專利名稱:一種評估pc12細胞的神經元樣分化程度的裝置的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于評估細胞分化程度領域，尤其是一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，是基于PC12細胞在神經生長因子(NGF)持續(xù)誘導分化作用下表現(xiàn)出不斷變化的表面微形貌及電生理特征，采用探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡技術(HPICM)以及與其結合的膜片鉗技術，通過鑒定其相應的結構和功能特征參數(shù)來評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置。
背景技術：
PC12細胞是大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，與神經元細胞在發(fā)生學上均來源于神經脊，經神經生長因子(NGF)誘導分化后在結構、功能上與類交感神經元細胞有很多相似之處，又相對易于培養(yǎng)，實踐中普遍將PC12細胞用作研究神經元的細胞模型，因此，準確鑒定 PC12細胞的神經元樣分化程度對于建立良好的神經元研究模型具有基礎性的重要意義。
NGF誘導PC12細胞分化過程主要體現(xiàn)在三個方面的變化胞體微形貌的變化、神經突起的生長和電興奮性的改變，而且這三方面的變化在神經細胞分化過程中又起到基礎性作用。眾所周知，在神經細胞分化過程中，離子通道對于細胞膜形貌變化和神經突起的生長起到關鍵性作用，其中鉀離子對于神經突起的生長更為重要。另外，神經元電興奮性取決于電壓敏感性Na+、K+通道的表達和功能的發(fā)揮，其興奮性發(fā)育的關鍵是河豚毒素(TTX)敏感型Na+通道，而NGF可上調PC12細胞中上述Na+、K+通道的表達。
目前，常用的評估PC12細胞神經元樣分化程度的方法主要有兩種一、在普通光學顯微鏡下觀察細胞胞體的變化和神經突起的生長狀態(tài)，普遍認為胞體變大，神經突起數(shù)量增多、長度增加、相互交錯，進而形成類神經網絡結構，是PC12細胞達到高度分化的標志；但這種評估更多的借助于經驗的積累，缺乏定量判斷依據(jù)。二、利用膜片鉗技術獲得 PC12細胞表面Na+、K+通道的信息，大量試驗證實神經元樣PC12細胞的細胞膜上有功能性電壓門控K+通道和TTX敏感型Na+通道，而且，PC12細胞經NGF作用時間越長，細胞分化程度越高，其TTX敏感型Na+電流越大。但是，只有70-80%的神經元樣PC12細胞符合這種規(guī)律。因此，將兩種手段結合起來，對NGF誘導分化作用下的PC12細胞胞體微形貌的變化、神經突起的生長狀態(tài)和電興奮性的改變進行定性定量的綜合分析可以更加準確地評估PC12 細胞的神經元樣分化程度。
然而，利用普通光學顯微鏡觀察細胞微形貌的變化和神經突起的生長狀態(tài)受到光學衍射極限的限制，其分辨率有限。為了保證既能觀察到活體細胞又不會損傷柔軟的細胞表面以免影響后續(xù)的膜片鉗實驗，掃描探針顯微鏡(SPM)技術是很好的選擇，其中，非接觸式掃描離子電導顯微鏡(SICM)無疑比接觸式的原子力顯微鏡(AFM)更具有優(yōu)勢。然而，對于連續(xù)負反饋控制模式下的SICM而言，很難對垂直高度變化比較劇烈的神經元樣PC12細胞進行高分辨率地掃描成像。
實用新型
本實用新型的目的在于提供一種評估PC12細胞神經元樣分化程度的裝置，它能夠解決現(xiàn)有技術的不足，在室溫條件下結合運用探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡技術 (HPICM)與膜片鉗技術，對NGF誘導分化作用下活體PC12細胞的胞體微形貌變化、神經突起生長狀態(tài)和電興奮性改變進行鑒定，從結構和功能兩方面綜合評估PC12細胞的神經元樣分化程度。
本實用新型的技術方案一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于它是由在生理液態(tài)培養(yǎng)條件下非接觸式、高分辨率對活體生物樣品表面微結構進行探測的探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM，以及從功能上對NGF誘導分化的PC12細胞電興奮性進行評估的膜片鉗系統(tǒng)兩個部分構成的裝置；所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/ AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內含細胞與細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、HPICM掃描控制系統(tǒng)、Z向 HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺、膜片鉗放大器、數(shù)模/模數(shù)轉換器及計算機控制系統(tǒng)； 所述充滿電解液的玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細胞培養(yǎng)液中； 所述充滿電解液的玻璃微探針裝于Z向HPICM掃描探頭上；所述置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極分別與膜片鉗放大器和HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所述參比Ag/ AgCl電極與膜片鉗放大器連接；所述數(shù)模/模數(shù)轉換器分別于與膜片鉗放大器和計算機控制系統(tǒng)連接；所述Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺分別與HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所述HPICM掃描控制系統(tǒng)與計算機控制系統(tǒng)連接。
所述玻璃微探針均由硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管經程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，其中用于探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡的玻璃微探針要求尖端內壁直徑 50nm,電阻 150ΜΩ ；用于膜片鉗的玻璃微探針要求電阻3 6ΜΩ。
所述HPICM掃描控制系統(tǒng)、Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺采用英國 Ionscope公司的ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統(tǒng)；所述ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統(tǒng)自帶的圖像處理軟件SICM Image Viewer裝于計算機控制系統(tǒng)中。
所述膜片鉗放大器采用商用美國Axon膜片鉗Multiclamp 700B放大器。
所述數(shù)模/模數(shù)轉換器采用美國Molecular Device公司的Digidata 1440A數(shù)模 /模數(shù)轉換器。
所述計算機控制系統(tǒng)中安裝有膜片鉗系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集軟件；所述膜片鉗系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集軟件采用Clampex 10. 2數(shù)據(jù)采集及Origin 8. O分析軟件。
所述觀測細胞表面微結構時，細胞所處的細胞培養(yǎng)液為L15培養(yǎng)基，玻璃微探針內充灌的電解液亦為L15培養(yǎng)基；記錄離子通道電流時，細胞所處的細胞培養(yǎng)液是PC12細胞外液，玻璃微探針內充灌的電解液是PC12細胞內液。
本實用新型的工作過程⑴得到適合于利用HPICM技術觀測PC12細胞微形貌的玻璃微探針將由硼硅酸鹽玻璃毛細管拉制的玻璃微探針內充灌L15培養(yǎng)基，并裝于Z向 HPICM掃描探頭上，玻璃微探針內置有Ag/AgCl電極；玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極浸于PC12細胞的細胞培養(yǎng)液L15培養(yǎng)基中；通過膜片鉗技術測量玻璃微探針的電阻，選用阻值 150ΜΩ的微探針用于后續(xù)掃描；(2)利用HPICM技術對NGF誘導分化不同時間點的活體神經元樣PC12細胞表面形貌進行掃描成像通過HPICM掃描軟件設定掃描參數(shù)， 以HPICM掃描控制系統(tǒng)監(jiān)控流入玻璃微探針電流的微小變化，控制玻璃微探針的跳躍狀態(tài)，記錄下在各個成像點流入微探針的電流減小到設定值時微探針的位置，即為活體神經
4元樣PC12細胞的表面三維拓撲結構；細胞的環(huán)境浴液和玻璃微探針的內液均為L15培養(yǎng)基；(3)利用HPICM系統(tǒng)自帶的圖像處理軟件SICM Image Viewer掃描成像進行分析，得到各個PC12細胞胞體體積(Volume)、細胞膜表面粗糙度(RMS)、細胞膜表面積(Ssurf)，然后統(tǒng)計分析NGF誘導分化不同時間的PC12細胞的這些形貌數(shù)據(jù)，得到NGF誘導分化不同時間的PC12細胞胞體體積、細胞膜表面粗糙度、細胞膜表面積的差異性；這種差異性可作為從結構方面評估PC12細胞神經元樣分化的參考依據(jù)；(4)得到適合于利用膜片鉗技術進行全細胞記錄的玻璃微探針充灌有PC12細胞內液的玻璃微探針裝于Z向HPICM掃描探頭上， 玻璃微探針內內置有Ag/AgCl電極；玻璃微探針的尖端、參比Ag/AgCl電極和活體神經元樣PC12細胞都浸于PC12細胞外液中；也通過膜片鉗技術來測量此玻璃微探針的電阻，選用阻值3 6ΜΩ用于后續(xù)離子通道電流的記錄；(5)利用膜片鉗技術在生理條件下記錄活體神經元樣PC12細胞的離子通道電流玻璃微探針針尖進入PC12細胞外液后先補償玻璃微探針的電阻和電容，然后利用HPICM掃描控制系統(tǒng)將玻璃微探針準確定位于細胞胞體上的實驗位置，關閉HPICM掃描控制系統(tǒng)，手動控制玻璃微探針以豎直方向緩慢接近細胞胞體， 在接近過程中利用膜片鉗系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集軟件Clampex 10. 2持續(xù)監(jiān)測電阻的變化，通過調整玻璃微探針的位置和微探針內的壓力使電阻達到GQ即形成高阻抗封接；通過膜片鉗記錄軟件中ZAP功能或人工吮吸將玻璃微探針鉗制的膜片打破，形成全細胞記錄模式；補償串聯(lián)電阻后，通過Clampex 10. 2中預設的記錄方法(protocol)，即可記錄到生理條件下 PC12細胞的離子通道電流；(6)利用PC12細胞的離子通道電流計算出其對應的內向電流和電流密度，統(tǒng)計分析NGF誘導分化不同時間的PC12細胞的離子通道電流、內向電流和電流密度，得到隨著NGF誘導分化時間的延長PC12細胞細胞膜離子通道電流、內向電流和電流密度的變化趨勢，以及不同時間點的差異性；這種變化趨勢和差異性可作為從功能方面評估PC12細胞神經元樣分化的參考依據(jù)。
本實用新型的優(yōu)越性1、利用HPICM技術與膜片鉗技術相結合的手段可操作性強，能更加準確的從結構和功能兩方面來定性定量的綜合分析評估PC12細胞的神經元樣分化程度；2、探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM用于在活體細胞上觀測PC12細胞經 NGF誘導分化不同時間后胞體表面微形貌的變化和神經突起的生長狀態(tài)；膜片鉗系統(tǒng)用于記錄經NGF誘導分化后PC12細胞離子通道電流的變化；3、探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡(HPICM)技術是由掃描離子電導顯微鏡(SICM)技術改進而來，它不僅秉承了 SICM的可直接在液態(tài)生理培養(yǎng)條件下非接觸式、高分辨率地探測活體生物樣品表面三維微觀結構的優(yōu)點，而且克服了傳統(tǒng)SICM連續(xù)負反饋控制掃描模式的不足，實現(xiàn)了對高度急劇變化且表面形態(tài)復雜的活體生物樣品的納米尺度高分辨率掃描成像；這就為在生理條件下、非接觸式、高分辨率觀察神經元樣PC12細胞提供了更理想的技術手段，同時，由于HPICM良好的開放性使得它可以與膜片鉗技術相結合，能夠對NGF誘導分化作用下PC12細胞胞體微形貌的變化、神經突起的生長狀態(tài)和電興奮性的改變進行綜合分析，從而使得在活體細胞上從結構和功能兩方面共同探討PC12細胞的神經元樣分化程度成為可能。


附圖為本實用新型所涉結合運用探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡技術(HPICM) 與膜片鉗技術評估PC12細胞神經元樣分化程度的裝置結構示意圖。
具體實施方式
實施例一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置(見附圖)，其特征在于它是由在生理液態(tài)培養(yǎng)條件下非接觸式、高分辨率對活體生物樣品表面微結構進行探測的探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM，以及從功能上對NGF誘導分化的PC12細胞電興奮性進行評估的膜片鉗系統(tǒng)兩個部分構成的裝置；所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl 電極、參比Ag/AgCl電極、內含細胞與細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、HPICM掃描控制系統(tǒng)、Z向HPICM 掃描探頭、XY向HPICM掃描臺、膜片鉗放大器、數(shù)模/模數(shù)轉換器及計算機控制系統(tǒng)；所述充滿電解液的玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細胞培養(yǎng)液中；所述充滿電解液的玻璃微探針裝于Z向HPICM掃描探頭上；所述置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極分別與膜片鉗放大器和HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所述參比Ag/AgCl電極與膜片鉗放大器連接；所述數(shù)模/模數(shù)轉換器分別于與膜片鉗放大器和計算機控制系統(tǒng)連接；所述Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺分別與HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所述 HPICM掃描控制系統(tǒng)與計算機控制系統(tǒng)連接。
所述玻璃微探針均由硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管經程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，其中用于探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡的玻璃微探針要求尖端內壁直徑 50nm,電阻 150ΜΩ ；用于膜片鉗的玻璃微探針要求電阻3 6ΜΩ。
所述HPICM掃描控制系統(tǒng)、Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺采用英國 Ionscope公司的ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統(tǒng)；所述ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統(tǒng)自帶的圖像處理軟件SICM Image Viewer裝于計算機控制系統(tǒng)中。
所述膜片鉗放大器采用商用美國Axon膜片鉗Multiclamp 700B放大器。
所述數(shù)模/模數(shù)轉換器采用美國Molecular Device公司的Digidata 1440A數(shù)模 /模數(shù)轉換器。
所述計算機控制系統(tǒng)中安裝有膜片鉗系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集軟件；所述膜片鉗系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集軟件采用Clampex 10. 2數(shù)據(jù)采集及Origin 8. O分析軟件。
所述觀測細胞表面微結構時，細胞所處的細胞培養(yǎng)液為L15培養(yǎng)基，玻璃微探針內充灌的電解液亦為L15培養(yǎng)基；記錄離子通道電流時，細胞所處的細胞培養(yǎng)液是PC12細胞外液，玻璃微探針內充灌的電解液是PC12細胞內液。
以上對本實用新型的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本實用新型的較佳實施例，不能被認為用于限定本實用新型的實施范圍。凡依本實用新型申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本實用新型專利的涵蓋范圍之內。
權利要求
1.一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于它是由在生理液態(tài)培養(yǎng)條件下非接觸式、高分辨率對活體生物樣品表面微結構進行探測的探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM，以及從功能上對NGF誘導分化的PC12細胞電興奮性進行評估的膜片鉗系統(tǒng)兩個部分構成的裝置；所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl 電極、內含細胞與細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、HPICM掃描控制系統(tǒng)、Z向HPICM掃描探頭、XY向 HPICM掃描臺、膜片鉗放大器、數(shù)模/模數(shù)轉換器及計算機控制系統(tǒng)；所述充滿電解液的玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細胞培養(yǎng)液中；所述充滿電解液的玻璃微探針裝于Z向HPICM掃描探頭上；所述置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極分別與膜片鉗放大器和HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所述參比Ag/AgCl電極與膜片鉗放大器連接；所述數(shù)模/模數(shù)轉換器分別與膜片鉗放大器和計算機控制系統(tǒng)連接；所述Z向 HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺分別與HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所述HPICM掃描控制系統(tǒng)與計算機控制系統(tǒng)連接。
2.根據(jù)權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述玻璃微探針均由硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管經程控水平激光微電極拉制儀拉制而成， 其中用于探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡的玻璃微探針要求尖端內壁直徑50nm，電阻 150ΜΩ ；用于膜片鉗的玻璃微探針要求電阻3 6ΜΩ。
3.根據(jù)權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述HPICM掃描控制系統(tǒng)、Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺采用英國Ionscope公司的ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統(tǒng)。
4.根據(jù)權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述膜片鉗放大器采用商用美國Axon膜片鉗Multiclamp 700B放大器。
5.根據(jù)權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述數(shù)模/模數(shù)轉換器采用美國Molecular Device公司的Digidata 1440A數(shù)模/模數(shù)轉換ο
6.根據(jù)權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述觀測細胞表面微結構時，細胞所處的細胞培養(yǎng)液為L15培養(yǎng)基，玻璃微探針內充灌的電解液亦為L15培養(yǎng)基；記錄離子通道電流時，細胞所處的細胞培養(yǎng)液是PC12細胞外液，玻璃微探針內充灌的電解液是PCl2細胞內液。
專利摘要
一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于它是由在生理液態(tài)培養(yǎng)條件下非接觸式、高分辨率對活體生物樣品表面微結構進行探測的探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM，以及從功能上對NGF誘導分化的PC12細胞電興奮性進行評估的膜片鉗系統(tǒng)兩個部分構成的裝置。優(yōu)越性利用HPICM技術與膜片鉗技術相結合的手段可操作性強，能更加準確的從結構和功能兩方面來定性定量的綜合分析評估PC12細胞的神經元樣分化程度。
文檔編號G01Q60/44GKCN202256386SQ201120215251
公開日2012年5月30日 申請日期2011年6月23日
發(fā)明者劉曉, 張彥軍 申請人:國家納米技術與工程研究院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan