專利名稱：一種基因芯片逆轉(zhuǎn)錄探針標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因芯片技術(shù)，尤其涉及一種基因芯片逆轉(zhuǎn)錄探針標(biāo)記的方法。
基因芯片是九十年代發(fā)展起來的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，20世紀(jì)人類最宏偉的計(jì)劃之一—人類基因組計(jì)劃預(yù)計(jì)將提前至2003年完成，屆時(shí)人類將完成25種染色體(22種常染色體，2種性染色體和1種線粒體染色體)共計(jì)30億對(duì)堿基的序列測(cè)定，以及小鼠、果蠅、線蟲等模式生物的全基因組序列的測(cè)定。人類基因組計(jì)劃將由此進(jìn)入后基因組時(shí)代，研究的重點(diǎn)將由發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)向發(fā)現(xiàn)基因的功能。人們將逐步闡明從基因到蛋白再到生命現(xiàn)象這一過程的奧秘。如何大規(guī)模研究人類約10萬條基因的功能，特別是基因相互作用和調(diào)控關(guān)系，迫切需要一種新的方法能以大規(guī)模、高通量的方式進(jìn)行成千上萬個(gè)基因在各種生理狀態(tài)下表達(dá)狀況的研究。傳統(tǒng)的Northern blot雜交或點(diǎn)雜交方法，以及以電泳為基礎(chǔ)的基因表達(dá)、序列測(cè)定、突變和多態(tài)性分析等研究方法顯然不能適應(yīng)上述的要求。基因芯片技術(shù)由此應(yīng)運(yùn)而生。將大量的靶基因片段有序地、高密度地(點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離一般小于500μm)排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片，也叫基因微矩陣(Microarray)?；蛐酒梢杂脽晒鈾z測(cè)和計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較和分析，以達(dá)到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因芯片的概念可追溯到southern blot雜交技術(shù)，即DNA-DNA之間通過堿基配對(duì)機(jī)制形成互補(bǔ)鏈。隨后又發(fā)展出northern blot雜交和點(diǎn)雜交技術(shù)。這三種技術(shù)都是將核酸樣品固定在濾膜上，樣品容易擴(kuò)散，因此在單位面積上點(diǎn)樣的密度受到限制，無法進(jìn)行大規(guī)模、高通量的DNA雜交。同時(shí)，由于濾膜面積較大而需較多探針量，檢測(cè)靈敏度較低。為了提高點(diǎn)樣密度和檢測(cè)靈敏度，降低探針用量，以玻璃、硅等材料為載體的基因芯片技術(shù)逐步得到了發(fā)展。
美國affymetrix公司于二十世紀(jì)八十年代末至90年代初，率先開展了這方面的研究(Fodor,S.P.A.et al.(1991)Science 251,767-773.)。1992年，該公司運(yùn)用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，誕生了世界上第一塊基因芯片(Southern,E.,Maskos,U.&Elder,R.(1992)Genomics 13,1008-1017.)。同時(shí)，探針的熒光標(biāo)記，激光共聚焦掃描(U.S Patent5981965)和計(jì)算機(jī)分析(U.S Patent 5974164)等技術(shù)也隨之發(fā)展。1995年，第一塊以玻璃為載體的基因芯片(微矩陣)在美國Stanford大學(xué)誕生(Schena,M.等(1995)Science.270.(20):467-480.)，這標(biāo)志著基因芯片技術(shù)步入了廣泛研究和應(yīng)用的時(shí)期。
原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等優(yōu)點(diǎn)，適用于DNA序列測(cè)定、SNP分析等。但其缺點(diǎn)是合成寡聚核苷酸長(zhǎng)度有限，因而基因特異性差，而且隨長(zhǎng)度的增加合成錯(cuò)誤率隨之增高，作為基因表達(dá)譜研究遠(yuǎn)不如cDNA芯片。cDNA芯片是將微量cDNA片段在玻璃等載體上按矩陣密集排列并固化，也叫微矩陣(Microarray)(DeRisi,J.等(1997)Science 278,680-686.)?；螯c(diǎn)樣密度雖不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用傳統(tǒng)載體，如混合纖維素濾膜或尼龍膜的點(diǎn)樣密度要高得多，可達(dá)到每張載玻片4萬個(gè)基因。而cDNA芯片最大的優(yōu)點(diǎn)是靶基因檢測(cè)特異性非常好，用作表達(dá)譜研究結(jié)果可靠。目前許多國家實(shí)驗(yàn)室和大制藥公司都用此類芯片(Baldwin,D等(1999)Curr OpinPlant Biol 2(2):96-103.)。
有鑒于基因芯片具有高通量、高信息量、快速、樣品用量少、造價(jià)低、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)，目前世界上許多國家和地區(qū)都已著手進(jìn)行基因芯片的研制和開發(fā)工作。美國政府于1998年正式啟動(dòng)基因芯片計(jì)劃，NIH、能源部、商業(yè)部、司法部、國防部、中央情報(bào)局等均參與了此項(xiàng)目。同時(shí)斯坦福大學(xué)、麻省理工學(xué)院及部分國立實(shí)驗(yàn)室如Argonne,Oakridge也參與了該項(xiàng)目的研究和開發(fā)。英國劍橋大學(xué)、歐亞公司也正在從事該領(lǐng)域的研究。世界大型制藥公司尤其對(duì)基因芯片技術(shù)用于基因多態(tài)性、疾病相關(guān)性、基因藥物開發(fā)和合成或天然藥物篩選等領(lǐng)域感興趣，都已建立了或正在建立自己的芯片設(shè)備和技術(shù)。
在基因芯片技術(shù)中，探針標(biāo)記是指通過PCR或逆轉(zhuǎn)錄的方法等，摻入經(jīng)過熒光基團(tuán)修飾的堿基(如dCTP、dUTP)，形成帶有熒光標(biāo)記的DNA探針。這是基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)的重要步驟。雜交檢測(cè)的結(jié)果通過熒光信號(hào)來表示，所以探針標(biāo)記的好壞直接影響到雜交信號(hào)的強(qiáng)弱。而逆轉(zhuǎn)錄的方法標(biāo)記探針是目前表達(dá)譜芯片(cDNA芯片)制備中最好的標(biāo)記方法。
現(xiàn)有的關(guān)逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)主要有以下幾種1、逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記過程中，以從組織中提取的5μg mRNA作模板，在50μl體系中含有1Xbuffer,SuperScriptⅡ酶200U＞=2μl,dNTP終濃度500μM dA,G,C；200μM dTTP；100μM cy3,cy5-dUTP；0.05μg/μL Oligo dT；即Cy3-dUTP(Cy5-dUTP)的用量=5μl,Cy3-dUTP∶dTTP=1∶2(DR.Joseph,Nature genetics,14,457-460,)。2、逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記過程中，以從組織中提取的mRNA作模板，加入5*buffer,SuperScriptⅡ酶(200U)＞=2ul,dNTP終濃度500μM dA,G,C；40μM dTTP；40μM cy3,cy5-dUTP；0.05μg/μL Oligo dT；即Cy3-dUTP(Cy5-dUTP)的用量=2μl,Cy3(Cy5)-dUTP∶dTTP=1∶1。(Schena,M.,Science.270.(20):467-480)3．逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記過程中，以從組織中提取的2μg mRNA作模板，在30μl體系中含有1Xbuffer,SuperScriptⅡ酶200U=4μl,dNTP終濃度500μM dA,G,C；300μM dTTP；100μM cy3,cy5-dUTP；0.13μg/uL Oligo dT；即Cy3-dUTP(Cy5-dUTP)的用量=5μl,Cy3(Cy5)-dUTP∶dTTP=1∶3?？偨Y(jié)目前的方法如下mRNA作模板2-5μgdA,G,C終濃度500μMdTTP終濃度40-30000μMCy3-dUTP(Cy5-dUTP)(1mM,Amsham)終濃度40-100μM，用量2-5μl(即dTTP的總濃度大于80μM)。Cy3(Cy5)-dUTP∶dTTP=1∶1-3。Oligo dT:0.05-0.13μg/μL上述方法一般存在成本較高，標(biāo)記效率不高的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的在于公開尋找一種高效率，低成本的能增強(qiáng)雜交信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄探針標(biāo)記方法。
發(fā)明的構(gòu)思是這樣的在標(biāo)記過程中，一般要加入一定量的dNTP和cy3,cy5-dUTP(或cy3,cy5-dCTP),以確保反應(yīng)的進(jìn)行。其中，dNTP的作用是保證DNA鏈的延伸，以形成更多量的探針。cy3,cy5-dUTP(或cy3,cy5-dCTP)的作用是保證熒光基團(tuán)修飾堿基的滲入，以形成更多標(biāo)記探針。可見，dTTP和cy3,cy5-dUTP的濃度和比例(或dCTP和cy3,cy5-dCTP的濃度和比例)均是影響標(biāo)記效率的因素，直接和標(biāo)記效率有關(guān)。因此，要設(shè)計(jì)出高效率低用量的探針標(biāo)記法，就必須解決兩方面的矛盾其一，是dNTP終濃度和成本間的矛盾。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，dNTP終濃度達(dá)到飽和時(shí)，標(biāo)記效率不再增加，因而，再增加dNTP終濃度，對(duì)提高標(biāo)記效率作用不大，結(jié)果只會(huì)造成成本的浪費(fèi)。其二，是標(biāo)記效率和dTTP∶cy3,cy5-dUTP(或dCTP∶cy3,cy5-dCTP)用量比間的矛盾。由于在反應(yīng)體系中保持dTTP和cy3,cy5-dUTP(或dCTP∶cy3,cy5-dCTP)的總量恒定，因此兩者在反應(yīng)體系中存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。dTTP用量越高，雖能得到更多的探針，但也影響了熒光基團(tuán)的滲入，使標(biāo)記效率降低；cy3,cy5-dUTP(或cy3,cy5-dCTP)用量越高，能形成更多標(biāo)記探針，但熒光基團(tuán)的滲入也增大了反應(yīng)分子間的空間位阻，進(jìn)一步抑制了DNA鏈的延伸和酶的作用，降低了標(biāo)記效率。所以，在反應(yīng)體系中要維持適當(dāng)?shù)膁TTP∶cy3,cy5-dUTP(或dCTP∶cy3,cy5-dCTP)用量比，對(duì)提高標(biāo)記效率尤為重要。
為克服普通的標(biāo)記方法通常碰到雜交信號(hào)弱的缺點(diǎn)，可通過以下方法增強(qiáng)雜交信號(hào)1、引入oligo-dT和隨機(jī)引物共同逆轉(zhuǎn)錄有關(guān)文獻(xiàn)記載，在核酸鏈合成過程中，一般所用的引物在合成中的位置是固定的，因而只能引導(dǎo)核酸鏈5’端約400-1000bp的合成，很難保證完整核酸鏈的合成。而經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，若引入oligo-dT和隨機(jī)引物，由于oligo-dT和隨機(jī)引物是一種無固定位置的引物，所以在鏈的合成反應(yīng)中，可在鏈的任何位置開始引導(dǎo)合成小片段，將兩種引物同時(shí)引入反應(yīng)，可以提高標(biāo)記效率。按這種構(gòu)思實(shí)施，可以得到更多的探針，結(jié)果可以使標(biāo)記效率提高1倍左右。2、dNTP最佳濃度的確定一般認(rèn)為，dNTP終濃度越高，標(biāo)記效率也越高。所以，在標(biāo)記過程中均采用過飽和濃度的dNTP。但研究發(fā)現(xiàn)，dNTP終濃度達(dá)到飽和時(shí)，標(biāo)記效率不再增加，因而，再增加dNTP終濃度，對(duì)提高標(biāo)記效率作用不大，結(jié)果只會(huì)造成成本的浪費(fèi)。進(jìn)一步的對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示，dNTP的終濃度達(dá)到20uM時(shí)，dNTP達(dá)到飽和，所以發(fā)現(xiàn)dNTP的終濃度為20μM左右是它的最佳濃度。這是相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道過的最低dNTP的終濃度。3、不帶熒光標(biāo)記的核苷酸與帶熒光標(biāo)記的核苷酸的用量比經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)體系中dNTP的總濃度恒定，因此不帶熒光標(biāo)記的核苷酸用量越高，雖能得到更多的探針，但也影響了熒光基團(tuán)的滲入，使標(biāo)記效率降低；帶熒光標(biāo)記的核苷酸用量越高，能形成更多標(biāo)記探針，但熒光基團(tuán)的滲入也增大了反應(yīng)分子間的空間位阻，進(jìn)一步抑制了DNA鏈的延伸和酶的作用，降低了標(biāo)記效率。所以，構(gòu)想可以尋找不帶熒光標(biāo)記的核苷酸與帶熒光標(biāo)記的核苷酸的最佳用量比，并在反應(yīng)體系中維持這種適當(dāng)?shù)挠昧勘?，既可提高?biāo)記效率，又可得到更多的探針。大量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯示，不帶熒光標(biāo)記的核苷酸與帶熒光標(biāo)記的核苷酸的用量比為1∶1時(shí)，標(biāo)記效率最高。這是相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道過的最低用量比。4、SuperScriptⅡ酶(200U)的用量一般文獻(xiàn)報(bào)道的SuperScriptⅡ酶(200U)用量為SuperScriptⅡ酶(200U)≥2ul?？墒沁@樣一來，酶肯定是過量的，因而造成了酶的浪費(fèi)。構(gòu)想確定酶的最佳用量，在反應(yīng)正常進(jìn)行的條件下進(jìn)一步節(jié)約成本。通過一系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SuperScriptⅡ酶(200U)用量只須200U/50uL，反轉(zhuǎn)錄效率就達(dá)最高，再提高SuperScriptⅡ酶的用量反而使產(chǎn)量降低。這樣，按反應(yīng)體系需要使用一定量的酶，就減少了酶的不必要浪費(fèi)。
本發(fā)明亦是這樣實(shí)現(xiàn)的經(jīng)過大量對(duì)比實(shí)驗(yàn)，得出了很有價(jià)值的結(jié)果。結(jié)果如下1、不帶熒光標(biāo)記的核苷酸與帶熒光標(biāo)記的核苷酸與用量比為1∶1時(shí)，標(biāo)記效率最高；二者總濃度達(dá)到20uM時(shí)，dNTP達(dá)到飽和。2、同時(shí)使用隨機(jī)引物和Oligo dT(二者的比值為0.25-2)的方法，可以使標(biāo)記效率提高1倍左右。3、SuperScriptⅡ酶的用量為200U/50uL時(shí)，反轉(zhuǎn)錄效率最高，提高SuperScriptⅡ酶的用量反而使產(chǎn)量降低。
因此，我們公開的高效率，低成本的能增強(qiáng)雜交信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄探針標(biāo)記方法，其具體的制備方法為在逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記過程中，以2-5ug mRNA作模板，分別加入以下物質(zhì)5Xbuffer(Gibco公司)，終濃度為1 XbufferSuperscriptⅡ(200U/μl)反轉(zhuǎn)錄酶為1-2ul,隨機(jī)引物和Oligo和dT混合物(比例為0.25-2)；dNTP終濃度500uM dA,G,C；20uM dTTP，熒光標(biāo)記dUTP 20uM(或500uM dA,G,T；20uM dCTP,20uM熒光標(biāo)記dCTP)；用水稀釋至所需體積。
以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的有關(guān)細(xì)節(jié)作進(jìn)一步的闡述，但實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，有關(guān)的技術(shù)人員完全可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和所公開的技術(shù)方案，舉一反三地應(yīng)用于基因芯片逆轉(zhuǎn)錄探針的制備，這也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1 cDNA芯片的探針制備于一已滅菌的1.5ml eppendorf管內(nèi)依次加入以下試劑ddH2O(Rnase-free)23μl500ng/μl oligo(dT)183μl500ng/μl 6堿基隨機(jī)引物 3μl1μg/μl mRNA3μl置于70℃水浴10min。取出后，迅速置于冰上冷卻。
向該eppendorf管內(nèi)分別加入以下試劑5×first strand buffer10μl0.1mol/L DTT 5μl
各10mmol/L dATP-dGTP-dCTP混合物2μl1mmol/L Cy3-dUTP 1μl1mmol/L dTTP 1μl置于42℃水浴2min。
向eppendorf管內(nèi)加入1.5μl SuperscriptⅡ(200U/μl)反轉(zhuǎn)錄酶，混勻樣品，5000rpm離心10秒。將eppendorf管置于42℃水浴1小時(shí)。
通過說明書所公開的技術(shù)方案和實(shí)施例表明，本發(fā)明與現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)①節(jié)約熒光標(biāo)記核苷酸和的用量，節(jié)約成本；②節(jié)約了SuperScriptⅡ酶的用量。③使用Oligo dT和隨機(jī)引物混合引物，標(biāo)記效率提高1倍左右。④增強(qiáng)了雜交信號(hào)約3倍左右。
權(quán)利要求
1.一種基因芯片逆轉(zhuǎn)錄探針標(biāo)記的方法，其中使用的試劑包括反轉(zhuǎn)錄酶、堿基隨機(jī)引物、Oligo dT混合物、不帶熒光標(biāo)記的核苷酸以及帶熒光標(biāo)記的核苷酸，其特征在于至少有一種所述試劑的用量是選用以下所列的優(yōu)選數(shù)值范圍(1)不帶熒光標(biāo)記的核苷酸與帶熒光標(biāo)記的核苷酸與用量比范圍為1∶1-1∶1.5,二者總濃度為20-80μM；(2)同時(shí)使用堿基隨機(jī)引物和Oligo dT，二者的比值范圍為0.25-2；(3)SuperScriptⅡ酶的用量范圍為150U/50μL-250U/50μL；
2.如權(quán)利要求1所述的基因芯片逆轉(zhuǎn)錄探針標(biāo)記的方法，其特征在于，反應(yīng)中，不帶熒光標(biāo)記的核苷酸與帶熒光標(biāo)記的核苷酸與用量比為1∶1，二者總濃度為20μM。
3.如權(quán)利要求1所述的基因芯片逆轉(zhuǎn)錄探針標(biāo)記的方法，其特征在于，同時(shí)使用的6堿基隨機(jī)引物和Oligo dT二者的濃度比值為1∶1。
4.如權(quán)利要求1所述的基因芯片逆轉(zhuǎn)錄探針標(biāo)記的方法，其特征在于，SuperScriptⅡ酶的用量為200U/50uL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基因芯片逆轉(zhuǎn)錄探針標(biāo)記方法,該方法提供了反轉(zhuǎn)錄酶、堿基隨機(jī)引物、Oligo dT混合物、不帶熒光標(biāo)記的核苷酸以及帶熒光標(biāo)記的核苷酸等試劑的優(yōu)選的用量范圍,其優(yōu)點(diǎn)是①節(jié)約熒光標(biāo)記核苷酸和的用量,節(jié)約成本;②節(jié)約了SuperScriptⅡ酶(200U)的用量。③使用O1igo dT和6堿基隨機(jī)引物,標(biāo)記效率提高1倍左右。④增強(qiáng)了雜交信號(hào)約3倍左右。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1314594SQ00115000
公開日2001年9月26日 申請(qǐng)日期2000年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月20日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅, 李瑤 申請(qǐng)人:上海博道基因開發(fā)有限公司