專利名稱:一種加壓裝置及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及加壓裝置，尤其涉及用于藥物篩選的加壓裝置，以及利用該加壓裝置進行藥物篩選的方法和用途。
背景技術：
常壓環(huán)境下視網膜神經細胞的培養(yǎng)方法已經比較成熟、穩(wěn)定，能夠較好的反映細胞的生長狀態(tài)及藥物對細胞體外存活的影響，但是不能針對性的考察藥物對高壓下培養(yǎng)細胞的影響。整體動物的高眼壓模型盡管研究較多，但不能全程觀察高眼壓導致視網膜神經細胞損傷的病理過程。由此，需要建立一種體外高壓培養(yǎng)視網膜神經細胞的方法，便于進行相關細胞水平的藥物篩選。
目前國內外常用的加壓培養(yǎng)裝置多為注液式加壓，即在密封的容器內注滿培養(yǎng)液，然后連接另一裝有培養(yǎng)液的容器，通過調節(jié)兩容器內液體高度差來改變壓力大小。該裝置的缺陷表現(xiàn)在首先培養(yǎng)瓶中缺乏氣體，特別是氧氣，不能排除缺氧導致細胞損傷的可能；密封裝置雖能保證無液體滲漏，但不能確保外部管道中的液體是否回吸入培養(yǎng)瓶，因而回吸會造成污染等。而現(xiàn)有的注氣式加壓裝置，即加壓時將培養(yǎng)瓶口密封，然后用注射器注入無菌氣體，單人即可操作；利用和培養(yǎng)瓶相連的壓力表，可以實時監(jiān)測瓶內壓力。但該裝置仍存在一些不足之處加壓操作繁瑣，需要同時監(jiān)控多個培養(yǎng)瓶，且不同培養(yǎng)瓶之間壓力不容易保持穩(wěn)定；實驗需要樣本量多，細胞數(shù)量大，相應的試劑用量也增多，不能滿足大量的細胞篩選需要。整體動物的高眼壓模型盡管研究較多，但不能全程觀察高眼壓導致視網膜神經細胞損傷的病理過程。
目前，已有采用培養(yǎng)瓶注氣式加壓裝置考察不同壓力或加壓時間對大鼠視網膜神經細胞、牛眼小梁細胞等的影響的報道。也有關于考察了持續(xù)壓力不同時程對大鼠成骨細胞的影響等的報道。但尚未有模擬體內高壓，根據不同細胞的特點進行不同藥物篩選的加壓裝置的相關報道。

發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種加壓裝置，利用該加壓裝置能滿足藥物篩選過程中大量篩選細胞需要。為解決該技術問題本發(fā)明所采用的技術方案是本發(fā)明的加壓裝置，包括由下殼、殼蓋構成的耐壓殼體，和設置在下殼、殼蓋結合端面之間的密封件，以及加壓后使殼蓋與下殼緊固連接的鎖止結構，所述耐壓殼體上開設有壓力檢測端口、進氣端口，壓力檢測端口外固定連接有壓力表，進氣端口外則連接有控制閥和進氣管。
本發(fā)明還提供了一種藥物篩選方法，它是利用本發(fā)明加壓裝置進行細胞水平藥物篩選的方法。
該藥物篩選方法包括如下步驟a、分離培養(yǎng)目的細胞；b、將目的細胞放入加壓裝置中，加入供篩選的藥物，在40～140mmHg的壓力下培養(yǎng)12～72h，觀察，記錄、分析數(shù)據。
其中，所述的目的細胞是視網膜神經細胞，加壓裝置壓力是80mmHg；所述的培養(yǎng)時間是48h。
其中，所述的培養(yǎng)容器是染缸、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶；所述的培養(yǎng)液是800ml·L-1DMEM高糖培養(yǎng)基、200ml·L-1胎牛血清、L-谷氨酰胺0.45g·L-1、NaHCO33g·L-1、HEPES 4.5g·L-1、青霉素1×106U·L-1和鏈霉素1×106U·L-1。
其中，所述的目的細胞還可以是大鼠視網膜神經細胞、牛眼小梁細胞、血管內皮細胞或大鼠成骨細胞。
本發(fā)明還提供了該加壓裝置用于篩選治療青光眼或高血壓的藥物中的用途。
在本發(fā)明加壓裝置中，可以根據不同細胞的特點選擇不同的培養(yǎng)方式，如貼壁細胞可以先在蓋玻片(24×24mm)上培養(yǎng)，貼壁完全后，將覆有細胞的蓋玻片嵌入染缸內，然后將染缸統(tǒng)一放入加壓裝置中進行高壓培養(yǎng)；如懸浮培養(yǎng)的細胞可以直接用培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)，然后轉入加壓裝置中進行高壓培養(yǎng)。本發(fā)明加壓裝置適用于模擬體內與青光眼相關的視網膜神經細胞、小梁細胞及與高血壓相關的血管內皮細胞等相關細胞的體外高壓培養(yǎng)試驗研究。本發(fā)明篩選方法模擬了體內青光眼高眼壓環(huán)境，建立了體外高壓視網膜神經細胞培養(yǎng)模型，確定了誘導細胞凋亡的加壓條件，并考察了藥物對高壓誘導的視網膜神經節(jié)細胞凋亡的影響。
本發(fā)明加壓裝置內可同時放入多個染缸、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶，不用對每個培養(yǎng)瓶分別加壓，大大減少了工作量；可以根據不同細胞的特點選擇不同的培養(yǎng)方式，而且各受試藥組和模型組可以同時在一個完全相同的條件下進行高壓培養(yǎng)，盡可能的避免操作帶來的差異；解決了用培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿等培養(yǎng)時無法加壓等問題；還可以根據不同細胞的特點及檢測手段要求的不同，選擇不同的培養(yǎng)容器，節(jié)約大量的培養(yǎng)及檢測試劑，減少細胞用量，從而大大降低實驗成本。本發(fā)明加壓裝置的操作方法簡便可行，為模擬體內高壓進行細胞水平的藥物篩選提供一種新的選擇。
顯然，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
本說明書包括如下兩幅附圖圖1是本發(fā)明加壓裝置的結構示意圖；圖2是本發(fā)明加壓裝置的局部放大示意圖。
圖中零部件、部位及編號下殼10、殼蓋11、壓力檢測端口12、進氣端口13、鉸鏈14、壓力表15、控制閥16、進氣管17、密封圈18、卸壓閥19、鎖止結構20、曲臂21、銷軸22、螺桿23。
以下通過附圖結合實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施方式如圖1所示，本發(fā)明的加壓裝置，包括由下殼10、殼蓋11構成的耐壓殼體，設置在下殼10、殼蓋11接觸端面之間的密封件，以及加壓后使殼蓋11與下殼10緊固連接的鎖止結構20。耐壓殼體上設置有壓力檢測端口12、進氣端口13，壓力檢測端口12外固定連接有壓力表15，進氣端口13外則連接有控制閥16和進氣管17。下殼10底部平坦，可以放入染缸、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶數(shù)個，將下殼10、殼蓋11鎖止后，通過進氣管17向耐壓殼體注入消毒空氣進行加壓并達到所需壓力。
本發(fā)明的加壓裝置適應于模擬體內與青光眼相關的視網膜神經細胞、小梁細胞及與高血壓相關的血管內皮細胞等相關細胞的體外高壓培養(yǎng)實驗研究。
殼蓋11與下殼10可以采用多種連接方式，圖1示出了其中一種，如該圖所示，殼蓋11通過鉸鏈14與下殼10連接，壓力檢測端口12、進氣端口13均開設在殼蓋11上，下殼10的端口上開設有環(huán)形凹槽，所述密封件為設置于該環(huán)形凹槽內的密封圈24。。同樣，鎖止結構20也可以采用多種結構，圖2示出了其中一種，如該圖所示，鎖止結構20設置在下殼10與鉸鏈14相對一側，它包括設置在下殼10、殼蓋11結合部處的曲臂21，該曲臂21的下端通過銷軸22與下殼10形成鉸鏈連接，曲臂21的上端則設置有可抵壓在殼蓋11上的螺桿23。
高壓培養(yǎng)結束后，在打開殼蓋11之前應先對耐壓殼體進行卸壓，卸壓可以采用如下的兩種方式，其一，取下進氣管17，打開控制閥16卸壓；其二，在殼蓋11上開設有卸壓端口18，在該卸壓端口18外設置卸壓閥19。
本發(fā)明加壓裝置進行藥物篩選試驗如下試驗例1本發(fā)明加壓裝置篩選藥物的加壓條件1、主要試劑多聚鳥氨酸(Sigma公司)，層粘連蛋白(Roche公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，小牛血清(成都哈里生物有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Sigma公司)，5-溴-2′-脫氧脲苷(Roche公司)。
2、實驗動物SD乳鼠(出生2～3d內)，雌雄兼用。由成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號川實動管第11號。
3、主要儀器LDZ5-2型低速自動平衡離心機，北京醫(yī)用離心機廠；LDZX-40BI型自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Multiskan MK3酶標儀，SANYO MCO-15ACCO2孵箱，DMIL萊卡倒置相差顯微鏡，萊卡體式顯微鏡，Sartorius超純水器。
4、方法與結果根據視網膜神經節(jié)細胞培養(yǎng)的特點將培養(yǎng)瓶培養(yǎng)改成蓋玻片(24×24mm)培養(yǎng)，加壓時將覆有細胞的蓋玻片固定于染缸內，每缸可放置蓋玻片6～12張，將染缸放入本發(fā)明加壓裝置中，分別使壓力達到80、120mmHg，保持24h、48h，采用原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記(TUNEL-POD)法，檢測細胞凋亡指數(shù)，結果見表1。
表1不同時間及壓力對細胞凋亡指數(shù)(％)的影響
注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01上述結果表明，模型組(80mmHg和120mmHg)凋亡率都明顯高于對照組(0mmHg)，細胞凋亡程度隨壓力和加壓時間的變化而變化。通過對細胞凋亡指數(shù)的統(tǒng)計分析，選擇壓力80mmHg，時間48h為高眼壓造模條件。
試驗例2本發(fā)明加壓裝置用于篩選藥物對壓力誘導的視網膜神經細胞Fas蛋白表達及凋亡的影響在本發(fā)明加壓裝置中進行下述藥物篩選試驗。
1、培養(yǎng)板的處理取6孔板，每孔預先置入一蓋玻片(24×24mm)，加入0.2mg/ml多聚鳥氨酸1ml，振蕩均勻，室溫靜置2h后，吸棄上清液，用適量PBS液洗滌三次，加入5μg/ml層粘連蛋白2ml，放置37℃，5％的CO2孵箱中過夜，備用。
2、細胞懸液制備將乳鼠斷頸處死，無菌條件下摘取眼球，置入含青霉素的PBS液中。在體式顯微鏡下沿角膜剪開，去除晶狀體和玻璃體，鈍性分離出視網膜。用0.125％的胰蛋白酶37℃下消化，30min后加入純小牛血清終止消化，用200目無菌鋼篩網濾過。將濾液1000r·min-1離心6min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)液(800ml·L-1DMEM高糖培養(yǎng)基、200ml·L-1胎牛血清、L-谷氨酰胺0.45g·L-1、NaHCO33g·L-1、HEPES 4.5g·L-1、青霉素1×106U·L-1、鏈霉素1×106U·L-1)，吸管吹打使之分散均勻制成單細胞懸液。計數(shù)并調整細胞密度為毫升含5×106個細胞。
3、接種培養(yǎng)將細胞懸液按每孔1ml接種于經包被的6孔板中，培養(yǎng)24h后加入5-溴-2′-脫氧脲苷以抑制非神經細胞生長。
4、模型制作及藥物的加入培養(yǎng)72h后每孔吸棄上清液，將蓋玻片轉移本發(fā)明加壓裝置中，并加入各不同藥液后，按選定的加壓條件同前進行加壓操作。加壓培養(yǎng)48h后，分批進行Fas蛋白免疫組化染色檢測，原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記(TUNEL-POD)法，結果見表2、3。
表2 各給藥組對RGCs中Fas蛋白表達的影響
注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01
表3各給藥組對視網膜神經節(jié)細胞凋亡指數(shù)的影響
注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01結果表明，與模型組比較，燈盞細辛黃酮類提取物、燈盞花素及陽性藥尼莫地平、維拉帕米均能明顯抑制視網膜神經細胞Fas蛋白的表達(P＜0.05，P＜0.01)，也能明顯對抗體外高壓誘導的RGCs凋亡(P＜0.05)。而燈盞細辛咖啡酰類提取物及咖啡酸無明顯影響。從統(tǒng)計結果中還可看出各組數(shù)據的標準差比較小，各批實驗的結果重復性良好。
上述藥物篩選試驗說明，本發(fā)明加壓裝置用于藥物的篩選，操作簡便，重現(xiàn)性高，可操作性強，能為臨床藥物篩選試驗提供較準確的數(shù)據，為正確判斷藥物使用提供了依據。本發(fā)明加壓裝置還可以節(jié)約大量的培養(yǎng)及檢測試劑，減少細胞用量，從而大大降低實驗成本，為模擬體內高壓進行細胞水平的藥物篩選提供一種新的選擇。
權利要求
1.加壓裝置，包括由下殼(10)、殼蓋(11)構成的耐壓殼體，設置在下殼(10)、殼蓋(11)接觸端面之間的密封件，以及加壓后使殼蓋(11)與下殼(10)緊固連接的鎖止結構(20)，其特征在于所述耐壓殼體上設置有壓力檢測端口(12)、進氣端口(13)，壓力檢測端口(12)外固定連接有壓力表(15)，進氣端口(13)外則連接有控制閥(16)和進氣管(17)。
2.根據權利要求
1所述的加壓裝置，其特征在于所述殼蓋(11)通過鉸鏈(14)與下殼(10)連接，所述壓力檢測端口(12)、進氣端口(13)均開設在殼蓋(11)上。
3.根據權利要求
2所述的加壓裝置，其特征在于所述鎖止結構(20)設置在下殼(10)與鉸鏈(14)相對一側，它包括設置在下殼(10)、殼蓋(11)結合部處的曲臂(21)，該曲臂(21)的下端通過銷軸(22)與下殼(10)形成鉸鏈連接，曲臂(21)的上端則設置有可抵壓在殼蓋(11)上的螺桿(23)。
4.根據權利要求
2所述的加壓裝置，其特征在于所述殼蓋(11)上開設有卸壓端口(18)，該卸壓端口(18)外設置有卸壓閥(19)。
5.根據權利要求
1所述的加壓裝置，其特征在于所述下殼(10)的端口上開設有環(huán)形凹槽，所述密封件為設置于該環(huán)形凹槽內的密封圈(24)。
6.一種藥物篩選方法，它是利用權利要求
1所述的加壓裝置進行細胞水平藥物篩選的方法。
7.根據權利要求
6所述的藥物篩選方法，它包括如下步驟a、分離培養(yǎng)目的細胞；b、將目的細胞放入加壓裝置中，加入供篩選的藥物，在40～140mmHg的壓力下培養(yǎng)12～72h，觀察，記錄、分析數(shù)據。
8.根據權利要求
7所述的藥物篩選方法，其特征在于所述的目的細胞是視網膜神經細胞，加壓裝置壓力是80mmHg；所述的培養(yǎng)時間是48h。
9.根據權利要求
8所述的藥物篩選方法，其特征在于所述的培養(yǎng)容器是染缸、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶；所述的培養(yǎng)液是800ml·L-1DMEM高糖培養(yǎng)基、200ml·L-1胎牛血清、L-谷氨酰胺0.45g·L-1、NaHCO33g·L-1、HEPES 4.5g·L-1、青霉素1×106U·L-1和鏈霉素1×106U·L-1。
10.根據權利要求
7所述的藥物篩選方法，其特征在于所述的目的細胞是大鼠視網膜神經細胞、牛眼小梁細胞、血管內皮細胞或大鼠成骨細胞。
11.權利要求
1所述的加壓裝置用于篩選治療青光眼或高血壓的藥物中的用途。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種用于藥物篩選的加壓裝置，包括由下殼(10)、殼蓋(11)構成的耐壓殼體，設置在下殼(10)、殼蓋(11)接觸端面之間的密封件，以及加壓后使殼蓋(11)與下殼(10)緊固連接的鎖止結構(20)。本發(fā)明還提供了該加壓裝置的用途，用于藥物的篩選。本發(fā)明裝置可節(jié)約大量的培養(yǎng)及檢測試劑，減少細胞用量，從而大大降低實驗成本。本發(fā)明加壓裝置用于藥物的篩選，操作簡便，重現(xiàn)性高，可操作性強，能為臨床藥物篩選試驗提供較準確的數(shù)據，為正確判斷藥物使用提供了依據，為模擬體內高壓進行細胞水平的藥物篩選提供一種新的選擇。
文檔編號F17C1/00GK1995800SQ200510022445
公開日2007年7月11日 申請日期2005年12月29日
發(fā)明者孟憲麗, 張藝, 段俊國, 盛艷梅, 張靜, 龍怡, 曾潔萍 申請人:成都中醫(yī)藥大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan