專利名稱：外周血中肝細(xì)胞的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到有關(guān)臨床肝癌診斷中采用的檢測(cè)方法，尤其是關(guān)于外周血中肝細(xì)胞的檢測(cè)新方法。
肝癌是遍及全球的死亡率高的癌癥之一。盡管目前對(duì)肝癌相關(guān)的一些病理學(xué)因素有了較好的認(rèn)識(shí)，但引起肝癌的分子機(jī)理仍不清楚。肝膽切除術(shù)僅是肝癌形成期的有效治療，而不適合于肝外轉(zhuǎn)移的肝癌患者。外周惡性細(xì)胞的檢測(cè)對(duì)證明癌微小的轉(zhuǎn)移、設(shè)計(jì)治療策略、估價(jià)治療效果和預(yù)見外科手術(shù)后復(fù)發(fā)的可能性很有幫助(AkriviadisEA.et al.，Br J Surg 1998；1319-1331)。
α-白蛋白(ALF)與肝癌的一種廣泛應(yīng)用的診斷指標(biāo)α-甲胎蛋白(AFP)具有高度同源性，但它與肝癌的關(guān)系仍沒有報(bào)道。白蛋白基因家族由四個(gè)基因編碼的白蛋白、ALF、AFP和維生素D粘合蛋白組成，它們連續(xù)排列在4號(hào)染色體短臂亞著絲粒位點(diǎn)(Lichenstein HS.et al.，J Biol Chem1994；26918149-18154.；Nishio H.Et al.，J Mol Biol 1996；259113-119)。在這些蛋白基因中，AFP選擇性地在胎兒的肝中表達(dá)，而ALF和維生素D粘合蛋白的表達(dá)限制于新生兒和成人的肝中。然而，在60-70％的肝癌細(xì)胞中AFP表達(dá)出現(xiàn)再活化，且刺激肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)是AFP的生物學(xué)功能之一。由于AFP基因的異常表達(dá)是肝癌患者的主要特征之一，所以血清AFP被作為肝癌的一種診斷指標(biāo)。從肝癌原發(fā)灶釋放的外周血肝癌細(xì)胞通常用來檢測(cè)肝癌患者不同時(shí)期的肝外轉(zhuǎn)移。盡管外周血中，AFP信使RNA(mRNA)表達(dá)通常作為血源性脫落的肝癌細(xì)胞的一種指標(biāo)，但在肝硬化患者檢測(cè)中AFP mRNA表達(dá)的假陽(yáng)性結(jié)果占相對(duì)高的百分比(達(dá)30％)(Funaki NO.Et al.，Life Sci 1998；621973-1984.；Matsumura M.et al.，hepatology 1994；201418-1425)。
AFP被廣泛地研究，但ALF和肝癌的關(guān)系已知的很少。AFP mRNA表達(dá)作為血源性脫落的肝細(xì)胞的一種指標(biāo)檢測(cè)靈敏度不高，而白蛋白mRNA在正常人外周血中也表達(dá)，因而沒有特異性(Muller C.Hepatology1997；25(4)896-9.)。因此，研究ALF mRNA表達(dá)與肝臟疾病之間的關(guān)系是一個(gè)新的課題。
為此，本發(fā)明的目的是提供一種外周血中肝細(xì)胞檢測(cè)的新方法，作為檢測(cè)肝癌的一個(gè)輔助手段。通過檢測(cè)外周血中肝細(xì)胞ALF mRNA表達(dá)和AFPmRNA表達(dá)，區(qū)別正常肝細(xì)胞和惡性肝細(xì)胞，從而為臨床診斷肝臟疾病提供更可靠、有力的證據(jù)，降低肝硬化所造成的假陽(yáng)性結(jié)果，以利于臨床診斷治療肝癌。
本發(fā)明一種外周血中肝細(xì)胞檢測(cè)的新方法是采用外周血取樣、巢式PCR技術(shù)，檢測(cè)外周血中肝細(xì)胞ALF mRNA表達(dá)，結(jié)合檢測(cè)外周血中肝細(xì)胞AFPmRNA表達(dá)，從而提供一種外周血中肝細(xì)胞檢測(cè)的新指標(biāo)，它包括以下步驟1.外周血取樣，RNA提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA從肝癌患者取外周血樣品，肝素化。對(duì)照的外周血樣品從正常人身上獲得。血樣立即用于RNA提取。然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入RNA，隨機(jī)引物，核糖核酸酶抑制劑，dNTPs，反轉(zhuǎn)錄緩沖液及反轉(zhuǎn)錄酶，使mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
2.外周血肝細(xì)胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR擴(kuò)增外周血肝細(xì)胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR擴(kuò)增按下列兩引物進(jìn)行，ALF的PCR引物用GGTTTCTACAAAGATGAAACTAC和CATTTCTCTTCGGGATCCAG作外引物，用TGAAACTACTAAAACTTACAGG和GCAGAAATCCCACATCAGATT作內(nèi)引物。AFP的PCR引物用CTGCAAACTGACCACGCTG和TGCTTGGCTCTCCTGGATG作外引物，用GGTCAATGTATAATTCATGCAG和ATTTCTGTAATTCTTCTTCTCC作內(nèi)引物。
3、PCR產(chǎn)物分別于2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，正常人外周血中ALF mRNA和AFP mRNA都不表達(dá)；肝癌患者AFP mRNA檢出率為93％，ALF mRNA檢出率為10％。因而可以把外周血中ALF mRNA表達(dá)作為檢測(cè)肝癌的一個(gè)輔助指標(biāo)。即外周血中ALF mRNA和AFP mRNA的陰性結(jié)果作為良性肝細(xì)胞的指標(biāo)，AFPmRNA的陽(yáng)性結(jié)果而ALF mRNA的陰性結(jié)果作為惡性肝細(xì)胞的指標(biāo)。
因此，檢測(cè)個(gè)別患者外周血中肝細(xì)胞時(shí)通過下列步驟進(jìn)行外周血取樣，提取RNA及反轉(zhuǎn)錄成cDNA；外周血肝細(xì)胞中ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR，PCR產(chǎn)物的凝膠電泳分析。然后，根據(jù)結(jié)果及其它臨床資料對(duì)患者作出比較準(zhǔn)確的診斷。圖1、圖2所示是實(shí)施例3對(duì)肝癌患者進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，由圖1、圖2可以看出，正常人外周血中ALF mRNA和AFP mRNA都不表達(dá)；肝癌患者ALF mRNA不表達(dá)，AFP mRNA表達(dá)。
本發(fā)明外周血中肝細(xì)胞的檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是采用巢式PCR這一實(shí)驗(yàn)室常用的技術(shù)，檢測(cè)外周血中肝細(xì)胞ALF mRNA表達(dá)，結(jié)合AFP mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)肝癌作出初步診斷。對(duì)證明癌微小的轉(zhuǎn)移、設(shè)計(jì)治療策略、估價(jià)治療效果和預(yù)見外科手術(shù)后復(fù)發(fā)的可能性很有幫助。此方法簡(jiǎn)便，并能將肝硬化在肝癌檢測(cè)中所造成的高假陽(yáng)性率30％降低到10％。


圖1是肝細(xì)胞ALF cDNA的巢式PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)圖M—肝組織細(xì)胞N—正常人外周血HCC—肝癌患者外周血圖2是肝細(xì)胞AFP cDNA的巢式PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)圖M—肝組織細(xì)胞 N—正常人外周血HCC—肝癌患者外周血本發(fā)明通過以下的實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1外周血取樣，RNA提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA從上海東方肝膽醫(yī)院的30個(gè)肝外轉(zhuǎn)移性肝癌患者(肝癌診斷由探針肝活性組織學(xué)檢查確定，20男，10女)各取5ml外周血樣品肝素化，用于作ALFmRNA和AFP mRNA表達(dá)測(cè)定。對(duì)照的外周血樣品從20個(gè)正常人(12男，8女)身上獲得，血樣立即用于RNA提取。取5ml肝素抗凝血加入30ml NH4Cl-TRIS溶液混勻，室溫靜置20分鐘使紅細(xì)胞溶解，離心(5000RPM)5分鐘，收集沉淀白細(xì)胞，加入1ml TRIZOL試劑(購(gòu)自Boehringer mannheim公司)，用移液器將白細(xì)胞反復(fù)吹打徹底勻漿，室溫靜置5分鐘，加入200μl氯仿，混勻高速離心(12000g)兩分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)移至離心管，加入500μl異丙醇，振蕩混勻，室溫放置5分鐘。高速離心(12000g)5分鐘，小心棄上清液，室溫靜置約15分鐘使RNA恰好干燥，加水溶解。
然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，于20μl反應(yīng)體系中分別加入5μg mRNA，隨機(jī)引物(0.1ng/μl)1.0μl，核糖核酸酶抑制劑1.0μl(10U)，2mM dNTPs 2.0μl，5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液4.0μl，反轉(zhuǎn)錄酶1.0μl(10U)(這些均在一PCR試劑盒中，購(gòu)自GIBCO公司)，于37℃反應(yīng)一小時(shí)，使mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，95℃5分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶。
實(shí)施例2外周血中肝細(xì)胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR擴(kuò)增外周血中肝細(xì)胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR按下列兩引物進(jìn)行。ALF的引物按基因庫(kù)中增加數(shù)字L32140排序設(shè)計(jì)，用GGTTTCTACAAAGATGAAACTAC和CATTTCTCTTCGGGATCCAG作外引物，用TGAAACTACTAAAACTTTACAGG和GCAGAAATCCCACATCAGATT作內(nèi)引物。AFP的引物按基因庫(kù)中增加數(shù)字V01514排序設(shè)計(jì)，用CTGCAAACTGACCACGCTG和TGCTTGGCTCTCCTGGATG作外引物，用GGTCAATGTATAATTCATGCAG和ATTTCTGTAATTCTTCTTCTCC作內(nèi)引物。
ALF的PCR反應(yīng)第一步(94℃，5分鐘；94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，40秒；30個(gè)循環(huán)；72℃，2分鐘)在200ml容器中加入2μl cDNA液體，每種外引物10 pmol和2個(gè)單位的Taq DNA多聚酶(Life Technologies，Inc)于標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液(200umol/L dNTPs，1.5mmol/LMgCl2，10mmol/L Tris-HCl，PH8.3，50mmol/L KCl)中進(jìn)行。2ml第一步PCR產(chǎn)物和內(nèi)引物進(jìn)行第二步PCR反應(yīng)(94℃，5分鐘；94℃，40秒；58℃，40秒；72℃，30秒；30個(gè)循環(huán)；72℃，2分鐘)。AFP第一步擴(kuò)增(94℃，5分鐘；94℃，40秒；64℃，30秒；72℃，40秒；30個(gè)循環(huán)；72℃，2分鐘)，第二步擴(kuò)增94℃，5分鐘；94℃，30秒；60℃，1分鐘；72℃，30秒；30個(gè)循環(huán)；72℃，2分鐘)。PCR產(chǎn)物于2％葡聚糖凝膠上電泳。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，正常人外周血中未檢測(cè)到ALF mRNA和AFP mRNA；肝癌患者AFP mRNA檢出率為93％，ALF mRNA檢出率為10％。
實(shí)施例3肝癌患者外周血中肝細(xì)胞的檢測(cè)取肝癌患者外周血，肝素化，并提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA(方法同實(shí)施例1)，然后進(jìn)行外周血中肝細(xì)胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR擴(kuò)增(方法同實(shí)施例2)。結(jié)果見圖1及圖2，肝癌患者ALF mRNA不表達(dá)，AFP mRNA表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種外周血中肝細(xì)胞的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)外周血取樣，RNA提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA；(2)外周血肝細(xì)胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR擴(kuò)增；(3)PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳分析，外周血中ALF mRNA及AFP mRNA兩者陰性，結(jié)果作為良性肝細(xì)胞的指標(biāo)；AFP mRNA陽(yáng)性結(jié)果，而ALF mRNA陰性結(jié)果則作為惡性肝細(xì)胞的指標(biāo)。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述外周血肝細(xì)胞ALFcDNA的巢式PCR用的引物是GGTTTCTACAAAGATGAAACTAC和CATTTCTCTTCGGGATCCAG作外引物，TGAAACTACTAAAACTTACAGG和GCAGAAATCCCACATCAGATT作內(nèi)引物。
全文摘要
一種外周血中肝細(xì)胞的檢測(cè)方法,是臨床診斷肝癌的一個(gè)輔助手段。該方法步驟:首先是外周血取樣,提取RNA及反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增,再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析,從而檢出外周血中ALF mRNA及AFP mRNA的表達(dá),以區(qū)別良性肝細(xì)胞與惡性肝細(xì)胞。該方法簡(jiǎn)便,在肝癌檢測(cè)中造成的假陽(yáng)性率僅為10%。
文檔編號(hào)G01N33/558GK1331417SQ0011671
公開日2002年1月16日 申請(qǐng)日期2000年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月23日
發(fā)明者裴鋼, 吳國(guó)祥, 周天華, 林義明, 高華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所