專利名稱：以具有催化活性的核酸為基礎的診斷方法
在本申請中，引證了各種文獻。這些文獻的內(nèi)容作為參考文獻編入本申請以更充分地描述本發(fā)明涉及的領域的現(xiàn)狀。
本發(fā)明涉及診斷特征為已知核酸突變的疾病的方法。本方法采用有催化活性的核酸分子，并用于與諸如癌癥和AIDS的疾病的診斷結合。
各種遺傳和獲得性疾病與諸如點突變，缺失和插入的遺傳改變相關。一些改變直接與疾病的存在相關，而其它改變與疾病風險和/或預后相關。有500種以上的遺傳疾病由單個基因的突變引起(21，22)。它們包括囊性纖維化，肌肉營養(yǎng)障礙，α1-抗胰蛋白酶缺陷，苯丙酮尿癥，鐮狀細胞貧血病或特性，各種其它的血紅蛋白病(21，22)。而且，對一些常見多基因病癥，如動脈粥樣硬化心臟病敏感性增加的個體顯示出與特定DNA序列多態(tài)性的遺傳相關。
據(jù)認為癌癥是由于涉及細胞增生或分化的基因中遺傳損傷的積累而形成的。ras原癌基因，K-ras，N-ras和H-ras，以及p53腫瘤抑制基因是人癌癥中經(jīng)常突變的基因的例子。在這些基因中特定的突變導致轉化潛力增加。在評價疾病風險，疾病的診斷，預測病人的預后或對治療的反應的臨床中遺傳分析是無法估價的。然而，引入這類遺傳試驗取決于開發(fā)簡單，廉價且迅速的試驗用于遺傳改變。
體外核酸擴增的方法已廣泛應用于遺傳學和疾病的診斷中。在最近10年中，已描述了許多核酸擴增技術。它們包括聚合酶鏈反應(PCR)(1-7)，連接酶鏈反應(LCR)(8)，鏈置換擴增試驗(SDA)(9)和轉錄介導的擴增(TMA)(10，11)(也稱為自我維持的序列復制(SSR))。由PCR，LCR和SDA產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物(擴增子)為DNA，而TMA產(chǎn)生RNA復制子。可分析由這些方法或其它方法產(chǎn)生的DNA或RNA模板以確定與疾病相關的序列改變(即突變)的存在。
使用核酸擴增，最近幾年深入研究了催化性核酸。使用催化性核酸作為治療劑抑制基因功能的潛力在文獻中已廣泛討論(12-18)。已表明有催化活性的RNA分子(核酶)能裂解RNA(12)和DNA(17)分子。同樣，也顯示催化性DNA分子(DNAzymes)能裂解RNA(13，19)和DNA(18)分子。催化性核酸僅能裂解靶核酸序列，只要靶序列能滿足最小序列要求。靶序列必須與催化核酸的雜交區(qū)互補且靶必須在裂解位點含有特定序列。在裂解位點需要這種序列的例子包括一類DNA zyme裂解(10-23類型)對嘌呤嘧啶序列的需要(19)，錘頭核酶對序列尿嘧啶H的需要，其中H可等于A，C或U，但不能是G(23)。
除了其治療性潛力外，催化性核酸分子也能區(qū)分其區(qū)別在于單個點突變的靶(14-16)。經(jīng)過靶向存在于野生型而突變性模板不存在或剛好相反的特異性序列來實現(xiàn)這點。至今，這種區(qū)分能力僅被用作基因表達治療性改造的方法。
Nollau-Wagener(24)的綜述就所分析的核酸類型，檢測的突變百分數(shù)，進行試驗的時間和花費，涉及使用有毒試劑的問題比較了一些用于點突變檢測的方法。每一種檢查的方法均有其缺點。例如，變性梯度凝膠電泳耗時，RNA酶裂解僅能檢測大約70％可能的突變，化學裂解涉及使用有毒物質。
稱為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的另一方法涉及確定在感興趣的基因座上是否存在限制性酶位點。在極少情況下，可檢測到突變，因為它們碰巧位于天然存在的限制性核酸內(nèi)切酶識別/裂解位點內(nèi)(31)。
用于幫助體外擴增的引物內(nèi)含有錯堿基可能導致引入人工限制性核酸內(nèi)切酶識別/裂解位點，因此，可用RFLP分析的基因座數(shù)目增加(32)。含錯配堿基的修飾引物用于在ras基因家族內(nèi)關鍵密碼子上引入限制性核酸內(nèi)切酶的人工識別/裂解位點。在靠近引物3′端設計含有錯配堿基的引物的一般規(guī)則已經(jīng)建立(36)。
盡管使用錯配引物拓寬了RFLP分析的實用性，但該技術仍受這一事實的限制，即限制性酶識別和裂解最少需要4個堿基對。
本發(fā)明提供了確定受試者是否患有其特征在于存在已知核酸突變的疾病的方法，該方法包括如下步驟(a)從受試者中分離核酸分子樣品；(b)(i)擴增分離樣品中存在的核酸片段，該片段已知在患有該疾病的受試者中含有突變，(ii)在合適的條件下，接觸所得的擴增片段與催化性核酸分子，該催化性核酸分子特異性地識別和裂解(1)在具有已知突變的核酸片段中或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是兩者中同時存在的靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行；和(c)，測定步驟(b)(ii)中催化性核酸分子是否裂解擴增片段，以確定受試者是否患有該疾病。
本發(fā)明還提供了確定受試者是否患有其特征在于存在多處已知核酸突變的疾病的方法，包括如下步驟；(a)從受試者中分離核酸分子的樣品；(b).(i)擴增分離的樣品中存在的核酸片段，該片段已知在患有該疾病的受試者中含有多處突變，(ii)在合適的條件下，將所得的擴增片段與多種催化性核酸分子接觸，每種催化性核酸分子均特異性地識別和裂解(i)在具有已知突變的核酸片段中或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是兩者中存在的靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行；(c)測定步驟(b)(ii)中各催化性核酸分子是否裂解擴增片段，以確定該受試者是否患有該疾病。
本發(fā)明還提供了測定受試者是否患有其特征在于存在多處已知核酸突變的疾病的方法，該方法包括如下步驟(a)從受試者中分離核酸分子樣品；(b).(i)擴增分離的樣品中存在的核酸片段，這些片段已知在患有該疾病的受試者中共同含有多處突變，(ii)在合適的條件下，接觸所得的擴增片段與多種催化性核酸分子，每種催化性核酸分子均特異性地識別和裂解(1)在具有一種已知突變的一種核酸片段中，或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是兩者中存在的靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行；(c)測定步驟b)(ii)中各催化性核酸分子是否裂解含其各自靶序列的擴增片段以確定該受試者是否患有該疾病。
最后，本發(fā)明提供了用于實施本診斷方法的試劑盒。第一種這類試劑盒包括(a)一種催化性核酸分子，它特異性地識別和裂解(i)在具有已知是一種疾病的特征的突變的核酸片段中或(ii)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，(b)適用于擴增含有靶序列的核酸片段的核酸試劑。
第二種這類試劑盒包含(a)10-23 DNAzyme，它特異性地識別和裂解(i)在具有已知是一種疾病的特征的突變的核酸片段中或(ii)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，(b)適于在聚合酶鏈反應條件下起動該片段擴增的DNA引物，該引物含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，它用作被10-23 DNAzyme識別和裂解的擴增片段內(nèi)的5′側位點。
第三種這類試劑盒包含(a)，第一DNA引物，它含有編碼10-23DNAzyme的酶基因，該DNAzyme特異性地識別和裂解(i)在具有已知是一種疾病的特征性突變的核酸片段中或(ii)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，該第一引物適于在聚合酶鏈反應條件下起動該片段的擴增；和(b)一種適于在聚合酶鏈反應條件下起動該片段擴增的第二DNA引物，該第二引物含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，用作被10-23 DNAzyme識別和裂解的擴增片段內(nèi)的5′側位點，這樣，在擴增時，(i)所得的擴增的核酸分子含有10-23 DNAzyme，且(ii)擴增的核酸片段被DNAzyme順式識別和裂解。
本發(fā)明提供了采用催化性核酸分子測定受試者是否患有其特征在于存在一處或多處已知核酸突變的疾病的方法。這些方法共同適用于如下方案，其中該疾病的特征在于(i)在單個核酸片段內(nèi)的單個突變，或(ii)在單個核酸片段內(nèi)的多個突變，或(iii)在多個核酸片段內(nèi)的多處突變。對于以核酸擴增，特異性裂解和分析試驗的每個突變，該方法對是否存在突變提供了“是或否”的答案。這一答案又最終導致對在受試者中是否存在相應疾病得出“是或否”的答案。
具體來說，本發(fā)明提供了測定受試者是否患有其特征在于存在已知核酸突變的疾病的方法，它包含如下步驟(a)從受試者中分離核酸分子樣品；(b)(i)擴增在分離的樣品中存在的核酸片段，已知在患有該疾病的受試者中該片段含有突變，(ii)在合適的條件下，將所得的擴增片段與催化性核酸分子接觸，該催化性核酸分子特異性地識別和裂解(i)在具有已知突變的核酸片段中或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行；(c)測定步驟(b)(ii)中的催化性核酸分子是否裂解擴增片段，以便確定受試者是否患有該疾病。
本發(fā)明還提供了確定受試者是否患有其特征在于存在多處已知核酸突變的疾病的方法，它包括如下步驟，(a)從受試者分離核酸分子的樣品；(b)(I)擴增分離的樣品中存在的核酸片段，已知在患有該疾病的受試者中該片段含有多處突變，和(ii)在合適條件下，接觸所得的擴增片段與多種催化性核酸分子，每種催化性核酸分子特異性地識別和裂解(i)在具有已知突變的核酸片段中或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行，(c)測定步驟(b)(ii)中的各催化性核酸分子是否裂解擴增的片段，以便確定受試者是否患有該疾病。
本發(fā)明還提供了測定受試者是否患有其特征在于存在多種已知的核酸突變的疾病的方法，包含如下的步驟(a)從受試者中分離核酸分子樣品；(b)(i)擴增在分離的樣品中存在的核酸片段，已知在患有該疾病的受試者中這些片段共同含有多種突變，且(ii)在合適條件下，接觸所得的擴增片段與多種催化性核酸分子，每種催化性核酸分子特異性地識別和裂解(1)在具有一種已知突變的一種核酸片段中或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的一種靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行；(c)測定步驟(b)(ii)中的各催化性核酸分子是否裂解含各自靶序列的擴增片段，以確定該受試者是否患有該疾病。
本方法可用于在任何受試者中診斷疾病。本文使用的“受試者”指任何動物，例如，包括小鼠，大鼠，狗，豚鼠，雪貂，兔和靈長類。在優(yōu)選的實施方案中，受試者是人類。
本發(fā)明診斷的疾病可以是其特征在于存在至少一種已知的核酸突變的任何疾病，當無該疾病時，沒有該突變。該疾病在本領域是熟知的，例如，包括，癌癥，AIDS，囊性纖維化，肌肉營養(yǎng)障礙，α1-抗胰蛋白酶缺陷，苯丙酮尿癥，鐮狀細胞貧血癥或特征，和各種其它的血紅蛋白病。在一個實施方案中，該疾病選自癌癥，AIDS和囊性纖維化。在優(yōu)選的實施方案中，該疾病是癌癥。在下面的實驗詳述部分中，給出了特異性突變，含該突變的靶序列，和用于診斷諸如癌癥，AIDS和囊性纖維化的疾病的催化性核酸的許多例子。
本文使用的“催化性核酸分子”指特異性地識別和裂解不同靶核酸序列的DNA分子(本領域也稱為“DNAzyme”)或RNA分子(本領域也稱為“核酶”)。對于DNAzymes和核酶，靶核酸序列可以是DNA或RNA。
存在已知疾病特征性突變的核酸序列(即，在本方法中擴增的序列)可以是DNA或RNA序列。這些突變包括，例如，點突變，缺失突變，插入突變和移碼突變。各種擴增的核酸片段和催化性核酸分子可以是DNA或RNA。在一個實施方案中，擴增的核酸片段是RNA，催化性核酸分子是DNA或RNA。在另一實施方案中，擴增的核酸片段是DNA，催化性核酸分子是RNA或DNA(25)。
本發(fā)明使用的分離和擴增核酸分子的方法是本領域所熟知的。更具體地說，從受試者中分離核酸分子樣品的方法包括，例如，酚氯仿提取，快速裂解，在柱上捕獲和多聚體捕獲(20，26-29)。擴增核酸序列的方法包括，例如，PCR，LCR，SDA和TMA(也稱為(SSR))(1-11)。
接觸含靶序列的擴增核酸片段與催化性核酸分子以便允許特異性識別和裂解靶序列的合適條件是本領域熟知的。另外，該條件在下面實驗詳述部分進行了舉例。
測定催化性核酸分子是否裂解擴增的核酸片段的方法也是本領域的常規(guī)技術。例如，該方法包括，聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳(20，30)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，(a)使用聚合酶鏈反應進行擴增；(b)催化性核酸分子是10-23 DNAzyme；(c)聚合酶鏈反應采用適于起動核酸片段擴增的DNA引物(即，“嵌合”引物)，該引物含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，用作10-23 DNAzyme識別和裂解的擴增片段內(nèi)的5′側位點。嵌合引物中的這個嘌呤核糖核苷酸殘基是為10-23DNAzyme裂解所必需的。因此，使用這種嵌合引物允許在PCR反應中產(chǎn)生10-23 DNAzyme裂解位點。嵌合引物也可包括，例如，用作10-23 DNAzyme識別和裂解的3′側位點的核糖核苷酸殘基。
在該實施方案的一種形式中，擴增的片段被DNAzyme反式識別和裂解。在另一種形式中，(a)聚合酶鏈式反應采用適于起動片段擴增的第二種DNA引物，該第二種引物包含編碼10-23 DNAzyme的酶基因，以便擴增時，所得的擴增核酸分子包含10-23 DNAzyme；和(b)擴增的核酸片段被DNAzyme順式識別和裂解。
本文使用的被DNAzyme“順式”裂解指DNAzyme識別和裂解與其共存于相同的擴增核酸分子上的序列。反式裂解指DNAzyme裂解位于不同分子上的底物。最后，“酶基因”指包含催化性核酸分子反義(即，互補)序列的核酸序列，且其轉錄產(chǎn)物是催化性核酸分子本身。
本發(fā)明還提供了用于實施本診斷方法的試劑盒。第一種該試劑盒包含(a)一種催化性核酸分子，它特異性地識別和裂解(i)在具有已知是一種疾病的特征性突變的核酸片段中或(ii)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，和(b)適用于擴增含靶序列的核酸片段的核酸試劑。
在一種實施方案中，該試劑盒包含多種催化性核酸分子。適用于擴增含靶序列的核酸片段的核酸試劑可以是，例如，一種核酸引物。在一個實施方案中，該試劑盒包含多種該核酸試劑。
更具體地說，第二種這類試劑盒包含(a)一種10-23 DNAzyme，它特異性地識別和裂解(i)在具有已知是一種疾病的特征性突變的核酸片段中或(ii)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，和(b)在聚合酶鏈反應條件下適于起動擴增該片段的DNA引物，該引物含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，它用作被10-23 DNAzyme識別和裂解的擴增片段內(nèi)的5′側位點。
第三種這類試劑盒包含(a)第一DNA引物，它含有編碼10-23DNAzyme的酶基因，該10-23 DNAzyme特異性地識別和裂解(i)在具有已知是一種疾病的特征性突變的核酸片段中或(ii)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，該第一引物在聚合酶鏈反應條件下適于起動該片段的擴增；(b)一種第二DNA引物，它適于在聚合酶鏈反應條件下起動該片段擴增，這種第二引物含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，用作10-23 DNAzyme識別和裂解的擴增片段內(nèi)的5′側位點，以便在擴增時，(i)所得的擴增核酸分子含有10-23 DNAzyme，和(ii)擴增的核酸片段被DNAzyme順式識別和裂解。
在一個實施方案中，該試劑盒進一步包含一或多種下列成份(a)用于從所診斷的受試者分離核酸分子樣品的試劑；(b)用于擴增存在于分離的樣品中的核酸片段的試劑，該片段已知含有在患有該疾病的受試者中的突變；和(c)，用于產(chǎn)生催化性核酸活性的合適反應條件的試劑。在該試劑盒成份(a)-(c)中的試劑可以從商業(yè)途徑獲得或根據(jù)本領域熟知的方法制備，這在下面實驗詳述部分中舉例。
該試劑盒的成份可以是溶液或按需要凍干。在一個實施方案中，該試劑盒的成份在同一區(qū)室中，在另一實施方案中，該試劑盒的成份在分開的區(qū)室中。在優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒還包含使用說明書。
參考下面的實驗詳述更易于理解本發(fā)明，但本領域的技術人員容易預料到詳述的具體實驗僅僅是對本發(fā)明的說明，在其后的權利要求書中作了更充分的描述。
下面所列的DNAzymes和核酶的例子以10-23 DNAzyme(19)為基礎，且設計成裂解下列醫(yī)學上重要的靶。下面所列的核酶的例子以錘頭型核酶(12)為基礎。I.DNAzymes其中R＝嘌呤，A或者Gy＝嘧啶，C，T或UH＝A，T，U或C(不是G)D＝A，T，U或G(不是C)R＝C，T，U或G(不是A)V＝A，C，或G(不是T，不是U)。
W＝T，U，或A。
斜體字＝使用含有與靶序列錯配的堿基的引物經(jīng)體外擴增人工導入的堿基。
黑體與＝用于分析的靶堿基或序列。
下劃線＝識別位點(Ry/R)。
E＝修飾的序列(引物誘導的人工序列)。A、獲得性疾病(1)癌癥(a)K-ras密碼子12，位置2-突變體(G突變?yōu)镃，U或A)。
5′-GUU GGA GCU GGU GGC GUA GGC-3′ 野生型RNA5′-GUU GGA GCU GYU GGC GUA GGC-3′ 突變型RNA3′-CAA CCT CGA RA CCG CAT CCG-5′ DNAzyme
5′-GUU GGA GCU GAU GGC GUA GGC-3′ 突變型3′-CAA CCU CGA CUA CCG CAU CCG-5′ 反義5′-GCC UAC GCC AUC AGC UCC AAC-3′ 反義3′-CGG ATG CGG AG TCG AGG TTG-5′ DNAzyme (b)K-ras密碼子13，位置1-突變型(G突變成A，U或C)5′-GGA GCU GGU GGC GUA GGC AAG-3′ 野生型RNA5′-GGA GCU GGU HGC GUA GGC AAG-3′ 突變型RNA3′-CCT CGA C A UCG CAT CCG TTC-5 DNAzyme (c)H-ras密碼子61，位置1-突變型(G突變成G，U或A)5′-ACC GCC GGC CAG GAG GAG-3′ 野生型RNA5′-ACC GCC GGC DAG GAG GAG-3 ′ 突變型RNA3′-TGG CGG C G HTC CTC CTC-5′ DNAzyme (d)H-ras密碼子61，位置2-突變型(A突變成C，G或U)5′-ACC GCC GGC CAG GAG GAG-3＇ 野生型RNA3′-UGG CGG CCG GUC GUC CUC-5′ E野生型RNA5′-CUC CUG CUG GCC GGC GGU-3′ E野生型RNA3′-GAG GA GAC CGG CCG CCA-5′ DNAzyme (e)H-ras密碼子61，位置3-突變型(G突變成C或U)(注C突變成A是沉默突變)5′-ACC GCC GCC CAG GAG GAG-3′ 野生型HNA5′-ACC GCC GGC CAY GAG GAG-3′ 突變型RNA3′-UGG CGG CCG GUR CUC CUC-5′ 反義5′-CUC CUC RUG GCC GGC GGU-3′ 反義3′-GAG GAG AC CGG CCG CCA-5′ DNAzyme (f)N-ras密碼子61，位置1-突變型(C突變成A，G或U)5′-GCU GGA CAA GAA GAG-3′ 野生型RNA5′-GCU GGA DAA GAA GAG-3′ 突變型RNA3′-CGA CCU HUG CUU CUC-5′ E突變型RNA
5′-CUC UUC GUH UCC AGC-3′ E突變型RNA3′-GAG AAG AD AGG TCG-5′ DNAzyme 5′-GCU CGA UAA GAA GAG-3′ 突變型RNA3′-CGA CC ATT CTT CTC-5′ DNAzyme (2)HIV 1-AZT抗性，點突變(a)密碼子41-突變體(A突變成U或C)5′-UGU ACA GAA AUG GAA AAG-3′ 野生型RNA5′-UGU ACA GAA YUG GAA AAG-3′ 突變型RNA3′ ACA TGT CT RAC CTT TTC-5′ DNAzyme (b)密碼子70-突變型(A突變成G)5′-GAC AGU ACU AAA UGG AGA AAA-3′ 野生型RNA5′-GAC AGU ACU AGA UGG AGA AAA-5′ 突變型RNA3′-CTG TCA TGA TC ACC TCT TTT-3′ DNAzyme (c)密碼子215-突變型(C突變成U或A)5′-AGG UGG GGA UUU ACC ACA CCA GAC-3′ 野生型RNA5′-AGG UGG GGA UUU AUC ACA CCA GAC-5′ 突變型RNA3′-TCC ACC CCT AAA AG TGT GGT CTG-3′ DNAzyme 5′-AGG UGG GGA UUU AAC ACA CCA GAC-5′ 突變型 RNA3′-TCC ACC CCT AAA T G TGT GGT CTG-3′ DNAzyme (d)密碼子74-突變型(U突變成G提供ddT抗性)5′-AAA UGG AGA AAA UUA GUA GAU-3′ 野生型RNA5′-AAA UGG AGA AAA GUA GUA GAU-3′ 突變型RNA3′-TTT ACC TCT TTT AT CAT CTA-3′ DNAzyme B.遺傳病(1)囊性纖維化(a)密碼子542-野生型5′-UAGUUCUUGGAGAAGGU-3′生型RNA5′-UAGUUCGUGGAGAAGGU-3′E野生型RNA3′-ATCAAG ACCTCTTCCA-5′DNAzyme 密碼子542-突變型(G突變成U)5′-UAGUUCUUUGAGAAGGU-3′突變型RNA5′-UAGUUCGUUGAGAAGGU-3′E-突變型RNA3′-ATCAAG AACTCTTCCA-5′DNAzyme (b)密碼子551-野生型5′-GAGUGGAGGUCAACGAG-3′ 野生型RNA3′-CUCACCUCCAGUUGCUC-5′ 反義5′-CUCGUUGACCUCCACUC-3′ 反義3′-GAGCAAC GGAGGTGAG-5′ DNAzyme 密碼子551-突變型(G突變成A)5′-GAGUCGAGAUCAACGAG-3′ 突變型RNA3′-CUCACCUCUAGUUGCUC-5′ 反義5′-CUCGUUGAUCUCCACUC-3′ 反義3′-GAGCAAC AGAGGTGAG-5′ DNAzyme (c)密碼子508-野生型5′-GAAAUAUCAUCUUUGGUGUUU-3′ 野生型RNA3′-CTTTATAG AGAAACCACAAA-5′ DNAzyme 密碼子508-突變型(CTT缺失)5′-AAAUAUCAUUGGUGUUU-5′ 突變型RNA3′-TTTATAG AACCACAAA-3′ DNAzyme (2)α1-抗胰酶缺陷密碼子342-突變型(G突變成A)5′-GACCAUCGACGAGAAAGG-3′野生型RNA5′-GACCAUCGACAAGAAAGG-3′突變型RNA3′-CTGGTAGC GTTCTTTCC-5′DNAzyme II.核酶其中 黑體字＝用于分析的靶堿基下劃線＝識別位點(UH)A.獲得性疾病(1)癌癥K-ras密碼子12，位置1-突變型(G突變成A，C或U)5′-GUA GUU GGA GCU GGU GGC GUA-3′ 野生型RNA5′-GUA GUU GGA GCU HGU GGC GUA-3′ 突變型RNA3′-CAU CAA CCU CGA CA CCG CAU-5′ 核酶 K-ras密碼子12.位置2-突變型(G突變成U)5′-GUU GGA GCU GGU GGC GUA GGC-3′ 野生型RNA5′-GUU GGA GCU GUU GGC GUA GGC-3′ 突變型RNA3′-CAA CCU CGA CA CCG CAU CCG-5′ 核酶 (2)HIV 1-AZT抗性(a)密碼子41-突變型(A突變成U或C)5′-UGU ACA GAA AUG GAA AAG-3′ 野生型RNA5′-UGU ACA GAA YUG GAA AAG-3′ 突變型RNA3′-ACA UGU CUU RAC CUU UUC-5′ 反義
5′-CUU UUC CAR UUC UGU ACA-3′反義3′-GAA AAG GUY A G ACA UGU-5′核酶 (b)密碼子70-突變型(A突變成G)5′-GAC AGU ACU AAA UGG AGA AAA-3′野生型RNA5′-GAC AGU ACU AGA UGG AGA AAA-3′突變型RNA3′-CUG UCA UGA UCU ACC UCU UUU-5′反義5′-UUU UCU CCA UCU AGU ACU GUC-3′反義3′-AAA AGA GGU AGA CA UGA CAG-5′核酶 (c)密碼子215-突變型(C突變成U或A)5′-AGG UGG GGA UUU ACC ACA CCA GAC-3′野生型RNA5′-AGG UGG GGA UUU AWC ACA CCA GAC-3′突變型RNA3′-UCC ACC CCU AAA UWG UGU GGU CUG-5′反義5′-GUC UGG UGU GWU AAA UCC CCA CCU-3′反義3′-CAG ACC ACA CWA UU AGG GGU GGA-5′核酶 (d)密碼子74-突變型(U突變成G提供ddT抗性)5′-AAA UGG AGA AAA UUA GUA GAU-3′野生型RNA5′-AAA UGG AGA AAA GUA GUA GAU-3′ 突變型RNA3′-UUU ACC UCU UUU CA CAU CUA-5′ 核酶 B.遺傳病(1)囊性纖維化(a)密碼子542-野生型5′-UAGUUCUUGGAGAAGGUGGA-3′野生型RNA3′-AUCAAGA CCUCUUCCACCU-5′核酶 密碼子542-突變型(G突變成U)5′-UAGUUCUUUGAGAAGGU-5′ 突變型RNA3′-AUCAAGA ACUCUUCCA-3′ 核酶 (b)密碼子551-野生型5′-GAGUGGAGGUCAACGAG-3′野生型RNA3′-CUCACCUCCA UUGCUC-5′核酶 密碼子551-突變型(G突變成A)5′-GAGUGGAGAUCAACGAG-3′突變型RNA3′-CUCACCUCUA UUGCUC-5′核酶 (c)密碼子508-野生型5′-GAAAUAUCAUCUUUGGUGUUU-3′野生型RNA3′-CUUUAUAGUAGA ACCACAAA-5′核酶 或密碼子508-突變型(CUU缺失)5′-GAAAUAUCAUUGGUGUUU-3′ 突變型RNA3′-CUUUAUAGUA CCACAAA-5′ 核酶 (2)β-珠蛋白β+-黑體字(poly A信號)-突變型(U突變成C)5′-UCUGCCUAAUAAAAAAACAU-3′野生型RNA5′-UCUGCCUAACAAAAAACAU-3′ 突變型RNA3′-AGACGGAUUGUUUUUUGUA-5′ 反義5′-AUGUUUUUUGUUAGGCAGA-3′ 反義3′-UACAAAAAACA UCCGUCU-5′ 核酶 III.使用核酶進行K-ras分析A在K-ras密碼子12處的核酶靶向突變?nèi)薑-ras基因在密碼子12處的序列是GGT。經(jīng)常觀察到在該序列的前2個堿基上的點突變與胰，肺和結腸癌相聯(lián)系。設計了2個核酶來裂解突變型但不裂解野生型K-ras。K-ras5′····AGUUGGAGCUHGUGGCGUAGG·····3′核酶I3′UCAACCUCGA CACCGCAUCC 5′ (K-ras密碼子12-粗體字；核酶靶雙聯(lián)體—下劃線)上面的核酶I設計成裂解在密碼子12第一位含點突變的所有RNA分子，但設計成不裂解野生型序列。核酶的靶序列是UH，其中H可等于C，U或A，但不等于G。由于在該位置的野生型序列是G，所以用該核酶可裂解所有突變型。
K-ras5′····UUGGAGCUGUUGGCGUAGGCA·····3′核酶II3′AACCUCGACA CCGCAUCCGU 5′ (K-ras密碼子突變等位基團-粗體字；核酶靶雙聯(lián)體—下劃線)核酶II設計成靶向在密碼子12的第二位由G取代成U。野生型序列G不能與核酶雜交臂內(nèi)的第一位的A配對，因此野生型序列預期不會被該核酶裂解。
以Macromolecular Resources(Fort Collins，Co)合成編碼核酶I和II的DNA序列。退火核酶的反義和有義鏈并克隆進載體pSP70(Promega Corporaton，Madison，WI)中的T7聚合酶啟動子后。經(jīng)過用NdeI消化在核酶的3′位點線型化這些克隆，然后純化。用標準體外RNA轉錄反應制備放射標記的核酶，其中使用這些模板摻入[α-32P]UTP(20)。B.制備K-ras模板從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)獲得人細胞系SW480和CaluI。結腸癌細胞系SW 480在K-ras密碼子12內(nèi)第2位上具有純合突變(GTT)。Calu I是肺癌細胞系，它在K-ras密碼子12內(nèi)位置1上是雜合的，具有野生型(GGT)和突變型(TGT)等位基因。
經(jīng)過PCR擴增Calu I和SW 480 DNA以及含有在密碼子12為突變型的K-ras插入片段的PUC質粒克隆產(chǎn)生K-ras DNA模板(在密碼子12處有4個突變型和1個野生型)。5′PCR引物的序列為TGGACTTAATACGACTCACTATAGG GCGACTGAATATAAACTTGTGGTAG。該5′引物在5′端插入T7啟動子中。3＇引物的序列為CCTCTATTGTTGGATCATATTCG。在摻入[α-32P]UTP的標準體外RNA轉錄反應中使用T7/K-rasPCR產(chǎn)物產(chǎn)生放射標記的K-rasRNA模板(20)。C.檢測點突變按如下所述進行體外裂解實驗。在裂解緩沖液(10mM MgCl2；250mM TrisCl，pH7.5)以4∶1的摩爾比溫育核酶和底物。在50℃用放射標記的K-rasRNA模板與核酶I和II保溫6小時以測定體外裂解能力。以聚丙烯酰胺凝膠電泳分析反應。核酶I成功地裂解在密碼子12的位置1上含C，A或U突變的K-ras RNA但不能裂解野生型序列G。核酶II成功地裂解在密碼子12位置2含U突變的K-ras RNA但不能裂解野生型序列G。因此存在被裂解的K-rasRNA被診斷為在密碼子12上存在點突變。
該分析證實了催化性核酸特異性裂解體外模板的能力，該能力提供了診斷與存在突變序列相聯(lián)系的疾病的基礎。核酸可用各種技術擴增，例如，PCR或TMA，然后用催化性核酸，例如，DNAzyme(10-23型)或核酶裂解。該方法可用于檢測K-ras中的點突變，該突變與肺，結腸和胰腺癌特異性地聯(lián)系。該方案可用于診斷其特征在于存在獲得性或遺傳突變的任何疾病。
IV.使用10-23 DNAzymes和嵌合引物進行K-ras突變分析。
Walder等(38)以前已表明TaqDNA聚合酶可延伸DNA/RNA嵌合引物，該引物含一個或2個3′端核糖殘基。Santoro和Joyce(19)顯示了10-23DNAzyme裂解DNA/RNA嵌合底物。這里使用嵌合引物產(chǎn)生PCR擴增子，它用作10-23DNAzyme的底物。A使用DNAzymes區(qū)分變異的等位基因；以反式提供的DNAzymes靶向序列。
經(jīng)過向PCR混合物中加入化學合成的DNAzyme實現(xiàn)裂解從嵌合引物產(chǎn)生的DNAzyme底物。在該反應中，DNAzyme以反式方向裂解底物。
(1)DNAzymes靶向在K-ras密碼子12上的突變；天然裂解位點(a)方案使用5′DNA/RNA嵌合引物(5K42r)和3′引物(3K2)的PCR擴增K-ras基因的一個區(qū)域。5K42r與鄰近密碼子12的K-ras序列雜交且含有形成潛在DNAzyme裂解位點的嘌呤嘧啶殘基。嵌合引物與提供10-23DNAzyme天然裂解位點的K-ras序列完全互補。以Taq DNA聚合酶從5K42r 3′端延伸擴增K-ras基因的密碼子12。設計DNAzyme，Dzl以裂解在K-ras密碼子12含野生型序列的擴增子。DNAzyme的5′臂與在密碼子12處為野生型的序列完全互補。在K-ras密碼子12處突變導致與5＇DNAzyme雜交臂錯配，預期會明顯減小DNAzyme裂解的效率。(b)引物和DNAzyme序列5′TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAA 3′K-ras5′TATAAACTTGTGGTAGTTGGAgcT 3′ “5K42r”引物3′ TGAACACCATCAACCT GACCACCG 5′ “Dzl”DNAzyme (K-ras野生型序列的密碼子12下劃線，引物5K42r中的核糖核苷酸堿基為小寫字母。)設計另一PCR引物3K2，當與5K42r擴增時產(chǎn)生82個堿基對的擴增子。3K2的序列為5′CGTCCACAAAATGATTCTGA 3′“3K2”引物引物和DNAzyme由Pacific Oligos Pty.Ltd.(Lismore，NSW，Australia)或OligosEtc.，Inc.(Wilsonville，OR.USA)合成。經(jīng)過加入3′磷酸(phosphate)基團以防止被Taq DNA聚合酶延伸來修飾DNAzyme Dzl。經(jīng)過將25μl20μM的引物與2.5μl多核苷酸激酶(10×103U/ml，無3′磷酶酶，Boehringer Mannheim)，2.5μlRNasin(40U/ul重組RNasin，核糖核酸酶抑制劑，Promega)，5μl多核苷酸激酶緩沖液(Boehringer Mannheim)，10μlγ-32P腺苷5′-三磷酸(2.5μM，穩(wěn)定標記GoldTM，Bresatec)和5μl DEPC水在37℃下溫育30分鐘用γ-32P5′端標記5′引物，5K42r。
(c)制備K-ras模板含有在密碼子12處為野生型(GGT)或突變型(CGT或AGT)的K-ras外顯子1序列的puc18質粒載體用作PCR的DNA模板。
(d)檢測點突變PCR混合物含0.2pg/μl質粒DNA，10pmole γ-32P標記的5K42r，2pmole 3K2，1mM DTT，8mM MgCl2，dNTP(dATP，dCTP，dTTP，dGTP)各100μM，0.4U/ulRNasin，和1×緩沖液(100mM NaCl，50mM Tris pH8.3，25℃)。用0.5uM Dzl建立兩份反應，無Dzl的單個反應用作對照反應。將6單位的Taq DNA聚合酶(5U/ul AmpliTaq，Perkin-Elmer)與TaqStartTM抗體(Clontech)混合以產(chǎn)生Taq DNA聚合酶TaqStartTM抗體為1∶5的最終摩爾比率。Taq DNA聚合酶TaqstartTM抗體混合物在加入PCR混合物前在室溫下溫育15分鐘。總反應體積為50ul。反應物放置于GeneAmpPCR9600(Perkin-Elmer)中并在94℃變性2分鐘，然后在60℃下1分鐘，接著在94℃20秒進行15個循環(huán)。反應在40℃下1分鐘，接著在94℃下20秒再進行25個循環(huán)。
2.5ul各反應的等份試樣與2.5ul上樣染料(97.5％甲酰胺，0.1％二甲苯腈藍，0.1％溴酚藍和0.01MEDTA)混合，在75℃溫育2分鐘，然后立即上樣到預溫的16％變性(尿素)丙烯酰胺凝膠上。凝膠電泳大約1小時。經(jīng)過使用分子動力學磷成像儀445S1掃描凝膠觀察PCR產(chǎn)物和裂解片段。
在凝膠上可見幾條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。片段按遷移率從最慢到最快(即，從起點到凝交底端)的順序是(a).PCR擴增子(以雙聯(lián)體遷移)，(b)未摻入的引物，和(c)裂解的PCR擴增子。在5′引物內(nèi)核糖核苷酸殘基上被背景水解產(chǎn)生的少量的2個片段也可見，它在引物與裂解的擴增子之間遷移，且與裂解的擴增子平行遷移。在所有反應中，可見PCR產(chǎn)物和未摻入的引物。含有在密碼子12處為野生型的模板DNA(即，與DNAzyme完全互補)的反應物含裂解擴增子。含有在密碼子12處突變的模板DNA(即，與DNAzyme錯配)的反應物不含裂解擴增子。在這些反應物中在凝膠上在該位置僅可見低水平的背景水解產(chǎn)物。
(2)靶向在K-ras密碼子12處突變的DNAzymes；誘導的裂解位點。
(a)方案使用5′DNA/RNA嵌合引物(5K44r)和3′引物(3K2)的PCR擴增K-ras基因的一個區(qū)域。5K44γ與鄰近密碼子12的K-ras序列雜交，且含有形成潛在的DNAzyme裂解位點的嘌呤嘧啶殘基。在5K44γ中的嘌呤核糖核苷酸與野生型序列在該位置具有一個嘧啶的K-ras模板錯配。因此，該引物誘導DNAzyme裂解位點。Taq DNA聚合酶從5K44r的3′端延伸擴增出K-ras基因的密碼子12。DNAzyme，Dz3設計成裂解在K-ras密碼子12處含野生型序列的擴增子。DNAzyme的5′臂與在密碼子12處為野生型的序列完全互補。在K-ras密碼子12處的突變導致與5′DNAzyme雜交臂錯配，預期顯著降低DNAzyme裂解的效率。
(b)設計PCR引物和DNAzymes5′TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAA 3′K-ras5′TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGgu 3′ “5K44r”引物3′ GAACACCATCAACCTC ACCACCGC 5′ “Dz3”DNAzyme (在K-ras野生型序列的密碼子12下劃線，引物5K44r的核糖核苷酸堿基以小寫字母表示。引物5K44r中的核糖核苷酸“g”與K-ras序列錯配)。
另一PCR引物3K2當與5K44r擴增時設計成產(chǎn)生82堿基對的擴增子。3K2的序列是5′CGTCCACAAAATGATTCTGA 3′“3K2”引物引物和DNAzyme由Pacific Oligos Pty.Ltd.(Lismore，NSW，Australia)或Oligos Etc.，Inc.(Wilsonville，OR，USA)合成。DNAzyme Dz3經(jīng)過添加3′磷酸基團進行修飾以防止被Taq DNA聚合酶延伸。經(jīng)過將25ul 20uM的引物與2.5μl多核苷酸激酶(10×103U/ml，無3′磷酶酶，Boehringer Marnnheim)，2.5μlRNasin(40U/ul重組RNasin，核糖核酸酶抑制劑，Promega)，5μl多核苷酸激酶緩沖液(Boehringer Mannheim)，10μlγ-32P腺苷5′-三磷酸(2.5μM，穩(wěn)定標記GoldTM，Bresatec)和5μlDEPC水在37℃下溫育30分鐘用γ-32P5′端標記5′引物，5K44r。
(c)制備K-ras模板含有在密碼子12處為野生型(GGT)或突變型(CGT)的K-ras外顯子1序列的puc18質粒載體用作PCR的DNA模板。
(d)檢測點突變PCR混合物含0.2pg/μl質粒DNA，10pmole γ-32P標記的5K44r，2pmole 3K2，1mM DTT，8mM MgCl2，dNTP(dATP，dCTP，dTTP，dGTP)各100μM，0.4U/ulRNasin，和1×緩沖液(100mM NaCl，50mM Tris pH8.3，25℃)。用0.5uM Dz3DNAzyme建立兩份反應，無Dz3的單個反應用作對照反應。將6單位的Taq DNA聚合酶(5U/ul AmpliTaq，Perkin-Elmer)與TaqStartTM抗體(Clonteeh)混合以產(chǎn)生Taq DNA聚合酶TaqStartTM抗體為1∶5的最終摩爾比率。Taq DNA聚合酶TaqstartTM抗體混合物在加入PCR混合物前在室溫下溫育15分鐘?？偡磻w積為50ul。反應物放置于GeneAmp PCR9600(Perkin-Elmer)中并在94℃變性2分鐘，然后在60℃下1分鐘，接著在94℃20秒進行30個循環(huán)。反應在50℃下1分鐘，接著在94℃下20秒再進行10個循環(huán)。
2.5ul各反應的等份試樣與2.5ul上樣染料(97.5％甲酰胺，0.1％二甲苯腈藍，0.1％溴酚藍和0.01MEDTA)混合，在75℃溫育2分鐘，然后立即上樣到預溫的16％變性(尿素)丙烯酰胺凝膠上。凝膠電泳大約1小時。經(jīng)過使用分子動力學磷成像儀445S1掃描凝膠觀察PCR產(chǎn)物和裂解片段。
在凝膠上可見幾條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。片段按遷移率從最慢到最快(即，從起點到凝膠底端)的順序是(a)PCR擴增子(以雙聯(lián)體遷移)，(b)未摻入的引物，和(c)裂解的PCR擴增子。在5′引物內(nèi)核糖核苷酸鍵上被背景水解產(chǎn)生的少量的片段也可見，它與裂解的擴增子平行遷移。在所有反應中，可見PCR產(chǎn)物和未摻入的引物。含有在密碼子12處為野生型的模板DNA(即，與DNAzyme完全互補)的反應物含裂解的擴增子。含有在密碼子12處突變的模板DNA(即，與DNAzyme錯配)的反應物不含裂解擴增子。在這些反應物中在凝膠上在該位置僅可見低水平的背景水解產(chǎn)物。
(B)靶向在K-ras密碼子12處突變的DNAzymes；以順式方向裂解。
使用PCR期間合成的活性DNAzymes也可實現(xiàn)裂解從嵌合引物產(chǎn)生的擴增子。在這種反應的一個例子中，DNAzyme以順式方向裂解底物。
(a)方案使用5′DNA/RNA嵌合引物(5K42r)和3′酶基因引物(3K42Dz2)的PCR擴增K-ras基因的一個區(qū)域。5K42γ與鄰近密碼子12的K-ras序列雜交，且含有形成潛在的DNAzyme裂解位點的嘌呤嘧啶殘基。酶基因引物3K42Dz2具有與K-ras互補的3′區(qū)和含DNAzyme反義序列的5′區(qū)。酶基因引物本身沒有可遺傳的催化活性，當與5K42r結合使用時，有利于產(chǎn)生在靠近其5′端具有DNAzyme裂解位點在其3′端具有活性(有義)DNAzymes的擴增子。DNAzyme設計成順式裂解擴增子的5′端。
DNAzyme的5′臂與在密碼子12處為野生型的序列完全互補。在K-ras密碼子12處的突變導致與5′DNAzyme臂錯配，預期顯著降低DNAzyme裂解的效率。
(b)引物序列5′嵌合引物5K42r(大寫字母—脫氧核糖核苷酸殘基；小寫字母—核糖核苷酸殘基)5′TATAAACTTGTGGTAGTTGGA gcT 3′3′酶基因引物3K42Dz2(10∶23催化核心的互補(反義)序列為黑體字)5′ACTTGTGGTAGTTGGATCGTTGTAGCTAGCCCTGGTGGCAGCTGTATCGTCAAGGCACTC 3′引物由Pacific Oligos Pty.Ltd.(Lismore，NSW，Australia)或Oligos Etc.，Inc.(Wilsonville，OR，USA)合成。經(jīng)過將25ul 20uM的引物與2.5μl多核苷酸激酶(10×103U/ml，無3′磷酸酶，Boehringer Mannheim)，2.5μl RNasin(40U/nl重組RNasin，核糖核酸酶抑制劑，Promega)，5μl多核苷酸激酶緩沖液(Boehringer Mannheim)，10μl γ-32P腺苷5′-三磷酸(2.5μM，穩(wěn)定標記GoldTM，Bresatec)和5μlDEPC水在37℃下溫育30分鐘用γ-32P 5′端標記5′引物，5K42r。
(c)K-rasDNA模板含有在密碼子12處為野生型(GGT)或突變型(CGT或AGT)的K-ras外顯子1序列的PUC18質粒載體用作PCR的DNA模板。
(d)PCR期間合成的DNAzymes順式裂解PCR混合物含0.2pg/μl K-ras質粒DNA，10pmole γ-32P標記的5K42r，2pmole 3K42Dz2，1mM DTT，8mM MgCl2，dNTP(dATP，dCTP，dTTP，dGTP)各100μM，0.4U/ul RNasin，和1×緩沖液(100mM NaCl，50mM Tris pH8.3，25℃)。各DNA模板建立兩份反應。將6單位的Taq DNA聚合酶(5U/ul AmpliTaq，Perkin-Elmer)與TaqStartTM抗體(Clontech)混合以產(chǎn)生Taq DNA聚合酶TaqStartTM抗體為1∶5的最終摩爾比率。TaqDNA聚合酶TaqstartTM抗體混合物在加入PCR混合物前在室溫下溫育15分鐘?？偡磻w積為50ul。反應物放置于GeneAmp PCR 9600(Perkin-Elmer)中并在94℃變性2分鐘，然后在60℃下1分鐘，接著在94℃處理20秒進行30個循環(huán)。反應在50℃下1分鐘，接著在94℃下處理20秒再進行10個循環(huán)。
2.5ul各反應的等份試樣與2.5ul上樣染料(97.5％甲酰胺，0.1％二甲苯腈藍，0.1％溴酚藍和0.01M EDTA)混合，在75℃溫育2分鐘，然后立即上樣到預溫的16％變性(尿素)丙烯酰胺凝膠上。凝膠電泳大約1小時。經(jīng)過使用分子動力學磷成像儀445S1掃描凝膠觀察PCR產(chǎn)物和裂解片段。
在凝膠上可見幾條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。片段按遷移率從最慢到最快(即，從起點到凝膠底端)的順序是(a).PCR擴增子(以雙聯(lián)體遷移)，(b)未摻入的引物，和(c)裂解的PCR擴增子。在5′引物內(nèi)核糖核苷酸殘基上被背景水解產(chǎn)生的少量的2個片段也可見，它與引物與裂解的擴增子之間遷移，且與裂解的擴增子平行遷移。在所有反應中，可見PCR產(chǎn)物和未摻入的引物。含有在密碼子12處為野生型的模板DNA(即，與DNAzyme完全互補)的反應物含裂解擴增子。含有在密碼子12處突變的模板DNA(即，與DNAzyme錯配)的反應物不含裂解擴增子。在這些反應物中在凝膠上在該位置僅可見低水平的背景水解產(chǎn)物。
下面的序列是在構象中所示的密碼子12的位置1(下劃線)處為野生型的擴增子，其中DNAzyme(黑體字)以順式雜交。
5′TATAAACTTGTGGTAGTTGGAgcTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC3′TGAACACCATCAACCT GACCACCGTCGACATAGCAGTT
V.結論本診斷方法是具有優(yōu)勢的。催化性核酸需要少到2個堿基對的特異性序列以產(chǎn)生裂解位點。催化性核酸二核苷酸裂解位點比限制性酶切位點以更高的頻率天然出現(xiàn)。而且，錯配引物可用于按與錯配引物用于誘導人工限制性酶切位點相同的方式誘導催化性核酸的裂解位點。
在裂解位點僅需要雙核苷酸序列的催化性核酸的例子是錘頭核酶和10-23DNAzyme。這兩種分子也需要雜交區(qū)(臂)和待裂解分子之間的互補。然而，這些區(qū)域可以制成靶特異性的。盡管催化性核酸分子僅可裂解單鏈核酸模板，但產(chǎn)生合適的單鏈模板的方法是本領域熟知的。例如，單鏈RNA模板可經(jīng)過諸如TMA的方法產(chǎn)生，單鏈DNA可經(jīng)過不對稱PCR(37)產(chǎn)生或經(jīng)過變性雙鏈產(chǎn)物產(chǎn)生。
本方法提供了比RFLP分析具有潛在更靈活的用于序列分析的新工具。結合核酸擴增與催化性核酸裂解克服了使用限制性酶分析的局限。這樣，減少了裂解所需的最小序列。而且，由于催化性核酸也必需在雜交區(qū)互補，因此在雙核苷酸裂解位點側翼的這些區(qū)域也影響裂解效率。因此，一個催化性核酸掃描的序列長度比單個限制性酶掃描的長度更長。使用催化性核酸的序列分析相對于其它方案也具有優(yōu)勢，因為它不需要蛋白酶(例如，限制性酶或RNAaseA)或毒性化合物。
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權利要求
1.測定受試者是否患有其特征在于存在已知核酸突變的疾病的方法，它包括步驟(a)從受試者分離核酸分子樣品；(b)(i)擴增在分離的樣品中存在的核酸片段，該片段已知含有在患有該疾病的受試者中存在的突變，和(ii)在合適的條件下，將所得的擴增片段與催化性核酸分子接觸，其中該催化性核酸分子特異性地識別并裂解(1)在具有已知突變的核酸片段中或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行；和(c)測定步驟(b)(ii)中的催化性核酸分子是否裂解擴增的片段，以確定受試者是否患有該疾病。
2.測定受試者是否患有其特征在于存在多種已知核酸突變的疾病的方法，它包括步驟(a)從受試者分離核酸分子樣品；(b)(i)擴增在分離的樣品中存在的核酸片段，該片段已知含有在患有該疾病的受試者中存在的多種突變，和(ii)在合適的條件下，將所得的擴增片段與多種催化性核酸分子接觸，其中各催化性核酸分子特異性地識別并裂解(1)在具有已知突變的核酸片段中或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行；和(c)測定步驟(b)(ii)中的各催化性核酸分子是否裂解擴增的片段，以確定受試者是否患有該疾病。
3.測定受試者是否患有其特征在于存在多種已知核酸突變的疾病的方法，它包括步驟(a)從受試者分離核酸分子樣品；(b)(i)擴增在分離的樣品中存在的核酸片段，這些片段已知共同含有在患有該疾病的受試者中存在的多種突變，和(ii)在合適的條件下，將所得的擴增片段與多種催化性核酸分子接觸，其中各催化性核酸分子特異性地識別并裂解(1)在具有一種已知突變的一種核酸片段中或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行；和(c)測定步驟(b)(ii)中的各催化性核酸分子是否裂解含有其各自靶序列的擴增片段，以確定受試者是否患有該疾病。
4.權利要求1，2或3的方法，其中受試者是人類。
5.權利要求1，2或3的方法，其中疾病選自癌癥，AIDS和囊性纖維化。
6.權利要求5的方法，其中該疾病是癌癥。
7.權利要求1，2或3的方法，其中擴增的核酸片段是RNA，且催化性核酸分子選自DNA和RNA。
8.權利要求1，2或3的方法，其中擴增的核酸片段是DNA，催化性核酸分子是RNA或DNA。
9.權利要求1，2或3的方法，其中(a)使用聚合酶鏈反應進行擴增；(b)催化性核酸分子是10-23DNAzyme；和(c)聚合酶鏈反應采用適于起動該片段擴增的DNA引物，該引物含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，它用作被10-23DNAzyme識別和裂解的擴增片段內(nèi)的5′側位點。
10.權利要求9的方法，其中擴增片段被DNAzyme反式識別和裂解。
11.權利要求9的方法，其中(a)聚合物鏈反應采用一種適于起動該片段擴增的第二DNA引物，該第二引物包含編碼10-23 DNAzyme的酶基因，以便擴增時，所得的擴增的核酸分子包含10-23 DNAzyme；和(b)擴增的核酸片段被DNAzyme順式識別和裂解。
12.用于實施權利要求1，2或3的方法的試劑盒，包含(a)一種催化性核酸分子，它特異性地識別和裂解(i)在具有已知是一種疾病的特征的突變的核酸片段中或(ii)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，和(b)一種核酸試劑，它適用于擴增含有靶序列的核酸片段。
13.用于實施權利要求9的方法的試劑盒，包含(a)10-23 DNAzyme，它特異性地識別和裂解(i)在具有已知是一種疾病特征的突變的核酸片段中或(ii)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，和(b)適于在聚合酶鏈式反應條件下起動該片段擴增的DNA引物，該引物含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，它用作被10-23 DNAzyme識別和裂解的擴增片段內(nèi)的5′側位點。
14.用于實施權利要求11的方法的試劑盒，包括(a)第一DNA引物，它包含編碼10-23 DNAzyme的酶基因，該10-23DNAzyme特異性地識別和裂解(i)在已知是一種疾病特征的突變的核酸片段中或(ii)在相應的野生型核酸片段中，但不是同時在兩者中存在的靶序列，該第一引物適于在聚合酶鏈式反應條件下起動該片段的擴增；和(b)一種第二DNA引物，它適于在聚合酶鏈式反應條件下起動該片段的擴增，該第二引物含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，它用作被10-23 DNAzyme識別和裂解的擴增片段內(nèi)的5′側位點，以便在擴增時，(i)所得的擴增的核酸分子包含10-23 DNAzyme，和(ii)擴增的核酸片段被DNAzyme順式識別和裂解。
全文摘要
本發(fā)明提供了測定受試者是否患有其特征在于存在處或多處已知核酸突變的疾病的方法和試劑盒,該方法包括如下步驟:分離核酸分子樣品;擴增接觸所得的擴增片段與一種或多種催化性核酸分子,每種催化性核酸分子均特異性地裂解(1)病歷中,或(2)在相應的野生型核酸片段中,但不是兩者中存在的靶序列,前提是步驟(ⅱ)可在步驟(ⅰ)之后或同時進行;測定步驟擴增片段的裂解。
文檔編號G01N33/48GK1327070SQ0012257
公開日2001年12月19日 申請日期2000年6月3日 優(yōu)先權日2000年6月3日
發(fā)明者A·V·托德, C·J·菲里, M·J·凱恩斯 申請人:莊臣及莊臣研究股份有限公司