)會會志(j.am.chem.soc.)》2005，127，6540-6541)，但這是在容納10ml的體積的簡單攪拌瓶中進(jìn)行的。然而，并沒有設(shè)想以工業(yè)實踐的規(guī)模進(jìn)行該反應(yīng)。

自然界中包含有用的氧化還原酶的微生物是廣泛已知的，且可以通過簡單的篩選快速找到。如果需要特定的氧化還原酶且天然宿主生物不容易生長或處理，則氧化還原酶可以容易地在標(biāo)準(zhǔn)的工業(yè)上有用的宿主中被克隆和過表達(dá)，如釀酒酵母(s.cerevisiae)或大腸桿菌(e.coli)。

因而非常需要從外部源向具有一定物理布置的氧化還原酶系統(tǒng)提供電子，其允許以連續(xù)的工藝料流提供底物分子、通過經(jīng)選擇的氧化還原酶來催化所需的氧化還原反應(yīng)、且易從連續(xù)的工藝料流回收和分離所得產(chǎn)物。

該需要已經(jīng)被他人認(rèn)識到，并已經(jīng)公開了向生物系統(tǒng)遞送電子的多項嘗試。電子從電極(陰極)向生物系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移也通過電子運送介質(zhì)的使用而被改進(jìn)，且化合物中性紅(nr)普遍應(yīng)用于該方面。

zeikus等的美國專利第6,270,649號顯示了中性紅是一種改進(jìn)的電子介質(zhì)，其用于將電力轉(zhuǎn)化為微生物的還原力，該還原力用于增強的細(xì)胞生長和還原的最終產(chǎn)物的產(chǎn)量(見park等，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(appl.environ.microbioi.)》65:2912-2917，1999；和park等，《細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)》1812:2403-2410，1999)，或在生物燃料電池中將微生物的還原力轉(zhuǎn)化為電力(見park和zeikus，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》66:1292-1297，2000)。

在《細(xì)菌學(xué)雜志》1812:2403-2410，1999中，park等首次提供了nr如何通過生理學(xué)方式形式功能的生物化學(xué)證據(jù)，其顯示(i)nr的電還原與nad+還原有化學(xué)聯(lián)系，并且其與質(zhì)子動力勢的生成和琥珀酸鹽的生產(chǎn)有生物化學(xué)聯(lián)系，(ii)nr似乎通過替代膜結(jié)合復(fù)合物中的甲基萘醌來行使功能。

在《生物技術(shù)通信》(biotech.lett.)22:1301-1304，2000中park等顯示了將中性紅結(jié)合在石墨電極上進(jìn)一步增強了微生物燃料電池中的電子轉(zhuǎn)移效率。

發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化的電增強還涉及電極和電子介質(zhì)在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的利用，以增強還原的最終產(chǎn)物的產(chǎn)量(見hongo等，《農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)期刊》(agri.biolio.chem.)，43:2075-208111979；hongo等，《農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)期刊》，43:2083-2086，1979；kim等，1988；park和zeikus，《細(xì)菌學(xué)雜志》181:403-2410，1999；和shin等，《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》(applmicrobiolbiotechnol.)，dol1o.1007/s002530100809.網(wǎng)上公開：2001年9月22日)。例如，石墨粘結(jié)電極和可溶的中性紅可大大增強通過發(fā)酵而生產(chǎn)的琥珀酸鹽的產(chǎn)率(見park和zeikus，《細(xì)菌學(xué)雜志》181:403-2410，1999)以及通過酵母轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的四氫萘醇的產(chǎn)率(shin等，《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》，dol1o.1007/s002530100809.網(wǎng)上公開：2001年9月22日)。

在化學(xué)合成(見例如，s.m.roberts等，《今日化學(xué)》(chimicaoggi)，1993年7月/8月，93-104頁；和d.miyawaki等，《酶和微生物技術(shù)》(enzg.microbiol.technol.)15:525-29，1993)或化學(xué)檢測即生物傳感器(見例如，p.n.bartlett，《醫(yī)學(xué)與生物工程與計算機》(med.andbioi.eng.andcomput.)28:blo-b7，1990；和d.miyawaki等，同上)中，限制氧化還原酶利用的一個主要因素是缺乏用于電子轉(zhuǎn)移輔因子(例如，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、醌類、黃素腺嘌呤二核苷酸等)再生或回收再利用的簡便系統(tǒng)。

雖然電子可作為單個電子通過輔因子在生物系統(tǒng)中被傳遞，但電子的傳遞常以電子對的形式發(fā)生。在電子對的情況下，質(zhì)子也在形式上被傳遞，因此形式上的化學(xué)物質(zhì)是氫化物，也就是說具有額外(第二)電子的氫原子，因此帶負(fù)電荷，通常寫作“h-”。

在生物系統(tǒng)中，這種物質(zhì)在歷史上被稱為“還原當(dāng)量”，因為向化學(xué)物質(zhì)的形式添加氫化物導(dǎo)致了該化學(xué)物質(zhì)的減少。形式上，需要一個額外的第二質(zhì)子來中和反應(yīng)的還原產(chǎn)物通過添加氫化物物質(zhì)所攜帶的形式負(fù)電荷。通常在生物系統(tǒng)中，必需的質(zhì)子簡單地通過水合氫離子(即質(zhì)子化水分子，h3o⁺)提供。在電化學(xué)電池中，質(zhì)子化水分子可在陽極產(chǎn)生并被允許向陰極動。

park和zeikus在《細(xì)菌學(xué)雜志》181:2403-2410，1999中已經(jīng)報道，稱為中性紅的化合物將與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔因子(nad+)進(jìn)行可逆的化學(xué)氧化還原反應(yīng)，也就是說中性紅的還原形式(nrred)具有足夠低的氧化還原值，以使電子轉(zhuǎn)移至，進(jìn)而將氧化還原輔因子nad+從其氧化形式還原到其還原形式nadh。在該過程中，中性紅被氧化為物質(zhì)nrox，然后該物質(zhì)可從陰極接受電子，從而回到還原形式nrred，進(jìn)而可減少nad+。

還有報道說，通過在含有微生物的電化學(xué)反應(yīng)器中使用可溶性中性紅，微生物可以僅依靠電力生長；不同的微生物可在生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵過程中過量生產(chǎn)各種還原的生物化學(xué)物質(zhì)；微生物可以在有機物代謝過程中發(fā)電。(見例如，park等，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》(appl.environ.microbioi.)2912-2917頁，1990；park和zeikus，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》，66:1292-1297，2000；和美國專利第6,270,649號)。

美國專利第7,250,288號b2中，zeikus等討論了在電化學(xué)生物反應(yīng)器系統(tǒng)中提高電極效率的需求并提出了提高的方式，如將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)、中性紅和延胡索酸還原酶連接至電極，以改善電子轉(zhuǎn)移特性。盡管上述這些可以改善電子轉(zhuǎn)移特性，但是基于電極設(shè)計和電化學(xué)生物反應(yīng)器系統(tǒng)設(shè)計的其它方式的改進(jìn)也可能是有利的。

用于生產(chǎn)氯、臭氧和過氧化氫的商業(yè)規(guī)模電化學(xué)工藝設(shè)備的文獻(xiàn)記載了在實驗室電化學(xué)研究中使用的電極規(guī)模通常具有較差的流體流動確定和質(zhì)量傳遞特點，從而難以擴(kuò)大規(guī)模(walsh,f.,和g.reade,《分析員》(analyst)，119(1)，797-803頁(1994年5月))。

向微生物提供還原當(dāng)量可通過再生nadh來實現(xiàn)。在文獻(xiàn)中，標(biāo)準(zhǔn)電勢常被報道為-0.32v，然而根據(jù)karyakin等，ph6下-0.59v的電勢可能是更精確的(見karyakin等，《電化學(xué)通訊》(electrochemistrycommunications)5:677-680，2003)。

還原的電子穿梭體可以將電子轉(zhuǎn)移到幾種不同的吸電子化合物，例如偶氮染料、多鹵代化合物、硝基芳族化合物和氧化的準(zhǔn)金屬。vanderzee和cervantes綜述了電子穿梭體催化的還原生物轉(zhuǎn)化過程的結(jié)果(見frankp.vanderzee和franciscoj.cervantes.《生物技術(shù)進(jìn)展》(biotechnologyadvances)27:265-277,2009)。

為了使電化學(xué)生物反應(yīng)器變得商業(yè)上可行，必須對常規(guī)系統(tǒng)的硬件設(shè)計和工藝設(shè)計做出改變，以將產(chǎn)率和效率提高到實用水平。

此外，雖然其他人之前已經(jīng)認(rèn)識到向生物系統(tǒng)提供外部電子的適宜性，但是在其提供的實施例中顯示，用于實現(xiàn)這一點的方法要求以一定形式包含陽極，該形式防止其與本體(bulk)生物系統(tǒng)發(fā)生不期望的反應(yīng)。因此，必須采取一些物理布置以提供向陽極的電子轉(zhuǎn)移，同時保持陽極與發(fā)酵液(在為全細(xì)胞的情況下)或緩沖系統(tǒng)(在分離的酶處于水介質(zhì)中的情況下)的物理隔離，且這由各種膜、鹽橋或其他物理手段實現(xiàn)。相對于先前公開的設(shè)計，電化學(xué)電池的設(shè)計的簡化，以及用于連續(xù)、流通系統(tǒng)(例如通過大型發(fā)酵容器或化學(xué)反應(yīng)器的環(huán)路)的電池的設(shè)計是理想的。甚至更希望以如下方式安排電化學(xué)電池，所述方式在陽極利用簡單的半反應(yīng)，并且以避免使用鹽橋來連接陽極室和陰極室的方式進(jìn)行操作，且當(dāng)采用膜來分隔陽極室和陰極室時減輕膜污染。

本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的方法和系統(tǒng)，其允許在電化學(xué)生物反應(yīng)器模塊(ebm)中相互轉(zhuǎn)化生物化學(xué)還原力(例如nadh)和電能。本發(fā)明的另一目的是制造所需的產(chǎn)品，其要求ebm中的還原能力或還原當(dāng)量。本發(fā)明的另一個目的是公開酶、輔因子和/或電子傳遞介質(zhì)與ebm聯(lián)合用于制備所需產(chǎn)物的應(yīng)用，并且以高效利用酶、輔因子和/或電子傳遞介質(zhì)的方法中實現(xiàn)上述目的，并且基本上防止它們與制備的制備的所需產(chǎn)物混合或摻混。

在閱讀了說明書和權(quán)利要求的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)勢是顯而易見的。

附圖的簡要說明

圖1示出了在示例性設(shè)計中，wo2014039767中描述的電化學(xué)電池的整體電化學(xué)和總體布置。

圖2示出了在示例性實施方式中的陰極室的總體布置，其顯示了分隔陰極和本體反應(yīng)相的不對稱膜的放置。

圖3示出了在示例性實施方式中，在陰極室中的水性本體相中使用中性紅(“nr”)作為etm，使電子穿梭到包含在不對稱膜的孔內(nèi)的nad(p)輔因子/酶系統(tǒng)。

圖4示出了在示例性實施方式中，在陰極室中的水相中使用甲酸鹽/碳酸鹽(碳酸氫鹽)作為etm。

圖5示出了在示例性實施方式中，采用不同部件相對設(shè)置的電化學(xué)生物反應(yīng)器的分解圖。

發(fā)明概述

在一個方面，本發(fā)明包括用于向氧化還原酶提供以電化學(xué)方式產(chǎn)生的還原能力或還原當(dāng)量的設(shè)備或裝置，用于催化所需的底物分子的還原。通過提供以電化學(xué)方式產(chǎn)生的還原當(dāng)量，該發(fā)明允許在非生理或非細(xì)胞環(huán)境中使用氧化還原酶，并且允許所述酶用于工業(yè)工藝。

該裝置還允許以如下方式包括已知的生物輔因子如nad(p)、一種或多種氧化還原酶，和電子傳遞介質(zhì)(etm)的系統(tǒng)，所述方式允許在連續(xù)工藝料流中將所需的底物分子提供給所述裝置，允許使工藝料流與所需的氧化還原酶接觸來催化所需的氧化還原反應(yīng)，并允許所得的所需產(chǎn)物分子在連續(xù)工藝料流中離開所述裝置。

該裝置還允許捕獲在向氧化還原酶提供還原當(dāng)量的過程中可能在陰極表面不定產(chǎn)生的任何氫氣。

本發(fā)明的一個方面涉及以通過需要還原當(dāng)量的反應(yīng)來生產(chǎn)產(chǎn)物的裝置，包括：

(a)包含在陽極室中的陽極和包含在陰極室中的陰極；

(b)陽極室中去離子水，其與陽極接觸；

(c)分隔陽極室和陰極室的質(zhì)子滲透膜；

(d)陰極室中的液相，其與陰極連續(xù)接觸，所述液相任選地包含能夠?qū)⑦€原當(dāng)量傳遞到氧化還原酶系統(tǒng)的電子傳遞介質(zhì)(etm)，所述氧化還原酶系統(tǒng)包含氧化還原酶和輔因子；

(e)含有待被氧化還原酶系統(tǒng)催化為所需產(chǎn)物的底物的工藝料流；

(f)位于陰極和工藝料流之間的膜，所述膜能防止任選的etm和氧化還原酶系統(tǒng)顯著地進(jìn)入工藝料流；以及

(g)在陽極和陰極之間提供電壓的外部電源。

在一些實施方式中，膜允許液相和工藝料流之間的界面接觸，同時防止液相和工藝料流的大量混合并防止工藝料流與陰極大幅接觸。膜可以是其中含有氧化還原酶系統(tǒng)的至少一部分(例如，一種或多種氧化還原酶和任選的一種或多種輔因子)的親水性不對稱膜。在某些實施方式中，膜可以具有延伸穿過其中的一個或多個孔，且氧化還原酶系統(tǒng)的至少一部分可以包含在所述孔內(nèi)?？卓梢栽谀さ拿嫦蜿帢O的第一表面上具有第一開口，其中第一開口足夠小以防止分子量大于100kda(例如，大于100kda、大于80kda、大于60kda、大于50kda、大于40kda、大于30kda、大于20kda、大于20kda、大于10kda或大于5kda)的分子大幅通過?？走€可以在面向工藝料流的膜的第二表面上具有第二開口，其中第二開口足夠大以允許包含在孔內(nèi)的氧化還原酶的至少一部分接觸工藝料流中的底物。第二開口可在尺寸上大于第一開口。

在一些實施方式中，輔因子可位于膜或液相中。

在一些實施方式中，工藝料流可以是氧化還原酶系統(tǒng)在其中基本上不溶的本體有機相。當(dāng)膜為親水性時，氧化還原酶和/或輔因子存在于與本體有機相基本上不混溶的水性環(huán)境中。

液相可以任選地再循環(huán)進(jìn)和出陰極室。任選的etm可以是選自中性紅、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)、黃素單核苷酸(fmn)、黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、鐵氧還蛋白、醌和腐殖酸中的一種或多種，其各自任選經(jīng)化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾以保持其氧化還原性質(zhì)和與氧化還原酶的功能性相互作用、同時允許膜防止etm大幅進(jìn)入工藝料流的方式進(jìn)行。在一個實施方式中，etm是甲酸鹽或碳酸氫鹽。

在一個實施方式中，氧化還原酶系統(tǒng)包括p450酶、p450還原酶、以及任選的鐵氧還蛋白。在另一個實施方式中，氧化還原酶系統(tǒng)包括酮還原酶或具有必需輔因子的醇脫氫酶，最典型的是nad(p)。在另一個實施方式中，氧化還原酶系統(tǒng)有能力催化脫氮。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可以使用需要輔因子還原形式的其它氧化還原酶系統(tǒng)。

本發(fā)明的另一個方面涉及從底物生產(chǎn)所需產(chǎn)物的方法，包括；

(a)提供采用包括底物的工藝料流的本發(fā)明公開的裝置的任何實施方式；

(b)在陽極和陰極之間施加來自外部電源的合適電壓；

(c)在工藝料流中累積所需的產(chǎn)物；以及

(d)任選地，收集不定產(chǎn)生的氫氣。

在一些實施方式中，該方法可進(jìn)一步包括通過膜保持氧化還原酶系統(tǒng)和任選的etm，使得工藝料流基本上不含氧化還原酶系統(tǒng)或任選的etm。

發(fā)明詳述

本文提供了一種裝置和用于使用該裝置的方法，用于通過需要添加還原當(dāng)量的氧化還原酶系統(tǒng)來生產(chǎn)日用、專用、功能或精細(xì)化學(xué)品。該裝置允許方便地改變操作條件以實現(xiàn)最大電化學(xué)效率以供給定的酶促介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)或一系列反應(yīng)。

在一些實施方式中，本發(fā)明涉及pct專利申請公開號wo2014039767a1中先前描述的“電化學(xué)生物反應(yīng)器模塊”(ebm)的改進(jìn)形式。現(xiàn)有的ebm示于圖1，其通常包括電化學(xué)電池，該電化學(xué)電池具有包含在陽極室中的陽極、包含在陰極室中的陰極、分隔所述兩室的質(zhì)子滲透膜、任選的etm和氧化還原酶系統(tǒng)。氧化還原酶可用于將底物催化還原成所需產(chǎn)物。圖1中，指出了隨水合氫離子(h3o⁺)從陽極室(“去離子化的水側(cè)”)向陰極室(“反應(yīng)側(cè)”)的質(zhì)子凈流量，以及外部驅(qū)動電流和電化學(xué)物質(zhì)。圖1顯示一般的電子傳遞介質(zhì)(etm)，其通過從陰極接受電子并向nad(p)輔因子遞送電子而在其氧化態(tài)和還原態(tài)之間循環(huán)。etm由于可以將電子從陰極直接遞送到nad(p)輔因子而是任選的。

在一些實施方式中，本發(fā)明涉及在ebm中使用一個或多個膜以限制電子傳遞介質(zhì)(任選的)、氧化還原輔因子和/或酶，以及其與本體化學(xué)反應(yīng)相的隔離，所述化學(xué)反應(yīng)相中，底物被氧化還原酶催化為還原產(chǎn)物。

更具體地，在某些實施方式中，氧化還原酶、它們的相應(yīng)的輔因子和任選的電子傳遞介質(zhì)可通過膜與本體反應(yīng)相隔離，防止它們大幅進(jìn)入本體反應(yīng)相。這樣，反應(yīng)相基本不含氧化還原酶、輔因子和/或任選的電子傳遞介質(zhì)，這顯著地節(jié)省了與純化終產(chǎn)物相關(guān)的時間和成本。在某些實施方式中，膜可被設(shè)計為具有孔，氧化還原酶、輔因子和/或任選的電子傳遞介質(zhì)可被包含或定位在所述孔中，從而增加氧化還原酶與反應(yīng)相中的底物的接觸面積，并減少促進(jìn)將底物還原為所需產(chǎn)物所要求的氧化還原酶、輔因子和/或任選的電子傳遞介質(zhì)的量。

如本文所用，“氧化還原酶”是催化導(dǎo)致被作用的分子的化學(xué)氧化狀態(tài)發(fā)生變化的反應(yīng)的酶，這樣的分子稱為“底物”。在反應(yīng)過程中，底物分子通過氧化還原酶接受電子以產(chǎn)生比底物分子化學(xué)還原程度更高的分子。該還原的分子為“還原產(chǎn)物”，或更簡潔地，“產(chǎn)物”。示例性產(chǎn)物包括商業(yè)或工業(yè)上重要的產(chǎn)物，例如琥珀酸(例如從富馬酸鹽還原)、甲烷(例如從co2還原)、丁二醇、乙醇、脂肪酸和其它醇。

通過質(zhì)子進(jìn)行平衡的電子被稱為“還原當(dāng)量”或“還原力”。還原當(dāng)量通常通過輔因子向氧化還原酶提供。通常，一起催化底物轉(zhuǎn)化為具有不同化學(xué)氧化態(tài)的產(chǎn)物分子的氧化還原酶及其相應(yīng)的輔因子的組合被稱為“氧化還原酶系統(tǒng)”。

任何合適的氧化還原酶可用于本發(fā)明的基質(zhì)中，包括氧化還原酶的混合物。氧化還原酶可從商業(yè)來源獲得，或通過可以大量生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的基因工程制備。

在底物分子上操作以得到還原產(chǎn)物的氧化還原酶系統(tǒng)的一個例子是通過稱為“醇脫氫酶”(例如，酶類別ec1.1.5尤其是ec1.1.5.2，或ec1.1.1尤其是ec1.1.1.1或ec1.1.1.2)或“酮還原酶”的酶將酮催化還原為仲醇；一些實施方式中的術(shù)語被同義使用。該類酶能夠作用于>ch—oh基團(tuán)以將其氧化為>c＝o基團(tuán)(或逆反應(yīng))。通過使用氧化還原酶來催化該反應(yīng)，仲醇產(chǎn)物可以所需立體化學(xué)或手性特點被制造。這為制備藥學(xué)上有用的分子提供了相當(dāng)大的價值，例如其中手性通常是必要性質(zhì)的情況。

在一個實施方式中，醇脫氫酶(adh)可獲自或獲自活體。合適的adh來源于細(xì)菌或真菌。優(yōu)選細(xì)菌來源的adh酶，尤其是葡萄糖假葡萄糖桿菌(pseudogluconobactersaccharoketogenes)adh、高加索酸奶乳桿菌(lactobacilluskefir)adh、布氏熱厭氧菌(thermoanaerobiumbrockii)adh和大腸桿菌(escherichiacoli)adh，或與其中任一種具有至少70％、例如至少75％、如至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、進(jìn)一步優(yōu)選至少95％、更進(jìn)一步優(yōu)選至少96％，如至少97％、還更優(yōu)選至少98％、最優(yōu)選至少99％序列相同性的醇脫氫酶。特別優(yōu)選葡萄糖假葡萄糖桿菌(pseudogluconobactersaccharoketogenes)adh或與其具有至少70％、例如至少75％、如至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、進(jìn)一步優(yōu)選至少95％、更進(jìn)一步優(yōu)選至少96％，如至少97％、還更優(yōu)選至少98％、最優(yōu)選至少99％序列相同性的醇脫氫酶。在真菌來源的adh酶中，優(yōu)選釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)adh或與其具有至少70％、例如至少75％、如至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、進(jìn)一步優(yōu)選至少95％、更進(jìn)一步優(yōu)選至少96％，如至少97％、還更優(yōu)選至少98％、最優(yōu)選至少99％序列相同性的醇脫氫酶。

氧化還原酶的另一個例子是p450單加氧酶或p450酶，一類催化多種有用的化學(xué)轉(zhuǎn)化的酶。p450酶需要還原當(dāng)量，盡管它們催化的反應(yīng)的結(jié)果實際上是一種氧化，其中產(chǎn)物的化學(xué)氧化程度高于起始底物。為了實現(xiàn)這個目的，p450氧化還原酶使用氧分子o2，并將其分解為兩個組分氧原子。一個氧原子通過p450由其輔因子提供的還原當(dāng)量被還原為水h2o，該輔因子最通常是“p450還原酶”并在一些情況下為鐵氧還蛋白分子。另一個氧原子形式上插入在其它情況下未活化的碳-氫或碳-碳鍵，產(chǎn)生氧化的產(chǎn)物分子。這種類型的反應(yīng)，未活化的碳的氧化在不使用p450酶的情況下是非常困難的，因此是非常有價值的。一個具體的例子是生產(chǎn)皮質(zhì)類固醇必需的羥基化反應(yīng)。因此，可認(rèn)為提供可以向p450酶提供還原當(dāng)量的系統(tǒng)有相當(dāng)大的實用價值。盡管所需的產(chǎn)物分子的氧化程度高于底物分子，在本發(fā)明的內(nèi)容中其仍被認(rèn)為是“產(chǎn)物”，并將存在于工藝料流中。

可以使用任何細(xì)胞色素p450酶。因此，本發(fā)明所涵蓋的p450包括原核、真核、細(xì)菌和線粒體酶。細(xì)胞色素p450(通?？s寫為cyp、p450，和不經(jīng)?？s寫為cyp450)是血紅素蛋白的一個非常大且多樣化的超家族，其形成稱為含p450的系統(tǒng)的多組分電子傳遞鏈的一部分。已知適用于本發(fā)明的細(xì)胞色素p450包括cyp1家族(cyp1a1；cyp1a2；cyp1b1)、cyp2家族(cyp2a6；cyp2a7、cyp2b6、cyp2a13；cyp2b6；cyp2c8；cyp2c9；cyp2c18、cyp2c19；cyp2d6；cyp2e1；cyp2f1；cyp2j2；cyp2r1；cyp2s1；cyp2u1、cyp2w1)、cyp3家族(cyp3a4；cyp3a5；cyp3a7；cyp3a43)、cyp4家族(cyp4a11；cyp4a22；cyp4b1；cyp4f2、cyp4f3、cyp4f8、cyp4f11、cyp4f12、cyp4v2、cyp4z1)、cyp5a1、cyp7a1、cyp7b1、cyp8a1、cyp8b1、cyp11a1、cyp11b1、cyp11b2、cyp17a1、cyp19a1、cyp20a1、cyp21a2、cyp24a1、cyp26a1、cyp26b1、cyp26c1、cyp27a1、cyp27b1、cyp27c1、cyp39a1、cyp46a1、和cyp51a1。其他p450由urlacher和girhard在《生物技術(shù)趨勢》(trendsinbiotechnology)，30(1)，2012，26–36頁中進(jìn)行綜述，其通過引用整體并入本文。

如本文所用，術(shù)語“電子傳遞介質(zhì)”或“etm”是指能夠自身接受一個或多個電子，然后將電子傳遞到另一分子的分子，包括將電子傳遞到酶分子。一個典型的周知的etm是中性紅，其也被用作ph指示劑?？捎米鱡tm的其他化合物包括亞甲基藍(lán)、甲基紫精和醌。最通常地，可以使用其還原電勢比nad+更低的化合物，并且其包括通常稱為氧化還原染料的各種化合物。例如，在先前描述的情形下，中性紅通過促進(jìn)電子從陰極到nad+輔因子的運動而充當(dāng)電子傳遞介質(zhì)，從而有助于還原nad+以產(chǎn)生nadh。

術(shù)語“電子傳遞介質(zhì)”或“etm”可包括促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移到酶分子的分子，因此在廣義上，輔因子(例如nadh、fmn、fad，鐵氧還蛋白等)也可以被認(rèn)為是電子傳遞介質(zhì)。然而，在一些例子中，術(shù)語“電子傳遞介質(zhì)”或etm僅意在描述促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，但在其它情況下通常不被認(rèn)為是氧化還原酶系統(tǒng)的天然存在的輔因子的那些分子，例如，nadh、fmn、fad、鐵氧還蛋白等。

在本公開的內(nèi)容中，etm通常被認(rèn)為是促進(jìn)電子從實際陰極表面轉(zhuǎn)移到氧化還原酶系統(tǒng)的輔因子所需要的。然而，氧化還原酶系統(tǒng)的輔因子自身能直接從陰極表面吸收電子而不需要etm分子的介導(dǎo)。從而，在通常情況下，etm的使用是任選的，盡管在本發(fā)明的一些實施方式中是優(yōu)選的。

除了提供還原當(dāng)量之外，本發(fā)明允許通過使用合適的膜將酶、nad(p)輔因子和任選的etm包含在陰極附近。這種布置防止酶、nad(p)輔因子和任選的etm進(jìn)入包含底物和產(chǎn)物的大得多的本體反應(yīng)相中的損失，從而減少這些試劑所需的量并因此降低成本。此外，對酶、輔因子和任選的etm的這種包含使得它們不會污染本體有機反應(yīng)相中的產(chǎn)物，從而顯著簡化還原產(chǎn)物的回收和純化。這在etm是氧化還原染料分子時特別有用。

在一個方面，提供一種用于通過需要還原當(dāng)量的反應(yīng)產(chǎn)生所需產(chǎn)物的裝置。該裝置包括：

(a)包含在陽極室中的陽極和包含在陰極室中的陰極；

(b)陽極室中的去離子水，其與陽極接觸；

(c)分隔陽極室和陰極室的質(zhì)子滲透膜；

(d)陰極室中的液相，其與陰極連續(xù)接觸，所述液相任選地包含能夠?qū)⑦€原當(dāng)量傳遞到氧化還原酶系統(tǒng)的電子傳遞介質(zhì)(etm)，所述氧化還原酶系統(tǒng)包含氧化還原酶和輔因子；

(e)含有待被氧化還原酶系統(tǒng)催化為所需產(chǎn)物的底物的工藝料流；

(f)位于陰極和工藝料流之間的膜，所述膜能防止任選的etm和氧化還原酶系統(tǒng)大幅進(jìn)入工藝料流；以及

(g)在陽極和陰極之間提供電壓的外部電源。

在本發(fā)明中，陽極可以是允許有用的電流密度的任何簡便的設(shè)計。最典型地，陽極可以是涂覆有鉑的鈦基底。這樣的陽極設(shè)計現(xiàn)在商業(yè)可得且被用于電解槽。

陽極室可以任何方便的設(shè)計，其允許去離子水的輸入、再循環(huán)和溫度控制，同時允許在陽極表面處產(chǎn)生的氣體(即氧氣)的輸出和任選的收集。

在一個實施方式或使用方法中，陽極室被去離子水填充，并且施加足夠的電壓以引起水的電解裂解。這導(dǎo)致了氧氣在陽極室中形成，其可以釋放到大氣中或被捕獲用于其他用途。附帶產(chǎn)生的水合氫離子(h3o⁺)沿著電梯度遷移并穿過隔離陽極室和陰極室的膜。

陰極可以是任何方便的設(shè)計，其允許良好的電流密度和電子傳遞到etm。優(yōu)選地，陰極被設(shè)計成使表面積、陰極室中的液相與陰極的接觸、以及陰極的整體電子傳遞特性均最大化。

在一個實施方式中，陰極室包括主要由碳構(gòu)成的陰極。其可以是已經(jīng)加工成具有增加表面積和etm和陰極之間的接觸時間的流動通道或其它物理形狀的固體碳塊。

在另一個實施方式中，陰極室包括碳、碳?xì)只蚨嗫滋嫉谋∑问降奶茧姌O。這是商業(yè)上稱為“碳紙”，可以以以下品牌名稱購得：toraycarbonpapertgp-h-060、carbonpaperavcarb。其他類似的產(chǎn)品也是可得的且被本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。電連通的多張?zhí)技埧捎米麝帢O，從而提供增加的表面積。

在某些實施方式中，陰極室被構(gòu)造成允許在頂部空間或其他合適的區(qū)域中收集氫氣，該頂部空間或其它合適的區(qū)域被設(shè)計成允許在ebm的正常操作期間從液相中分離不定地在陰極上形成的氫氣小氣泡，并且允許從ebm裝置除去氫氣。該氫氣可以回收并作為其他化學(xué)過程的試劑流，或用作燃料。

在各種實施方式中，本發(fā)明的裝置包括分隔陽極室和陰極室的質(zhì)子滲透膜。在一個實施方式中，質(zhì)子滲透膜可以是改良的膜，其允許質(zhì)子(如水合氫離子，h3o⁺)穿過它。質(zhì)子滲透膜可以在陽極側(cè)支撐或容納催化劑，以產(chǎn)生氧氣。

在本發(fā)明的一些實施方式中，陰極室包括陰極，和一個或多個位于陰極和本體反應(yīng)相之間并將它們分隔開的膜。該分隔通過聚合物膜的存在而實現(xiàn)，最典型的是親水性膜，例如，聚丙烯腈，其用作保持任選的etm、輔因子和氧化還原酶的物理屏障，并防止這些物質(zhì)分散或進(jìn)入在陰極室內(nèi)循環(huán)的本體反應(yīng)相。

膜可以具有穿過其中延伸的一個或多個孔?？卓捎糜谌α粞趸€原酶和/或輔因子。該膜可以是“不對稱”的，由于孔在膜的一側(cè)(例如，面向本體反應(yīng)相的一側(cè))的開口尺寸可以比另一側(cè)大(例如，面向陰極的一側(cè))。

孔的大小可以表示為分子量截止值。例如，膜可以被稱為10kda膜，這意味著孔尺寸較小的膜的側(cè)面的孔尺寸具有使分子量大于10kda(千道爾頓)的分子不以任何實質(zhì)的程度通過該膜的尺寸。在一些實施方式中，孔可以在膜的面向陰極的第一表面上具有第一開口，其中第一開口足夠小以防止分子量大于100kda(例如，大于100kda、大于80kda、大于60kda、大于50kda、大于40kda、大于30kda、大于20kda、大于20kda、大于10kda、大于5kda或大于1kda)的分子大幅通過?？卓梢栽诿嫦蚬に嚵狭鞯哪さ牡诙砻嫔线M(jìn)一步具有第二開口，其中第二開口足夠大以允許包含在孔內(nèi)的氧化還原酶的至少一部分接觸工藝料流中的底物。第二開口可在尺寸上大于第一開口。

可以根據(jù)需要提供墊圈，以在所述一個或多個膜之間形成填隙空間。本體反應(yīng)相本質(zhì)上可以是有機的，并且合理地不與水混溶。陰極室可以裝配有端口，以允許包含在任何任選的填隙空間或隔室中的流體被獨立地移除、替換或再循環(huán)。不對稱膜支持工藝料流和含有氧化還原酶的水相之間的界面接觸以及直接與陰極接觸的流體的界面接觸。優(yōu)選選擇使不對稱膜的孔徑盡可能地大，但仍應(yīng)防止氧化還原酶、輔因子和/或etm通過膜和/或以顯著程度進(jìn)入工藝料流中。在一些實施方式中，超過99％、超過98％、超過95％、超過90％、超過80％、超過70％、超過60％、超過50％的氧化還原酶、輔因子和/或etm被膜所保留。在特定的實施方式中，工藝料流中基本上沒有氧化還原酶、輔因子和/或etm，例如，包含少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％、少于2％或少于1％的氧化還原酶、輔因子和/或etm。

一個示例性的親水性不對稱膜在美國專利第4,705,704號和第5,077,217號中被描述，兩者的全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。然而，應(yīng)該注意的是，美國專利號第4,705,704號和第5,077,217號中使用的膜用于分離含有底物的反應(yīng)物相和含有所得產(chǎn)物的產(chǎn)物相。也就是說，底物和產(chǎn)物在膜的不同側(cè)，從而不處于同一個工藝料流中。另外，美國專利第4,705,704號和第5,077,217號中的膜必須同時影響跨過膜的酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物的遷移。而且，其中使用的酶不需要還原當(dāng)量，且其中沒有公開與任何電化學(xué)工藝相關(guān)的任何膜的使用，或者用于防止etm或輔因子與工藝流體混合的目的。

本文所用術(shù)語“本體反應(yīng)相”、或“本體有機反應(yīng)相”是其中溶解有底物和/或產(chǎn)物的液體或氣體或流體相。在標(biāo)準(zhǔn)用法中，這種液體或氣體或流體也稱為“工藝料流”，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易理解這些術(shù)語。

在本發(fā)明的一個實施方式中，例如，陰極與本體有機反應(yīng)相由本文公開的膜隔離，所述本體有機反應(yīng)性中存在待還原的化學(xué)物質(zhì)(即，底物)且將包含所述反應(yīng)的還原產(chǎn)物。本體有機反應(yīng)相可以含有待用氧化還原酶系統(tǒng)還原的化學(xué)物質(zhì)的工藝流料形式連續(xù)循環(huán)。在反應(yīng)過程中，反應(yīng)相的組成隨著底物的量或濃度減少，同時產(chǎn)物的量或濃度增加而持續(xù)變化。在反應(yīng)結(jié)束時，本體有機工藝料流主要含有得到的產(chǎn)物的化學(xué)物質(zhì)。作為本體有機相的實例，可以使用溶劑如庚烷、叔丁基甲基醚、甲苯或與水不混溶的其它有機溶劑來提供底物和還原產(chǎn)物所需的溶解。本領(lǐng)域技術(shù)人員能直接理解，本體有機反應(yīng)相還必須與不對稱膜的材料相容，以免損害或溶解膜。

在本發(fā)明的一個實施方式中，任選的電子傳遞介質(zhì)可被用于將電子從陰極傳遞到輔因子。etm是任選的，因為輔因子可直接將電子從陰極傳遞到氧化還原酶，而不需要etm。在一些實施方式中，希望采用etm。

如果etm存在于陰極液相中，則可以由不對稱膜保留，因此不會大幅或顯著進(jìn)入反應(yīng)相。這可以通過在水性陰極液相的情況下?lián)碛凶銐蚋叩姆肿恿?例如通過etm的化學(xué)修飾)來實現(xiàn)。在非水性或部分水性陰極液相(例如，有機的)的情況下，可以選擇etm以在其中具有合適的溶解度，或者可以選擇溶劑以適當(dāng)?shù)厝芙鈋tm。

在特定的實施方式中，etm和/或輔因子可通過接枝到可溶性聚合物上的方法來被化學(xué)修飾，使得它們不能通過與陰極室連通的膜的孔。在該方式中，etm被保留在陰極室內(nèi)，且輔因子被保留在膜的多孔基質(zhì)中，甚至在陰極室中的水相和保持在膜中的水相彼此連續(xù)時也是如此，從而允許etm將電子轉(zhuǎn)移到輔因子，進(jìn)而允許氧化還原酶。例如，etm和/或輔因子可以被共價連接至水溶性聚合物，所述水溶性聚合物具有足夠的分子量，從而其物理上無法穿過孔較小的非對稱膜。作為具體的例子，中性紅具有可以與聚合物如聚丙烯酸上的活化的羧酸基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的游離的伯氨基。共價鍵可以通過在中性紅上的伯氨基和聚丙烯酸酯上的可接近的羧酸基之間形成酰胺鍵來實現(xiàn)。可以使用通常用于在水性環(huán)境中形成酰胺鍵的試劑，例如在寡肽合成期間遇到的條件，水溶性碳二亞胺是這些試劑的常見和公知的實例。

在一個實施方式中，圖2所示，陰極室包含液體(水性或有機)相，其包含任選的etm。電子從陰極傳遞到etm。氧化還原酶或酶的系統(tǒng)，任選地與其所需的一個輔因子或多個輔因子一起被包含在合適的水相中，該水相通過合適的膜、最典型是親水膜保持在適當(dāng)?shù)奈恢蒙稀Ｔ谝粋€實施方式中，設(shè)置親水不對稱膜以在膜的多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)的水性環(huán)境中含有氧化還原酶或輔因子/氧化還原酶系統(tǒng)。輔因子從etm接受存在于陰極液相的電子，并將電子傳遞到被保持在膜中的水性環(huán)境中的氧化還原酶。含有氧化還原酶的水性環(huán)境接觸本體有機反應(yīng)相，允許催化氧化還原反應(yīng)。底物和氧化還原反應(yīng)的還原產(chǎn)物都包含在本體有機反應(yīng)相中。

參考圖2，膜上的水相或環(huán)境與液相直接接觸，其可以是水性或有機的且位于陰極室中并保持etm。含有氧化還原酶的膜中的水相也與本體有機反應(yīng)相接觸并將本體有機反應(yīng)相與陰極分離。在該實施方式中，當(dāng)陰極室包含有機相時，etm通過有機相的不混溶性而被保持在陰極室中，且水相中的etm被膜保持，并從而防止分散到膜的另一側(cè)的本體反應(yīng)相中。被膜所保持的、存在于水性相中的輔因子和酶同樣由于其在有機相中的溶解度不足而被防止分散到陰極室或本體有機反應(yīng)相中。

仍然參考圖2，左邊的質(zhì)子滲透膜將陽極室與陰極室分隔。不定產(chǎn)生于陰極的氫氣可被捕獲離開陰極室。

在另一個實施方式中，如圖3所示，陰極室含有水相，并且防止氧化還原酶通過與陰極室中的水相連通的膜中的孔的尺寸而分散到陰極室中。酶系統(tǒng)處于與陰極室中的主體水相連續(xù)的水性環(huán)境中。etm可以被適當(dāng)?shù)鼗瘜W(xué)修飾以具有足夠高的分子量，以被不對稱膜保留在陰極室中。具有氧化還原酶的不對稱膜中的nad(p)輔因子可任選地被修飾以具有顯著高的分子量，以防止其離開膜的孔并進(jìn)入陰極室。輔因子/氧化還原酶系統(tǒng)催化氧化還原反應(yīng)，底物及其產(chǎn)物保留在本體有機反應(yīng)相中。

在另一個實施方式中，輔因子可以是未經(jīng)修飾的并存在于陰極室中的水性相中，同時氧化還原酶被保留在膜的多孔結(jié)構(gòu)中。輔因子自由地與陰極直接接觸，被還原，然后通過膜中的孔擴(kuò)散到達(dá)氧化還原酶并向用于催化包含在本體有機反應(yīng)相中的底物的還原的酶提供電子。在該實施方式中，不存在etm，且酶和輔因子均由于其溶解度不足而被防止進(jìn)入本體有機相。

在密切相關(guān)的實施方案中，氧化還原酶所需的輔因子被化學(xué)修飾以防止其通過親水不對稱膜，例如nad化學(xué)接枝到20kda的peg寡聚體。這使得在溶劑中使用大量有機反應(yīng)相能夠溶解未修飾的輔因子，盡管溶劑的有機性質(zhì)。

在另一個實施方式中，如圖4所示，etm為小分子如甲酸鹽，其能夠向氧化還原酶系統(tǒng)遞送還原當(dāng)量，該氧化還原酶系統(tǒng)包括甲酸脫氫酶(fdh)本身連接到進(jìn)行連續(xù)工藝料流在所提供的底物的所需的還原的氧化還原酶。在該操作的實施方式中，甲酸鹽被fdh氧化以從nad+加上碳酸氫鹽和/或二氧化碳生成nadh，其可以任選使用碳酸酐酶重新捕獲為碳酸氫鹽。nadh被還原底物的氧化還原酶所用，再生為nad+。在陰極處，碳酸氫鹽還原形成甲酸鹽，并完成循環(huán)。該系統(tǒng)繼而催化本體有機反應(yīng)相中的氧化還原反應(yīng)。

本發(fā)明的裝置可進(jìn)一步包括具有集成儀器的電化學(xué)電池，該儀器包括陽極側(cè)氧收集系統(tǒng)、陰極側(cè)氣體收集系統(tǒng)、流動速率控制系統(tǒng)、溫度測定和控制系統(tǒng)、電壓和電流測定和調(diào)節(jié)系統(tǒng)、ph測定系統(tǒng)、溶解氧(do)測定系統(tǒng)、電導(dǎo)率測定系統(tǒng)、代謝能力(熒光)測定系統(tǒng)。這樣的集成系統(tǒng)允許以下具有很大效用的動作：電子和質(zhì)子轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)和優(yōu)化、微生物副產(chǎn)物最小化、h2氣體消除或最小化、所需產(chǎn)品優(yōu)化、蒸餾水(di)水純度分析、完全質(zhì)量平衡分析、流速控制、溫度控制。

在各種實施方式中，通過ebm將還原當(dāng)量引入生物系統(tǒng)可以包括以下一個或多個動作：

a)陽極室填充有去離子水，并且陰極室填充有待轉(zhuǎn)移電子的氧化還原酶系統(tǒng)的所需組分；

b)在陽極和陰極之間施加足夠電壓(電勢)的外部電流，使得水在陽極被電解裂解，導(dǎo)致電子流入陽極，以及陽極室中的帶正電荷的水合氫離子(h3o⁺)和中性氧(o2)的形成；

c)帶正電荷的水合氫離子通過質(zhì)子滲透膜從陽極室遷移到陰極室，從而在陰極室中提供質(zhì)子源；

d)來自陽極的電子由外部電源通過外部電路驅(qū)動到陰極；

e)電子從陰極轉(zhuǎn)移到陰極室中的氧化還原酶輔因子或所需的etm；

f)氧化還原酶系統(tǒng)使用從陰極提供的電子，通過電子從陰極的直接轉(zhuǎn)移，或直接轉(zhuǎn)移到輔因子如nad+，或者通過電子從陰極轉(zhuǎn)移到etm、然后轉(zhuǎn)移到輔因子如nad+、然后到氧化還原酶，以此在工藝料流中的底物上進(jìn)行所需的化學(xué)還原；和/或

g)從陽極室遷移的水合氫離子的質(zhì)子被置于本體生物系統(tǒng)中以平衡已從陰極轉(zhuǎn)移的電子。

應(yīng)該注意的是，這種ebm系統(tǒng)的電力輸入可來自可再生資源(風(fēng)能、太陽能、水力發(fā)電等)。

此處還提供一種從底物生產(chǎn)所需產(chǎn)物的方法，其包括；

a)提供具有包括底物的工藝料流的本發(fā)明公開的任何裝置；

b)在陽極和陰極之間施加來自外部電源的合適電壓；

c)在工藝料流中累積所需的產(chǎn)物；以及

d)任選地，收集不定產(chǎn)生的氫氣。

本發(fā)明的各方面可以單獨使用、聯(lián)用或以前述實施方式未具體討論的各種排列來使用，并且因此其應(yīng)用并不限制于前面描述或附圖說明所示組件的細(xì)節(jié)和排列。例如，一個實施方式的所述方面可與其它實施方式所述方面以任何方式組合。

權(quán)利要求中修飾所提要素使用的順序術(shù)語“第一”、“第二”、“第三”等本身并不暗指所提要素其一相對另一個的任何優(yōu)先、居先或級別高低，或?qū)嵭蟹椒ǘ鄠€行動的時間順序，而是僅僅用作標(biāo)記把有某一名稱的所提要素與有相同名稱的另一要素(但是就順序術(shù)語使用而言)區(qū)分開以區(qū)別所提的多個要素。

而且，本文所用的詞語和術(shù)語是為了描述目的，而不是限制性的。本文使用“包含”、“包括”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其變化意味著涵蓋其后列出的項目及其等價物，以及額外的項目。

實施例

在一個例子中，顯示ebm系統(tǒng)用于向由單一、分離的氧化還原酶催化的氧化還原反應(yīng)提供還原當(dāng)量的應(yīng)用，通過醇脫氫酶(ec1.1.1.1)在nad+輔因子的存在下將苯乙酮還原成苯乙醇。將通過共價連接到20kda的水溶性聚乙二醇(peg)低聚物來進(jìn)行化學(xué)修飾的醇脫氫酶和nad+按照美國專利第4,705,704號和第5,077,217號中描述的方式裝入親水性不對稱膜。將其自身被共價連接到聚丙烯酸酯的水溶性低聚物所修飾的中性紅的水性溶液加入到陰極和親水不對稱膜之間形成的隔室中。含有修飾的nad+(例如nad-peg)和醇脫氫酶的水性相與接觸陰極的修飾的中性紅水相連續(xù)，同時在親水性不對稱膜的另一側(cè)提供含有苯乙酮的有機相。施加足夠的電壓以引起陰極處的中性紅的還原，其隨后將nad+還原成nadh。nadh與醇脫氫酶結(jié)合，并將苯乙酮還原成苯乙醇，nadh被連帶氧化回到nad+。親水性不對稱膜非常薄(例如，100微米)，氧化的nad+簡單地通過擴(kuò)散重新接觸還原的中性紅，并再次還原成nadh。中性紅的溶液可以通過在形成于陰極和親水不對稱膜之間的隔室獨立地再循環(huán)，允許ph的控制、更多的中性紅的引入、或通過流通的分析室以跟蹤中性紅的總體氧化還原狀態(tài)。

等同形式

本發(fā)明提供了用于向生物系統(tǒng)提供還原當(dāng)量的新方法和裝置。盡管討論了本發(fā)明的具體實施方式，但以上說明書僅為說明性而非限制性的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀本說明書后將清楚了解本發(fā)明的許多變化。本發(fā)明的全部范圍應(yīng)該通過參考所附權(quán)利要求書連同其等同物的全部范圍，以及說明書連同此類變化來確定。

通過引用納入

本文中應(yīng)用的所有公開、專利和專利申請通過引用全文納入本文用于所有目的，就如同各公開、專利被具體地說明通過引用納入本文一樣。