專(zhuān)利名稱：：Ⅱ型膠原酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體涉及到一種Ⅱ型膠原酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析方法。眾所周知，Ⅱ型膠原是一種大分子蛋白，主要存在于人體的透明軟骨中，軟骨中80-90％的結(jié)構(gòu)成分是Ⅱ型膠原，當(dāng)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨降解，軟骨中Ⅱ型膠原丟失并釋放進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中Ⅱ型膠原濃度增加，當(dāng)前世界范圍內(nèi)老年人口逐年增加，隨著社會(huì)的老齡化，骨性關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，目前，對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎的早期診斷，軟骨降解的變化規(guī)率及關(guān)節(jié)炎手術(shù)后效果的判斷等許多方面的國(guó)內(nèi)外的研究都非常欠缺，其原因就是沒(méi)有一種穩(wěn)定性、敏感性及特異性都較高的測(cè)定軟骨膠原含量的檢測(cè)方法，近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)Ⅱ型膠原含量的測(cè)定也進(jìn)行了一些研究，1993年，美國(guó)雜志《免疫方法學(xué)》第159期上公開(kāi)了一種用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)法測(cè)定Ⅱ型膠原，從理論上探討了Ⅱ型膠原測(cè)定的方法，但是，這種方法僅限于對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中抗原的含量以及關(guān)節(jié)軟骨樣品中抗原含量的測(cè)定，而且測(cè)定結(jié)論對(duì)于了解關(guān)節(jié)軟骨中軟骨降解的病理變化規(guī)律，探討早期診斷指標(biāo)及關(guān)節(jié)病變的嚴(yán)重程度，只能起到在理論上分析研究的作用，應(yīng)用范圍較窄，如作為指導(dǎo)改進(jìn)治療方法的依據(jù)，則還不夠全面和充分。在酶聯(lián)免疫分析中，對(duì)于各類(lèi)的抗原測(cè)定，通常采用的是雙抗體夾心法，即選用兩種不同的單克隆抗體對(duì)樣品抗原進(jìn)行夾心測(cè)定，這種測(cè)定方法需要選配同種異型兩株抗二型膠原的抗體，比較復(fù)雜，當(dāng)僅有一株抗體時(shí)這種方法就不能應(yīng)用，使用范圍受到限制。本發(fā)明的目的是提供一種具有較高穩(wěn)定性、靈敏度及特異性的Ⅱ型膠原酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析方法，利用該方法可以只用一株單克隆抗體就可夾心進(jìn)行血清中Ⅱ型膠原含量的測(cè)定。本發(fā)明是利用多種試劑對(duì)酶聯(lián)免疫用96孔板采用免疫學(xué)抗原檢測(cè)原理對(duì)血清樣品Ⅱ型膠原測(cè)定，本發(fā)明的目的是通過(guò)下述方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其特點(diǎn)在于包括下列步驟(1)包板用Ph9．6，50mMol／l的碳酸鹽緩沖液稀釋鼠抗人Ⅱ型膠原Ⅱ-4C11單克隆抗體，濃度為4ug／ml，將抗體包被液加入酶聯(lián)板中200ul／孔，放37℃1小時(shí)，或放4℃過(guò)夜。(2)洗板將板內(nèi)包被液棄去，用洗板機(jī)每孔加入洗液300ul，洗板3次；如人工洗板，則洗板5次，每次放置5分種。(3)封板每孔加入滅活正常兔血清封板液200ul，放室溫(25℃左右)2小時(shí)。(4)洗板同步驟(2)(將板放入0-4℃冰箱待用)。(5)加樣將人或動(dòng)物樣品及質(zhì)控血清用分析緩沖液稀釋50倍，然后取100ul分別加入每孔，放37℃孵育2小時(shí)。(6)洗板同步驟(2)。(7)加入抗體將鼠抗人Ⅱ型膠原Ⅱ-C4ll單克隆抗體用50mM，PH7．4的分析緩沖液稀釋成3ug／ml，向板中每孔加入100ul，放37℃孵育1小時(shí)。(8)洗板同步驟(2)。(9)用50mM，PH7．4的分析緩沖液將酶標(biāo)羊抗鼠IgG做1∶1000的稀釋?zhuān)虬逯忻靠准尤?00ul，放37℃孵育0．5小時(shí)。(10)洗板同步驟(2)反復(fù)3次。(11)取等體積A，B底物液混均，每孔加入200ul，放室溫15-20分種。(12)加入終止液，每孔50ul。(13)用酶免測(cè)定儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光率。在上述步驟中，其中封板液的配制，采用滅活正常兔血清將正常兔血清放62℃20分種，加入0．05M固體Tris，0．15M氯化納(NaCL)及2M氯化氫(HCL)，將Ph調(diào)至8．0，制成封板液。底物液的配制(1)Ph5．0檸檬酸-磷酸緩沖液(A液)0．1M檸檬酸24．3ml；0．2M磷酸氫二鈉(Na2HPO4)25．7ml；50ml雙蒸水，30％過(guò)氧化氫(H2O2)50ul。(2)配制TMB溶液(B液)；25mg3’3’5’5’四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于4ml二甲基椏楓中，再加入96ml50mmol／LPh2．4檸檬酸。用時(shí)取等體積A，B底物液混均。在采用上述方法，對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎患者及正常人的血清樣品進(jìn)行Ⅱ型膠原的半定量測(cè)定或者是對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎手術(shù)前后血清樣品進(jìn)行Ⅱ型膠原的測(cè)定，以及對(duì)豚鼠血清樣品中Ⅱ型膠原的測(cè)定，其結(jié)果是通過(guò)吸光率測(cè)定得出多組吸光度數(shù)值，從而間接得出Ⅱ型膠原的含量，并通過(guò)多組數(shù)值的對(duì)比分析，就可了解軟骨降解的病理變化規(guī)律及關(guān)節(jié)病的嚴(yán)重程度，并可作為改進(jìn)治療方法的依據(jù)。由于本發(fā)明首次利用血清進(jìn)行Ⅱ型膠原酶聯(lián)免疫測(cè)定，并且只使用一株單克隆抗體進(jìn)行對(duì)膠原的夾心測(cè)定使得在僅有一株單抗的有限條件下也可對(duì)Ⅱ型膠原進(jìn)行半定量的檢測(cè)，擴(kuò)大了檢測(cè)的應(yīng)用范圍，同時(shí)由于對(duì)血清能夠進(jìn)行Ⅱ型膠原含量測(cè)定，不但較準(zhǔn)確地反映出手術(shù)前后軟骨病理變化規(guī)律，也可以正確評(píng)價(jià)手術(shù)效果，即有重要的理論價(jià)值，又有廣泛的實(shí)際應(yīng)用意義。下面結(jié)合實(shí)施例詳述本發(fā)明。一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備1．血清樣品A．骨性關(guān)節(jié)炎患者血清65例正常人對(duì)照組血清24例B．骨性關(guān)節(jié)炎手術(shù)前血清24例骨性關(guān)節(jié)炎手術(shù)后血清24例C．骨性關(guān)節(jié)炎患者截骨術(shù)前，截骨術(shù)后半年、一年的血清樣品各11份。D．豚鼠血清樣品包括1月齡(正常軟骨)組，3月齡(破壞軟骨)8月齡(重度破壞軟骨)組，每組10例。2．酶聯(lián)免疫標(biāo)準(zhǔn)用96孔板。3．試劑制備(1)鼠抗人Ⅱ型膠原Ⅱ-4Cll單克隆抗體一株。(2)配置Ph9．6，50mMol／l碳酸鹽包被緩沖液碳酸鈉Na2CO31．59g；碳酸氫鈉NaHCO32．93g；加雙蒸水1000ml，放4℃保存。(3)配置Ph7．4的磷酸鹽緩沖液為洗板液(PBST)氯化鈉(NaCL)2g；磷酸二氫鉀(KH2PO4)0．2g；磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)2．9g；氯化鉀(KCL)O．2g；加雙蒸水1000ml；加吐溫(Tween)20；0．5ml(加量要準(zhǔn))，放4℃保存。(4)封板液配制，采用滅活正常兔血清，將正常兔血清放62℃20分鐘，加入0．05M固體Tris，0．15M氯化納(NaCL)及2M氯化氫(HCL)，將Ph調(diào)至8．0，制成封板液備用。(5)配置50mMol／lPh7．4的分析緩沖液(PBS)氯化鈉(NaCL)2g；磷酸二氫鉀(KH=PO4)0．2g，磷酸氫二納(Na2HPO412H2O)2．9g；氯化鉀(KCL)0．2g；牛血清白蛋白(BSA)2g及9g氯化鈉(NaCL)，加雙蒸水至1000ml；放4℃保存。(6)羊抗鼠IgG的制備首稱用鹽析法純化出正常鼠血清中的IgG，再按常量免疫法制備出羊抗鼠抗血清，取出抗血清后，再用鹽析法分離純化出羊抗鼠IgG，放-20℃保存。(7)酶標(biāo)羊抗鼠IgG的制備，采用改良過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記。加入BSA補(bǔ)到10mg／ml蛋白濃度，再分管低溫保存?zhèn)溆谩?8)底物液配制A液(Ph5．0檸檬酸-磷酸緩沖液)0．1M檸檬酸24．3ml；0．2M磷酸氫二鈉(Na2HPO4)25．7ml；50ml雙蒸水；30％過(guò)氧化氫(H2O2)50ul。B液(TMB溶液)25mg3’3’5’5’四甲基聯(lián)苯胺溶于4ml二甲基椏楓中再加入96ml50mmol／LPh2．4檸檬酸。用時(shí)取等體積A、B底物液混均。(9)終止液2N氯化氫(HCL)。操作步驟采用本發(fā)明方法步驟(1)-(13)進(jìn)行操作，其中在步驟(5)中加入不同的經(jīng)50倍稀釋的各組血清樣品，分別進(jìn)行Ⅱ型膠原的測(cè)定，得出不同的測(cè)試數(shù)據(jù)，見(jiàn)下表表1正常人與骨性關(guān)節(jié)炎患者血清指標(biāo)比較<tablesid="table1"num="001"><table>項(xiàng)目正常人(n=24)患者總數(shù)(n=65)A組(n=9)B組(n=12)C組(n=33)D組Ⅱ型膠原(OD450)2．48±0．873．37±1．002．8±1．183．95±1．153．45±0．862．96±1．03</table></tables>表2骨性關(guān)節(jié)炎手術(shù)前后血清指標(biāo)的比較表311例截骨術(shù)的骨性關(guān)節(jié)炎患者手術(shù)后半年、一年與述前顯著性比較<tablesid="table2"num="002"><table>項(xiàng)目術(shù)前術(shù)后半年術(shù)后一年Ⅱ型膠原3．87±0．813．70±0．763．39±0．86</table></tables>表4在雌性豚鼠原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中的應(yīng)用(不同階段關(guān)節(jié)軟骨與正常軟骨的比較)<tablesid="table3"num="003"><table>項(xiàng)目1月齡，電鏡下正常軟骨(一組)3月齡，電鏡下重度破壞軟骨(二組)8月齡，電鏡下重度破壞軟骨(三組)Ⅱ型膠原OD4500．74±0．1621．306±0．551．193±0．37</table></tables>通過(guò)表1中的數(shù)值可看出患者及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中Ⅱ型膠原含量反映出的吸光度數(shù)值比正常人的數(shù)值明顯增加，對(duì)于豚鼠動(dòng)物的測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論，而對(duì)于手術(shù)后患者血清中Ⅱ型膠原含量的吸光度數(shù)值則明顯低于手術(shù)前的患者，對(duì)于這些結(jié)論則證明了本發(fā)明具有較高的穩(wěn)定性，靈敏度及特異性，其靈敏度在本實(shí)驗(yàn)使用的血清經(jīng)50倍稀釋后，正常人范圍OD450值在A3．35-1．61之間，而特異性在本方法與Ⅰ型膠原的反應(yīng)為0．1％，精密度指標(biāo)為測(cè)定的批內(nèi)變異系數(shù)為6．3％，批間變異系數(shù)為9．8(n)，證明了本方法有很好的可重復(fù)性，穩(wěn)定性高。權(quán)利要求1．一種Ⅱ型膠原酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析方法，其特征在于包括下列步驟(1)包板用Ph9．6，50mMol／l的碳酸鹽緩沖液稀釋鼠抗人Ⅱ型膠原Ⅱ-4C11單克隆抗體，濃度為4ug／ml，將抗體包被液加入酶聯(lián)板中200ul／孔，放37℃1小時(shí)，或放4℃過(guò)夜；(2)洗板將板內(nèi)包被液棄去，用洗板機(jī)每孔加入洗液300ul，洗板3次；如人工洗板，則洗板5次，每次放置5分種；(3)封板每孔加入滅活正常兔血清封板液200ul，放室溫(25℃左右)2小時(shí)；(4)洗板同步驟(2)(將板放入0-4℃冰箱待用)；(5)加樣將人或動(dòng)物樣品及質(zhì)控血清用分析緩沖液稀釋50倍，然后取100ul分別加入每孔，放37℃孵育2小時(shí)；(6)洗板同步驟(2)；(7)加入抗體將鼠抗人Ⅱ型膠原Ⅱ-C411單克隆抗體用50mM，PH7．4的分析緩沖液稀釋成3ug／ml，向板中每孔加入100ul，放37℃孵育1小時(shí)；(8)洗板同步驟(2)；(9)用50mM，PH7．4的分析緩沖液將酶標(biāo)羊抗鼠IgG做1∶1000的稀釋?zhuān)虬逯忻靠准尤?00ul，放37℃孵育0．5小時(shí)；(10)洗板同步驟(2)反復(fù)3次；(11)取等體積A，B底物液混均，每孔加入200ul，放室溫15-20分種；(12)加入終止液，每孔50ul；(13)用酶免測(cè)定儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光率。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于所述封板液的配制為采用滅活正常兔血清將正常兔血清放62℃20分種，加入0．05M固體Tris，0．15M氯化納(NaCL)及2M氯化氫(HCL)，將Ph調(diào)至8．0。3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于所述的底物液的配制為(1)Ph5．0檸檬酸-磷酸緩沖液(A液)0．1M檸檬酸24．3ml；0．2M磷酸氫二鈉(Na2HPO4)25．7ml；50ml雙蒸水，30％過(guò)氧化氫(H2O2)50ul；(2)配制TMB溶液(B液)25mg3’3’5’5’四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于4ml二甲基椏楓中，再加入96ml50mmol／LPh2．4檸檬酸。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種Ⅱ型膠原酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析方法,利用一株單克隆抗體通過(guò)抗體包板、洗板、封板、加樣、再加入同一株抗體、加入酶標(biāo)二抗及底物液后加入終止液,測(cè)定吸光率等程序步驟,對(duì)關(guān)節(jié)炎患者或動(dòng)物的血清進(jìn)行Ⅱ型膠原吸光度的測(cè)定,通光多組測(cè)定值與正常值進(jìn)行比較,就可得出Ⅱ型膠原含量的半定量結(jié)果,從而就可了解軟骨降解的病理變化規(guī)律,正確評(píng)價(jià)手術(shù)效果,具有廣泛的應(yīng)用意義。文檔編號(hào)G01N33/535GK1289924SQ0013013公開(kāi)日2001年4月4日申請(qǐng)日期2000年10月16日優(yōu)先權(quán)日2000年10月16日發(fā)明者趙丹惠,李成文,張艷,姚力申請(qǐng)人:北京市創(chuàng)傷骨科研究所