專(zhuān)利名稱(chēng):高原病高危人群的基因篩查方法及其相關(guān)基因診斷產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因篩查及基因診斷領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及高原肺水腫高危人群的基因篩查方法及其相關(guān)基因診斷產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
1、歷史背景
2001年7月-2005年12月，我國(guó)修建世界上海拔最高的青藏鐵路格拉段，北起青海省格爾木(觀60米)至西藏自治區(qū)首府——拉薩市(3680米)。全長(zhǎng)1142公里，其中960 公里地處海拔4000多米的青藏高原，還要通過(guò)海拔5000多米的唐古拉山。5年間，13-14 萬(wàn)名鐵路建設(shè)工人在高原低氧、寒冷和氣候多變的惡劣環(huán)境下筑路。因此，保證工人身體健康和勞動(dòng)能力，減少急、慢性高原病發(fā)生，是青藏鐵路建設(shè)中亟待解決三大難題中的首要問(wèn)題。發(fā)明人作為經(jīng)衛(wèi)生部和鐵道部批準(zhǔn)的唯一科研單位與中鐵建筑總公司合作參加了青藏鐵路建設(shè)中衛(wèi)生保障工作，并開(kāi)展了一系列醫(yī)學(xué)研究，完成了現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查，收集大量有用數(shù)據(jù)和各種急、慢性高原病(肺、腦水腫)及正常對(duì)照樣本，為研究個(gè)體對(duì)急性高原病易感差異性的相關(guān)基因奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
2、急性高原肺水腫概述
2. 1急性高原肺水腫定義
急性高原肺水腫(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“高原肺水腫”)是常見(jiàn)的急性高原病之一，指健康人進(jìn)入海拔2，500-3, 000以上米高原后，因高原低氧導(dǎo)致得以肺動(dòng)脈壓升高并伴有肺泡和肺間質(zhì)水腫為臨床特征的急性呼吸系統(tǒng)疾病，具有發(fā)病急、進(jìn)展快，救治不及時(shí)，死亡率高等特點(diǎn)。
2. 2診斷標(biāo)準(zhǔn)
高原肺水腫(HAPE)患者的顯著臨床特征為血氧飽和度降低。
2. 2. 1發(fā)病時(shí)間進(jìn)入2，500-3，000米以上高原1-6天內(nèi)發(fā)病。
2. 2. 2典型癥狀靜止時(shí)呼吸困難、咳，肺部有水泡樣啰音；X-胸片顯示明顯陰影， 部分發(fā)生紫紺；非感染所致。
2. 2. 3治療方法供氧，臥床休息或移送到海拔2000米以下地區(qū)，2-3天內(nèi)臨床癥狀基本消失。
2. 3青藏鐵路建設(shè)中的高原肺水腫發(fā)生率
2001年7月-2005年12月，在13萬(wàn)多建筑工人中發(fā)現(xiàn)有明顯癥狀在工地醫(yī)院就診患者841人，其平均發(fā)病率為841/13,000 = 0. 65%，發(fā)病率隨海拔高度增高而增加。
3、高原肺水腫的研究
高原肺水腫易感個(gè)體差異性與基因多態(tài)性相關(guān)聯(lián)
現(xiàn)代研究已證明，不同種族、民族(如藏族與漢族)人群基因多態(tài)性，不僅具有進(jìn)化和地域特點(diǎn)，而且與生物功能和公共衛(wèi)生相關(guān)，如對(duì)疾病易感性、抗性、衰老、長(zhǎng)壽及對(duì)特殊環(huán)境的應(yīng)激能力等密切相關(guān)。高原肺水腫易感個(gè)體差異性可謂是基因多態(tài)性的表型體現(xiàn)。因此，基因多態(tài)型及多基因相互作用的檢測(cè)是篩查HAPE易感個(gè)體的科學(xué)而有效的技術(shù)方法。高原肺水腫發(fā)生是遺傳與環(huán)境因素相互作用引發(fā)疾病的典型范例。雖然，低氧是 HAPE發(fā)生的重要引發(fā)因素，但是，在同樣高原低氧環(huán)境下，一些人易患HAPE，而另些人則無(wú)明顯不適反應(yīng)，說(shuō)明HAPE發(fā)生與個(gè)人的遺傳背景相關(guān)。
4、建立高原肺水腫高危人群基因篩查技術(shù)的必要性
西部大開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略實(shí)施的重大需求我國(guó)是一個(gè)多山的高原國(guó)家，3000米以上高原占我國(guó)陸地面積1/4，也是西部大開(kāi)發(fā)的主戰(zhàn)場(chǎng)。西部大開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略實(shí)施是加速我國(guó)社會(huì)主義經(jīng)濟(jì)建設(shè)，維護(hù)社會(huì)安定、民族團(tuán)結(jié)和鞏固國(guó)防的迫切要求，也是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化建設(shè)第三步戰(zhàn)略目標(biāo)的需要。青藏高原有豐富的資源(礦藏、水利、石油等)，亟待開(kāi)發(fā)利用。然而，高原低氧引發(fā)的急性高原病，特別是急性高原肺水腫和腦水腫，是人類(lèi)在高原上的主要疾病和死亡原因之一，這些疾病令人聞而生危。無(wú)疑高原低氧對(duì)人體損傷將大大影響高原建設(shè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，因此預(yù)防、減少急性高原病的發(fā)生顯得尤為重要。而通過(guò)基因檢測(cè)，篩除高原肺水腫等急性高原病高危人群，可減少高原病發(fā)生率，保持人體健康和勞動(dòng)能力成為青藏高原建設(shè)中亟待解決，及貫徹“以人為本”的首要問(wèn)題。
5、應(yīng)用前景
隨著世界人口的劇增，人類(lèi)生存空間將不斷向高山、海洋、太空擴(kuò)展，首先遇到的問(wèn)題便是低氧、低氧分壓對(duì)人類(lèi)生命的威脅。高原缺氧的自然環(huán)境與其他特種環(huán)境(如航天航空、潛水、極地等)相似，均存在諸多應(yīng)激源，人體對(duì)這些應(yīng)激源必定產(chǎn)生不同應(yīng)激反應(yīng)，其反應(yīng)可以表現(xiàn)在呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及血液等系統(tǒng)。高原肺水腫是人體對(duì)高原缺氧的應(yīng)激反應(yīng)在呼吸系統(tǒng)的表現(xiàn)，也是環(huán)境和遺傳因素相互作用引發(fā)的疾病的典型范例。腦水腫是人體對(duì)高原缺氧反應(yīng)產(chǎn)生的神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)，臨床癥狀與飛行員“暈動(dòng)病”等一系列特殊疾病相似。因此，高原肺水腫易感性的基因檢測(cè)技術(shù)有廣泛的應(yīng)用范圍及其他體檢技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)
5. 1高原駐軍和作戰(zhàn)部隊(duì)的選擇我國(guó)有很長(zhǎng)的國(guó)防線在海拔3000米以上的高原。駐守在那里的官兵，作戰(zhàn)部隊(duì)，特種快速反應(yīng)部隊(duì)(如玉樹(shù)地震救援部隊(duì))和到高原換防部隊(duì)，往往因初到低氧環(huán)境而引發(fā)不同程度，不同種類(lèi)急性高原病，使整個(gè)部隊(duì)?wèi)?zhàn)斗力下降。如果通過(guò)基因檢測(cè)，篩出高危個(gè)體，就可減少疾病發(fā)生，保證赴藏人員的體力、勞動(dòng)力和戰(zhàn)斗力。
5. 2可作為赴高原參加建設(shè)工作人員的一項(xiàng)體檢指標(biāo)。
5. 3作為飛行員、航天員、潛水員和地質(zhì)采礦等特殊工種人才選擇的有用指標(biāo)。
5. 4作長(zhǎng)跑、登山等運(yùn)動(dòng)員等體育人才的選擇。
5. 5作為赴高原旅游人員的安全檢查。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白和解偶聯(lián)蛋白2的4種組合基因型(以S表示Sl DD-GG-AA-AA-GG，S2 =DD-AG-AG-AG-GT, S3 =DD-AG-AA-AA-GG, S4 =DD-GG-AA-AG-GG)和高原肺水腫易感強(qiáng)正相關(guān)；而5種組合基因型(P5 =DI-AG-AG-AG-GG, P6 DD-AG-AA-AG-GT，P7 DD-AG-AG-GG-GG，P8 =DD-AA-AA-AG-GT, P9 =DD-GG-GG-GG-GG)與高原肺水腫抗性相關(guān)，即為保護(hù)性基因型。檢測(cè)組合基因型S1-S4，可篩除35%的肺水腫易感者；而檢測(cè)組合基因型P5-P9，可選擇出98%的不易患高原肺水腫的健康人群(見(jiàn)表4)。
因此，本發(fā)明一方面涉及檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的方法，該方法包括從待測(cè)個(gè)體中采集樣品如血樣，檢測(cè)樣品中解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G的核苷酸類(lèi)型，將檢測(cè)到的模式與S1-S4、P5-P9進(jìn)行比較， 從而確定該個(gè)體發(fā)生高原肺水腫的危險(xiǎn)性。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性個(gè)體的解偶聯(lián)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的組合基因型，其中所述組合基因型包含用于檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G。所述組合基因型可通過(guò)質(zhì)譜分析法、AFLP, RFLP, RAPD、實(shí)時(shí)熒光PCR分析法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法、異源雙鏈分析法、順序特異寡核苷酸法、序列特異性引物分析法、變性梯度凝膠電泳法、等位基因特異性寡核苷酸探針?lè)ā?PCR指紋圖法、基因芯片法或測(cè)序法檢測(cè)。
本發(fā)明另一方面涉及檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的組合物，其中所述組合物包含用于檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A 和-35T/G的試劑。應(yīng)當(dāng)理解，一旦確定了需要檢測(cè)的位點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知多種方法確定相關(guān)位點(diǎn)的核苷酸類(lèi)型，從而制備用于檢測(cè)該位點(diǎn)核苷酸類(lèi)型的組合物。所制備的組合物中包含檢測(cè)上述位點(diǎn)核苷酸類(lèi)型所必需的試劑。例如，所述的試劑可包括寡核苷酸 (例如SEQ ID No 1-5的寡核苷酸)、酶如限制性酶(例如下表5中所列舉的限制性酶)、 緩沖液、PCR引物(例如SEQ IDNo :6_15的引物)等。制備檢測(cè)已知位點(diǎn)核苷酸類(lèi)型的組合物的方法是本領(lǐng)域已知的。
對(duì)于多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，可使用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行。例如可通過(guò)質(zhì)譜分析法、AFLP、RFLP、RAPD、實(shí)時(shí)熒光PCR分析法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法、異源雙鏈分析法、順序特異寡核苷酸法、序列特異性引物分析法、變性梯度凝膠電泳法、等位基因特異性寡核苷酸探針?lè)āCR指紋圖法、基因芯片法或測(cè)序法檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的-866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G。相關(guān)方法的綜述可參考例如“單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)分析技術(shù)，高秀麗等，遺傳HEREDITAS (Beijing) 27 (1) =110-122, 2005”。因此，本發(fā)明的組合物中包含通過(guò)上述方法檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G所必需的試劑。例如，本發(fā)明的組合物包括解偶聯(lián)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白相應(yīng)多核苷酸序列測(cè)序所需的試劑，從而確定上述位點(diǎn)的核苷酸類(lèi)型。
本發(fā)明另一方面還涉及檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的基因芯片，其中所述基因芯片包含用于檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的_740G/A、_552G/A 和-35T/G的試劑。制備檢測(cè)已知位點(diǎn)核苷酸多態(tài)性芯片的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可參考申請(qǐng)日為2005年2月19日，公開(kāi)號(hào)為CN1771337A，發(fā)明名稱(chēng)為“包含單核苷酸多態(tài)性且與結(jié)腸癌有關(guān)的多核苷酸、包括該多核苷酸的微陣列和診斷試劑盒以及用該多核苷酸診斷結(jié)腸癌的方法”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的方法制備基因芯片。
本發(fā)明另一方面還涉及檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的_740G/A、_552G/A和-35T/ G的試劑。本發(fā)明的試劑盒可包含上述組合物或基因芯片，并可進(jìn)一步包含適合進(jìn)行自動(dòng)化分析的其他試劑。
本發(fā)明另一方面還涉及解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G在制備檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的用途。所述的產(chǎn)品可以是例如上述組合物、試劑盒、基因芯片。
根據(jù)發(fā)明人提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可對(duì)通過(guò)本發(fā)明的方法、組合物、試劑盒、基因芯片的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。如果檢測(cè)到的模式為下述模式S1-S4，則判斷受檢測(cè)個(gè)體發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性高，如果檢測(cè)到的模式為下述模式P5-P9，則判斷受檢測(cè)個(gè)體發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性低，其中按照組合45bp I/D/G-866A/A-740G/A-552G/G-35T的順序，模式S1-S4分別為 Sl DD-GG-AA-AA-GG，S2 =DD-AG-AG-AG-GT, S3 =DD-AG-AA-AA-GG, S4 =DD-GG-AA-AG-GG ； 模式 P5-P9 分別為 P5 =DI-AG-AG-AG-GG, P6 =DD-AG-AA-AG-GT, P7 =DD-AG-AG-GG-GG, P8 DD-AA-AA-AG-GT，P9 =DD-GG-GG-GG-GG
本發(fā)明另一方面還涉及多核苷酸組合物，其中所述多核苷酸組合物中多核苷酸包含偶聯(lián)蛋白的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、_552G/A和-35T/G。例如，所述多核苷酸序列可以為SEQ IDNo 1-5所示的序列或其互補(bǔ)序列的一部分或全部，或包含 SEQ IDNo :1-5所示的序列的一段更長(zhǎng)序列。更長(zhǎng)序列可從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。
本發(fā)明另一方面還涉及上述多核苷酸組合物在制備檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的用途。本發(fā)明的組合物、試劑盒、基因芯片中可包含上述多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)的序列制備(如人工合成)上述多核苷酸。
本發(fā)明另一方面還涉及SEQ ID No :6_10所示序列的引物以及該引物在制備檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的用途。


圖1 人體內(nèi)活性氧生成途徑及其相關(guān)成分?；疑蚶锏姆肿邮窃谘芗?xì)胞中的重要活性氧分子；白色框里是本發(fā)明中涉及的分子TF 轉(zhuǎn)鐵蛋白，SOD 過(guò)氧化物歧化酶， UCPs 解偶聯(lián)蛋白，eNOS 內(nèi)皮一氧化氮合成酶，GSH-Px 胱甘肽轉(zhuǎn)移酶1。
具體實(shí)施方式
高原肺水腫易感/抗性相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)過(guò)程
1.研究設(shè)計(jì)
采用前瞻性隊(duì)列研究。所有參加青藏鐵路建設(shè)人員均接受二次健康查體。第一次， 在各自低海拔地區(qū)，接受常規(guī)健康體檢，排除患有高血壓、糖尿病、肺心病、哮喘、感染性疾病、肝炎等慢性病個(gè)體。第二次，上述健康個(gè)體在海拔觀60米的格爾木，習(xí)服3-6天，排除在海拔觀60米有嚴(yán)重高原反應(yīng)個(gè)體，如血氧飽和度(SaO2)低于85%，心率> 100次/分，及輕度呼吸困難及高度失眠和感染性疾病的個(gè)體。此后，被選中的健康個(gè)體在進(jìn)入海拔4000 米以上的建筑工地工作。
2.樣本選擇
2. 1肺水腫患者選擇(見(jiàn)前述“肺水腫診斷標(biāo)準(zhǔn)”)
2. 2正常健康對(duì)照樣本的選擇標(biāo)準(zhǔn)
按年齡、性別、民族、工作類(lèi)型和生活環(huán)境(高度、溫度)條件相匹配原則，從其同事中選擇對(duì)照著，這些對(duì)照者至少在與患者相同的環(huán)境條件下工作三個(gè)月未患高原肺水腫和腦水腫。[0046]3.血樣本收集
在知情同意的原則下，采集外周血5ml，以2% EDTANa2抗凝。于4°C分離血漿和血球，血漿用以測(cè)定生化指標(biāo)，血細(xì)胞用來(lái)分離提取基因組DNA。
4.基因多態(tài)性分析
4. 1基因組DNA分離
應(yīng)用常規(guī)酚/氯仿方法，從白細(xì)胞中分離基因組DNA，其純度為A26Q/A28Q彡1.8。
4. 2候選基因選擇及多態(tài)性分析
4. 2. 1候選基因選擇
根據(jù)病例-對(duì)照組血漿生化指標(biāo)和血漿蛋白質(zhì)組學(xué)差異作為選擇候選基因的依據(jù)。結(jié)果表明肺水腫組血漿中轉(zhuǎn)鐵蛋白和活性氧(R0Q水平較對(duì)照組明顯升高(見(jiàn)表1)。 大量研究表明，活性氧生成均來(lái)自酶促或化學(xué)反應(yīng)(見(jiàn)圖1)。因此，將轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、內(nèi)皮一氧化氮合成酶(eNOQ，解偶聯(lián)蛋白2，3，Mn-過(guò)氧化物歧化酶，CuZn-過(guò)氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶作為候選基因。
表1高原肺水腫病例一對(duì)照組中血漿或紅細(xì)胞溶解液的某些活性氧水平比較
Of-士 S)
參數(shù)HAPE患者對(duì)照者P
MDA (μηιοΙ/L)*7.11 士0.455.12±0.56<0.001
GSH(pmol/L)*28.40±2.1035.61士 2.00<0.001
SOD (U/g Hb)** 34.38士7.3436.43士6.540.041
CAT (U/g Hb)**30.92±4.4228.34士7.670.003
MDA 丙二醛；GSH 谷胱甘肽；SOD 過(guò)氧化物歧酶；CAT 過(guò)氧化氫酶；
*血漿廣紅細(xì)胞溶解液；
4. 2. 2多態(tài)性位點(diǎn)的選擇
根據(jù)各種酶/蛋白質(zhì)編碼基因多態(tài)性對(duì)ROS生成的可能影響，選擇如下位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析過(guò)氧化氫酶基因啟動(dòng)子-262 ；CuZn過(guò)氧化物歧化酶第2外顯子(Glg41ser， Gly8Arg和GlulOOGly) ；Mn過(guò)氧化物歧化酶外顯子1 (Ala9Val)；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶外顯子5， 6 (The 105Val，Ala 114Val)；內(nèi)皮一氧化氮合成酶啟動(dòng)子(-786)，內(nèi)含子4中的27bp插入 /缺失多態(tài)性和外顯子894G/T ；解偶聯(lián)蛋白2啟動(dòng)子-866G/A，外顯子4674T/C (Ala55Val) 和3'-非翻譯區(qū)45bp插入/缺失多態(tài)性；解偶聯(lián)蛋白3啟動(dòng)子-55C/T ；轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子-740G/A，-618G/A, -552G/A 和-35G/T，共 18 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。
4. 2. 3多態(tài)性位點(diǎn)等位基因的鑒定
采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和PCR結(jié)合限制性?xún)?nèi)切酶分析(PCR/RFLP)，酶解產(chǎn)物通過(guò)3%瓊脂糖和/或10%丙烯酰凝膠電泳及EB或硝酸銀染色確定其基因型和等位基因。
實(shí)施方案
1、候選基因多態(tài)性位點(diǎn)A/B等位基因在病例-對(duì)照組的頻率分析
等位基因頻率由基因型頻率計(jì)數(shù)直接計(jì)算。例如AA純合型18例，AB雜合基因型 37例，BB純合基因型16例。A等位基因頻率為[(18 X 2+37) / (18 X 2+37 X 2+16 X 2) ] X 100 % =(73/142) X 100%= 51. 4%, B 等位基因頻率為 48. 6%。
2、病例-對(duì)照組間頻率差[0066]應(yīng)用SAS軟件9. 13版本計(jì)算組間各等位基因頻率分布；單倍型分析應(yīng)用 Haploview 3. 2軟件；應(yīng)用多因子降維法(MDR)分析基因與基因間相互作用。
3、結(jié)果
3. 1單個(gè)等位基因與高原肺水腫易感相關(guān)性
8個(gè)基因的18個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分析結(jié)果，只有UCP2的三個(gè)位點(diǎn)-866G/A，Ala55Val 和3，-非翻譯區(qū)的45bp插入/缺失多態(tài)性及內(nèi)皮一氧化氮酶基因894G/T(GlM89ASp)與高原肺水腫易感正相關(guān)(P < 0. 0001)。(見(jiàn)表2)
3. 2基因型與肺水腫易感相關(guān)性
在基因型水平，內(nèi)皮一氧化氮合成酶的894G/T雜合子的危險(xiǎn)性高于894T/T純合子，相對(duì)危險(xiǎn)性分別為5. 4和1. 2。而UCP2的-866G和45bp插入/缺失多態(tài)性表現(xiàn)為加和效應(yīng)。(見(jiàn)表2)
3. 3單倍型與高原肺水腫易感相關(guān)性
解偶聯(lián)蛋白2基因的-866G-55A_45bpD單倍型與肺水腫易感強(qiáng)相關(guān)，ρ = 0. 0002。 (見(jiàn)表2)
表2解偶聯(lián)蛋白2、轉(zhuǎn)鐵蛋白和內(nèi)皮一氧化氮合成酶基因單倍型與高原肺水腫易感/抗性相關(guān)性
權(quán)利要求
1.一種高原肺水腫高危人群的基因篩查方法，該方法包括從待測(cè)個(gè)體中采集樣品， 檢測(cè)樣品中解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A 和-35T/G的核苷酸類(lèi)型，由此確定該個(gè)體發(fā)生高原肺水腫的危險(xiǎn)性。
2.一種檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性個(gè)體的解偶聯(lián)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的組合基因型， 其中所述組合基因型包含用于檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A 和-35T/G。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性個(gè)體的解偶聯(lián)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的組合基因型，其中所述組合基因型通過(guò)質(zhì)譜分析法、AFLP, RFLP, RAPD、實(shí)時(shí)熒光PCR 分析法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法、異源雙鏈分析法、順序特異寡核苷酸法、序列特異性引物分析法、變性梯度凝膠電泳法、等位基因特異性寡核苷酸探針?lè)āCR指紋圖法、基因芯片法或測(cè)序法檢測(cè)。
4.一種檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的基因芯片，其中所述基因芯片包含用于檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G的試劑。
5.一種檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的試劑盒，其中所述試劑盒包含用于檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G的試劑。
6.一種解偶聯(lián)蛋白基因的-866A/G、4^3PI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A 和-35T/G在制備檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的高原肺水腫高危人群的基因篩查方法、或根據(jù)權(quán)利要求
2或 3所述的檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性個(gè)體的解偶聯(lián)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的組合基因型、或根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的基因芯片、或根據(jù)權(quán)利要求
5所述檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的試劑盒，其中如果檢測(cè)到的模式為下述模式S1-S4，則判斷受檢測(cè)個(gè)體發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性高，如果檢測(cè)到的模式為下述模式P5-P9，則判斷受檢測(cè)個(gè)體發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性低，其中按照組合45bp I/D/G-866A/A-740G/A-552G/G-35T的順序，模式 S1-S4 分別為 Sl DD-GG-AA-AA-GG，S2 =DD-AG-AG-AG-GT, S3 =DD-AG-AA-AA-GG, S4 DD-GG-AA-AG-GG ；模式 P5-P9 分別為 P5 =DI-AG-AG-AG-GG, P6 =DD-AG-AA-AG-GT, P7 DD-AG-AG-GG-GG，P8 =DD-AA-AA-AG-GT, P9 =DD-GG-GG-GG-GG
8.一種多核苷酸組合物，其中所述多核苷酸組合物中多核苷酸序列分別為SEQ ID No 1-5所示的序列或其互補(bǔ)序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的多核苷酸組合物在制備檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的用途。
10.SEQ ID No :6-10所示序列的引物在制備檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的用途。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及高原病高危人群的基因篩查方法及其相關(guān)基因診斷產(chǎn)品。本發(fā)明提供通過(guò)檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白基因的-866A/G、45bpI/D和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G的核苷酸類(lèi)型對(duì)高原肺水腫高危人群進(jìn)行基因篩查的方法。本發(fā)明還提供了檢測(cè)發(fā)生高原肺水腫危險(xiǎn)性的組合物、基因芯片、試劑盒等。本發(fā)明的方法、組合物、基因芯片、試劑盒等特異性高，應(yīng)用范圍廣泛。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102559853SQ201010594501
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月9日
發(fā)明者周文郁, 邱長(zhǎng)春 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan