專利名稱：用于檢測患者血清中Gliadin抗體的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒及其制備方法。
在測試方法上，用于快速診斷的滴金法(dot immunogold filtration assayDIGFA)已廣泛應(yīng)用于人類免疫缺陷病(HIV)，抗乙型肝炎病毒核心抗原的抗體，C-反應(yīng)蛋白，早早孕及感染的診斷等疾病的檢測。在上述系列臨床測試中全部用膠體金為標(biāo)記物進(jìn)行目視觀察。無論以膠體金標(biāo)記抗原還是標(biāo)記抗體都存在一個(gè)成本價(jià)格昂貴的特點(diǎn)。
步入90年代，隨著HIV疾病在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)不同程度的蔓延，引起了世界衛(wèi)生組織及各國的衛(wèi)生部門及醫(yī)療機(jī)構(gòu)對該病的防治進(jìn)行了大量全方位的研究，并發(fā)現(xiàn)由于HIV病毒對患者免疫功能的損壞，在受到HIV病毒感染的人中，當(dāng)T-細(xì)胞再次受到外源蛋白刺激時(shí)，許多T-細(xì)胞甚至包括沒有受到感染的T-細(xì)胞都不是按正常方式發(fā)生細(xì)胞分裂，而是發(fā)生細(xì)胞自殺，即出現(xiàn)由遺傳控制的功能所發(fā)生的稱為程序性細(xì)胞自殺，故此，該技術(shù)可能對于愛滋病患者病情的發(fā)展及跟蹤治療提供一絲幫助。同時(shí)該技術(shù)對于研究和檢測皰疹性皮膚病患者Gliadin受體是個(gè)極為有利的工具。
本發(fā)明的目的是提供一種檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒及其制備方法，該試劑盒容易制備，利用該試劑盒可以快速檢測。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案這種用于檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒包括(1)載體濾膜其孔徑0.22-1.20um，(2)標(biāo)記抗原抗原濃度E1cm1％280nm為15-5，標(biāo)記物濃度為0.01％-2.00％(V/V)，標(biāo)記物為亮綠或快綠，抗原與標(biāo)記物的用量比為1-10∶10-1(V/V)，(3)質(zhì)控血清其特異蛋白總量總Ig為2-10mg/ml。
本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)標(biāo)記抗原抗原濃度E1cm1％280nm為15-5，采用亮綠或快綠為標(biāo)記物，其濃度為0.01％-2.00％(V/V)，抗原與標(biāo)記物的用量比為1-10∶10-1(V/V)，按照上述配比，逐滴混合，室溫靜置半小時(shí)后，于顯微鏡下觀察有大量藍(lán)綠色囊泡出現(xiàn)，表示標(biāo)記完成，
(2)質(zhì)控血清的制備取市售SIGMA公司G3375 Gliadin作為免疫青紫藍(lán)兔的抗原，采用常規(guī)手段，免疫；抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分離與制備；測定抗血清中蛋白含量的測定。
在本發(fā)明專利中利用了抗原可呈現(xiàn)的特殊形態(tài)特征即可以在特定條件下抗原能夠以出現(xiàn)囊泡形態(tài)的特征，并能利用該特征包裹可做為標(biāo)記物的染料的技術(shù)進(jìn)行抗原標(biāo)記，亮綠，快綠就是本方法中標(biāo)記抗原的染料。用該標(biāo)記抗原在載體濾膜上對人血清和免疫兔血清中抗Gliadin抗體進(jìn)行定性測定獲得了與酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)中的有類同的定性數(shù)據(jù)。故用綠色染料標(biāo)記抗原進(jìn)行滴滲并用于臨床快速診斷的技術(shù)是個(gè)創(chuàng)新。
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1．質(zhì)控血清的制備1、免疫取市售SIGMA公司G3375 Gliadin作為免疫青紫藍(lán)兔的抗原，采用常規(guī)手段，分四次進(jìn)行免疫。整個(gè)免疫過程在無菌條件下進(jìn)行。在免疫前首先將抗原配制成1mg/ml的溶液備用。
第一次免疫取抗原3ml，逐滴加入等體積的完全佐劑，在加佐劑過程中不斷研磨，使成乳濁液，分次注入消毒后的兔腳墊中，每只腳墊0.4-4.5ml。
第二次免疫抗原乳濁液的制備方法同上，只不過采用不完全佐劑(即不含卡介苗)，制備體積亦為6ml，兔免疫部位為背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.4-0.5ml。
第三次免疫完全同第二次免疫。
第四次免疫取無菌的抗原溶液1ml，慢速注入兔耳緣靜脈中，每只耳朵注射量為0.5-0.7ml。每次免疫的間隔均為5-7天，經(jīng)過近一月的免疫后，從兔的耳部取少量血進(jìn)行效價(jià)測定。
2、抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分離與制備——PAGE法<1>血清處理血清10％甘油=1∶1(v/v)<2>電極緩沖液Tris-Gly,pH 8.3<3>膠濃度濃縮膠5％，分離膠12％<4>電泳條件溫度15-20oC，恒流20mA，電泳4-5小時(shí)<5>分離提取γ-球蛋白采用橫向切膠法。連續(xù)切膠，每條膠長2mm；并分別立即浸泡于0.9％的生理鹽水中，4oC提取48小時(shí)。
<6>電泳條帶掃描在分離提取γ-球蛋白的同時(shí)，進(jìn)行縱向切膠并對蛋白條帶染色及脫色，然后作條帶掃描，以確定活性部位的位置。
3、抗血清中蛋白含量的測定(1)在紫外區(qū)波長280nm下測定抗血清的總蛋白含量。
(2)根據(jù)免疫活性測定的結(jié)果和電泳條帶掃描圖譜確定電泳條帶中γ-球蛋白的位置，計(jì)算γ-球蛋白的含量。本質(zhì)控血清的特異蛋白總量，總Ig為2-10mg/ml。
上述免疫活性測定采用酶聯(lián)免疫吸附法<1>抗原包被量10-50μg/孔<2>第一抗體為系列稀釋的抗血清<3>第二抗體為羊抗兔酶標(biāo)抗體<4>底物TMB<5>反應(yīng)產(chǎn)物測定波長450nmIg類型的檢測采用直接法，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)即將正常人或病人血清直接鋪板，再用酶標(biāo)羊抗人IgG或羊抗人IgA及酶的底物按常規(guī)比例進(jìn)行檢測。
本實(shí)施例用是的酶標(biāo)抗體為辣根酶標(biāo)記，底物為TMB，酶促反應(yīng)產(chǎn)物檢測使用酶標(biāo)儀，波長為450nm。
抗原的標(biāo)記免疫用的抗原制成E1cm1％280nm為15-5的濃度與O.01％-2.00％(V/V)的亮綠按1-10∶10-1的比例逐滴混合，室溫靜置半小時(shí)后，于顯微鏡下觀察有大量的藍(lán)綠色囊泡出現(xiàn)，便意味著完成制備標(biāo)記抗原。
滴綠法檢測人血清抗Gliadin IgG抗體首先滴15μl病人血清在給定的濾膜上，再滴上15μl試劑盒中標(biāo)記抗原，(本測定中，標(biāo)記抗原的抗原濃度為E1cm1％280nm為10，亮綠濃度0.1(V/V)，兩者比例為1∶1，本實(shí)用新型采用的磷酸緩沖液為0.01mol/L,pH為7.6)反應(yīng)完畢(待液體完全滲入膜后)，立即觀察到濾膜上標(biāo)記抗原的外圍沉淀圈與內(nèi)部(蘭綠色實(shí)心或雜斑)之間有空白間隔，其中空白間隔極明顯者定為陽性，空白間隔僅可分辯者定為±，不可分辯者定為陰性(見

圖1)，表1系濾膜片法(本發(fā)明)與酶聯(lián)免疫法結(jié)果對照比較測試樣品\ 測試結(jié)果＼方法 酶聯(lián)免疫法O,D450nm;濾膜片法**正常血清(N)*0.37 有可辯白環(huán)±稀釋100倍正常人血清(N100) 0.12 無白環(huán)-稀釋20倍免疫兔血清(IR20)1.11 有明顯白環(huán)+(N)*用14人正常人血清測試結(jié)果
**濾膜法見圖1圖1中，左圖為陽性，在蘭綠色斑外有白環(huán)，中圖為±性，在蘭綠色斑外有不明顯的白環(huán)；右圖為陰性，在蘭綠色斑無白環(huán)。
檢測范圍血清總蛋白47×103mg/L-58×103mg/L血清球蛋白<1.4×103mg/L--->2.0×103mg/L本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的試劑盒制作簡便，測定快速。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒，其特征在于它包括(1)載體濾膜其孔徑0.22-1.20um，(2)標(biāo)記抗原抗原濃度E1cm1％280nm為15-5，標(biāo)記物濃度為0.01％-2.00％(V/V)，標(biāo)記物為亮綠或快綠，抗原與標(biāo)記物的用量比為1-10∶10-1(V/V)，(3)質(zhì)控血清其特異蛋白總量總Ig為2-10mg/ml。
2.一種制備權(quán)利要求1所述試制盒的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)標(biāo)記抗原抗原濃度E1cm1％280nm為15-5，采用亮綠或快綠為標(biāo)記物，其濃度為0.01％-2.00％(V/V)，抗原與標(biāo)記物的用量比為1-10∶10-1V/V)，按照上述配比，逐滴混合，室溫靜置半小時(shí)后，于顯微鏡下觀察有大量藍(lán)綠色囊泡出現(xiàn)，表示標(biāo)記完成，(2)質(zhì)控血清的制備取市售SIGMA公司G3375 Gliadin作為免疫青紫藍(lán)兔的抗原，采用常規(guī)手段，免疫；抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分離與制備；測定抗血清中蛋白含量的測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備試劑盒的方法，其特征在于所述抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分離與制備，采用PAGE法<1>血清處理血清10％甘油=1∶1(V/V)<2>電極緩沖液Tris-Gly,pH 8.3<3>膠濃度濃縮膠5％，分離膠12％<4>電泳條件溫度15-20℃，恒流20mA，電泳4-5小時(shí)<5>分離提取γ-球蛋白采用橫向切膠法。連續(xù)切膠，每條膠長2mm；并分別立即浸泡于0.9％的生理鹽水中，4℃提取48小時(shí)。<6>電泳條帶掃描在分離提取γ-球蛋白的同時(shí)，進(jìn)行縱向切膠并對蛋白條帶染色及脫色，然后作條帶掃描；抗血清中蛋白含量的測定<1>在紫外區(qū)波長280nm下測定抗血清的總蛋白含量。<2>根據(jù)免疫活性測定的結(jié)果和電泳條帶掃描圖譜確定電泳條帶中γ-球蛋白的位置，計(jì)算γ-球蛋白的含量，本實(shí)驗(yàn)控制特異蛋白總量，總Ig為2-10mg/ml。
全文摘要
一種用于檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒及其制備方法,試劑盒包括:(1)載體濾膜:其孔徑:0.22－1.20um,(2)標(biāo)記抗原:抗原濃度E
文檔編號(hào)G01N33/531GK1304042SQ00100250
公開日2001年7月18日 申請日期2000年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月11日
發(fā)明者王素云 申請人:吳光耀