專利名稱:診斷分枝桿菌感染的方法及用于該方法的試劑的制作方法
診斷分枝桿菌感染的方法及用于該方法的試劑
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求享有2009年2月沈日申請(qǐng)的第2009900876號(hào)澳大利亞專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，在此引入該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及對(duì)結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)，涉及對(duì)被結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌感染的動(dòng)物受試者(如人類)進(jìn)行診斷和預(yù)后，以及對(duì)與感染相關(guān)的癥狀(特別是肺結(jié)核)進(jìn)行診斷。更特別地，本發(fā)明涉及在被感染受試者中表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)mRNA，及其所編碼蛋白質(zhì) (SEQ ID NO :1)，以及用于新型診斷和預(yù)后方法的試劑，用于監(jiān)控治療感染和/或治療肺結(jié)核的效果的試劑。
發(fā)明背景
相關(guān)技術(shù)的描述
肺結(jié)核(TB)是一種慢性傳染病，通常因感染結(jié)核分枝桿菌引起，或者因感染結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種生物體引起。在此所用的術(shù)語“結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群”是指選自結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、牛分枝桿菌(M. bovis)、非洲分枝桿菌 (M. africanum)、卡氏分枝桿菌(M. canetti)和田鼠分枝桿菌(M. microti)中的一種或多種生物體。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知曉結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群不同于所謂的鳥分枝桿菌(Mavium) 復(fù)合群，鳥分枝桿菌復(fù)合群包括鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulaire)，在家畜中引起其他疾病，叫做副結(jié)核病。
肺結(jié)核(TB)是發(fā)展中國家的主要疾病，也是世界上發(fā)達(dá)地區(qū)日漸增多的問題，每年有大約800萬新病例并且300萬死亡。雖然感染在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)毫無臨床癥狀，肺結(jié)核最常見的表現(xiàn)是肺部急性炎癥，導(dǎo)致發(fā)燒和排痰性咳嗽。如果不進(jìn)行治療，結(jié)核分枝桿菌感染會(huì)從肺部的最初感染部位發(fā)展到身體的任何器官，通常導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥和死亡。
衛(wèi)生保健行業(yè)的許多工作者已經(jīng)時(shí)常描述了 TB的發(fā)病率正快速的全球性的升高的問題，這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。由于治療結(jié)核分枝桿菌感染需要用多種藥物治療數(shù)月，例如延長(zhǎng)治療期，會(huì)導(dǎo)致依從性差以及出現(xiàn)多重抗藥性的(MDR)和廣泛抗藥性的 (XDR) TB0
HIV感染使問題變得更糟糕。在晚期AIDS患者中，肺結(jié)核特別常見，是該患者的主要問題。事實(shí)上，在結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)陽性患者中，HIV感染是產(chǎn)生急性肺結(jié)核的最主要的風(fēng)險(xiǎn)因素，與未感染HIV的個(gè)體相比，感染HIV的免疫抑制個(gè)體患有肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。同時(shí)感染HIV-I和結(jié)核分枝桿菌還可能觸發(fā)病毒復(fù)制和病毒加載增加，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞被清空以及免疫缺陷或者免疫抑制，縮短個(gè)體的無HIV綜合癥期和存活時(shí)間 (Corbett 等人 2003 ；Ho, Mem. Inst. Oswaldo Cruz，91，385-387，1996)。
盡管肺結(jié)核成為全球性的巨大負(fù)擔(dān)，病例檢測(cè)仍然還是個(gè)問題。據(jù)估計(jì)，約有一半 TB患者未被診斷和恰當(dāng)治療(WHO Report 2007，WH0/HTM/TB/2007. 376，瑞士日內(nèi)瓦)。從這些數(shù)據(jù)顯然可以得出，對(duì)于控制肺結(jié)核，早期診斷急性感染以及診斷潛伏感染是必要的。
傳統(tǒng)的肺結(jié)核診斷仍然依賴于通過痰涂片顯微檢測(cè)抗酸性桿菌、培養(yǎng)物，結(jié)核菌素皮試，以及胸部X光線照相術(shù)，眾所周知所有這些方法具有多種缺陷。在活動(dòng)性肺結(jié)核感染的檢測(cè)中，顯微鏡觀察法快速而且成本低，但是要求在痰涂片樣品中看見桿菌，靈敏度低。培養(yǎng)法的靈敏度較高，但是需要花費(fèi)數(shù)周時(shí)間獲得結(jié)果并且假陽性達(dá)到10-20%。盡管這些檢測(cè)方法被使用了近一個(gè)世紀(jì)，但是它們還不足以用于控制肺結(jié)核，特別在發(fā)展中國家和HIV流行地方。
診斷肺結(jié)核的方法的發(fā)展受到許多困難阻礙。在本發(fā)明之前，鑒定適合用于檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種細(xì)菌引起的感染的生物標(biāo)志物是困難的。這是因?yàn)樯胁磺宄谌魏翁囟w內(nèi)環(huán)境中結(jié)合分枝桿菌中，哪種結(jié)合分枝桿菌蛋白質(zhì)的表達(dá)最高。而且，不同環(huán)境中的表達(dá)使得鑒定感染性標(biāo)志物以及區(qū)分活動(dòng)性感染和潛伏感染的標(biāo)志物變得復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)室體系以及使用實(shí)驗(yàn)室菌株不能克服這種不足。此外，鑒定可用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的其他分枝桿菌的標(biāo)志物也是困難的。即便鑒定了推定的標(biāo)志物，當(dāng)前的測(cè)定方法缺乏靈敏度和針對(duì)大量臨床樣品的重復(fù)性，診斷TB仍然是復(fù)雜的。依賴于DNA 和rRNA目標(biāo)序列擴(kuò)增的分子檢測(cè)還不適合用于檢測(cè)急性感染，或者用作感染標(biāo)志物。而且，基于mRNA檢測(cè)的分子檢測(cè)方法遭遇了與基于蛋白質(zhì)檢測(cè)的測(cè)定相同的障礙，信息穩(wěn)定性更為復(fù)雜，特別是在臨床樣品的存儲(chǔ)過程中。因此，本領(lǐng)域需要能夠提供一種試劑，其提供了總體上超過分枝桿菌蛋白質(zhì)檢測(cè)的、檢測(cè)臨床樣品的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種細(xì)菌所需的靈敏度和選擇性。
鑒定高水平表達(dá)的合適生物標(biāo)志物的進(jìn)展在本領(lǐng)域遇到多個(gè)障礙。盡管對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因組進(jìn)行測(cè)序便于開展大量確定理論上能由生物體序列數(shù)據(jù)單獨(dú)表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)和mRNA的研究工作，但是這不足以得出結(jié)論，即任何特定蛋白質(zhì)或者mRNA都在生物體表達(dá)，無論是人或者動(dòng)物個(gè)體被感染的過程中。結(jié)核分枝桿菌基因組的開放閱讀框名義上的解釋并不說明任何被編碼的特定蛋白質(zhì)實(shí)際上由細(xì)菌表達(dá)，并且可用作抗原或者用于基于mRNA的診斷。例如，結(jié)核分枝桿菌的特定蛋白質(zhì)或者編碼蛋白質(zhì)的mRNA可用作基于抗原的測(cè)試的診斷試劑，或者作為核苷酸擴(kuò)增測(cè)試(NAAT)的診斷試劑，該蛋白質(zhì)或者mRNA必須存在于樣品中或者可從樣品中獲得，這表明在細(xì)菌感染周期中表達(dá)了該蛋白質(zhì)。此外，已知在臨床樣品存儲(chǔ)過程中，mRNA不穩(wěn)定，這使得在實(shí)際檢測(cè)以及在大量臨床樣品重復(fù)操作時(shí)，基于mRNA檢測(cè)的診斷測(cè)試成為非常具有挑戰(zhàn)性的事情。
結(jié)核分枝桿菌能夠在培養(yǎng)物中培育，為在體外確定被表達(dá)的肺結(jié)核蛋白質(zhì)提供了方便的模型。但是，培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的人巨噬細(xì)胞、肺或肺外位點(diǎn)的環(huán)境迥然有異。此外，結(jié)核分枝桿菌是一種細(xì)胞外病原體，也是一種細(xì)胞內(nèi)病原體。近期證據(jù)表明胞內(nèi)寄生物的蛋白質(zhì)表達(dá)模式會(huì)根據(jù)環(huán)境信號(hào)發(fā)生顯著變化，以致于生物體的體外表達(dá)模式不能正確地反映生物體的原位表達(dá)模式。這同樣適用于處于細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)下的結(jié)核分枝桿菌。
結(jié)核分枝桿菌引起的感染，或者潛在感染的激活會(huì)引發(fā)宿主反應(yīng)，包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集到感染部位上。當(dāng)更多免疫細(xì)胞匯集成肉芽瘤形式的節(jié)結(jié)，其包括免疫細(xì)胞和被巨噬細(xì)胞的毒素產(chǎn)物破壞的宿主組織。隨著疾病進(jìn)展，巨噬細(xì)胞的酶水解蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸，使得周圍組織液化，并形成肉芽瘤。最終病灶破裂，桿菌釋放到周圍的肺部、血液或者淋巴系統(tǒng)中。
在這個(gè)感染周期中，桿菌被暴露于四種不同的宿主環(huán)境，即肺泡巨噬細(xì)胞、干酪樣肉芽瘤、肺部細(xì)胞外、肺部外的部位，例如，腎臟或者腹腔、淋巴、骨骼或者脊骨。
一般認(rèn)為，桿菌在這些環(huán)境中能夠復(fù)制到不同程度，但是對(duì)各個(gè)部位的環(huán)境條件知之甚少。四種宿主環(huán)境截然不同，這表明在各種環(huán)境下，結(jié)核分枝桿菌的表達(dá)模式是不同的。
因此，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物中鑒定到結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)并不必然表明，該蛋白質(zhì)或者mRNA在體內(nèi)的各種環(huán)境下都被表達(dá)。類似地，體外在巨噬細(xì)胞中培養(yǎng)下確定的結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)并不必然模仿在干酪肉芽瘤、高度充氣的肺部，或者肺部外的低含氧量部位中結(jié)核分枝桿菌的蛋白質(zhì)或者mRNA的表達(dá)模式。
此外，宿主內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌感染可被視為一件動(dòng)態(tài)事件，宿主免疫系統(tǒng)不斷試圖通過破壞被感染的巨噬細(xì)胞，將桿菌包裹和消滅。因此，結(jié)核分枝桿菌通過胞內(nèi)生長(zhǎng)、破壞(細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和分泌蛋白質(zhì)都被暴露和破壞)和快速細(xì)胞外繁殖的循環(huán)進(jìn)行發(fā)展。宿主和病原體相互作用是多因素的結(jié)果，這是難以在體外重復(fù)的。
雖然結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群成員的特定DNA和rRNA目標(biāo)序列的擴(kuò)增系統(tǒng)已經(jīng)被描述，由于核苷酸靶點(diǎn)的持久性，這種測(cè)試方法還不適用于監(jiān)控患者對(duì)治療的反應(yīng)。這是由于細(xì)菌DNA和rRNA的穩(wěn)定性能夠說明可擴(kuò)增的DNA和rRNA靶點(diǎn)一直存在于患者中。這些核苷酸種類的持久性被認(rèn)為反映了死亡或者靜止?fàn)顟B(tài)的桿菌從肺部病灶上脫落下來，因而不是急性感染的良好指示物。這種基于核苷酸的測(cè)試也并未獲得成功，也未被WHO推薦為一種無需涂片法或者培養(yǎng)法確認(rèn)的獨(dú)立測(cè)試。
由于結(jié)核分枝桿菌基因和假設(shè)的編碼序列被確定，已經(jīng)出現(xiàn)數(shù)種核苷酸擴(kuò)增測(cè)試方法(NAAT)。最近對(duì)所有可用的基于DNA、rRNA和mRNA目標(biāo)的NAAT進(jìn)行的元分析表明， 這些測(cè)試的實(shí)際性能并不理想(Ling等人，PLoS ONE 3⑵el536，2008年2月)。在呼吸系統(tǒng)樣品中，NAAT的靈敏度和特異性估計(jì)值的變化極大，靈敏度低于特異性，并且比特異性更不一致，診斷精確度的總和測(cè)量值不具有臨床意義。元分析試驗(yàn)表明由于NAAT用于檢測(cè)無法生活的細(xì)菌仍然存在問題并且會(huì)得出假陽性結(jié)果，目前可用的NAAT不被推薦用于替代診斷肺部TB的傳統(tǒng)測(cè)試方法，也未被證明可用于監(jiān)控治療進(jìn)程。
顯然仍需要對(duì)診斷和預(yù)后試劑的診斷精確度(特別是靈敏度)進(jìn)行改進(jìn)，以經(jīng)濟(jì)而快速地確定結(jié)核分枝桿菌的感染和/或與之相關(guān)的疾病狀況。
分子生物學(xué)、微生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、病毒學(xué)、DNA重組技術(shù)、液相肽合成、固相肽合成，以及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)已經(jīng)描述在，例如如下文章中
1. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratories，紐約，第二版(1989)，第 I、II、III 卷的全部?jī)?nèi)容;
2. DNA Cloning :A Practical Approach，第 I 和 II 卷(D. N. Glover 編，1985)，IRL ft~ess，牛津，全部?jī)?nèi)容；
3.Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach(Μ. J. Gait IS,1984)IRL Press,牛津，全部?jī)?nèi)容；特別是其中kit編寫的第1-22頁，Atkinson等人編寫的第35-81 頁，Sproat等人編寫的第83-115頁，以及■等人編寫的第135-151頁；
4. Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach (B. D. Hames 禾口S. J. Higgins 編，1985) IRL Press，牛津，全部?jī)?nèi)容；
5. Immobilized Cells and Enzymes :A Practical Approach(1986)IRLPress,牛津，全部?jī)?nèi)容；
6. Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；
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發(fā)明概述
在為本發(fā)明準(zhǔn)備的工作中，發(fā)明人試圖確定一種由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群 (M. tuberculosis complex)的一種或多種分枝桿菌引起的TB感染的生物標(biāo)志物，該標(biāo)志物在蛋白質(zhì)水平和/或RNA水平上表達(dá)，優(yōu)選在與細(xì)菌負(fù)荷相關(guān)的水平上表達(dá)，并且在臨床樣品和臨床菌株中表達(dá)；和/或試圖提供用于不同于普通的分枝桿菌檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的特定分枝桿菌的試劑；和/或試圖開發(fā)與常規(guī)測(cè)試相比對(duì)臨床樣品(包括對(duì)存儲(chǔ)的樣品)具有更高靈敏度和/或選擇性的測(cè)試方法；和/或試圖開發(fā)一種能夠在一組臨床樣品(包括存儲(chǔ)的樣品)中重復(fù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生物體的測(cè)試方法。
本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生物體在一定范圍的體內(nèi)環(huán)境中表達(dá)一些蛋白質(zhì)，從而確定了結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的其他生物體的高表達(dá)和/或高免疫原性的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)在多個(gè)專利申請(qǐng)中有描述，所有專利文獻(xiàn)在此被引入作為參考(國際公開號(hào)W02006/01792、WO 2007/087679、WO 2007/131291, WO 2007/140545,W02007/131293,WO 2007/131292,WO 2006/000045)。用一種蛋白質(zhì)組學(xué)方法確定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在體內(nèi)表達(dá)，并且存在于一群患者的體液中， 包括痰、胸液、血漿和血清。對(duì)含有免疫球蛋白(特別是IgG)的樣品進(jìn)行二維電泳，體內(nèi)確定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群蛋白質(zhì)，樣品事先從一群被診斷患有肺結(jié)核患者中獲得，例如，感染結(jié)核分枝桿菌或者結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的其他生物體的患者。確定肽片段，通過對(duì)胰蛋白酶消化片段進(jìn)行質(zhì)譜分析，并且與酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)比對(duì)，確定肽片段的氨基酸序列。特別地，相匹配的肽與KARI蛋白質(zhì)序列的一個(gè)區(qū)域比對(duì)。編碼SEQ ID NO :1的KARI蛋白質(zhì)的核酸由結(jié)核分枝桿菌的ilvC基因或者同系物編碼。
發(fā)明人利用這些發(fā)現(xiàn)開發(fā)一種使用多種先前確定的肺結(jié)核標(biāo)志物的核苷酸擴(kuò)增測(cè)試方法，這些標(biāo)志物如前所述被發(fā)現(xiàn)存在于臨床樣品中。在檢測(cè)被表達(dá)的肺結(jié)核生物標(biāo)志物的定量比較實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)ilvC轉(zhuǎn)錄物是最可靠的，在臨床樣品中檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄物拷貝數(shù)最多。ilvC的轉(zhuǎn)錄水平與患者感染的嚴(yán)重性也是相關(guān)的。
這些發(fā)現(xiàn)提供了用于設(shè)計(jì)基于雜交的診斷測(cè)試方法的手段，例如FISH，以及基于核苷酸擴(kuò)增(NAA)的診斷測(cè)試，包括基于NASBA平臺(tái)，例如基于PCR的測(cè)試方法，以及無需熱循環(huán)的等溫?cái)U(kuò)增方法，以及包括實(shí)時(shí)進(jìn)行的擴(kuò)增方法，例如實(shí)時(shí)PCR和實(shí)時(shí)RT-PCR以及實(shí)時(shí)等溫方法和實(shí)時(shí)NASBA，以及包括借助結(jié)合引物的標(biāo)記報(bào)道分子(例如基于STOR-綠I 和/或II)來實(shí)施的測(cè)試方法，或者使用結(jié)合擴(kuò)增子(amplicon)的探針的測(cè)試方法，例如 scorpion探針、TaqMan探針和分子信標(biāo)。例如，這些測(cè)試方法通過檢測(cè)個(gè)體中的結(jié)核分枝桿菌和/或其他的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物體，可用于特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物體引起感染，用于診斷肺結(jié)核或者用于監(jiān)控感染或者治療，或者用于感染或相關(guān)疾病狀態(tài)的預(yù)后。這種基于NAA的診斷學(xué)和預(yù)后學(xué)是基于在臨床樣品中高度特異性和靈敏性地檢測(cè)到ilvC轉(zhuǎn)錄物(ilvC-NAA)。例如，本發(fā)明人能夠在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到至少約IO3的 ilvC編碼RNA拷貝。技術(shù)人員顯然知曉，這種診斷測(cè)試和預(yù)后測(cè)試可以與治療肺結(jié)核或者與之相關(guān)的感染的處理方法結(jié)合，以確定治療性干涉的效果。
因此，本發(fā)明提供特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌存在與否的方法，所述方法包括用在此描述的檢測(cè)方法檢測(cè)生物樣品中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的核酸。例如，在不能檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的核酸的條件下，用檢測(cè)手段來實(shí)施該方法。
在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌存在與否的方法，所述方法包括在不能檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸的條件下，檢測(cè)樣品中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸。
在一個(gè)實(shí)例中，通過標(biāo)準(zhǔn)的核酸雜交或者其變化方式(例如FISH，或者任何不包括核酸擴(kuò)增的其他方法)來實(shí)施檢測(cè)。與本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)一致，在合適條件下，ilvC可方便作為一種生物標(biāo)志物，在可接受的靈敏度下，特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的分枝桿菌。
因此，被檢測(cè)的ilvC核酸可能包含結(jié)核分枝桿菌的ilvC DNA或者RNA的序列。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物體可以獨(dú)自地或者共同地選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡耐提分枝桿菌和田鼠分枝桿菌或者它們的組合。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生物體選自結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌或者它們的組合。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生物體可以是結(jié)核分枝桿菌或者結(jié)核分枝桿菌的臨床菌株或者臨床分離株。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生物體可以是牛分枝桿菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，鳥分枝桿菌復(fù)合群中的分枝桿菌可以是鳥分枝桿菌或者胞內(nèi)分枝桿菌。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)例中，用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸的本發(fā)明方法包括實(shí)施一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)，例如，多種基于NASBA檢測(cè)的任何一種，例如等溫?cái)U(kuò)增或者無需熱循環(huán)的其他擴(kuò)增，或者需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，例如，標(biāo)準(zhǔn)PCR或者逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的PCR(RT-PCR)。本文提供的實(shí)例明確支持需要熱循環(huán)的方法和無需熱循環(huán)的方法。除非另外特別指出，本文中的術(shù)語“擴(kuò)增”應(yīng)該被解釋為包括所有的擴(kuò)增方法，而與是否要熱循環(huán)無關(guān)。還包括未在本文中特別指出的擴(kuò)增檢測(cè)形式。
例如，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸包括，擴(kuò)增一種或多種ilvC核酸，制備被擴(kuò)增的ilvC核酸，和檢測(cè)被擴(kuò)增的核酸，其中檢測(cè)到被擴(kuò)增的ilvC核酸指示在樣品中存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的分枝桿菌的一種或多種。根據(jù)該實(shí)例，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸，而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括，進(jìn)行一擴(kuò)增反應(yīng)(例如，需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)或者不需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng))，從而檢測(cè)ilvC核酸，其包含SEQ ID NO :2或其來自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的同源序列的長(zhǎng)度至少為20個(gè)或40個(gè)或50個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。用于此的術(shù)語“檢測(cè)包含長(zhǎng)度至少為20個(gè)或40個(gè)或50個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的ilvC 核酸”是指樣品的ilvC核酸的最小區(qū)域，其特異性地與引物或探針雜交?？蛇x擇地，或者另外地，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸，而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括進(jìn)行一擴(kuò)增反應(yīng)(例如，需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)或者不需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng))，從而生成SEQ ID NO :2或其來自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的同源序列的長(zhǎng)度至少50個(gè)或60個(gè)或70個(gè)或80個(gè)或90個(gè)或100個(gè)或110個(gè)或 120個(gè)或130個(gè)或140個(gè)或150個(gè)或160個(gè)或170個(gè)或180個(gè)或190個(gè)或200個(gè)連續(xù)核苷酸的擴(kuò)增子。技術(shù)人員知曉術(shù)語“擴(kuò)增子”是指被擴(kuò)增的核酸。
可選擇地或者另外地，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的ilvC 核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸，包括進(jìn)行一擴(kuò)增反應(yīng)(例如，需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)或者不需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng))，使用一種或多種引物，每種引物包含來自SEQ ID
NO 2的一個(gè)區(qū)域的至少約18個(gè)SEQ ID NO 2的連續(xù)核苷酸的序列，SEQ ID NO 2區(qū)域選自
(i) SEQ ID NO 2的位置420到位置600或者與SEQ ID NO 2的位置420到位置 600互補(bǔ)的序列；
(ii)SEQ ID NO :2的位置40到位置180或者與SEQ ID NO :2的位置40到位置 180互補(bǔ)的序列；
(iii) SEQ ID NO 2的位置880到位置1000或者與SEQ ID NO 2的位置880到位置1000互補(bǔ)的序列。
例如，正向引物選自由SEQ ID NO 19、27、29、31和35組成的組。在另一個(gè)實(shí)例中，反向引物選自由SEQ ID NO :20、沘、30、32、36、37、38、39和40組成的組。
可選擇地，或者另外地，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群ilvC核酸，包括進(jìn)行一擴(kuò)增反應(yīng)(例如，需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)或不需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng))，至少約30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，例如約12個(gè)到約27個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，或者約14到20個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。
可選擇地，或者另外地，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的 ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸，包括用少于約2ng/ml的加入核酸進(jìn)行一擴(kuò)增反應(yīng)(例如，需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)或者不需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng))?！凹尤牒怂帷笔侵窹CR反應(yīng)中包括的核酸，而不必是指ilvC核酸。
在大量擴(kuò)增平臺(tái)的任何一種中，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸，任選地使用一種定量方法。一種示例性的定量方法包括使用一種或多種擴(kuò)增引物和一種包含能夠與擴(kuò)增引物的核酸產(chǎn)物雜交的序列的被標(biāo)記探針進(jìn)行一擴(kuò)增反應(yīng)， 例如，需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)或者不需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)例中，使用一種或多種擴(kuò)增引物以及能夠結(jié)合至少一種擴(kuò)增引物的被標(biāo)記探針進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，例如，需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)或者不需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)。
本發(fā)明用于在許多不同樣品類型的任何一種中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌。例如，樣品可能包含任何結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生物體的培養(yǎng)細(xì)胞?？蛇x擇地，樣品包括痰，和/或支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)，和/或淋巴結(jié)活檢物，和 /或血液或其部分，如血清、血漿，血清的一部分或者血漿的一部分?？蛇x擇地，樣品包括尿。 還包括其他已知包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌的樣品。
按照本文任何實(shí)例的本發(fā)明的方法能夠在約60分鐘內(nèi)檢測(cè)至少約IO4個(gè)拷貝的 ilvC核酸，優(yōu)選在約60分鐘內(nèi)檢測(cè)至少約IO3個(gè)拷貝的ilvC核酸?？蛇x擇地或者另外地， 按照本文任何實(shí)例的本發(fā)明的方法能夠檢測(cè)至少約104CFU/ml結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌。
本發(fā)明的方法還適合于多種分析方式，例如，多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)，例如，需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)或不需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，例如多重NASBA或者多重PCR，其中特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌的ilvC核酸，以檢測(cè)ilvC核酸之外的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的一種或多種核酸作為補(bǔ)充。例如，ilvC核酸之外的核酸可以是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的分枝桿菌的16s rRNA?？蛇x擇地，或者另外地，ilvC核酸之外的一種或多種核酸編碼選自BSX、S9、Rvl265、EF-Tu, P5CR、TetR樣蛋白和谷氨酰胺合成酶的蛋白質(zhì)，或與ilvC核酸互補(bǔ)的核酸，從而檢測(cè)選自SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14和16的序列或其互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度至少20個(gè)或30個(gè)或40個(gè)或50個(gè)或60個(gè)或70個(gè)或80個(gè)或90個(gè)或 100個(gè)或者更多個(gè)連續(xù)核苷酸。本發(fā)明還制備一種或多種擴(kuò)增子，每種長(zhǎng)度至少為50個(gè)或 60個(gè)或70個(gè)或80個(gè)或90個(gè)或100個(gè)連續(xù)核苷酸，衍生自ilvC核酸之外的一種或多種核酸，該核酸存在于樣品中。其中檢測(cè)到這些核酸組合的形式也包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的方法也適合于多平臺(tái)方式，例如，基于NAA的平臺(tái)和基于抗原的平臺(tái)的組合，其中對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的分枝桿菌的ilvC核酸的特異性檢測(cè)，以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白質(zhì)作為補(bǔ)充，例如，由ilvC核酸編碼的KARI蛋白質(zhì)，和/或BSX,和/或S9，和/或Rv 1265, ^P /或EF-Tu，和/或P5CR，和 /或TetR樣蛋白，和/或谷氨酰胺合成酶。在檢測(cè)形式中，特別優(yōu)選的是按照本文的任何實(shí)例描述用基于抗原的檢測(cè)方法檢測(cè)蛋白質(zhì)。[0064]本發(fā)明還提供一種檢測(cè)在生物學(xué)樣品中是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的方法，所述方法包括
(i)從受試者中獲取生物樣品；
(ii)從所述樣品中分離核酸；
(iii)在體外核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法中擴(kuò)增一種或多種ilvC核酸，以產(chǎn)生被擴(kuò)增的核酸；和
(iv)檢測(cè)被擴(kuò)增的核酸，其中陽性檢測(cè)到被擴(kuò)增的核酸指示在所述樣品中存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中所述分枝桿菌的一種或多種。
在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明還提供檢測(cè)生物學(xué)樣品中是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的方法，所述方法包括在存在擴(kuò)增引物和探針(如分子信標(biāo)，或者TaqMan探針，或者&011^011探針)的情況下擴(kuò)增一種或多種ilvC核酸，探針與ilvC核酸雜交產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，其中該可檢測(cè)信號(hào)指示在該樣品中存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的所述分枝桿菌的一種或多種。
一種或多種按照本文具體實(shí)施方式
描述的用于檢測(cè)ilvC核酸的基于NAA的分析方法(ilvC-NAA)可用于感染或者疾病的早期診斷，提供一種通過檢測(cè)多種臨床樣品中是否存在ilvC核酸來檢測(cè)活動(dòng)性感染或者潛伏感染的手段。
在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供在受試者中診斷由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌引起的感染的方法，所述方法包括對(duì)來自受試者的生物學(xué)樣品實(shí)施按照本文任何實(shí)例的方法，從而在不能檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸的條件下檢測(cè)樣品中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸，其中檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的一種或多種ilvC核酸指示發(fā)生感染。本發(fā)明的這種方法特別適用于診斷活動(dòng)性感染或者潛在感染。
在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供在受試者中診斷肺結(jié)核的方法，所述方法包括對(duì)來自受試者的生物學(xué)樣品實(shí)施按照本文任何實(shí)例的方法，從而在不能檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸的條件下檢測(cè)樣品中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的ilvC 核酸，其中檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的一種或多種ilvC核酸指示患有肺結(jié)核。本發(fā)明的這種方法特別適用于診斷肺部肺結(jié)核和肺部外肺結(jié)核。本發(fā)明的這種方法也特別適用于與肺結(jié)核或者與肺結(jié)核相關(guān)狀況或者結(jié)核分枝桿菌感染的其他臨床檢測(cè)方法配合使用，例如診斷受試者中的一種或多種肺結(jié)核臨床癥狀，和/或診斷受試者中的一種或多種免疫抑制臨床癥狀，和/或診斷受試者中的HIV感染。
在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供一種診斷受試者中肺結(jié)核或者由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌引起的感染的方法，包括檢測(cè)來自所述受試者的生物學(xué)樣品中是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的一種或多種ilvC核酸，樣品中存在所述ilvC核酸指示發(fā)生感染。
因此，本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)例提供一種在受試者中診斷肺結(jié)核或者由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌引起的感染的方法，包括在存在探針的情況下，例如分子信標(biāo)或者TaqMan探針或korpion探針，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，檢測(cè)來自所述受試者的生物學(xué)樣品中是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的一種或多種ilvC核酸，其中通過探針的熒光性檢測(cè)到樣品中存在所述ilvC核酸，所述熒光性指示發(fā)生感染。[0075]在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供治療肺結(jié)核或者由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌引起的感染的方法，包括
(i)對(duì)來自受試者的樣品實(shí)施按照本文任何實(shí)例的方法，從而檢測(cè)樣品中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌；和
(ii)給受試者施用治療有效量的藥物組合物，從而降低受試者肺部、血液和淋巴系統(tǒng)中的致病桿菌的數(shù)量。
本發(fā)明還提供治療肺結(jié)核或者由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌引起的感染的方法，包括
(i)實(shí)施按照本文任何實(shí)例的診斷方法，從而檢測(cè)來自受試者的生物學(xué)樣品中是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌；和
(ii)給受試者施用治療有效量的藥物組合物，降低受試者肺部、血液和淋巴系統(tǒng)中的致病桿菌的數(shù)量。
本發(fā)明還提供治療肺結(jié)核或者由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌引起的感染的方法，包括
(i)實(shí)施按照本文任何實(shí)例的診斷方法，從而檢測(cè)來自正用第一種藥物組合物治療的受試者的生物學(xué)樣品中是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌；和
(ii)給受試者施用治療有效量的第二種藥物組合物，降低受試者肺部、血液和淋巴系統(tǒng)中的致病桿菌的數(shù)量。
本發(fā)明還提供治療受試者中的肺結(jié)核的方法，包括實(shí)施本文所述的診斷方法或者預(yù)后方法。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種預(yù)防方法，包括
(i)檢測(cè)來自受試者的生物學(xué)樣品中是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌引起的感染；和
(ii)施用治療有效量的藥物組合物，降低受試者肺部、血液和淋巴系統(tǒng)中的致病桿菌的數(shù)量。
本發(fā)明還提供一種試劑盒，用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌，所述試劑盒包含
⑴一種或多種用于基于NAA檢測(cè)的引物；和
(ii)適合用于使用本發(fā)明方法擴(kuò)增核酸(例如，緩沖液和/或一種或多種脫氧核糖核酸，和/或聚合酶，和/或?qū)φ找?和用于量化擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑。
任選地，試劑盒裝有使用說明書。
在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供一種還包括適合用于基于抗原檢測(cè)的試劑的試劑盒，所述試劑盒還包括
(i) 一種或多種分離的抗體或其免疫反應(yīng)片段，能夠特異性結(jié)合按照本文描述的任何具體實(shí)施方式
的分離的或者重組的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的免疫原性KARI蛋白質(zhì)或者免疫原性KARI肽或者免疫原性KARI片段或其表位，或者結(jié)合所述肽或表位或者片段的組合或者混合物，或者結(jié)合包含所述免疫原性KARI蛋白質(zhì)、肽、片段或表位的融合蛋白或者蛋白質(zhì)集合體；和
(ii)檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物形成的工具。
任選地，試劑盒裝有使用說明書。
14[0095]在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供一種還包括適用于基于抗體檢測(cè)的試劑的試劑盒， 所述試劑盒還包括
(i)分離的或重組的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌的免疫原性 KARI蛋白，或者按照任何本文描述的具體實(shí)施方式
的免疫原性KARI肽或者免疫原性KARI 片段或其表位，或者所述肽或者表位或者片段的組合或者混合物；和
(ii)檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物形成的工具。
任選地，試劑盒裝有使用說明書。
定義
本說明書包含用I^tentln Version 3. 3制備的核苷酸和氨基酸的序列信息。 每條核苷酸序列在序列表中用數(shù)字指示(numeric indicator) <210>，接著為序列標(biāo)識(shí) (sequence identifier)(例如 <210>1，<210>2，<210>3 等)來確定。序列的長(zhǎng)度和類型 (DNA，蛋白質(zhì)(PRT)等)，以及每條核苷酸序列的來源生物體分別通過數(shù)字指示字段<211>、 <212>和<213>提供的信息表明。
說明書中涉及的核苷酸序列通過術(shù)語“SEQ ID NO ”來定義，隨后為序列標(biāo)識(shí)(例如SEQ ID NO 1是指在序列表中被指定為<400>1的序列)。
本文的核苷酸殘基命名是按照IUPAC-IUB Biochemical NomenclatureCommission推薦的名稱，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，T 代表胸腺嘧啶，Y代表嘧啶殘基，R代表嘌呤殘基，M代表腺嘌呤或胞嘧啶，K代表鳥嘌呤或者胸腺嘧啶，S代表鳥嘌呤或胸腺嘧啶，W代表腺嘌呤或者胸腺嘧啶，H代表鳥嘌呤外的核苷酸，B代表腺嘌呤外的核苷酸，V代表胸腺嘧啶外的核苷酸，D代表胞嘧啶外的核苷酸，而N 代表任何核苷酸殘基。
如本文所用，術(shù)語“酮醇酸還原異構(gòu)酶”或者“KARI”是指結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)化合物，其包括或者具有與SEQ ID NO :1至少約80%同一性的序列，或者與本發(fā)明SEQ ID NO: 1所示序列實(shí)質(zhì)上相同的序列，和/或包含或者具有與結(jié)核分枝桿菌的ilvC基因編碼序列具有至少80%同一性的序列，所述化合物適合用于制備免疫原性肽或者制備抗體，它們可與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種分枝桿菌或者來自感染所述一種或多種分枝桿菌的受試者的臨床基質(zhì)交叉反應(yīng)，而不要求具有其他功能，如在蛋白質(zhì)翻譯中起作用。在本發(fā)明之前，尚未證實(shí)SEQ ID NO :1所示結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)在體內(nèi)表達(dá)，具有免疫原性或者不與其他生物體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，KARI蛋白質(zhì)的相關(guān)信息來自對(duì)編碼SEQ ID NO :1的多肽的結(jié)核分枝桿菌基因組中的開放閱讀框進(jìn)行的生物信息學(xué)分析。
如本文所用，術(shù)語“衍生自，，是指特定的整體來自特定來源，雖然不必直接來自該來源。
除非上下文另有指示，或明確表示相反含意，本文中記載為單數(shù)的整體、步驟或要素的本發(fā)明的整體、步驟或要素明確地涵蓋所記載的整體、步驟或要素的單數(shù)和復(fù)數(shù)形式。
本文中所述的針對(duì)任何單一具體實(shí)施方式
的本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，具體而言， 針對(duì)任何蛋白或其在診斷、預(yù)后或治療結(jié)核分枝桿菌中的用途應(yīng)理解為可根據(jù)情況適當(dāng)變動(dòng)以適用于(mutatis mutandis)本文中所述的任何其他具體實(shí)施方式
。
本文描述的用于個(gè)體受試者的診斷具體實(shí)施方式
明確地可根據(jù)情況適當(dāng)變動(dòng)以適用于群體、種族集團(tuán)或亞集團(tuán)的流行病學(xué)或針對(duì)具有特定MHC限制(restriction)的個(gè)體的診斷或預(yù)后。所有上述本發(fā)明的變化可由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文中所述的主題容易地推出。
本文中所提及的檢測(cè)或鑒定結(jié)核分枝桿菌和/或所提及的診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)肺結(jié)核或者由結(jié)核分枝桿菌引起的感染明確地延及對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中任何一種或多種生物的檢測(cè)，但不延及對(duì)副結(jié)核病和/或鳥分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種生物的診斷，除非上下文另行表明。舉例而言，如本文所述，本發(fā)明涵蓋使用與結(jié)核分枝桿菌KARI和片段以及一種或多種鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌交叉反應(yīng)的抗體作為對(duì)分枝桿菌屬的篩選，其與使用一種或多種替代性測(cè)定法以供檢測(cè)結(jié)核病和/或檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌相偶聯(lián)(但并不與任何供診斷副結(jié)核病和/或檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的替代性測(cè)定法相偶聯(lián))。
在整個(gè)本說明書中，除非上下文另行表明，單詞“包括/包含(comprise)，，或其變化形式如“comprises”或“comprising”，應(yīng)理解為暗示包括所述步驟或要素或整體或者一組步驟或要素或整體，但并不排除任何其他步驟或要素或整體或者一組要素或整體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可對(duì)本文中所述的本發(fā)明進(jìn)行除了那些經(jīng)具體描述的變化和修飾之外的變化和修飾。應(yīng)理解本發(fā)明包含所有上述變化和修飾。本發(fā)明還包括在本說明書中個(gè)別地或整體地所提及或表明的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任何兩個(gè)或更多個(gè)所述步驟或特征的任何和全部組合。
本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受本文中所述的具體實(shí)例的限制。如本文中所述，功能上等同的產(chǎn)物、組合物和方法明確地落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的實(shí)施無需不必要的實(shí)驗(yàn)嘗試，除非另行指明，使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、蛋白組學(xué)、病毒學(xué)、重組DNA技術(shù)、液相肽合成、固相肽合成和免疫學(xué)的常規(guī)方法。教導(dǎo)上述常規(guī)技術(shù)的文中的文獻(xiàn)1-17以全文提述的方式并入本文。
附圖簡(jiǎn)介
附
圖1是顯示用于實(shí)時(shí)PCR中量化轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖示，使用基因組DNA作為PCR模板進(jìn)行計(jì)算。A組是用于計(jì)算使用引物對(duì)rtM.tbl6SF(SEQ ID N0:17)和rtM. tbl6SR(SEQ ID NO :18)的16S rRNA轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B組是用于計(jì)算使用引物對(duì)rtM. tbiIvCF(SEQ ID NO 19)和 rtM. tbiIvCR(SEQ ID NO 20)的 ilvC 轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)準(zhǔn)曲線； C 組是用于計(jì)算使用引物對(duì) rtM. tbBSXF (SEQ ID NO :21)和 rtM. tbBSXR(SEQ ID NO :22) 的BSX的標(biāo)準(zhǔn)曲線；D組是用于計(jì)算使用引物對(duì)rtM. tbRvl265F(SEQ IDNO :23)和rtM. tbRvl265R(SEQ ID NO :24)的Rvl265轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)準(zhǔn)曲線；E組是用于計(jì)算使用引物對(duì)rtM. tbS9F(SEQ ID NO :25)和rtM. tbS9R(SEQ IDNO :26)的S9轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。給出了該曲線的回歸(R2)和等式。
附圖2是顯示供檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)的擴(kuò)增的夾心ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖示。標(biāo)準(zhǔn)曲線是如實(shí)施例中所述使用優(yōu)化ELISA條件檢測(cè)緩沖液中KARI而產(chǎn)生的。重組KARI蛋白的濃度(pg/ml)以對(duì)數(shù)尺度標(biāo)于X軸[rilvC]，而平均OD示于Y軸。 分別使用5和2. 5 μ g/mL的捕捉和檢測(cè)抗體(分別為Mol283F和Ch34/35)。使用4-參數(shù)對(duì)數(shù)方程將代表性ELISA(n = 2)的數(shù)據(jù)擬合于標(biāo)準(zhǔn)曲線(#1217 ；LOD = 1690pg/mL)。
圖3是顯示在結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室菌株(H37Rv)和兩個(gè)臨床菌株(CSU93和HN878)中KARI蛋白表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其由夾心ELISA確定。通過夾心ELISA分析來自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv (左)、結(jié)核分枝桿菌菌株CSU93 (中)和 HN878(右)的全細(xì)胞裂解液(WCL)。內(nèi)源蛋白的濃度通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來計(jì)算，并就摻入水平(spiking level)加以校正。從每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析的重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)。內(nèi)源蛋白的水平(表示為Pg/μ g總細(xì)胞蛋白)對(duì)于三個(gè)培養(yǎng)菌株中的每一個(gè)就平均值士 SD 進(jìn)行作圖。結(jié)核分枝桿菌菌株承蒙Colorado State University的好意而獲得。
圖4是顯示結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌中KARI蛋白表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過夾心ELISA確定。在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次測(cè)定來自結(jié)核分枝桿菌H35Rv (左邊)，和鳥分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)的全細(xì)胞裂解液。 內(nèi)源蛋白的濃度通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來計(jì)算，并就稀釋因子加以校正。表示為pg/yg總細(xì)胞蛋白的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)測(cè)試的分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士 SD進(jìn)行作圖。
圖5是顯示從結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌的全細(xì)胞裂解液獲得的濾過物中KARI蛋白的表達(dá)的圖示，其通過夾心ELISA確定。將從結(jié)核分枝桿菌菌株 H35Rv(左邊)、鳥分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)全細(xì)胞裂解液獲得的濾過物重復(fù)兩次進(jìn)行測(cè)定。內(nèi)源蛋白的濃度通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來計(jì)算，并就稀釋因子(如果存在)加以校正。表示為pg/yL濾過物的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士 SD進(jìn)行作圖。
圖6是夾心ELISA結(jié)果的圖示，其顯示抗體與結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白(0. 1 μ g/ ml (柱2、4、6))或來自非分枝桿菌病原菌大腸桿菌(柱1和幻、枯草芽孢桿菌(柱3和4)和銅綠假單胞菌(柱5和6)的全細(xì)胞裂解液(100yg/ml(柱1、3、5))缺乏顯著交叉反應(yīng)性。 全細(xì)胞裂解液在兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次進(jìn)行測(cè)定。作為對(duì)照，使用分別為Ong/ml (柱7)、 0. 12ng/ml (柱 8)、0. 49ng/ml (柱 9)、1· 95ng/ml (柱 10)、7· 8ng/ml (柱 11) >31. 3ng/ml (柱 12)或125ng/ml (柱13)的純化的重組KARI蛋白，其通過將重組蛋白在封閉緩沖液中連續(xù)稀釋制備。對(duì)樣品和對(duì)照就平均值OD士SD進(jìn)行作圖。
圖7是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中KARI蛋白的表達(dá)的圖示。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的 KARI蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋:60yg/ml，柱 1 ；20yg/ml，柱 2 ；6. 67 μ g/ml，柱 3 ;2· 22yg/ml，柱 4 ；0. 74 μ g/ml，柱 5 ；0. 25 μ g/ml，柱 6 ；0. 08 μ g/ml，柱 7 ；0 μ g/ml，柱 8。附圖左側(cè)的系列直方圖顯示如伴隨的實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的KARI蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值(方法3 4. 5mL痰-Cl，17x150 μ L替代擴(kuò)增ELISA)?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)物”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)。 空心柱表明涂片陰性/培養(yǎng)陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽性/培養(yǎng)陽性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽性/培養(yǎng)陽性樣品中，無論受試者的HIV狀態(tài)如何，KARI蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯者更尚。
圖8是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為Pg KARI蛋白/ml樣品體積。將示于圖6的數(shù)據(jù)基于其中的KARI蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的μ g/ml KARI蛋白內(nèi)插為pg/mL rKARI蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)物”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽性/培養(yǎng)陽性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽性 /培養(yǎng)陽性樣品中，無論受試者的HIV狀態(tài)如何，KARI蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。測(cè)定法的 LOD = 900pg/mL。
圖9提供顯示痰抑制抗體結(jié)合重組KARI (live)蛋白質(zhì)的圖示。放大ELISA系統(tǒng)用于分析在TB陰性痰中對(duì)抗體結(jié)合重組蛋白質(zhì)的抑制程度。痰中加入lOng/mL各種重組蛋白質(zhì)(柱1-3;注圖上不見柱說2)，用封閉緩沖液以1 3稀釋的混合物(柱4-6)，用封閉緩沖液以1 9稀釋的混合物(柱7-9)，用封閉緩沖液以1 27稀釋的混合物(柱 10-12)。樣品在4°C下培養(yǎng)過夜后檢測(cè)(柱1、4、7、10)或者馬上檢測(cè)(柱2、5、8、11)。陽性對(duì)照樣品未加入痰，孵育過夜后檢測(cè)(柱3、6、9、12)。在兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，在一式兩份的兩個(gè)孔中檢測(cè)樣品。在每個(gè)稀釋中在痰中檢測(cè)出的內(nèi)源蛋白濃度通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來計(jì)算，表示為％重組蛋白質(zhì)摻入濃度(％信號(hào)回收)。對(duì)于三種處理的四個(gè)稀釋因子中的每一個(gè)，將回收水平作為平均％信號(hào)回收士SD進(jìn)行作圖。對(duì)每個(gè)示于χ軸的稀釋，數(shù)據(jù)表示為信號(hào)回收百分比(Y軸)。
圖10提供了顯示痰抑制抗體與內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白結(jié)合的圖示，其通過放大夾心ELISA確定。使用放大ELISA系統(tǒng)分析在摻入TB陰性痰的結(jié)核分枝桿菌H37Rv 全細(xì)胞裂解液對(duì)抗體與內(nèi)源KARI蛋白結(jié)合的淬滅和遮掩的水平。將全細(xì)胞裂解液加入痰以在痰中產(chǎn)生KARI = 31ng/mL的目標(biāo)濃度(柱1_3 ；注柱1&2在圖中不可見)，并用封閉緩沖液1 3稀釋的混合物(柱4-6)、用封閉緩沖液1 9稀釋的混合物(柱7-9)、和用封閉緩沖液1 27稀釋的混合物(柱10-1 。樣品在檢測(cè)前在4°C孵育過夜(柱1、4、7、 10)或立即檢測(cè)(柱2、5、8、11)。陽性對(duì)照樣品缺乏痰，并在測(cè)定之前孵育過夜(柱3、6、9、 12)。在兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，在一式兩份的兩個(gè)孔中檢測(cè)樣品。在每個(gè)稀釋中在痰中檢測(cè)出的內(nèi)源蛋白濃度通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線(用封閉緩沖液系列稀釋的H37RV-WCL)內(nèi)插來計(jì)算，并表示為摻入濃度的％ 信號(hào)回收)。對(duì)于三種處理的四個(gè)稀釋因子中的每一個(gè)將回收的水平作為平均％信號(hào)回收士SD進(jìn)行作圖。
圖 11 是顯示 BSX (柱 1-3) ,EF-Tu (柱 4-6) ,KARI (柱 7-9)、P5CR (ProC)(柱 10-12)、 Rvl265(柱13-15)、S9(柱16-18)、TetR (柱19-21)基于在結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv (每3 列一組的第一列)、CSU939 (每3列一組的第二列)和HN878 (每3列一組的第三列)中總細(xì)胞蛋白表達(dá)的相對(duì)表達(dá)的圖示，其通過夾心ELISA來確定。內(nèi)源蛋白的濃度通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來計(jì)算，并就稀釋因子來加以校正。數(shù)據(jù)通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)來獲取，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的水平(表示為Pg/μ g總細(xì)胞蛋白)對(duì)于分析的每種TB抗原作為平均值士 SD進(jìn)行作圖。
圖12是圖11所述的圖示的擴(kuò)展表示，顯示一些低表達(dá)抗原的表達(dá)水平。
圖 13 是顯示 BSX (柱 1-3) ,EF-Tu (柱 4-6) ,KARI (柱 7-9)、P5CR (ProC)(柱 10-12)、 RvU65(柱13-15)、S9(柱16-18)和TetR(柱19-21)的相對(duì)表達(dá)的圖示，所述表達(dá)表示為每IxlO6CFU結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv (每3列一組的第一列)、鳥分枝桿菌(每3列一組的第二列)和胞內(nèi)分枝桿菌(每3列一組的第三列)的蛋白ng數(shù)，通過夾心ELISA來確定。 內(nèi)源蛋白的濃度通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來計(jì)算，并就稀釋因子來加以校正。數(shù)據(jù)通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)來獲取，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的水平對(duì)于分析的每種TB抗原的每一個(gè)作為平均值士SD進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)表示結(jié)核分枝桿菌中BSX、EF-Tu、KARI、Rvl265和S9 的特異性表達(dá)。
圖14是圖13所述的圖示的擴(kuò)展圖，顯示一些低表達(dá)抗原的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表明在結(jié)核分枝桿菌中BSX、EF-Tu、P5CR、Rvl265和S9的特異性表達(dá)，以及KARI在胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌中在這些低檢出限具有可檢測(cè)出的表達(dá)。
圖 15 是顯示 BSX (柱 1-3) ,EF-Tu (柱 4-6) ,KARI (柱 7-9)、P5CR (ProC)(柱 10-12)、 RvU65(柱13-15)、S9(柱16-18)和TetR(柱19-21)的相對(duì)表達(dá)的圖示，所述表達(dá)表示為每Pg結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(每3列一組的第一列)、鳥分枝桿菌(每3列一組的第二列)和胞內(nèi)分枝桿菌(每3列一組的第三列)總細(xì)胞蛋白的抗原pg數(shù)，通過夾心ELISA來確定。內(nèi)源蛋白的濃度通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來計(jì)算，并就稀釋因子來加以校正。數(shù)據(jù)通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)來獲取，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的水平對(duì)于分析的11個(gè)TB抗原中的每一個(gè)作為平均值士SD進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)表示結(jié)核分枝桿菌中BSX、EF-Tu, Rvl265、 S9和TetR(參見圖16)的特異性表達(dá)。在這些條件下在胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌中KARI 的可檢測(cè)的表達(dá)是明顯的。
圖16是圖15所述的圖示的擴(kuò)展圖，顯示一些低表達(dá)抗原的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表明 Rvl265在結(jié)核分枝桿菌中特異性表達(dá)，而大部分在胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌中測(cè)試的其他抗原在這些低檢出限內(nèi)具有可檢測(cè)出的表達(dá)。
圖 17 是顯示 BSX (柱 1-3) ,EF-Tu (柱 4-6) ,KARI (柱 7-9)、P5CR (ProC)(柱 10-12)、 RvU65(柱13-15)、S9(柱16-18)和TetR(柱19-21)的相對(duì)表達(dá)的圖示，所述表達(dá)表示為每μ L結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv (每3列一組的第一列)、鳥分枝桿菌(每3列一組的第二列)和胞內(nèi)分枝桿菌(每3列一組的第三列)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的濾過物的抗原pg數(shù)，通過夾心ELISA來確定。內(nèi)源蛋白的濃度通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來計(jì)算，并就稀釋因子來加以校正。數(shù)據(jù)通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)來獲取，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的水平對(duì)于每種所分析的TB抗原中的每一個(gè)作為平均值士SD進(jìn)行作圖。
圖18是圖17所述的圖示的擴(kuò)展圖，顯示一些低表達(dá)抗原的表達(dá)水平。
圖19被刪除。
圖20是痰樣品中的ilvC轉(zhuǎn)錄水平的圖示，通過實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定。從分離自患者樣品的樣品中確定在臨床患者中所表達(dá)的ilvC基因的RNA轉(zhuǎn)錄物水平。分離核酸，制備 cDNA，用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定表達(dá)。數(shù)值表示為拷貝/μ g cDNA。
圖21是痰樣品中相對(duì)于16S rRNA的ilvC轉(zhuǎn)錄物水平的圖示，通過實(shí)時(shí)定量PCR 測(cè)定，并與涂片狀態(tài)比較。確定分離自患者樣品的樣品中的ilvC基因和16S rRNA的RNA 轉(zhuǎn)錄物水平。分離核酸，制備cDNA，用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定表達(dá)。數(shù)值表示為拷貝/yg cDNA。
圖22是通過四個(gè)靶標(biāo)測(cè)定比較檢測(cè)重組蛋白質(zhì)和結(jié)核分枝桿菌的圖示。制備結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的培養(yǎng)細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液，用PBS-T對(duì)材料進(jìn)行系列稀釋，采用本文描述的用于篩選臨床痰的條件進(jìn)行ELISA。
圖23是抗KARI Μο2Β1與普通微生物的交叉反應(yīng)性測(cè)定的圖示。制備結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的培養(yǎng)細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液，用PBS-T對(duì)材料進(jìn)行系列稀釋，采用本文描述的用于篩選臨床痰的條件進(jìn)行ELISA。
圖M是結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的亞細(xì)胞部分的KARI蛋白質(zhì)的圖示。用PBS-T系列稀釋結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的亞細(xì)胞部分，采用本文描述的用于篩選臨床痰的條件進(jìn)行ELISA分析。
圖25是在含有KARI蛋白的緩沖液中的和以護(hù)理點(diǎn)的測(cè)定法形式(DiagnostIQ) 的結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖示。離液劑平衡緩沖液中摻有范圍在7. 5-120 μ g/mL的結(jié)核分枝桿菌(H37Rv WCL)。將500 μ L各種樣品添加到Diagnostlq測(cè)試中，用以前結(jié)合的單克隆2B1進(jìn)行檢測(cè)。用雞抗KARI (Ch34/35)捕獲內(nèi)源的KARI。每個(gè)測(cè)定點(diǎn)重復(fù)進(jìn)行兩次。 5 μ g H37RvffCL 為約 2ng 重組 KARI (ilvC)。
圖沈是使用KARI為靶標(biāo)抗原和用抗體Mol283F對(duì)臨床痰樣品中結(jié)核分枝桿菌的篩選結(jié)果的圖示。對(duì)經(jīng)過系列稀釋的代表涂片為陰性、2+個(gè)體和3+個(gè)體的特征明確的臨床樣品進(jìn)行分析，所述個(gè)體包括HIV陽性和HIV陰性患者。用抗體U83F作為檢測(cè)物的結(jié)果表明在ELISA形式中，六種涂片陽性的臨床樣品中的六種樣品均檢測(cè)到ilvC。
圖27是使用KARI作為靶標(biāo)抗原和使用優(yōu)化的Μο2Β1單克隆抗體的臨床痰樣品中的結(jié)核分枝桿菌的圖示。對(duì)經(jīng)過系列稀釋的代表涂片為陰性、2+個(gè)體和3+個(gè)體的特征明確的臨床樣品進(jìn)行分析，所述個(gè)體包括HIV陽性和HIV陰性患者。對(duì)照痰也用該樣品處理程序，在溶解時(shí)具有和沒有10 □ g/mL結(jié)核分枝桿菌WCL摻料。每個(gè)ELISA分析12種樣品， 每種樣品系列稀釋重復(fù)分析(當(dāng)只測(cè)定1/1和1/3稀釋時(shí)重復(fù)三次，當(dāng)1/1、1/3和1/9稀釋時(shí)重復(fù)兩次)。MPC表明樣品源自喀麥隆。
圖28是用western印跡分析檢測(cè)rilvC(rKARI)和內(nèi)源iIvC(KARI)的照片。將重組KARI蛋白質(zhì)(rilvC)和，培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌(WCL H37Rv)的全細(xì)胞裂解液分別以 IOng/泳道和10 □ g/泳道加載到SDS-PAGE。在存在和缺乏過量的重組蛋白質(zhì)的情況下， 用初級(jí)抗體(primary antibody)探查印跡。
圖29是用western印跡分析檢測(cè)rilvC(rKARI)和內(nèi)源iIvC(KARI)的照片。在泳道1-3中，麗標(biāo)志物、重組ilvC和培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌(WCLH37RV)的全細(xì)胞裂解液分別以Ing/泳道和5mg/泳道加載到SDS-PAGE上。用初級(jí)抗體探查印跡(Blaot)。Ch34/35 來自雞初始抗體集合，Ch35隨后用重組ilvC的高純度制備物再加強(qiáng)。Mo2Bl、MolE7、Mo2C7 和Mo3A2是分別結(jié)合KARI肽骨架的1區(qū)、2區(qū)、5區(qū)和6區(qū)的單克隆抗體(cf圖36)。
圖30是顯示KARI (ilvC)ELISA形式的特異性的圖示。制備培養(yǎng)細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液，用PBS-T連續(xù)稀釋，在與臨床痰篩選中標(biāo)準(zhǔn)所采用的相同的條件下應(yīng)用于ELISA。對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母等其他常見細(xì)菌靶標(biāo)沒有檢測(cè)到顯著的交叉反應(yīng)性。
圖31是采用Μο2Β1單克隆抗體捕獲測(cè)定檢測(cè)臨床樣品中的KARI (ilvC)的圖示。 如本文所述處理臨床樣品(η >25)。上面給出被篩選的受試者臨床樣品的代表性數(shù)據(jù)。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述
檢測(cè)手段
例如與常規(guī)方法和/或本領(lǐng)域知曉的其他核酸擴(kuò)增方法相比，該方法的檢測(cè)手段提供了高靈敏度和/或高特異性和/或高再現(xiàn)性。
術(shù)語“高靈敏度”是指大約100%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約99%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約98%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約97%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約96 %檢測(cè)到樣品中的i IvC核酸，或約95 %檢測(cè)到樣品中的i IvC核酸，或約94 %檢
20測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約93%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約92%檢測(cè)到樣品中的 ilvC核酸，或約91%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約90%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約89%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約88%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約87%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約86%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸，或約85%檢測(cè)到樣品中的ilvC 核酸，或約80-84%檢測(cè)到樣品中的ilvC核酸。
在一個(gè)實(shí)例中，檢測(cè)手段檢測(cè)ilvC核酸比已知方法更靈敏約15-20倍。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明方法檢測(cè)ilvC核酸比已知方法更靈敏約20-30倍。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明方法檢測(cè)ilvC核酸比已知方法更靈敏約30-50倍。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明方法檢測(cè) ilvC核酸比已知方法更靈敏約2-15倍。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明方法檢測(cè)ilvC核酸比已知方法更靈敏約5-10倍。
術(shù)語“高特異性”是指檢測(cè)ilvC核酸的特異性約100%，或檢測(cè)ilvC核酸的特異性約99%，或檢測(cè)ilvC核酸的特異性約98%，或檢測(cè)ilvC核酸的特異性約97%，或檢測(cè) ilvC核酸的特異性約96%，或檢測(cè)ilvC核酸的特異性約95%，或檢測(cè)ilvC核酸的特異性約80-95%，或檢測(cè)ilvC核酸的特異性約80-85%。
在一個(gè)實(shí)例中，按照本文描述的任何實(shí)施方式的檢測(cè)手段重復(fù)檢測(cè)到至少約1拷貝模板/μ g起始模板。在另一個(gè)實(shí)例中，按照本文描述的任何實(shí)施方式的檢測(cè)手段重復(fù)檢測(cè)到至少約1-2000拷貝模板/μ g起始模板。在另一個(gè)實(shí)例中，按照本文描述的任何實(shí)施方式的檢測(cè)手段重復(fù)檢測(cè)到至少約1-1000拷貝模板/μ g起始模板。在另一個(gè)實(shí)例中，按照本文描述的任何實(shí)施方式的檢測(cè)手段重復(fù)檢測(cè)到至少約1-500拷貝模板/μ g起始模板。 在另一個(gè)實(shí)例中，按照本文描述的任何實(shí)施方式的檢測(cè)手段重復(fù)檢測(cè)到至少約1-400拷貝模板/μ g起始模板。在另一個(gè)實(shí)例中，按照本文描述的任何實(shí)施方式的檢測(cè)手段重復(fù)檢測(cè)到至少約1-300拷貝模板/μ g起始模板。在另一個(gè)實(shí)例中，按照本文描述的任何實(shí)施方式的檢測(cè)手段重復(fù)檢測(cè)到至少約1-200拷貝模板/ μ g起始模板。在另一個(gè)實(shí)例中，按照本文描述的任何實(shí)施方式的檢測(cè)手段重復(fù)檢測(cè)到至少約1-100拷貝模板/μ g起始模板。在另一個(gè)實(shí)例中，按照本文描述的任何實(shí)施方式的檢測(cè)手段重復(fù)檢測(cè)到至少約1-50拷貝模板/ μ g起始模板。
本發(fā)明方法使用的檢測(cè)手段可能包括核苷酸雜交，使用探針或者肽核酸(PNA)或者鎖定核酸(LNA)探針通過產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)檢測(cè)加入的核酸?？蛇x擇地，本發(fā)明使用的檢測(cè)手段可能包括擴(kuò)增反應(yīng)，如需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)或不需要熱循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，使用一種或多種引物，和任選地一種或多種本文描述的探針，由此生成包括來自加入核酸的 iIvC核酸的擴(kuò)增子。
加入的核酸或模板
在來自相同受試者的多個(gè)樣品中，用如本文任何實(shí)例描述的基于核酸擴(kuò)增的測(cè)定方法高靈敏度和/或高選擇性和再現(xiàn)性地檢測(cè)和/或量化臨床樣品中的ilvC核酸 (iIvC-NAA)?；趇lvC-NAA的檢測(cè)在一大組臨床樣品中產(chǎn)生可重復(fù)的結(jié)果，例如，與感染嚴(yán)重性和或疾病進(jìn)展嚴(yán)重性相關(guān)的ilvC轉(zhuǎn)錄水平。例如，通過檢測(cè)被擴(kuò)增的核酸并量化來獲得結(jié)果。
“模板”是指任何的ilvC核酸，并且可包括具有或沒有任何核苷酸類似物的DNA、 RNA或者RNA/DNA，包括單鏈或者雙鏈的基因組DNA、mRNA或cDNA。然而，模板優(yōu)選是從ilvC基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的cDNA。
在一個(gè)實(shí)例中，模板是編碼SEQ ID NO=I所示的KARI蛋白的核酸。在另一個(gè)實(shí)例中，模板是編碼與SEQ ID NO :1所示的KARI蛋白至少80%同源的蛋白質(zhì)的核酸。在另一個(gè)實(shí)例中，模板是編碼與SEQ ID NO :1所示的KARI蛋白80%-100%同源的蛋白質(zhì)的核酸。 在另一個(gè)實(shí)例中，模板是編碼與SEQ ID NO :1所示的KARI蛋白85%-100%同源的蛋白質(zhì)的核酸。在另一個(gè)實(shí)例中，模板是編碼與SEQ ID NO :1所示的KARI蛋白90%-100%同源的蛋白質(zhì)的核酸。在另一個(gè)實(shí)例中，模板是編碼與SEQ ID NO :1所示的KARI蛋白95%-100% 同源的蛋白質(zhì)的核酸。
在另一個(gè)實(shí)例中，模板是SEQ ID NO :2所示的核苷酸編碼序列。在另一個(gè)實(shí)例中， 模板是與SEQ ID NO :2所示的編碼序列至少80%同源的核苷酸編碼序列。在另一個(gè)實(shí)例中，模板是與SEQ ID NO :2所示的編碼序列至少80%-100%同源的核苷酸編碼序列。另一個(gè)實(shí)例中，模板是與SEQ ID NO :2所示的編碼序列至少85%-100%同源的核苷酸編碼序列。另一個(gè)實(shí)例中，模板是與SEQ ID NO :2所示的編碼序列至少90%-100%同源的核苷酸編碼序列。另一個(gè)實(shí)例中，模板是與SEQ ID NO :2所示的編碼序列至少95%-100%同源的核苷酸編碼序列。另一個(gè)實(shí)例中，模板是與SEQ ID NO :2所示的編碼序列至少85%-100% 同源的核苷酸編碼序列。
根據(jù)上下文可以理解，上文所說的蛋白質(zhì)和編碼序列包括序列表中示例的示例性蛋白質(zhì)和編碼序列的同系物，其中所述同系物由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的一種或多種細(xì)菌表達(dá)，例如結(jié)核分枝桿菌，和/或牛分枝桿菌，和/或非洲分枝桿菌，和/或卡耐提分枝桿菌，和/或田鼠分枝桿菌。
在另一個(gè)實(shí)例中，按照本發(fā)明特異性擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌或者結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸，在不考慮引物或探針的作用下，在標(biāo)準(zhǔn)25 μ 1反應(yīng)中使用核酸濃度小于約 IOng,或小于約5ng,或小于4ng,或小于3ng,或小于2ng,或小于Ing,或小于約500pg,或小于約lOOpg，或小于約50pg。在不考慮引物或探針的作用下，在標(biāo)準(zhǔn)25 μ 1反應(yīng)中的優(yōu)選核酸濃度為約IOpg或15pg或20pg或25pg或30pg或35pg或40pg或45pg或50pg，例如，約 35pg到約45pg。對(duì)于本文描述的特定引物對(duì)，較低濃度的加入核酸(在不考慮引物或探針的作用下)會(huì)降低非特異性擴(kuò)增的作用，例如鳥分枝桿菌序列的擴(kuò)增。無需過度的試驗(yàn)或努力，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠調(diào)整核酸濃度，用于不同反應(yīng)條件。
引物設(shè)計(jì)
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，“引物”是包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者它們類似物的任何組合的核酸分子，其包括其中含有一個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸類似物的DNA、RNA或DNA/RNA，并且能夠退火到核酸模板上，作為酶的結(jié)合位點(diǎn)，例如DNA或RNA 聚合酶，從而提供了抑制特定核酸由5'方向向3'方向復(fù)制的位點(diǎn)。引物的核苷酸序列通常實(shí)質(zhì)上與被擴(kuò)增的模板核酸的核苷酸序列互補(bǔ)，或者至少包括一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域的互補(bǔ)性足以發(fā)生退火并由5'方向向3'方向延伸。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知曉，不互補(bǔ)程度不足以對(duì)引物起始延伸產(chǎn)生顯著的反作用。設(shè)計(jì)和/或制備適合用于本發(fā)明方法的引物的恰當(dāng)方法在本領(lǐng)域是已知的和/或在本文中有描述。引物通常但非必須是長(zhǎng)度約12-50 個(gè)核苷酸的短的合成核酸。優(yōu)選地，第一引物或者第一引物組的每條引物包括長(zhǎng)度至少約 12-15個(gè)核苷酸，能夠退火到核酸模板的一條鏈上。引物還可包括長(zhǎng)度至少約20個(gè)或25個(gè)或30個(gè)核苷酸，能夠退火到模板的一條鏈上。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知曉，能夠退火到核酸模板上的核苷酸的數(shù)量與引物退火的嚴(yán)格條件相關(guān)。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的引物在中度到高度嚴(yán)格條件下退火到核酸模板上。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通過實(shí)驗(yàn)確定本發(fā)明的引物能夠退火到模板核酸上的嚴(yán)格性。在另一個(gè)實(shí)例中，計(jì)算機(jī)生物模擬(in silico)確定引物能夠退火到模板核酸上的條件。在另一個(gè)實(shí)例中，Breslauer 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,83 :3746_3750，1986 描述的最鄰近領(lǐng)域的方法可用于確定引物的Tm。本文中描述了確定引物Tm的其他示例性方法。
本文描述了用于特異性檢測(cè)和靈敏檢測(cè)ilvC核酸的引物的設(shè)計(jì)。例如，本文示例說明，進(jìn)行BLAST檢索，對(duì)引物和假定的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行篩選以確保特異性。因此，在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中具有高同源性的引物被發(fā)現(xiàn)與其他分枝桿菌不具有顯著同源性。在一個(gè)實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)一種引物，其包括與模板核酸的一條鏈的一個(gè)區(qū)域具有至少約80%同一性的序列。更優(yōu)選地，序列同一性的程度為至少約80 %，或85 %，或90 %，或95 %，或98 %，或 99%，或100%。例如，引物或者引物的一個(gè)區(qū)域包含與感興趣的模板的一條鏈的一個(gè)區(qū)域具有至少約80%同一性的序列，感興趣模板如ilvC或其他結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的序列。
在一個(gè)實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)引物，使得其包含與模板核酸的一條鏈總體上具有至少約80%同一性的序列，模板核酸如本發(fā)明的單分析物的基于NAA的測(cè)定的情況中的ilvC轉(zhuǎn)錄物，或者多分析物檢測(cè)中描述的其他轉(zhuǎn)錄物的任何一種，如BSX轉(zhuǎn)錄物。更優(yōu)選地，序列與模板的同一性程度為至少約85 %，或90 %，或95 %，或98 %，或99 %。例如，引物或引物的一個(gè)區(qū)域包含與核酸模板的一條鏈具有至少80%同一性的序列。
顯然，本發(fā)明引物的特定組成取決于感興趣的核酸的序列。特別地，序列只需要能夠使引物退火到模板核酸上并起始擴(kuò)增反應(yīng)。
在上下文中，術(shù)語“退火”或類似術(shù)語應(yīng)被理解為是指引物和被擴(kuò)增的核酸(即模板或初始擴(kuò)增產(chǎn)物)相互堿基配對(duì)，形成雙鏈或者部分雙鏈的核酸，使用本領(lǐng)域知曉的溫度或其他反應(yīng)條件，促進(jìn)或允許互補(bǔ)核苷酸殘基之間發(fā)生堿基配對(duì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉， 形成雙鏈體的能力和/或形成雙鏈體的穩(wěn)定性取決于一種或多種因素，包括引物和被擴(kuò)增核酸之間的互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度，互補(bǔ)區(qū)域中腺嘌呤和胸腺嘧啶的百分含量(即“A+T含量”)， 與雙鏈體解鏈溫度(Tm)相關(guān)的孵育溫度，進(jìn)行擴(kuò)增的緩沖液或其他溶液的鹽濃度。通常， 為了促進(jìn)退火，在比從引物的A+T含量和長(zhǎng)度預(yù)測(cè)的引物Tm低至少約1_5°C的溫度下，孵育引物和被擴(kuò)增的核酸。還可以通過提高反應(yīng)緩沖液中的鹽(例如，NaCl、MgCl2、KCl、檸檬酸鈉，等等)的含量，或者延長(zhǎng)孵育時(shí)間段，使得雙鏈體形成增加或變穩(wěn)定，如Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press ； Hames 禾口 Higgins， Nucleic Acid Hybridization :A PracticalApproach， IRL Press， Oxford (1985) ；Berger 禾口 Kimmel，Guide to MolecularCloning Techniques，In :Methods in Enzymology, Vol 152，Academic Press，San Diego CA(1987)；或者 Ausubel 等人， Current Protocols in MolecularBiology, Wiley Interscience，ISBN 047150338(1992) 中所描述。
由于引物通常從5'到3'方向延伸，優(yōu)選至少3'末端的核苷酸與模板核酸的相關(guān)核苷酸互補(bǔ)。更優(yōu)選地，至少引物3'末端的至少3個(gè)或4個(gè)或6個(gè)或8個(gè)或10個(gè)連續(xù)核苷酸與模板核酸的相關(guān)核苷酸互補(bǔ)。引物3'末端的互補(bǔ)性確保引物的延伸端能夠起始模板核酸的擴(kuò)增，例如通過聚合酶。
由于非互補(bǔ)區(qū)降低引物的預(yù)測(cè)Tm，并可能與非模板核酸的擴(kuò)增相關(guān)，優(yōu)選本發(fā)明的引物不包括多個(gè)與模板核酸的鏈不同的連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，引物包括不超過6個(gè)或5 個(gè)或4個(gè)或3個(gè)或2個(gè)與模板核酸的鏈不同的連續(xù)核苷酸。更優(yōu)選地，與模板核酸的鏈不同的任何核苷酸是不連續(xù)的。
為了確定兩條核苷酸序列是否落入本文描述的特定百分同一性限制內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚需要進(jìn)行并行比較或者多重序列比對(duì)。在這種比較或比對(duì)中，在殘基不同的位置上可能出現(xiàn)差別，這取決于用于比對(duì)的算法。在上下文中，涉及兩條或多條核苷酸序列之間的百分比同一性是指所述序列之間相同殘基的數(shù)量，如用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何標(biāo)準(zhǔn)算法確定的。例如，使用 BESTFIT 程序或者 Computer Genetics Group, Inc. ,University Research Park, Madison, Wisconsin, United States of America(Devereaux 等人，Nucl. Acids Res. 12，387-395，1984)的其他合適程序，比對(duì)核苷酸序列并計(jì)算同一性。
可選擇地，National Center for Biotechnology Information (NCBI) BasicLocal Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul 等人· J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990)提供一批常用并且可自由獲得的序列比較算法，可以從多個(gè)地方獲得，包括NCBI，Bethesda, Md。 BLAST軟件組包括不同的序列分析程序，包括“blastn”，“blastn”用于將已知核苷酸序列與來自多種數(shù)據(jù)庫的其他多核苷酸序列比對(duì)。還可獲得的有稱為“BLAST 2 kquences”的工具，用于兩種核苷酸序列的直接成對(duì)比較。
如用于此，術(shù)語“NCBI” 應(yīng)被理解為是指 National Institutes of Health ofthe Government of the United States of America, Bethesda, MD, 20894 的 National Library of Medicine 白勺 National Center for BiotechnologyInformation 白勺數(shù)據(jù)庫。
通常，引物包含至少約10個(gè)核苷酸或者由至少約10個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選至少約 12個(gè)核苷酸或至少約15或20個(gè)核苷酸，它們退火到核酸模板上或者與核酸模板互補(bǔ)。然而，更長(zhǎng)的引物也可用于擴(kuò)增反應(yīng)，例如擴(kuò)增核酸的長(zhǎng)區(qū)域(如，超過IOOObp)的反應(yīng)。因此，本發(fā)明還包括一種引物，其包括至少約25個(gè)或30個(gè)或35個(gè)核苷酸，這些核苷酸退火到核酸模板上或者與核酸模板互補(bǔ)。
可選擇地，包含一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的引物，如鎖定核酸(LNA)或肽核酸(PNA)， 僅需包含退火到核酸模板上或者與核酸模板互補(bǔ)的至少約8個(gè)核苷酸的區(qū)域。優(yōu)選地，互補(bǔ)核苷酸是連續(xù)的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知曉，能夠退火到核酸模板上的核苷酸的數(shù)量與引物退火的嚴(yán)格性相關(guān)。優(yōu)選地，在中度至高度嚴(yán)格條件下，本發(fā)明的引物退火到核酸模板上。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通過經(jīng)驗(yàn)確定本發(fā)明弓丨物退火到模板核酸上的嚴(yán)格性。通常， 這種方法需要在各種條件下用一種或多種引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并確定所產(chǎn)生的特異性擴(kuò)增水平。
可選擇地，本發(fā)明的引物用可檢測(cè)標(biāo)志物(如放射性核苷酸(radionucleotide) 或熒光標(biāo)志物)標(biāo)記，并確定在適度嚴(yán)格條件下退火到靶標(biāo)核酸上的引物的水平。
為了定義嚴(yán)格性水平，通常用選自如下組的條件實(shí)現(xiàn)中度嚴(yán)格退火條件[0178]⑴在約42°C和約55°C之間的孵育溫度；
(ii)比預(yù)測(cè)的引物Tm低約15°C和約10°C之間的孵育溫度；和
(i i i)約 2mM 和 3mM 之間的 Mg2+ 濃度。
通常用選自如下組的條件實(shí)現(xiàn)高度嚴(yán)格退火條件
(i)高于約55°C和優(yōu)選高于約65°C的孵育溫度；
(ii)比預(yù)測(cè)的引物Tm低約10°C和約1°C之間的孵育溫度；和
(iii)約 ImM 和 1. 9mM 之間的 Mg2+濃度。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知曉用于提高退火嚴(yán)格性的可選擇的或其他的條件。例如，已知諸如以下的試劑改變引物和核酸模板的退火溫度，所述試劑例如甘油(5-10% )、 DMSO (2-10% )、甲酰胺(1-5% )、三甲銨乙內(nèi)酯(0. 5-2M)或者四甲基氯化銨(TMAC， > 50mM) (Sarkar 等人，Nucl. Acids Res. 18 :7465 ； 1990，Baskaran 等人 Genome Res. 6 633-638，1996 ；禾口 Frackman 等人，Promega Notes 65 :27，1998)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員理解變化擴(kuò)增反應(yīng)的嚴(yán)格性的條件。僅用于進(jìn)一步說明的目的，對(duì)影響核酸分子之間退火的參數(shù)的參考見于Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, ISBN047150338，1992)，在此引入作為參考。
可選擇地，計(jì)算機(jī)生物模擬確定引物退火到核酸模板上的條件。例如，用于確定引物的預(yù)測(cè)解鏈溫度(或Tm)(或者引物從特定核酸變性的溫度)的方法是本領(lǐng)域已知的。
例如，Wallace等人(Nucleic Acids Res. 6，3543，1979)的方法根據(jù) G、C、T 禾口 A 的含量估計(jì)引物的Tm。特別地，所述方法使用式2(A+G)+4(G+C)估計(jì)探針或引物的Tm。
可選擇地，Breslauer等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 :3746_3750，1986 描述的最鄰近領(lǐng)域方法可用于確定引物的Tm。最鄰近領(lǐng)域方法采用式
Tm(calc) =Σ Δ H。/(Rln (Ct/n) + Σ AS0),
其中Δ Η°是形成雙螺旋的標(biāo)準(zhǔn)焓，Δ S°是形成雙螺旋的標(biāo)準(zhǔn)熵，Ct是鏈的總濃度， η表示對(duì)稱因子，在自互補(bǔ)鏈的情況下η為1，在非自互補(bǔ)鏈的情況下η為4，R是氣體常量 (1. 987)。
Ryuchlik 等人，Nucl. Acids Res. 18 :6409-6412,1990 描述了用于確定寡核苷酸 Tm的另一公式
其中，dH是形成雙螺旋的焓，dS是形成雙螺旋的熵，R是摩爾氣體常量 (1. 987cal/°C mol)，“C”是核酸摩爾濃度(經(jīng)驗(yàn)測(cè)定，W. Rychlik等人，見上文)，(統(tǒng)一的熱力學(xué)參數(shù)的默認(rèn)值為0. 2 μ M)，[K+]是鹽摩爾濃度(默認(rèn)值為50mM)。
采用最鄰近領(lǐng)域方法確定寡核苷酸Tm的合適軟件在本領(lǐng)域是已知的，可從如US Department of Commerce, Northwest Fisheries Service Centerand Department of Molecular Genetics and BiochemistryjUniversity ofPittsburgh School of Medicine 獲得。
可選擇地，對(duì)于更長(zhǎng)的引物(即包含至少約200個(gè)核苷酸的引物)，可用Meinkoth 和Wahl (In =Anal Biochem, 138 =267-284,1984)的方法確定引物的Tm。該方法采用式[0197]81. 5+16. 6 (Iog10M) +0. 41(% GC)-0. 61(% form) -500/bp 長(zhǎng)度，
其中M是Na+的摩爾濃度，％ form是甲酰胺的百分比(設(shè)定為50% )
對(duì)于包含PNA或者由PNA組成的引物，用下式(Giesen等人，Nucl. Acids Res., 26 :5004-5006 描述的)確定 Tm
Tmpred = C0+Cl * Tmnn醒+C2 * fpyr+c3 * 長(zhǎng)度，
其中，Tmm是用最鄰近領(lǐng)域模型計(jì)算的解鏈溫度，對(duì)于對(duì)應(yīng)的DNA/DNA雙鏈體，應(yīng)用 SantaLucia 等人 Biochemistry，35 :3555-3562，1995 描述的 Δ H。和 Δ S。數(shù)值。fpyr 是指分?jǐn)?shù)嘧啶含量，長(zhǎng)度是指PNA的堿基序列長(zhǎng)度。常量為C。= 20. 79, C1 = 0. 83，C2 = -26. 13 禾口 c3 = 0. 44。
為了確定包含一個(gè)或多個(gè)LNA殘基的引物的Tm，采用SantaLucia等人 Biochemistry, 35 :3555-3562,1995 的式的改變形式
權(quán)利要求
1.一種特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的存在的方法，所述方法包括在不檢測(cè)鳥分枝桿菌(M. avium)復(fù)合群的ilvC核酸的條件下檢測(cè)樣品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸包括擴(kuò)增一種或多種ilvC核酸以由此產(chǎn)生擴(kuò)增的ilvC核酸和檢測(cè)所擴(kuò)增的核酸，其中檢測(cè)到擴(kuò)增的ilvC核酸指示所述樣品中所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種所述分枝桿菌的存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的方法，其中所檢測(cè)的ilvC核酸包括結(jié)核分枝桿菌ilvC DNA或RNA的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的方法，其中所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌(M. bovis)、非洲分枝桿菌(M. africanum)、卡氏分枝桿菌(M. canetti) 和田鼠分枝桿菌(M. microti)或其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其中所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物選自結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌或其組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其中所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物是結(jié)核分枝桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其中所述結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌的臨床菌株或臨床分離株。
8.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其中所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物是牛分枝桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中鳥分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌是鳥分枝桿菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中鳥分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌是胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulaire)。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸包括在熱循環(huán)下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸包括在沒有熱循環(huán)下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11或12所述的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)使用通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈或雙鏈cDNA模板或DNA/RNA雜合分子進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求
1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括檢測(cè)來自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的包含SEQ ID NO :2或其同源序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度的序列的ilvC核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的方法，所述方法包括檢測(cè)來自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的包含SEQ ID NO :2或其同源序列的至少40個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度的序列的 i IvC核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的方法，所述方法包括檢測(cè)來自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的包含SEQ ID NO :2或其同源序列的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度的序列的 i IvC核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求
1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸包括擴(kuò)增一種或多種ilvC核酸以由此產(chǎn)生擴(kuò)增的ilvC核酸和檢測(cè)所擴(kuò)增的核酸，并且其中所述擴(kuò)增產(chǎn)生來自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的SEQ ID NO :2或其同源序列的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度的擴(kuò)增子。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17所述的方法，其中所述擴(kuò)增子包含來自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的SEQ ID NO :2或其同源序列的至少80個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度。
19.根據(jù)權(quán)利要求
1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括使用一種或多種以下引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物各自包含SEQ ID NO :2的從其位置420至位置600、或與 SEQ ID NO 2互補(bǔ)的序列的從其位置420至位置600的至少約18個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求
1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括使用一種或多種以下引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物各自包含SEQ ID NO :2的從其位置40至位置180、或與SEQ ID NO 2互補(bǔ)的序列的從其位置40至位置180的至少約18個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求
1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括使用一種或多種以下引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物各自包含SEQ ID NO :2的從其位置880至位置1000、或與 SEQ ID NO 2互補(bǔ)的序列的從其位置880至位置1000的至少約18個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求
1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括進(jìn)行少于30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求
22所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括進(jìn)行約12個(gè)擴(kuò)增循環(huán)至約27 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)。
24.根據(jù)權(quán)利要求
22所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括進(jìn)行約14個(gè)擴(kuò)增循環(huán)至約20 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)。
25.根據(jù)權(quán)利要求
1-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括對(duì)少于約2ng/ml 加入原核核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求
1-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括使用一種或多種擴(kuò)增引物和包含能夠與所述擴(kuò)增引物的核酸產(chǎn)物雜交的序列的標(biāo)記探針進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以由此產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。
27.根據(jù)權(quán)利要求
1-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括使用一種或多種擴(kuò)增引物和能夠與所述擴(kuò)增引物的至少一種結(jié)合的標(biāo)記探針進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
28.根據(jù)權(quán)利要求
1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求
1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括痰。
30.根據(jù)權(quán)利要求
1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括支氣管肺泡灌洗液 (BAL)。
31.根據(jù)權(quán)利要求
1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括淋巴結(jié)活檢物。
32.根據(jù)權(quán)利要求
1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括血液、血清、血漿、血液的級(jí)分、血清的級(jí)分或血漿的級(jí)分。
33.根據(jù)權(quán)利要求
1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括尿。
34.根據(jù)權(quán)利要求
1-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括在足以在小于約60 分鐘內(nèi)檢測(cè)至少約104拷貝的ilvC核酸的條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
35.根據(jù)權(quán)利要求
1-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括在足以在小于約60 分鐘內(nèi)檢測(cè)至少約IO3拷貝的ilvC核酸的條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
36.根據(jù)權(quán)利要求
1-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸而不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸包括在足以檢測(cè)至少約 104CFU/ml結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌的條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
37.根據(jù)權(quán)利要求
1-36中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括檢測(cè)樣品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的一種或多種核酸，其中所述一種或多種核酸不是ilvC 核酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求
37所述的方法，其中不是ilvC核酸的所述一種或多種核酸是16s rRNA。
39.根據(jù)權(quán)利要求
37所述的方法，其中不是ilvC核酸的所述一種或多種核酸編碼選自由BSX、S9、Rvl265、EF-Tu、P5CR、TetR-樣蛋白和谷氨酰胺合成酶組成的組的蛋白或與其互補(bǔ)的核酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求
39所述的方法，所述方法包括進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以由此檢測(cè)包含選自由SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14和16組成的組的序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度的序列的核酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求
37-40中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以由此當(dāng)不是ilvC核酸的所述一種或多種核酸存在于所述樣品中時(shí)產(chǎn)生所述核酸的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度的擴(kuò)增子。
42.一種診斷受試者中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌感染的方法，所述方法包括對(duì)來自受試者的生物樣品進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求
1-41中任一項(xiàng)所述的方法以由此在不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸的條件下檢測(cè)樣品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸，其中檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的一種或多種ilvC核酸指示感染。
43.根據(jù)權(quán)利要求
42所述的方法，其中所述感染是活動(dòng)性感染。
44.根據(jù)權(quán)利要求
42所述的方法，其中所述感染是潛在性感染。
45.一種診斷受試者中的結(jié)核病的方法，所述方法包括對(duì)來自受試者的生物樣品進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求
1-41中任一項(xiàng)所述的方法以由此在不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvC核酸的條件下檢測(cè)樣品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvC核酸，其中檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的一種或多種ilvC核酸指示結(jié)核病。
46.根據(jù)權(quán)利要求
45所述的方法，其中所述結(jié)核病是肺結(jié)核病。
47.根據(jù)權(quán)利要求
45所述的方法，其中所述結(jié)核病是肺外結(jié)核病。
48.根據(jù)權(quán)利要求
45-47中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括診斷所述受試者中結(jié)核病的一種或多種臨床癥狀。
49.根據(jù)權(quán)利要求
45-48中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括診斷所述受試者中免疫抑制的一種或多種臨床癥狀。
50.根據(jù)權(quán)利要求
45-49中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括診斷所述受試者中的 HIV感染。
51.一種治療結(jié)核病或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌感染的方法，所述方法包括(i)對(duì)來自受試者的樣品進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求
1-41中任一項(xiàng)所述的方法以由此檢測(cè)所述樣品中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌；和( )向所述受試者施用治療有效量的藥物組合物以由此降低所述受試者的肺、血液或淋巴系統(tǒng)中的病原桿菌的數(shù)量。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中一種或多種分枝桿菌存在的方法，所述方法包括在不檢測(cè)鳥分枝桿菌復(fù)合群的ilvc核酸的條件下檢測(cè)樣品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvc核酸。本發(fā)明還提供了使用特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一種或多種分枝桿菌的ilvc核酸來診斷和治療受試者結(jié)核病的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102414326SQ201080018474
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年2月26日
發(fā)明者伊恩·加思韋特, 羅賓·林德納 申請(qǐng)人:泰里安診斷有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan