專利名稱:一種低尿酸分泌量益生菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地講，涉及一種通過(guò)基因工程方法制備低尿酸分泌量的益生菌制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類胃腸道是IO14個(gè)細(xì)菌類生物的棲息地，這些棲息菌被稱為共棲微生物 (commensal microbiota)。它們?cè)趮雰撼錾蟮淖畛鯉滋旒磥?lái)到并建立起一種對(duì)宿主正常機(jī)能必需的重要共生關(guān)系。目前已知,人體共棲微生物種類達(dá)500余種，其中99. 9%是以雙歧桿菌和類桿菌為主的專性厭氧菌，O. 1%是以腸桿菌科細(xì)菌為主的兼性厭氧菌。在成年個(gè)體中，這些微生物的總重量約1271克，相當(dāng)于肝臟的重量。共棲微生物與人體的這種終生關(guān)系在人體抵抗病原體、營(yíng)養(yǎng)吸收與代謝中起著重要作用。1989年，F(xiàn)uller把這些對(duì)宿主起有益作用的活的微生物稱為益生菌(Probiotics)。
目前對(duì)益生菌的研究表明，益生菌對(duì)機(jī)體的主要有益作用包括
I.代謝底物的消化(Digestion of metabolizable substrates)
分解食物來(lái)源的膳食纖維、淀粉、低聚糖、糖、脂肪和蛋白質(zhì)。以及人體來(lái)源的內(nèi)源性粘蛋白，脫落的上皮細(xì)胞和腸組織，細(xì)菌碎片，膽汁酸和膽固醇。對(duì)這些人體不吸收的底物分解后主要形成短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs),例如醋酸、丙酸和丁酸。 SCFAs可以刺激鹽和水的吸收、提供能量、維持腸道上皮細(xì)胞層的完整性等功能。
2.定植抗力(Colonization resistance)
腸道菌群，以黏附、嵌合等方式，形成膜樣結(jié)構(gòu)，通過(guò)其定植抗力，阻止致病菌黏附到上皮細(xì)胞；益生菌在胃腸道內(nèi)能產(chǎn)生有機(jī)酸、游離脂肪酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等具有不同程度抗菌活性的物質(zhì)。
3.制造維生素(Production of vitamins)
包括制造維生素B5、B6、B12、K2、生物素、核黃素、煙酸和硫胺素等，以及將有些維生素加工成人體可吸收利用的形式。
4.形成粘附位點(diǎn)(Development of attachment sites)
益生菌能夠刺激腸道上皮細(xì)胞合成糖復(fù)合物，這些復(fù)合物被認(rèn)為是益生菌附著的受體。
5.誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)育(Induces development of the immune system)
腸道正常菌群能夠刺激腸道相關(guān)淋巴系統(tǒng)(gut-associated lymphoid system, GALT)
的成熟。腸道菌群給GALT細(xì)胞提供了一系列的刺激性抗原，影響了局部和全身的淋巴細(xì)胞水平。
6.生產(chǎn)外源性酶類(Production of exogenous enzymes)
7.刺激腸道傳輸(Stimulation of intestinal transit)
已證明，腸道菌群能夠刺激腸蠕動(dòng)，并參與了腸神經(jīng)系統(tǒng)。腸道菌群影響行為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的證據(jù)越來(lái)越多。腸道菌群也影響能量平衡，并且不斷涌現(xiàn)的證據(jù)證明腸道菌群在肥胖的病理生理學(xué)中具有重要作用。
8.腸細(xì)胞的成熟和更新(Maturation and turn-over of intestinal cells) 腸道菌群能夠刺腸道上皮細(xì)胞的成熟和更新。
正是因?yàn)槟c內(nèi)菌群的上述重要功能，目前國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)了眾多益生菌制劑用以改善個(gè)體的健康狀況，效果明顯。目前世界上研究的功能最強(qiáng)大的產(chǎn)品主要是以上各類微生物組成的復(fù)合活性益生菌，包括①乳桿菌類(如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、詹氏乳桿菌、拉曼乳桿菌等);②雙歧桿菌類(如長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、卵形雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌等);③革蘭氏陽(yáng)性球菌(如糞鏈球菌、乳球菌、中介鏈球菌等)。此外，還有一些酵母菌。
盡管益生菌對(duì)機(jī)體有必需的重要功能，但是作為活的生命體，益生菌也存在正常的繁殖和死亡的過(guò)程，并可產(chǎn)生諸多次級(jí)代謝產(chǎn)物。這其中，益生菌對(duì)機(jī)體尿酸水平的影響是需要考慮的重要問(wèn)題之一，益生菌自身也具有分泌尿酸的能力，同時(shí)死亡菌體富含嘌呤， 嘌呤被機(jī)體吸收后最終會(huì)代謝成尿酸。兩方面累計(jì)無(wú)疑會(huì)增加機(jī)體尿酸代謝的負(fù)擔(dān)。
盡管人體內(nèi)尿酸是一種天然的抗氧化物質(zhì)，具有提高抗氧化活性、防止身體出現(xiàn)氧化應(yīng)激的作用。但是，因?yàn)槟蛩岬娜芙舛鹊?，所以?dāng)人體內(nèi)的嘌呤代謝發(fā)生紊亂或食入過(guò)量尿酸后，引發(fā)血尿酸濃度過(guò)高時(shí)，尿酸會(huì)以鈉鹽的形式沉積在關(guān)節(jié)、軟骨和腎臟中， 引起組織異物炎性反應(yīng)進(jìn)而引起高尿酸血癥和痛風(fēng)。在我國(guó)，人體血液中尿酸含量男性 >416. 5 μ mol/L,女性>357 μ mol/L被定義為高尿酸血癥。目前，在我國(guó)高尿酸血癥已經(jīng)發(fā)病率較高且呈快速上升現(xiàn)狀。
調(diào)查發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥的發(fā)病率已經(jīng)相當(dāng)普遍。據(jù)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢中心的公開(kāi)統(tǒng)計(jì)資料顯示，在1875例60 89歲老人中高血尿酸檢出率達(dá)到了 23. 7%(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，47 (6) 520-522 )。江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院社區(qū)體檢中心公開(kāi)資料顯示，在年齡為48±15歲的5960例中青年中，高尿酸血癥者患病率為10. 54%;在> 60歲的7860例老年人種，尿酸血癥者患病率為13. 63% (實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2011，25 (6) 454-456)0 廣東省佛山市第一人民醫(yī)院預(yù)防保健科體檢中心統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥是排在第4位的多發(fā)病，在1566名公安系統(tǒng)體檢者中的發(fā)病率高達(dá)21. 78% (實(shí)用心腦肺血管病雜志， 2011，19(12)2195-2196)。上海市浦東新區(qū)北蔡社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心統(tǒng)計(jì)分析表明，在7516 位60歲以上的體檢者中，高尿酸血癥患者數(shù)占了 19. 50%，且無(wú)男女差別(實(shí)用心腦肺血管病雜志，2010，18 (11) 1597-1598)。
根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，人體內(nèi)的尿酸來(lái)源有兩種一種是體內(nèi)經(jīng)由黃嘌呤分解代謝產(chǎn)生的，約占80% ;另一種是從食物中獲取的，約占20%。體內(nèi)尿酸大部分經(jīng)由腎臟排泄， 25%經(jīng)消化道排泄(實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2004，20(3) :337-338)。目前用于降低嚴(yán)重高尿酸血癥和急性痛風(fēng)病人血液中尿酸含量的治療藥物主要是通過(guò)(I)抑制腎小管對(duì)尿酸的重吸收 (如丙磺舒和苯澳香豆酮等)，或(2)通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶的活性來(lái)阻止尿酸的生成(如別嘌呤醇)，或(3)通過(guò)靜注尿酸氧化酶直接將尿酸氧化成比較容易排泄的尿囊素等三種方式。但此三種方式均有一定不良反應(yīng)，如丙磺舒等排尿酸藥物能引起尿酸鹽晶體在尿路的沉積，引發(fā)腎絞痛和腎功能損害；別嘌呤醇則具有致敏性，對(duì)骨髓有抑制作用，還具有胃腸道刺激、皮疹、發(fā)熱、肝損害等不良反應(yīng)；尿酸氧化酶是異源蛋白，可引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，出現(xiàn)發(fā)熱，惡心，嘔吐和皮疹等不良反應(yīng)，不能夠長(zhǎng)期多次用藥。這些方式不適合用于改善普通高尿酸血癥群體使用。[0015]根據(jù)人體尿酸25%來(lái)源于腸道吸收，且有25%的尿酸經(jīng)消化系統(tǒng)排泄的原理，有文獻(xiàn)報(bào)道利用蒙脫石(J Pharm Pharmacol. 2009 61 (11) : 1499-504)和活性炭(中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003 ,13(22): 117-118)灌胃的方式，利用吸附劑吸附消化道內(nèi)的尿酸可使高尿酸血癥小鼠體內(nèi)的尿酸水平得到顯著降低。但吸附劑的主要不良反應(yīng)是久服引起便秘，吸附的特異性較差，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也有吸附作用等。有必要尋找一種安全可靠，可用于預(yù)防和早期降低血液尿酸水平的新措施。
人體內(nèi)的益生菌是人體的共棲菌，可長(zhǎng)期駐留在腸道內(nèi)，數(shù)量龐大。這些益生菌本身就是機(jī)體尿酸的一個(gè)重要來(lái)源。日本明治乳業(yè)株式會(huì)社的一份專利中描述了通過(guò)突變篩選的方法，篩選出嘌呤體分解能力高的乳酸菌株，口服該菌的大鼠可以顯著抑制血清尿酸的上升(專利公開(kāi)號(hào)CN101932697A)。益生菌作為活的生命體也存在嘌呤代謝問(wèn)題，自身也具有尿酸產(chǎn)生能力。本發(fā)明認(rèn)為在益生菌中高效表達(dá)尿酸氧化酶，不僅可以降解自身所產(chǎn)生的尿酸，還可以分解腸道內(nèi)食源性和血液滲透而來(lái)的尿酸，從而減少尿酸的吸收，加速尿酸經(jīng)消化道的排泄，最終降低血尿酸的含量。此外，尿酸經(jīng)尿酸氧化酶分解后形成的H2O2還是一種抗菌活性物質(zhì)，有益于機(jī)體殺滅有害細(xì)菌。
由上可見(jiàn)，改造益生菌，增強(qiáng)菌體自身的尿酸分解能力，從而降低尿酸的產(chǎn)生量， 將可保留益生菌原有功效的同時(shí)改善益生菌引起血液尿酸水平升高的不利影響，為痛風(fēng)病人、高血尿酸癥患者以及潛在高血尿酸人群提供更好的福利。此外，通過(guò)長(zhǎng)期口服或手術(shù)方法，將腸道內(nèi)菌群部分或全部置換為低尿酸分泌的益生菌，將可長(zhǎng)期降低尿酸經(jīng)消化道吸收的量，最終降低血液尿酸水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種低尿酸分泌量益生菌的制備方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種可降低尿酸分泌量的基因工程干酪乳酸桿菌。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種降低尿酸產(chǎn)量的口服微生物制劑。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案一種低尿酸分泌量益生菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法包含如下步驟
(1)構(gòu)建包含有尿酸酶基因開(kāi)放閱讀框的重組質(zhì)粒；
(2)將(I)中所獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染益生菌，篩選獲得攜帶有該質(zhì)粒的重組菌株；
(3)在(2)中所獲得的重組菌株中篩選獲得重組質(zhì)?？煞€(wěn)定存在、尿酸酶可持續(xù)表達(dá)并具有明顯尿酸分解活性的低尿酸分泌的菌株。
所述的尿酸酶基因來(lái)自動(dòng)物、植物、微生物的天然基因組序列或cDNA序列，或根據(jù)受體菌的密碼子偏向性人工優(yōu)化設(shè)計(jì)合成的序列。
在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的尿酸酶來(lái)自于動(dòng)物的天然基因組序列或cDNA序列，或根據(jù)受體菌的密碼子偏向性人工優(yōu)化設(shè)計(jì)合成的序列。
在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的尿酸酶來(lái)自于豬的天然基因組序列或cDNA序列，或根據(jù)受體菌的密碼子偏向性人工優(yōu)化設(shè)計(jì)合成的序列。
所述的益生菌為乳酸菌、雙歧桿菌、放線菌和酵母菌中的一種或幾種。
在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的益生菌為乳酸菌、雙歧桿菌和酵母菌。
在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的益生菌為乳酸菌和雙歧桿菌。[0028]在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的益生菌為乳酸菌。
所述的尿酸酶基因開(kāi)放閱讀框包含有能夠指導(dǎo)尿酸酶編碼基因?qū)崿F(xiàn)組成性表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)的調(diào)控序列。
在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的尿酸酶基因開(kāi)放閱讀框?yàn)榻M成型表達(dá)。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的，本發(fā)明提供了利用上述制備方法獲得的低尿酸分泌
量益生菌。
作為一個(gè)優(yōu)選例，所述低尿酸分泌量益生菌為可降低尿酸分泌量的基因工程干酪乳酸桿菌，所述基因工程干酪乳酸桿菌中含有一種組成型表達(dá)人工合成的豬尿酸酶編碼基因的表達(dá)框架，所述人工合成豬尿酸酶編碼基因置于pMG36e表達(dá)載體內(nèi)。
所述的基因工程干酪乳酸桿菌的體外尿酸分泌水平可較對(duì)照組降低10 50% ;更優(yōu)的，該基因工程干酪乳酸桿菌的尿酸體外分泌水平可較對(duì)照組降低10 40%。
食用該基因工程干酪乳酸桿菌后體內(nèi)血液中尿酸水平較野生菌組降低10 40% ； 更優(yōu)的，食用該基因工程干酪乳酸桿菌后體內(nèi)血液中尿酸水平較野生菌組降低10 30%。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第三個(gè)目的，本發(fā)明提供了一種降低尿酸產(chǎn)量的口服微生物制劑， 所述口服微生物制劑含有所述的低尿酸分泌量益生菌。通過(guò)長(zhǎng)期口服所述微生物制劑或手術(shù)方法，將腸道內(nèi)菌群部分或全部置換為低尿酸分泌的益生菌，從而長(zhǎng)期降低經(jīng)消化道吸收的尿酸量，最終降低血液尿酸水平。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的低尿酸分泌量益生菌通過(guò)改造益生菌，增強(qiáng)菌體自身的尿酸分解能力，從而降低尿酸的產(chǎn)生量，將可保留益生菌原有功效的同時(shí)改善益生菌引起血液尿酸水平升高的不利影響，為痛風(fēng)病人、高血尿酸癥患者以及潛在高血尿酸人群提供更好的福利。此外，通過(guò)長(zhǎng)期口服或手術(shù)方法，將腸道內(nèi)菌群部分或全部置換為低尿酸分泌的益生菌，將可長(zhǎng)期降低尿酸經(jīng)消化道吸收的量，最終降低血液尿酸水平。


圖I.豬尿酸氧化酶擴(kuò)增載體pUC57_pU0。
圖2.人工合成的豬尿酸氧化酶的編碼序列和氨基酸序列；1-311為合成sUO翻譯后的氨基酸序列，1-942為sUO的人工合成的DNA編碼序列；下劃線部分為pMG36e載體內(nèi)的融合多肽；方框內(nèi)為加入的限制性酶切位點(diǎn)，3’端為Sacl，5’端為Hindlll。
圖3. pUC57-pU0質(zhì)粒的酶切鑒定。A為酶切鑒定結(jié)果；B為MF13的部分測(cè)序結(jié)果。I為Ikb DNA分子量標(biāo)記，各條帶分子量為10000，8000, 6000, 5000, 4000, 3500， 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250bp ;2 為 Sacl+Hindlll 雙酶切結(jié)果，可產(chǎn)生約O. 9kb和2. 7kb的預(yù)期條帶；3為Sal I單切結(jié)果,可產(chǎn)生約3. 6kb的單一線性化條帶。
圖4. pMG36e的質(zhì)粒圖譜。Emr為紅霉素抗性基因，來(lái)自金黃色葡萄球菌；箭頭為 P32啟動(dòng)子；T為prtP的轉(zhuǎn)錄終止子。
圖5.豬尿酸酶乳酸桿菌特異表達(dá)載體pMG-UO的鑒定。A為Sacl+Hindlll雙酶切鑒定結(jié)果，可見(jiàn)所挑取的1-5個(gè)克隆均具有正確的酶切結(jié)果；6為I為Ikb DNA分子量標(biāo)記，各條帶分子量為 10000，8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000,2500, 2000, 1500， 1000，750，500，250bp。B為插入序列的5’和3’序列的測(cè)序結(jié)果，與理論序列一致。
圖6. pMG-UO和pMG36e的轉(zhuǎn)換菌落鑒定。M為Ikb DNA分子量標(biāo)記，各條帶分子量為 10000，8000，6000，5000，4000，3500，3000，2500，2000，1500，1000，750，500， 250bp ;1和2為pMG-UO轉(zhuǎn)化的2個(gè)菌落，質(zhì)粒經(jīng)Sacl+Hindlll雙酶切可獲得預(yù)期O. 9kb 和3. 6kb的兩條帶。3和4為pMG36e的轉(zhuǎn)化菌落，質(zhì)粒經(jīng)Sacl+Hindlll雙酶切后，3號(hào)可獲得預(yù)期3. 6kb的單一條，4號(hào)無(wú)質(zhì)粒；+為陽(yáng)性對(duì)照，是pMG-UO質(zhì)粒經(jīng)Sacl+Hindlll雙酶切結(jié)果。
圖7.重組尿酸氧化酶的表達(dá)分析。A為SDS-PAGE電泳結(jié)果，其中M為預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白分子量為kDa ；UF0為UFO菌的裂解液；36e為36e菌的裂解產(chǎn)物；+為深圳邁瑞公司的尿酸測(cè)定試劑盒中的尿酸酶標(biāo)準(zhǔn)液(包含尿酸氧化酶和抗壞血酸氧化酶兩種成分)。B 為 Western-blot 結(jié)果，一抗為 Santa Cruz 公司的 uricase (FL-303) Antibody (Cat. No. sc-33830)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明從眾多益生菌中選擇了乳酸桿菌作為研究對(duì)象。原因有如下幾點(diǎn)(1)乳酸桿菌是唯一一種沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有致病性的菌；(2)乳酸桿菌是人和動(dòng)物腸道中的最優(yōu)勢(shì)菌群之一，對(duì)于調(diào)節(jié)人和動(dòng)物的生理和免疫起著至關(guān)重要的作用；(3)乳酸桿菌在益生菌中的粘附性是最好的，能很好地粘附在腸道或其它粘膜部位，終生發(fā)揮作用。
本發(fā)明檢測(cè)了乳酸桿菌尿酸產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)在體外情況下，0D600=1時(shí)的乳酸桿菌，40°C靜止孵育3小時(shí)，尿酸含量增加到了 881. 3± 12. 3 μ mol/L。分別稀釋10倍和100 倍后，尿酸含量分別增加到了 590. 2±16. 3、192. I ±6. 2 μ mol/L。
體內(nèi)進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，采用小鼠灌胃的方式，0. 2ml/d，菌體濃度為0. lg/ml，分別灌胃I天和2天后檢測(cè)小鼠血清中的尿酸含量，結(jié)果表明，小鼠血清中的尿酸水平分別從 179. 7 ±1.3 ymol/ml，增加到了 239. 8±19· 8 μ mol/L (I 天)和 285. 6 ±23. 8 μ mol/L (2 天)。
本發(fā)明根據(jù)GenBank公布的豬尿酸氧化酶基因序列(Accession No. M27697),通過(guò)乳酸菌密碼子優(yōu)化后，合成了豬尿酸氧化酶的全基因。將合成好的基因克隆入乳酸菌通用表達(dá)質(zhì)粒pMG36e載體內(nèi)，獲得了豬尿酸氧化酶基因表達(dá)載體pMG36-puo。
將pMG36-pUO質(zhì)粒導(dǎo)入了乳酸桿菌內(nèi)，篩選獲得了穩(wěn)定遺傳的重組乳酸桿菌。
蛋白表達(dá)檢測(cè)表明，該菌株內(nèi)可組成型的表達(dá)重組豬尿酸酶。
體外實(shí)驗(yàn)表明，起始OD=L O,分別稀釋10倍和100倍后，40°C靜止培養(yǎng)3小時(shí)， 該基因工程菌株的體外尿酸產(chǎn)量與不攜帶尿酸酶的菌株相比，尿酸水平分別下降了 23. 5%、 39. 9% 和 33. 3%ο
本發(fā)明開(kāi)展了體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證，采用小鼠灌胃的方式，0. 2ml/d，濃度為0. lg/ml, 連續(xù)灌胃兩天后檢測(cè)小鼠血清中的尿酸含量，結(jié)果表明，表達(dá)尿酸酶和不表達(dá)尿酸酶相比， 血清尿酸含量降低了 19. 2%，差異顯著。
由上述試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在益生菌內(nèi)高表達(dá)尿酸氧化酶是一種有效降低菌體自身尿酸產(chǎn)量的方法。
將這種低尿酸產(chǎn)量的益生菌制成口服微生物制劑，通過(guò)食入使工程菌駐留在消化道內(nèi)并持續(xù)高效表達(dá)尿酸氧化酶。腸道內(nèi)菌群不僅本身可大大降低尿酸的產(chǎn)量，還可以吸收和分解食源性與血液滲透而來(lái)的尿酸，從而減少尿酸的吸收，加速尿酸經(jīng)消化道的排泄，降低血尿酸的含量。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Samtoook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例I、乳酸桿菌的體外尿酸生產(chǎn)情況檢測(cè)
干酪乳酸桿菌(杭州味全食品有限公司)劃線培養(yǎng)于MRS固體培養(yǎng)板(青島海博生物技術(shù)有限公司)上，40°C培養(yǎng)30小時(shí)，取單菌落接種于IOml MRS液體培養(yǎng)基中，40 °C靜置培養(yǎng)36 h。取5ml，8000g離心3分鐘，收集菌體，用5ml生理鹽水洗滌菌體3次。最后用新鮮的MRS液體培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)整菌體濃度至0D_=1. 0，然后用MRS液體培養(yǎng)液做10、100 倍稀釋。上述各組設(shè)置重復(fù)3個(gè)重復(fù)，一同置于40°C靜止培養(yǎng)3小時(shí)，然后SOOOg離心3分鐘取上清進(jìn)行尿酸含量檢測(cè)。尿酸檢測(cè)使用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司BS-800 型生化分析儀測(cè)定,配套試劑盒為尿酸(UA)測(cè)定試劑盒(尿酸酶-過(guò)氧化物酶法)。
測(cè)定結(jié)果如表I.可見(jiàn)，干酪乳酸桿菌在生長(zhǎng)期間有持續(xù)的尿酸產(chǎn)生。
表I.干酪乳酸桿菌培養(yǎng)期間尿酸產(chǎn)生情況單位μ mol/L
重復(fù)I重復(fù)2重復(fù)3平均值士標(biāo)準(zhǔn)差0D600=1899. 8878. 9865. 3881. 3±12. 310倍稀釋604. 8600. I565. 7590. 2±16. 3100倍稀釋183. 8191. 2201. 4192. 1±6. 2MRS液體培養(yǎng)基0. 00. 00. 00. 0
實(shí)施例2、口服乳酸桿菌對(duì)小鼠血清尿酸水平的影響
干酪乳酸桿菌，取單菌落接種于10ml MRS液體培養(yǎng)基中，40 1靜置培養(yǎng)36 h。按照 I 100的比例，接種于新鮮的200ml MRS液體培養(yǎng)基中，持續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，8000g離心3分鐘，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體3次。最后一次離心后，除去上清后，準(zhǔn)確稱量菌體濕重，用按照加入適量生理鹽水將菌體重新懸浮，終濃度為0. lg/ml?；靹蚝筮M(jìn)行小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)。
所用小鼠為體重18±lg的昆明白小鼠(購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)，每組8只，雌雄各半。2次灌胃間隔24小時(shí)，最后I次灌胃12-15小時(shí)，摘眼球取血。 將血放入37°C培養(yǎng)箱放置半小時(shí)后，置4°C冰箱過(guò)夜。5000g，離心5分鐘后，取血清測(cè)定尿酸含量。小鼠分組與結(jié)果情況如表2。
表2. 口服UFO菌和36e菌對(duì)小鼠血液尿酸含量的影響單位μ mol/L
灌胃I天平均值灌胃2天平均值乳酸桿菌 (n=8)218. 2,255. 3,243. 3,216. 8,256. 4,223. 6,270. 3,234. 6，239. 8±19. 8"325. 4,292. 3,255. 6,298. 6,253. 4,275. 6,296.8， 287. 2，285. 6±23. 8*生理鹽水組 (n=8)178.4，181.3，179.5，177.4,180. 3，181. 0,179. 6,179.8179. 7±1. 3179. 4,177. 3,179. 5,177. 5，181. 3，180. 0,179.6， 179. 3179. 2±1. 3
*為與生理鹽水相比具有顯著性差異，P <0.01。
實(shí)施例3、豬尿酸氧化酶乳酸桿菌表達(dá)構(gòu)件的制備
為了提高豬尿酸氧化酶(pig Urate oxidase, pUO)在乳酸桿菌中的表達(dá)量,本發(fā)明根據(jù)GenBank公開(kāi)的豬尿酸氧化酶基因編碼序列(NM_214270)和氨基酸序列，通過(guò)西班牙洛維拉·依維爾基里大學(xué)(UNIVERSITAT ROVIRAI VIRGILI)的在線密碼子優(yōu)化程序 (http://genomes, urv. es/OPTIMIZER/Form. php),對(duì) pUO 的編碼序列進(jìn)行了針對(duì)嗜酸乳酸桿菌(lactobacillus bulgaricus)的密碼子優(yōu)化。同時(shí),為方便克隆入乳酸桿菌表達(dá)載體 pMG36e，在所合成的序列的5’和3’端分別加入了 SacI和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)。此外， 為了適應(yīng)pMG36e載體內(nèi)的讀框順序，合成序列的5 ’端做了調(diào)整，去除了前pUO蛋白N端的 10個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。具體序列和載體情況見(jiàn)圖2和圖3，人工合成的豬尿酸氧化酶的編碼序列和氨基酸序列參見(jiàn)SEQ ID NO. I所示，圖2方框中的DNA序列沒(méi)有編入序列表， 氨基酸序列用三聯(lián)密碼子表示，由DNA序列CDS獲得。將設(shè)計(jì)好的序列送北京金唯智生物公司合成，合成序列裝入了 PUC57載體內(nèi)形成了 pUO基因的擴(kuò)增載體，命名為pUC57-pU0 (圖 I)。
將pUC57_pU0轉(zhuǎn)化如DH5a菌內(nèi)，大規(guī)模提取質(zhì)粒，經(jīng)Sacl+Hindlll雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果正確(圖3)，同時(shí)經(jīng)DNA測(cè)序表明pUO編碼序列正確。
將pUO的編碼框架用Sacl+Hindlll雙酶切出后，定向插入經(jīng)相同酶切的pMG36e 載體(圖4)內(nèi)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，挑取5個(gè)克隆，經(jīng)質(zhì)粒小提和酶切鑒定表明均為成功插入(圖5A)，該質(zhì)粒命名為pMG-UO載體。經(jīng)測(cè)序表明，插入序列和讀框完全正確(圖5B)。
實(shí)施例4、特異表達(dá)豬尿酸氧化酶的乳酸桿菌的制備
本發(fā)明選擇了市售味全優(yōu)酪乳中的乳酸桿菌為受體菌。首先通過(guò)劃線方法，將細(xì)菌劃于MRS固體培養(yǎng)板上，40°C培養(yǎng)20-30小時(shí)，挑取單菌落，于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和。 經(jīng)pH值測(cè)定表明，飽和菌液(約培養(yǎng)30個(gè)小時(shí))的pH為3. 2，表明改菌為可以產(chǎn)乳酸的嗜酸性乳酸桿菌。將飽和菌液用含有1%甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基稀釋50倍后繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行感受態(tài)的制備。
通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法，將pMG-UO轉(zhuǎn)入乳酸桿菌內(nèi)，同時(shí)設(shè)置空載體pMG36e質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。電轉(zhuǎn)化后，約需在含有2 μ g/ml的MRS固體培養(yǎng)板上、40°C培養(yǎng)36-72小時(shí)，克隆方能長(zhǎng)出。
兩種轉(zhuǎn)化體，各挑取2個(gè)克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定表明2個(gè)pMG-UO轉(zhuǎn)化菌均與預(yù)期相符；pMG36e的2個(gè)轉(zhuǎn)化菌落中有一個(gè)正確，另一個(gè)提取質(zhì)粒失敗(圖6)。
將含有pMG-UO質(zhì)粒的乳酸桿菌(以下簡(jiǎn)稱UFO菌)和含有pMG36e質(zhì)粒的乳酸桿菌(以下簡(jiǎn)稱36e菌)飽和培養(yǎng)后，取5ml培養(yǎng)物離心收集菌落，用2mlPBS洗滌菌落2次，最終重懸于2mlPBS內(nèi)，經(jīng)研磨+超聲破壁后，取200ul懸浮液，加入50ul的5 X SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10分鐘，然后取20ul進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測(cè)豬尿酸氧化酶的表達(dá)情況。經(jīng) Swiss Institute of Bioinformatics 的在線軟件預(yù)測(cè)(http://web. expasy. org/compute_pi),本研究合成的重組豬尿酸氧化酶的分子量為35. 69kDa。圖7表明，UFO菌中有明顯的豬尿酸氧化酶的表達(dá)。
實(shí)施例5、重組乳酸桿菌的體外尿酸生產(chǎn)情況檢測(cè)
分別挑取新鮮生長(zhǎng)的UFO菌和36e菌單菌落，接種于IOml含有2 μ g/ml紅霉素的MRS 培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，8000rpm離心收集細(xì)菌，用PBS洗滌2次后，用添加有350 μ g/ml尿酸的 MRS液體培養(yǎng)基重新懸浮菌體。將兩種菌液準(zhǔn)確調(diào)制在600nm處的OD值為I. 0，并以此為母液，用添加有350 μ g/ml尿酸的MRS液體培養(yǎng)基做10倍和100倍稀釋。將不加菌液的MRS、 OD600=L O的原液和稀釋液每份3個(gè)重復(fù)，于40°C培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)，離心取上清，利用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司BS-800型生化分析儀測(cè)定上清中尿酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，轉(zhuǎn)入pUO的乳酸桿菌的尿酸產(chǎn)量明顯減少，三個(gè)組別菌與未轉(zhuǎn)pUO的乳酸菌均有顯著差異，尿酸產(chǎn)量最大降低了 39. 9%。值得注意的是，乳酸菌自身能夠產(chǎn)生較大量的尿酸，提示高尿酸血癥的病人不宜大量食用。
表3.轉(zhuǎn)尿酸酶乳酸菌的體外尿酸代謝分析單位μ mol/L
權(quán)利要求
1.一種低尿酸分泌量益生菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法包含如下步驟(1)構(gòu)建包含有尿酸酶基因開(kāi)放閱讀框的重組質(zhì)粒；(2)將(I)中所獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染益生菌，篩選獲得攜帶有該質(zhì)粒的重組菌株；(3)在(2)中所獲得的重組菌株中篩選獲得重組質(zhì)?？煞€(wěn)定存在、尿酸酶可持續(xù)表達(dá)并具有明顯尿酸分解活性的低尿酸分泌的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種低尿酸分泌量益生菌的制備方法，其特征在于，所述尿酸酶基因來(lái)自動(dòng)物、植物、微生物的天然基因組序列或cDNA序列，或根據(jù)受體菌的密碼子偏向性人工優(yōu)化設(shè)計(jì)合成的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的一種低尿酸分泌量益生菌的制備方法，其特征在于，所述尿酸酶基因來(lái)自動(dòng)物的天然基因組序列或cDNA序列，或根據(jù)受體菌的密碼子偏向性人工優(yōu)化設(shè)計(jì)合成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的一種低尿酸分泌量益生菌的制備方法，其特征在于，所述尿酸酶基因來(lái)自豬的天然基因組序列或cDNA序列，或根據(jù)受體菌的密碼子偏向性人工優(yōu)化設(shè)計(jì)合成的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種低尿酸分泌量益生菌的制備方法，其特征在于，所述益生菌為乳酸菌、雙歧桿菌、放線菌和酵母菌中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的一種低尿酸分泌量益生菌的制備方法，其特征在于，所述益生菌為乳酸菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種低尿酸分泌量益生菌的制備方法，其特征在于，所述尿酸酶基因開(kāi)放閱讀框包含有能夠指導(dǎo)尿酸酶編碼基因?qū)崿F(xiàn)組成性表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)的調(diào)控序列。
8.利用權(quán)利要求
I一7任一所述制備方法獲得的低尿酸分泌量益生菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的低尿酸分泌量益生菌，其特征在于，所述益生菌是基因工程干酪乳酸桿菌，所述基因工程干酪乳酸桿菌中含有一種組成型表達(dá)人工合成的豬尿酸酶編碼基因的表達(dá)框架，所述人工合成豬尿酸酶編碼基因置于pMG36e表達(dá)載體內(nèi)。
10.一種降低尿酸產(chǎn)量的口服微生物制劑，其特征在于，所述口服微生物制劑含有權(quán)利要求
8或9所述的低尿酸分泌量益生菌。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)基因工程方法制備的低尿酸分泌量益生菌及其制備方法，利用本發(fā)明方法可制備獲得尿酸分泌量明顯降低的改良益生菌，保留益生菌原有功效的同時(shí)，改善益生菌引起血液尿酸水平升高的不利影響。本發(fā)明還公開(kāi)了一種可顯著降低尿酸分泌量的干酪乳酸桿菌及一種降低尿酸產(chǎn)量的口服微生物制劑及其應(yīng)用，通過(guò)口服含有高表達(dá)重組尿酸酶的益生菌來(lái)降低血尿酸的方法，可為痛風(fēng)病人、高血尿酸癥患者以及潛在高血尿酸人群提供更好的福利。
文檔編號(hào)C12N1/19GKCN102586315SQ201210039297
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月21日
發(fā)明者劉思國(guó), 章澤人 申請(qǐng)人:劉思國(guó), 章澤人導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan