專利名稱：鑒定蛋白質的方法、裝置和系統(tǒng)的制作方法
相關申請交叉文獻本申請是1999年2月2日提交的美國專利申請09/243,149的部分續(xù)展申請，該文的全部公開內容納入本文作為參考。
背景技術：
鑒定生物學化合物是努力了解生命、了解維持生命的過程以及影響這些過程的活動和元素所必需的。通常，了解生命過程和控制生命過程的努力首先側重于了解生命的基礎構件模塊，即將活生物與純粹的無生命原始軟泥區(qū)別開來的大分子化合物和復合物。在了解和控制生命過程中特別值得感興趣的是核酸及其編碼的蛋白質。
對于蛋白質，數(shù)十年來，許多鑒定方法基本上保持不變。例如，目前的蛋白質鑒定方法通常至少部分依靠十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(即SDS-PAGE)通過其相對分子量來鑒定蛋白質。這些方法采用了交聯(lián)聚丙烯酰胺板或片。將待分離鑒定的蛋白質與含洗滌劑的緩沖液(SDS)混合，并置于凝膠板的一邊(通常在孔中)。施加跨越該板的電場，將含有蛋白質的帶大量電荷的洗滌劑膠束吸引通過凝膠。較大的蛋白質移動通過平板凝膠的速度比較小蛋白質慢，從而從較大的膠束中分離出來。分離后，使凝膠與染色劑接觸，該染料通常是“考馬斯藍”或銀絡合劑，它們與凝膠中的不同蛋白質結合。在考馬斯藍染色的凝膠中，必須對平板凝膠進行脫色，以除去過量的染色劑。這些方法在平板凝膠上產(chǎn)生了根據(jù)大小分開的不同蛋白質的梯條帶。同樣，銀染法也很耗時間，通常產(chǎn)生定性而非定量的染色凝膠。對這些方法進行改進產(chǎn)生了操作更迅速的較小的凝膠、購買后就可使用的凝膠以及其它染色方法。然而，基礎的SDS-PAGE方法作為蛋白質鑒定方法仍然基本上沒有變化。
人們已經(jīng)作了許多努力，試圖將其它領域得到的進展應用于蛋白質鑒定。例如在核酸分析中獲得成功的毛細管電泳方法已被嘗試用于鑒定蛋白質。盡管已證實這些方法能用于分離蛋白質，但是可獲得的標記化學物質的差別以及蛋白質與核酸之間的基礎結構和化學上的差別都給毛細管電泳方法在蛋白質鑒定中的廣泛使用帶來了很大障礙。具體地說，要檢測移動通過毛細管的分離的蛋白質通常需要標記基團通過相當復雜的化學原理與所有蛋白質都共價連接。另外，在蛋白質分離中確保根據(jù)大小進行分離而存在的SDS給在毛細管系統(tǒng)進行標記和分離帶來了困難。
因此，希望提供處理量和靈敏度有所提高、而對空間、時間和試劑要求降低的鑒定蛋白質和多肽的方法、裝置、系統(tǒng)和試劑盒。本發(fā)明滿足了這些需要以及其它各種需要。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供對第一液體樣品材料進行分析操作的方法。該方法通常包括提供微流體裝置，該裝置具有一個體部，體部內至少有一個第一通道。該第一通道包括第一和第二通道段，第一通道段包括與進行第一操作相容的第一液體環(huán)境。第一樣品材料流動經(jīng)過第一通道段進行第一操作。然后，它從第一通道段流入第二通道段。第一稀釋劑流入第二通道段，該稀釋劑在第二通道段產(chǎn)生了第二液體環(huán)境，該第二環(huán)境比第一環(huán)境更與第二操作相容。
在一個有關的方面，本發(fā)明提供對樣品材料進行分析操作的裝置。該裝置通常包括一個體部結構，該體部內部有第一通道段，該第一通道段含有第一環(huán)境。該裝置還包括在體部內與第一通道段液體相連的第二通道段。至少第一稀釋劑源也與第二通道段呈液體相連。該裝置通常還包括一個用于將第一稀釋劑輸送入第二通道段為第二通道段內提供第二環(huán)境的與第一稀釋劑源可操作相連的流量控制器。
本發(fā)明另一方面提供一種鑒定多肽的方法，該方法包括提供其中裝有分離緩沖液的第一毛細管通道。該分離緩沖液包含聚合物基質、緩沖劑、洗滌劑和親脂性染料。將多肽引入毛細管通道的一端。施加跨越毛細管通道長度的電場，使不同大小的多肽以不同的速度輸送通過聚合物基質。然后當多肽經(jīng)過沿毛細管通道長度的某點時檢測多肽。
本發(fā)明另一方面是一種分離多肽的裝置。該裝置包括一個體部結構，該體部結構有至少其中含分離緩沖液的第一毛細管通道。該分離緩沖液包含聚合物基質、緩沖劑、洗滌劑以及能與一種或多種多肽結合的親脂性染料。體部結構中的一個端口與第一毛細管通道液體相連溝通，以便將多肽引入第一毛細管通道。
本發(fā)明另一方面是用于鑒定多肽的試劑盒。該試劑盒包括一個微流體裝置，該裝置包含上述裝置的諸元件。分離緩沖液包含聚合物基質、緩沖劑和親脂性染料。每一包裝含有體部結構、分離緩沖液和親脂性染料。
本發(fā)明另一方面是鑒定多肽的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括一個體部結構，該體部結構中有至少其中含有分離緩沖液的第一毛細管通道。分離緩沖液包含聚合物基質、緩沖劑、洗滌劑和親脂性染料。電源與第一毛細管通道的相對末端操作性相連，以便施加跨越毛細管通道長度的電場。檢測器在第一點與毛細管通道傳感溝通，以便當多肽通過該第一點時檢測多肽。
附圖簡述

圖1描述了結合本發(fā)明使用的微流體裝置。
圖2描述了本發(fā)明用于鑒定多肽的整個系統(tǒng)。
圖3描述了用于在給定緩沖液中測定臨界膠束濃度的熒光強度對洗滌劑濃度的曲線。
圖4描述了用本發(fā)明方法在微流體裝置中進行的蛋白質分離色譜圖。該色譜圖展示成模擬凝膠的形式，顯示出12個分開的分離物，每一個在模擬凝膠的一個分開的泳道。
圖5是圖4所示分離的蛋白質標準品分子量對數(shù)值對遷移時間的曲線。
圖6是顯示洗滌劑-染料前沿峰的分子量標準品色譜圖。
圖7示意性地描述了根據(jù)本文描述的方法進行分離后處理的微流體裝置。
圖8(A-D)顯示了說明分離后稀釋效果的分離數(shù)據(jù)曲線。
發(fā)明詳述I.方法、裝置和試劑A.綜述本發(fā)明提供了用于鑒定多肽、蛋白質及其片段(本文總稱“多肽”)的方法、裝置、系統(tǒng)和試劑盒。本發(fā)明的方法、裝置、系統(tǒng)和試劑盒特別適用于通過多肽電泳遷移通過毛細管通道內含的聚合物分離基質根據(jù)其分子量來鑒定多肽(通常也統(tǒng)稱為“毛細管電泳”)。
如上所述，已有人嘗試用毛細管電泳方法來分離蛋白質和多肽。由于毛細管電泳采用封閉的系統(tǒng)(例如毛細管)，因此，蛋白質通常在分離前進行標記。這通常是采取標記基團與待分離混合物中所有蛋白質共價相連的形式。一旦分離后，就可檢測每個蛋白質上的標記。共價標記技術通常涉及到復雜的化學機理，至少在分離蛋白質之前需要額外的步驟。另外，標記物通常是相當大的結構，它可能會對蛋白質分子量的測定有不利的影響。盡管有人曾嘗試用非共價締合性染料，但是這些嘗試的結果大都不令人滿意。
然而，至少本發(fā)明第一方面提供了用毛細管電泳方法來鑒定和/或分離蛋白質的方法，該方法迅速、可重復，且在進行分離前沒有復雜的樣品準備步驟。具體地說，本發(fā)明方法提供了第一毛細管通道，該通道內有分離緩沖液，該分離緩沖液包含聚合物基質、緩沖劑、洗滌劑和親脂性染料。根據(jù)本發(fā)明的較佳方案，洗滌劑和緩沖劑在分離緩沖液中的濃度為等于或低于臨界膠束濃度(“CMC”)。通過維持洗滌劑和緩沖劑濃度等于或低于CMC，就可最大程度地減少染料與洗滌劑膠束結合等不利影響。不希望受具體操作理論的束縛，認為在以前描述的毛細管系統(tǒng)中染料與洗滌劑膠束的結合產(chǎn)生了很大的本底信號，并且在分離期間產(chǎn)生了不規(guī)則信號，例如在信號基線上下擾動(bumps and dips)。相反，本發(fā)明方法仔細地控制了系統(tǒng)各組件，從而避免或最大程度地減少了這些不良作用。特別佳的是，至少在操作待檢測的分離的組分位置處，使緩沖劑和洗滌劑的水平等于或低于CMC，得以避免染料與膠束結合而產(chǎn)生較高的本底信號。這可以使整個系統(tǒng)維持和/或運行在低于CMC的水平下(如緩沖液和洗滌劑濃度)來實現(xiàn)，或可通過原位處理樣品、緩沖液、洗滌劑流體(例如稀釋、加入試劑或用其它方式改變溶液)使該系統(tǒng)受檢測部分的分離緩沖液降低至低于CMC的水平。
在實踐中，通常對待分析和/或鑒定的蛋白質或多肽樣品進行預處理，用洗滌劑使蛋白質變性并足量地包裹蛋白質，并對樣品中包裹的蛋白質充分地標記。
然后將待鑒定的蛋白質或多肽(或待分離的多肽混合物)加入毛細管通道中，通常在通道段一端。通過施加跨越毛細管通道長度的電場，不同大小的多肽將以不同的速度遷移通過聚合物溶液。包裹在洗滌劑中、結合大量電荷的多肽將以一個方向遷移通過毛細管通道。然而，不同分子量的多肽將以不同的速度遷移通過聚合物溶液，從而被分離。在移動通過通道內分離緩沖液的時候，多肽將吸納分離緩沖液中的親脂性染料，并攜帶有例如在樣品預處理、稀釋等步驟中任選加入樣品的締合的染料。
至于分離，一旦相互分開，就可在毛細管通道中多肽引入位置下游的某部位利用結合的親脂性染料來檢測多肽(在此部位多肽結合了一定水平的締合性親脂性染料)。
B.樣品預處理如上所述，在鑒定前，通常用含有合適洗滌劑的緩沖液對含有蛋白質或多肽的樣品進行預處理。特別佳的是用以下緩沖液對多肽樣品混合物進行預處理，該緩沖液所含緩沖劑、洗滌劑與分離緩沖液相同，以確保蛋白質在分離前變性。蛋白質變性確保了它在分離期間是線狀分子，從而使蛋白質的分離圖與其分子量更密切相關，而不論天然蛋白質是球形、線性、絲狀還是具有其它一些構型。預處理通常在洗滌劑存在下進行，該洗滌劑的濃度高于樣品中的蛋白質濃度(w/v)，較佳的是高于樣品蛋白質濃度(w/v)的1.4倍。
為了避免洗滌劑結合染料的干擾影響，通常宜以洗滌劑(其濃度低于或約等于電泳緩沖液中洗滌劑濃度，是電泳緩沖液中洗滌劑濃度的0.05倍到大約3倍)進行樣品預處理。
較佳的，預處理緩沖液中的SDS濃度低于電泳緩沖液中所用的濃度。因此，樣品預處理通常在濃度約為0.05-2％(較佳的約0.05-1％，更佳的小于0.5％)的洗滌劑存在下進行。如果上樣樣品中的樣品材料以1∶2到1∶20的稀釋度稀釋，這將使上樣樣品中的洗滌劑水平在大約0.0025％-1％之間，較佳的在大約0.0025％-0.5％之間，更佳的小于大約0.5％。
這些水平與常規(guī)的SDS-PAGE分離相反(在常規(guī)SDS-PAGE中，樣品在比分離緩沖液高5-20倍的洗滌劑濃度下進行預處理)。具體地說，對于典型的SDS-PAGE方法，樣品預處理通常在洗滌劑(如SDS)濃度為2％或更高的50mM加樣緩沖液中進行(例如參見美國專利5,616,502)，而電泳緩沖液只含0.1％洗滌劑。然而，在本文所述的毛細管系統(tǒng)中，當加樣緩沖液中采用比電泳緩沖液高的洗滌劑水平時，產(chǎn)生了大得多的干擾性洗滌劑前沿，它會與分子量在所需范圍內的多肽一起被共同洗脫。例如，圖6顯示了一套分子量標準品的色譜圖(見下文實施例部分)。在下文實施例中，與洗滌劑前沿相結合的峰在大約43秒處洗脫，它對應于分子量60-70kD范圍內的蛋白質或多肽的洗脫時間，這是在蛋白質分析中很重要的分子量范圍。
通過降低樣品預處理步驟中的洗滌劑濃度，還可減少干擾峰。盡管本領域中以前堅持認為樣品預處理需要高水平的洗滌劑(例如2％或更高)，但降低洗滌劑濃度已被證實是有效的。另外，根據(jù)本文設置的參數(shù)來控制樣品預處理以及分離緩沖液的離子強度和洗滌劑濃度，可以在一定程度上控制洗滌劑前沿的洗脫曲線，例如使其在待鑒定的多肽之前或之后洗脫。
另外，在較佳的方面，用于預處理的洗滌劑與分離緩沖液中所用的洗滌劑相同(如SDS)。通常，預處理條件可根據(jù)總體分離條件(如待分離蛋白質的性質、樣品所處的介質如緩沖液和鹽濃度等，如下文分離緩沖液部分所述)而異。具體地說，SDS和鹽濃度可在如本文所述的參數(shù)內變化，以便針對給定的分離操作進行優(yōu)化。
B.分離緩沖液根據(jù)本發(fā)明，分離緩沖液被用于實施本文所述的方法，該緩沖液包含聚合物基質、緩沖劑、洗滌劑和親脂性染料。本發(fā)明可采用各種聚合物，包括交聯(lián)的和或可膠凝的聚合物。然而，較佳的是采用非交聯(lián)的聚合物作為聚合物基質。適用于本發(fā)明所述方法的非交聯(lián)的聚合物溶液以前曾描述用于毛細管電泳分離核酸(例如參見美國專利No.5,246,101，5,552,028，5,567,292和5,948,227，這些專利均納入本文作為參考)。這些非交聯(lián)的或“線狀”聚合物比交聯(lián)的或膠凝的聚合物更好的優(yōu)點是易于使用。具體地說，由于這些聚合物溶液的液體性質，它們更容易引入毛細管通道內，使用方便，而膠凝的聚合物通常需要聚合物在毛細管內發(fā)生交聯(lián)反應。
通常，最常用的非交聯(lián)聚合物溶液是聚丙烯酰胺聚合物，它宜為聚二甲基丙烯酰胺聚合物溶液，可以是中性、帶正電或帶負電。特別佳的是使用帶負電的聚二甲基丙烯酰胺聚合物，例如聚二甲基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物(例如參見美國專利5,948,227)。令人驚奇的是，采用聚二甲基丙烯酰胺聚合物溶液不會導致弄臟毛細管系統(tǒng)中正在分離的蛋白質/多肽。不希望受具體理論的束縛，認為該聚合物溶液在本文所述的系統(tǒng)中具有兩個功能。第一個功能是提供一個基質，較大物質移動遷移通過該基質比較小物質所受阻礙更大。這些聚合物溶液的第二個功能是降低或消除毛細管通道內物質的電滲透流動。認為聚合物溶液是通過吸附到毛細管表面而阻斷殼套流動(sheath flow)(這是電滲透流動的特征)來實現(xiàn)這一點的。
通常，非交聯(lián)的聚合物在分離緩沖液中的濃度在大約0.01％-30％(w/v)之間。當然，根據(jù)待進行的分離類型(如待鑒定的多肽的性質和/或大小)、進行分離的毛細管通道大小等，可采用不同的聚合物濃度。對于大多數(shù)多肽的分離而言，較佳的分離緩沖液中聚合物的濃度為大約0.01％-20％，更佳的在大約0.01％-10％之間。
聚合物溶液中聚合物的平均分子量在一定程度上因聚合物溶液所需應用場合而異。例如，需要較高分辨率的應用場合可采用較高分子量的聚合物溶液，而嚴謹度較低的應用場合可采用較低分子量的聚合物溶液。通常，本發(fā)明所用聚合物溶液的平均分子量在大約1-6000kD范圍內，較佳的在大約1-1000kD之間，更佳的在大約100-1000kD之間。
除了上述電荷百分數(shù)和分子量，用于本發(fā)明的聚合物另一特征為其粘度。具體地說，本文所述系統(tǒng)的聚合物組分當用于毛細管通道內時通常具有在大約2-1000厘泊范圍內的溶液粘度，較佳的在大約2-200厘泊范圍內，更佳的在大約5-100厘泊范圍內。
除了加入非交聯(lián)聚合物溶液外，本發(fā)明所用分離緩沖液中還可包含緩沖劑、洗滌劑和親脂性染料。
如前所述，多肽的理化性質、尤其是它們的荷質比有很大不同，這取決于它們的氨基酸組成。因此，不同的多肽在施加的電場下通常有不同的電泳遷移率。因此，蛋白質和其它多肽的電泳分離通常利用了在電泳緩沖液中的洗滌劑，以確保所有蛋白質/多肽在電場下以相同方向遷移。例如，在典型的蛋白質分離(如SDS-PAGE)中，樣品緩沖液中加入了洗滌劑(十二烷基硫酸鈉或SDS)。樣品中的蛋白質/多肽被洗滌劑包裹，從而向各種蛋白質/多肽提供了大量負電荷。然后，帶負電的蛋白質/多肽在電流作用下向陰極遷移。然而，在篩選基質存在時，較大蛋白質的移動比較小蛋白質慢，從而使它們分離。
根據(jù)本發(fā)明的某些方面，對分離緩沖液的每一種洗滌劑、緩沖劑和染料組分都進行選擇并以一定濃度提供，以最大程度地減少它們之間的不利的相互作用(該相互作用可能干擾蛋白質或多肽的分離和鑒定，例如降低分離效率、信號靈敏度、產(chǎn)生異常的信號等)。具體地說，緩沖劑和洗滌劑通常以能優(yōu)化多肽分離效率、但最大程度地減小本底信號和基線信號不規(guī)則性的濃度來提供。如前所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在毛細管分離期間染料與洗滌劑膠束結合產(chǎn)生了高水平的本底信號，并產(chǎn)生了各種基線不規(guī)則現(xiàn)象，如上下擾動。
因此，在第一方面，通過使緩沖液中緩沖劑和洗滌劑的濃度低于洗滌劑開始形成過量獨立膠束(該膠束可結合染料)時的濃度，實現(xiàn)多肽的分離和/或鑒定。開始形成膠束時的濃度稱為臨界膠束濃度(“CMC”)。也就是說，CMC是可獲得的最高的單體洗滌劑濃度，因此是可能獲得的最高的洗滌劑濃度。Helenius dr，Methods in Enzymol.56(63)734-749(1979)。
洗滌劑溶液的CMC隨非極性部分(或烴尾部)大小的增加而減小，在較小程度上隨極性基團的大小和極性而減小。Helenius等人，同上。因此，洗滌劑溶液是高于還是低于其CMC不僅取決于洗滌劑濃度，而且還取決于溶液中對CMC可能有影響的其它組分(即緩沖劑)的濃度以及整個溶液的離子強度。因此，在本發(fā)明的方法、系統(tǒng)和裝置中，分離緩沖液具有一定的洗滌劑濃度和緩沖劑濃度，從而維持分離緩沖液等于或低于CMC。
有許多方法可用于確定緩沖液是否低于其CMC。例如，Rui等人，Anal.Biochem.152250-255(1986)描述了用N-苯基-1-萘胺熒光染料來測定洗滌劑溶液的CMC。就本文所述的分離緩沖液而言，洗滌劑的濃度通常等于或低于分離緩沖液的CMC。特別佳的是，洗滌劑濃度等于或剛好低于緩沖液的CMC。洗滌劑最優(yōu)濃度的確定可根據(jù)實驗來測定。具體地說，用本文所述的親脂性染料，可通過測定作為隨洗滌劑濃度的函數(shù)的溶液熒光來測定洗滌劑溶液中的相對膠束濃度。例如，圖3描述了含有10μM熒光親脂性染料(Syto 61，Molecular Probes Inc.)的SDS溶液的熒光強度作為SDS濃度的函數(shù)的曲線。臨界膠束濃度用A處所示的熒光強度急劇增加來表示。因此，根據(jù)本發(fā)明，當表明洗滌劑濃度等于或低于CMC時，應理解成洗滌劑濃度落在所示曲線陡峭部分處或以下的濃度，特別是在B處所示曲線點以下，更佳的在點A所示區(qū)域內或以下。
應注意，洗滌劑的CMC視洗滌劑而各不相同，而且還會因洗滌劑所處緩沖液的離子強度而異。在典型的分離操作和緩沖液中，分離緩沖液的洗滌劑濃度高于大約0.01％(w/v)，但是低于大約0.5％，而緩沖劑的濃度通常約為10-500mM，條件是緩沖液維持等于或低于CMC。
摻入分離緩沖液的洗滌劑可以選自被描述用于電泳分離的眾多洗滌劑中的任何一種。通常，采用陰離子洗滌劑。烷基硫酸鹽和烷基磺酸鹽洗滌劑通常是較佳的，如十八烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)和癸基硫酸鈉。特別佳的洗滌劑是SDS。在SDS的實施方案中，洗滌劑濃度通常維持在上述濃度。因此，分離緩沖液中較佳的SDS濃度通常大于0.01％(以確保樣品的蛋白質被充分包裹)，但小于大約0.5％(以防止形成過量的膠束)。較佳的洗滌劑濃度在大約0.02％-0.15％之間，較佳的在大約0.03％-0.1％之間。
在采用較佳洗滌劑濃度的緩沖液中，緩沖劑通常選自眾多不同的緩沖劑。例如，通常和SDS-PAGE應用結合使用的緩沖液也可特別用于本發(fā)明，如tris、tris-甘氨酸、HEPES、CAPS、MES、Tricine、這些緩沖劑的組合物等。然而，特別佳的緩沖劑選自離子強度非常低的緩沖劑。使用這樣的緩沖液可增加洗滌劑濃度而不超過CMC。較佳的此類緩沖液包括兩性離子緩沖液，諸如組氨酸和Tricine等的氨基酸(它們在相關pH下有較高的緩沖能力，但是離子強度非常低，因為它們具有兩性離子的性質)。包含較大離子、在系統(tǒng)內具有較低遷移率的緩沖劑也是較佳的，因為它們明顯具有使信號基線平滑的能力(例如用Tris作為反荷離子)。
較佳的洗滌劑溶液(例如SDS、十八烷基硫酸鈉、癸基硫酸鈉等，在上述濃度下)，緩沖劑的濃度通常在大約10-200mM之間，較佳的在10-100mM之間。特別佳的是，用濃度在大約20-100mM之間的Tris-Tricine作為緩沖劑。
參照上述討論可以看出，當在整個系統(tǒng)/方法的正常操作條件下操作時，最佳的分離緩沖液SDS濃度在大約0.03-0.1％之間，以及濃度約20-100mM之間的緩沖劑Tris-Tricine，兩者使得緩沖液等于或低于CMC。
除了前述組分，分離緩沖液通常還包含與待鑒定/分離的蛋白質或多肽結合的締合性染料或其它可檢測的標記基團。這樣就能在蛋白質和/或多肽通過分離緩沖液時對它們進行檢測。本文所用的術語“締合性染料”指可檢測的標記化合物或部分，它與給定混合物中的其它分子相比優(yōu)先與感興趣的一類分子(如蛋白質或肽)結合。就蛋白質或多肽鑒定而言，親脂性染料特別可用作蛋白質或多肽的締合性染料。
用于本發(fā)明的親脂性染料的特別佳的例子包括熒光染料，如納入本文作為參考的美國專利No.5,616,502中描述的步花菁染料。特別佳的染料包括通常以Sypro RedTM、Sypro OrangeTM和Syto 61TM的染料名稱購自Molecular Probes，Inc.(Eugene OR)的那些染料。這些染料通常用于對平板凝膠進行染色(在平板凝膠中，過量的染料可被洗去)，且通過洗滌可除去凝膠中SDS的不利影響。然而，令人驚奇的是，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當如上所述配制緩沖液時，這些染料特別適用于SDS毛細管凝膠電泳(SDS-CGE)，它們提供了令人驚奇的靈敏度，很少有或沒有“弄臟”或洗滌劑干擾。
另外，比染料與分離緩沖液相容性更出人意料的是，將親脂性染料加入毛細管通道中的分離緩沖液內不會產(chǎn)生過量的降低試驗靈敏度的本底信號。具體地說，將染料加入分離緩沖液中，預計會觀察到緩沖液中有來自染料的較高的本底信號。因此，預計需要將染料加入樣品溶液中而不是通道內的分離緩沖液中。然而，后一技術在分離時產(chǎn)生了非常低的信號。通過將染料加入毛細管通道內的分離緩沖液中，信號保持較高，而本底信號之低令人驚奇。用于本發(fā)明的親脂性染料在分離緩沖液中的濃度通常在大約0.1μM-1mM之間，更佳的在大約1μM-20μM之間。
C.分離后處理與上述方法相反，在針對所用染料系統(tǒng)進行優(yōu)化的緩沖劑和洗滌劑濃度下(例如維持低于具體洗滌劑的CMC)對樣品進行預處理和分離，在某些方面，在分離那些組分后以及在檢測那些組分期間或之前，改變樣品組分所在的緩沖液/洗滌劑條件，這樣可以減少或消除洗滌劑膠束的不利影響。具體地說，樣品組分(如多肽)可在優(yōu)化的分離緩沖液和洗滌劑條件或濃度(可等于、高于或低于CMC)下進行分離。一旦分離出樣品組分，就改變這些條件，從而優(yōu)化檢測點的緩沖液和/或洗滌劑濃度利于檢測步驟，例如將其水平降低至低于CMC的水平。具體地說，通常一旦將洗滌劑水平和/或緩沖液濃度調至低于CMC，膠束就會分散，染料與膠束結合的不利影響就會減少或消除。
通常，就多肽分離而言，改變環(huán)境是這樣來實現(xiàn)的在分離的樣品組分通過檢測器之前向其中加入一種或多種稀釋劑，從而使含有樣品的分離緩沖液等于或低于CMC。任選地，這也可通過改變洗滌劑與緩沖劑之比使CMC升高至等于或高于洗滌劑的操作濃度，和/或稀釋洗滌劑使其濃度低于CMC。因此，可加入稀釋劑來維持或降低緩沖劑的濃度，同時通常也會降低洗滌劑的濃度；或可維持洗滌劑濃度，同時降低緩沖劑的濃度。在兩種情況之一下，所要達到的目的是消除檢測點和檢測時的洗滌劑膠束。還可以類似的方式加入能有效破壞洗滌劑膠束的材料，如協(xié)同洗滌劑(co-detergent)。
當采用分離后處理時，分離緩沖液組合物可在寬的緩沖液和洗滌劑濃度范圍內。例如，分離緩沖液通常包括如上所述的濃度為大約10-200mM的緩沖劑，洗滌劑濃度約為0.01-1.0％，通常高于CMC，例如高大約0.05％，較佳的高大約0.1％。另一方面，親脂性染料的檢測宜在沒有過量洗滌劑膠束下進行，過量洗滌劑膠束會結合染料并產(chǎn)生過量的本底信號。因此，稀釋分離緩沖液通常是將洗滌劑濃度降低至低于洗滌劑CMC的水平，例如低于大約0.1％。因此，稀釋步驟宜在檢測前將分離緩沖液稀釋大約1∶2-1∶30。盡管這也稀釋了待檢測的樣品組分，但是稀釋引起的本底大幅度下降使非常低的水平樣品材料很容易檢測。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，微流體裝置特別適用于實施這些方法。特別是，裝置內包含整合的流體通道網(wǎng)絡結構使得易于在流動的料流中加入稀釋劑和其它試劑。具體地說，使稀釋劑通道緊靠檢測區(qū)上游，以便將稀釋劑和分離的樣品組分一起輸送入檢測區(qū)。然后在沒有干擾性洗滌劑膠束存在下檢測樣品組分。圖7顯示了實現(xiàn)該分離后處理的微流體裝置的特別佳的通道設計布局的例子，該例子在下文有更詳細的描述。本文所用的術語“上游”和“下游”指在所述系統(tǒng)正常運作期間，從感興趣材料(如液流、樣品組分等)的流動方向來考慮的所述元件的相對位置。通常，術語“上游”指朝向與具體通道相連的樣品或緩沖液貯器的方向，而下游指朝向與具體通道相連的廢水貯器的方向。
D.毛細管通道和裝置1.綜述本發(fā)明還提供了用于進行上述蛋白質鑒定方法的裝置和系統(tǒng)。本發(fā)明的裝置通常包括一個支持基材，該基材包括其中盛有分離緩沖液的分離區(qū)。將待分離/鑒定的樣品置于分離區(qū)的一端，施加跨越該分離區(qū)的電場，使樣品內的蛋白質/多肽電泳分離。然后用與分離區(qū)毗鄰且與分離區(qū)傳感溝通的檢測系統(tǒng)，分別檢測所分離的蛋白質/多肽。
2.常規(guī)的毛細管系統(tǒng)第一，本發(fā)明方法至少適用于常規(guī)的基于毛細管的分離系統(tǒng)。因此，在這些方面中，支持基材通常包括毛細管，例如熔融二氧化硅、玻璃或聚合物制的毛細管，它包括穿過其中的毛細管通道。管中至少一部分的毛細管通道是毛細管分離區(qū)。將分離緩沖液通過諸如壓力泵、毛細管作用等方式加入毛細管通道中，然后將待分離/鑒定的樣品注入毛細管通道的一端。將毛細管的一端與陰極貯器(具有與該貯器接觸的陰極)放置成流體接觸關系，另一端與陽極貯器(具有與該貯器接觸的陽極)成流體接觸關系，施加通過該毛細管的電場，使樣品材料電泳通過毛細管和管內所含的分離緩沖液。當?shù)鞍踪|和多肽移動經(jīng)過分離緩沖液時，它們與親脂性染料結合，然后在毛細管陰極端被檢測系統(tǒng)檢測到。
在上述分離后處理步驟中，通常在分離后將額外的流體途徑或毛細管連接到主分離毛細管上，將額外的緩沖液加入樣品組分的流動途徑中，使離開分離毛細管的分離的組分與額外的緩沖液或稀釋劑混合。該接頭處還連接了檢測室或毛細管，從而使所有材料都流入待檢測的檢測區(qū)。
3.微流體裝置特別佳的是在微流體裝置中進行本發(fā)明的方法，該裝置提供了置于單塊整合固體基材上的微量毛細管通道網(wǎng)。具體地說，支持基材通常包括一個整合的體部結構，它包括了置于其中的一個或多個微量通道的網(wǎng)，這些微量通道中至少有一個是分離通道。分離緩沖液置于至少分離通道內。較佳的是，微流體通道網(wǎng)至少包括第一分離通道，它至少與第一樣品注射通道相交。這兩個通道相交形成了所稱的“注射交叉”。在操作中，樣品材料通過注射通道注入并通過分離通道。然后，相交處的部分材料注入分離通道中，于是它通過分離緩沖液進行分離。檢測器與分離通道毗鄰，以檢測分離的蛋白質。
在特別佳的方案中，用于本發(fā)明的微流體裝置包括多個與樣品注射通道流體溝通的樣品孔，而這些注射通道又與分離通道流體溝通。這樣就能在一個整合的微流體裝置中進行多種不同樣品的分析。用于本發(fā)明的特別佳的微流體裝置例子在1998年10月2日提交的共同擁有的美國專利申請No.09/165,704中有所揭示和描述，該文出于所有目的全部納入本文作為參考。圖1描述了該微流體裝置的一個例子。如圖所示，裝置100包括一個平的體部結構102，該結構在其內部包括多個互相連接的通道，如通道104-138。體部結構202中還有多個貯器140-170，這些貯器與各個通道104-138流體溝通。這些貯器中放置了待分析的樣品和緩沖液，用于導入該裝置的通道內。
在操作時，首先將用于分離/鑒定的分離緩沖液加入一個貯器(如貯器166)中，使其靠毛細作用進入裝置的所有通道，從而這些通道中充滿分離緩沖液。將待分離/鑒定的樣品分別加入貯器140-162中。然后將分離緩沖液加入貯器164、168和170中(它已經(jīng)存在于貯器166中)。通過施加合適的電流，使第一樣品材料從其貯器(如貯器140)經(jīng)過通道120和116輸送或電泳至或通過通道104的主要注射相交部172。這通常是通過在貯器140和168之間施加電流來實現(xiàn)的。通常在相交處施加低水平的緊縮電流(pinching current)，以防樣品材料在相交處擴散，例如可從貯器166和170向貯器168施加低水平的電流(例如參見WO96/04547)。短時間后，切換電流(如在貯器170和166之間施加電流)，使相交處的材料向下電泳至主分析通道104。通常，在注射后施加小電流，將通道116和134中的物質拉回相交處，以防滲漏入分離通道。當?shù)谝粯悠废蛳码娪就ǖ乐魍ǖ?04時，預先裝載下一個待分析的樣品，使該樣品材料從其貯器(如貯器142)通過預先裝載的相交處174向預先裝載貯器164電泳。使樣品材料從其預先裝載的位置移動到注射相交處172只要很短的輸送時間。一旦第一樣品完成分析，就使第二樣品材料和前面一樣電泳通過注射相交處172，向下注入主分析通道。對于裝載入裝置的每個樣品重復進行該過程。
檢測區(qū)176通常沿主分析通道104設置，以便提供可從通道檢測信號的檢測點。本文所述裝置通常用透明材料制成。因此，光學檢測分析的檢測窗實際上可位于分析通道104長度上的任何一點。當分離的樣品通過檢測窗時，與多肽片段締合的親脂性染料被檢測。然后，每種多肽片段移動通過分離通道所需的時間就可用來鑒定特定的多肽，例如作為其分子量的測量指標。具體地說，將未知多肽的滯留時間與分子量已知的標準品的滯留時間相比，從標準品內插或外推可確定未知多肽的近似分子量。
如上所述，本文所述的分離后處理方法對于使用微流體通道系統(tǒng)特別有好處。具體地說，將稀釋劑源與主分離通道相連接是在合適位置(例如在發(fā)生分離后、但檢測區(qū)或窗口之前的部位)提供與該通道相連的通道的一種簡單的方式。圖7描述了實現(xiàn)該方案的微流體通道網(wǎng)的例子。如圖所示，微流體裝置700包括體部702，該體部包括在其內部的一個通道網(wǎng)。通常，圖7所示裝置參照圖1相同的方式制造。該通道網(wǎng)包括主通道704，它分別通過樣品通道706a-722a和728a與多個不同的樣品材料貯器706-722和728液體溝通。圖中還示出了預先裝載/廢液貯器通道/貯器724/724a以及726/726a。主通道704與緩沖液貯器736以及廢液貯器732相連，并包括一個檢測區(qū)738。如圖所示，在主通道104的相對側有兩個稀釋劑通道730a和734a與主通道704相溝通，溝通部位緊靠檢測區(qū)上游(在材料操作流動方向上)，但在主通道704主要部分(在此處該通道有諸如分離的功能)的下游。稀釋劑通道730a和734a也與稀釋劑源(例如分別是貯器730和734)相連，從而可將稀釋劑從這些來源輸送至主通道704。
在多肽分離的操作中，當希望鑒定樣品(如含多肽的混合物)時，可用分離緩沖液填充裝置700的通道。在分離后處理的情況下，該緩沖液無需與上述結構粘附，因為很大程度上沒有形成過量膠束的顧慮。通常，在這些情況下，洗滌劑濃度并不象預處理方法中那樣重要。具體地說，分離緩沖液可具有較高的洗滌劑濃度，例如約0.1％-2.0％。洗滌劑濃度通常會超過0.1％。填充通道網(wǎng)通常是通過將分離緩沖液加入一個孔(如廢液貯器732)來實現(xiàn)的。然后，分離緩沖液會靠毛細作用進入通道網(wǎng)，直至其到達其它每一個貯器706-730以及743-736。任選地，可對廢液貯器732稍稍施壓，以加速通道網(wǎng)的填充。在緩沖液貯器736和加樣/廢液貯器724和726中加入額外量的緩沖液(如分離緩沖液)。將稀釋劑材料加入稀釋劑貯器730和734。
將樣品材料加入樣品貯器706-722和728的一個或多個中。任選地，將許多不同樣品材料置于不同貯器內。然后將該裝置放入控制器/檢測器儀器(如AgilentTechnologies的2100型生物分析儀)內，該儀器通過控制的電動力學方法(如美國專利No.5,976,336中所述，該專利出于全部目的納入本文作為參考)引導樣品材料移動通過裝置的通道。放在諸如貯器706中的樣品沿樣品通道706a移動，直至其經(jīng)過通道704，經(jīng)通道726a流向加樣廢液貯器726。然后，將樣品加樣通道706a和主通道704相交處的樣品材料部分注入分離通道704并移動通過。在施加的電場下，移動通過分離緩沖液的該部分樣品在沿通道704移動時分離出其組分。在其移動時，樣品組分(在一些情況下是洗滌劑膠束)吸納分離緩沖液中存在的親脂性染料。將含有低濃度或不含洗滌劑的稀釋緩沖劑經(jīng)通道730a和734a連續(xù)加入通道704中。該稀釋劑將分離緩沖液稀釋至低于洗滌劑CMC的點，從而除去了過量的洗滌劑膠束。然后，在檢測窗738處檢測攜帶親脂性染料的稀釋的樣品組分。在一些情況下，液體稀釋實際上是通過側通道引入液體來實現(xiàn)的。然而，較佳的是側通道730a和734a通常含有與整個通道網(wǎng)中相同的分離基質。因此，稀釋是電泳引入通過電泳進入分離通道的緩沖液的離子物質來實現(xiàn)的，以有效地稀釋分離通道中的物質?；蛘撸瑐韧ǖ?03a和734a沒有基質，例如它們能支撐壓力或電滲流，大量液體導入主通道704中，以稀釋分離的樣品組分。應注意，選擇向通道中加入稀釋劑的速度，以使通道中測定點處的洗滌劑濃度降低至低于該洗滌劑在具體條件下的CMC。通常，這包括大約1∶2到1∶30的洗滌劑稀釋度。因此，當分離緩沖液包括例如含2％SDS的30mM Tris Tricine緩沖液時，通常希望將洗滌劑水平稀釋至低于大約0.1％，較佳的大約0.05％SDS。這樣，稀釋大約2-3倍至大約4倍。當然，如上所述，具體洗滌劑的CMC將因緩沖液的性質和濃度而異。
盡管前面主要針對將多肽分離緩沖液稀釋至低于該緩沖液中洗滌劑的CMC作了描述，但是可以知道本文所述的分離后處理的方法有更廣泛的應用。具體地說，這些方法可用于各種分析操作，其中一連串分析方法步驟的隨后操作需要與前一步或操作不同的環(huán)境，該環(huán)境可通過加入用于隨后操作的試劑、緩沖液或稀釋劑來充分改變。在上述方法描述的例子中，針對多肽分離進行優(yōu)化的環(huán)境可能與最優(yōu)的檢測環(huán)境并不最相容。因此，根據(jù)對本發(fā)明該方面的最寬理解，術語“稀釋劑”指改變其所加入的環(huán)境的組分，如液體、緩沖劑等。在這種意義上，改變環(huán)境包括改變環(huán)境的物理性質(如洗滌劑膠束的存在，降低溶液粘度)，而且還包括改變化學環(huán)境(如滴加緩沖液以使溶液pH變化從而為pH敏感的染料或其它標記物質提供可操作的環(huán)境，改變溶液鹽濃度以改變疏水性/親水性，或影響溶液中的離子相互作用)。
類似地，標記物質可在最初的操作后加入，此時標記物質可能會影響前一操作。這些標記例如包括在特異性蛋白質中加入標記的抗體，從而使該系統(tǒng)起到基于芯片的Western印跡系統(tǒng)的作用。具體地說，在蛋白分離后、檢測前，在分離的蛋白質中加入標記的抗體，以優(yōu)先結合攜帶識別表位的蛋白質。然后利用蛋白質的大小以及被所選抗體識別的能力來檢測蛋白質。
D.整體系統(tǒng)本發(fā)明的裝置和試劑通常和分析系統(tǒng)結合使用，該分析系統(tǒng)控制和監(jiān)測微流體裝置和采用本文所述試劑所進行的操作和分析。具體地說，除微流體裝置或毛細管系統(tǒng)外，整體系統(tǒng)通常包括與微流體裝置或毛細管元件可操作相連的電控制儀，與裝置的分離區(qū)或通道傳感溝通的檢測器。
圖2顯示了本發(fā)明系統(tǒng)的一個例子。如圖所示，系統(tǒng)200包括微流體裝置100，該微流體裝置內部有通道網(wǎng)，而該通道網(wǎng)與多個貯器或樣品/試劑孔相連。電控制儀202通過多個與微流體裝置100貯器中的液體相接觸的電極204-234與微流體裝置100操作相連。電控制儀202施加了跨越該裝置分離通道長度的合適電場，以推動樣品材料的電泳，隨之推動本發(fā)明蛋白質和多肽的分離。微流體裝置包括如圖所示的相交的通道網(wǎng)，電控制儀施加電流還可使不同材料移動通過各個通道并將這些材料注入其它通道。為控制材料的移動，能提供通過該裝置通道的可選擇電流水平的電控制儀特別適合用于本發(fā)明。這些“電流控制儀”的例子例如在納入本文作為參考的美國專利No.5,800,690中有詳細描述。
整體系統(tǒng)200還包括檢測儀204，該檢測儀與微流體裝置100中通道網(wǎng)的分離通道部分傳感溝通。本文所用的術語“傳感溝通”指檢測儀放置在能接收來自微流體裝置內通道的特定信號的位置。例如，以進行操作產(chǎn)生光學信號(如生色、熒光或化學發(fā)光信號)的微流體裝置為例，檢測儀與該裝置的半透明部分毗鄰，從而使檢測儀中的光學元件能接受到微流體裝置合適部分的這些光信號。另一方面，為了傳感溝通，電化學檢測儀通常包括置于該裝置合適通道內的電化學傳感器(如電極)，以便感受通道內產(chǎn)生或存在的電化學信號。類似地，感受溫度的檢測儀將與裝置的通道呈熱傳感溝通，以感受其中的溫度或相關變化。較佳的是在本發(fā)明系統(tǒng)中采用光檢測儀，更佳的是將光檢測儀制成用于檢測熒光信號。因此，這些檢測儀通常包括一個光源、將激發(fā)光指引向分離通道的光學瞄準器(optical train)，以及用于收集、傳播和定量測定從分離通道發(fā)射出的熒光量的光學瞄準器和光傳感器。通常，利用一個光學瞄準器來傳播激發(fā)光和熒光發(fā)射光，依靠兩類能量波長之間的差別來區(qū)分它們。通常，裝入本發(fā)明光檢測儀的光傳感器選自本領域技術人員熟知的那些光傳感器，如光電倍增管(PMT)光電二極管等。特別佳的是用Agilent 2100生物分析儀作為收集器/檢測儀系統(tǒng)(AgilentTechnologies)。
本文描述的系統(tǒng)通常還包括與電控制儀操作相連的處理器或計算機206，用來根據(jù)用戶指令或預先編程的操作參數(shù)指導電控制儀的操作。計算機通常還與檢測儀操作相連，用于接收和分析檢測儀從微流體裝置接收到的數(shù)據(jù)。因此，計算機通常包括合適的程序用于指導電控制儀操作和施加電場以將可能的多種樣品各自注入分離通道。通常，計算機還與檢測儀操作相連，以接收來自檢測儀的數(shù)據(jù)并記錄檢測儀收到的信號。處理器或計算機206可以是各種不同類型的處理器中的任何一種。通常，計算機/處理器是IBM PC或PC兼容計算機，其中裝有Intel或Advanced Microdevice的微處理器，如奔騰TM或K6TM，或MacIntoshTM、ImacTM或兼容的計算機。
在本發(fā)明的鑒定多肽的方法中，計算機或處理器通常經(jīng)過編程，以接收來自檢測儀的信號數(shù)據(jù)，并鑒定對應于通過檢測儀的分離的蛋白的信號峰。通常，一個或多個內部標準蛋白質可與樣品材料一起跑電泳。在這些情況下，計算機通常經(jīng)過編程來鑒定標準品(例如通過其在整個分離中的位置，或最先或最后)，并通過從標準品外推或內插來確定樣品中未知多肽的分子量。用于本發(fā)明分離方法的特別有用的計算機軟件程序在1997年12月30日提交的臨時專利申請60/068,980中有所描述，該專利申請納入本文作為參考。在Agilent 2100 Bioanalyzer上運行的那些實施方案中，計算機通常包括為運行這些系統(tǒng)來分析核酸而提供的類似編程軟件。
E.試劑盒本發(fā)明還提供用于進行上述方法試劑盒。總地來說，這些試劑盒包括本文所述的毛細管或微流體裝置。試劑盒通常還包括分離緩沖液的各個組分，例如非交聯(lián)的聚合物篩濾基質、洗滌劑、緩沖劑和親脂性染料。這些組分在試劑盒中可以是預先配制的緩沖液組分(可以經(jīng)過或未經(jīng)預先測定)，或可以預先配制的所有試劑組合在一起提供，這樣用戶只需將分離緩沖液直接放入微流體裝置中即可。除了緩沖液組分，本發(fā)明的試劑盒還任選地包括其它有用的試劑，例如分子量標準品以及裝置和系統(tǒng)所用的工具，例如幫助將緩沖液、樣品或其它試劑加入微流體裝置通道內的儀器。
在試劑盒形式中，試劑、裝置和詳細描述其用途的說明書通常在一個包裝單元(如盒子或箱子)內并一起出售。以試劑盒形式提供試劑和裝置為用戶提供了使用方便、廉價的系統(tǒng)，其中試劑以更方便的用量提供，且均針對所需應用(例如高分子量相對于低分子量蛋白質的分離)作了最優(yōu)的配制。
下面將參照下列實施例進一步描述本發(fā)明，這些實施例只是描述了本發(fā)明的某些方面，并沒有限制本發(fā)明的范圍。
實施例所有實驗均在12份樣品的微流體裝置中進行，該裝置具有一個分離通道以及圖1所示的通道幾何圖形。控制和檢測采用具有多個通道、12個電極的電控制儀/檢測儀，沿單個分離通道裝有單點激光熒光檢測儀。
實施例1用低于CMC的分離緩沖液分離多肽用計算機(具有Intel奔騰微處理器的PC)記錄從分離通道接收到的熒光數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)顯示成熒光對時間的線形圖，以及Caliper Technologies Corp的專利權軟件產(chǎn)生的模擬凝膠形式。
將0.5M濃度的Tricine溶解在去離子水中，用1M Tris調節(jié)pH至7.5，配制得0.5Mtris-Tricine緩沖液溶液。然后，使所得緩沖液過濾通過0.22微米注射器濾膜。以12.5mM Tris-Tricine緩沖液配制含3％聚二甲基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物、0.9％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)和10μM Syto 60染料(Molecular Probes，Eugene OR)的篩濾和分離緩沖液。然后使分離緩沖液過濾通過Costar Spin-XTM0.22μM乙酸纖維素離心濾膜。
在將樣品放入裝置貯器中之前，以變性緩沖液對樣品進行預處理。變性緩沖液是0.75％SDS(w/v)和1％2-巰基乙醇(v/v)(BME)的250mM Tris-Tricine緩沖液。使樣品在0.5毫升微量離心管中與變性緩沖液1∶1混合(例如，20微升樣品和20微升緩沖液)，100℃加熱10分鐘。然后離心加熱樣品，并攪拌。將樣品加入微流體裝置的孔內之前，用去離子水作1∶10稀釋(例如1微升樣品/緩沖液和9微升水)。因此，制得的樣品的洗滌劑濃度為0.0375％SDS。
為了準備好微流體裝置，用移液管將7.5微升分離緩沖液加入清潔的干的裝置的孔166中，并用注射器將分離緩沖液壓入該裝置的所有通道內。然后用移液管在孔164、168和170中各加入7.5微升分離緩沖液。用移液管將0.5微升稀釋的樣品分別加入孔140-162的各個孔中。在圖4所示的實施例中，采用分子量已知的標準品。標準品包括卵白蛋白(45kD)、牛碳酸酐酶(29kD)、大豆胰蛋白酶抑制劑(21.5kD)和α-乳白蛋白(14.4kD)。
參看圖1，孔142和146只含緩沖液，用作空白。將含有四種蛋白質標準品各100微克/毫升的標準蛋白質溶液加入孔150和154的各孔內，同時將含同樣四種蛋白質各500微克/毫升的溶液加入孔158和162中。將僅含1000微克/毫升碳酸酐酶標準品的溶液加入孔140和144中。將含有100微克/毫升碳酸酐酶和胰蛋白酶抑制劑的溶液加入孔148和152中，同時將含有相同蛋白質(但為500微克/毫升)的溶液加入孔156和160中。
將每份樣品分開向下注入主分離通道104，檢測分離的組分作為從注射起的滯留時間的函數(shù)。每次運行的色譜圖以暗色條帶的形式顯示，以模擬標準的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。模擬凝膠的每條泳道代表分離的樣品的色譜圖，暗色條帶表示熒光增加超過本底增加。具體地說，制得卵白蛋白(45kD)、牛碳酸酐酶(29kD)、大豆胰蛋白酶抑制劑(21.5kD)和α-乳白蛋白(14.4kD)的混合物。使四種蛋白的混合物以兩種不同濃度(100微克/毫升(泳道A2，孔154)和500微克/毫升(泳道A3，孔162))跑電泳。另外如下制得這些標準品的每一種的分開的混合物并跑電泳泳道B1(孔144) 碳酸酐酶(1毫克/毫升)泳道B2(孔152) 胰蛋白酶抑制劑和碳酸酐酶(均為100微克/毫升)泳道B3(孔160) 與B2相同(均為500微克/毫升)泳道C2(孔142) 與泳道A2相同泳道C3(孔150) 與泳道A3相同泳道D1-D3(孔140-156)與B1-B3相同圖5顯示了以上述相同方式跑電泳的一系列標準品的分子量對數(shù)對遷移時間的曲線。從圖5可以看出，所述分離方法產(chǎn)生了準確的線性數(shù)據(jù)，這樣就能通過將那些未知蛋白質的遷移時間根據(jù)所示曲線與標準品系列關聯(lián)起來來鑒定未知分子量的蛋白質。從圖4和圖5可以看出，本發(fā)明為鑒定蛋白質和其它多肽提供了具有高度重復性的準確而迅速的方法。
另外還對包括Cy-5染料標記的同一組標準品進行電泳，以顯示洗滌劑染料前沿的共同洗脫。該電泳的色譜圖示于圖6。從圖6可以看出，洗滌劑-染料峰(用星號表示)與分子量為65kD的蛋白質基本上同時洗脫。而當樣品預處理緩沖液中洗滌劑濃度處于本領域先前所述的水平(例如2％)時，顯示出的峰要大得多，且該峰對在該分子量范圍內的蛋白質的鑒定和定量有很大干擾。
實施例2用分離后/檢測前稀釋來分離和檢測多肽用上述分離緩沖液充滿圖7所示的微流體裝置。分離通道704在注射點下游1.2厘米、檢測點732上游0.1厘米處，與稀釋劑通道702a和722a相交。分離緩沖液含有4.2％非交聯(lián)的聚二甲基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物的30mM Tris Tricine緩沖液和0.13％SDS。將含有30mM Tris-Tricine、沒有聚合物或SDS的稀釋緩沖液放入貯器720和722中。緩沖劑通過電動力學法(如電泳)流入分離通道。
在樣品貯器(如貯器706)中加入多肽標準溶液(10-205kD蛋白質標準品，購自Bio-Rad，Inc.)，用前面納入本文作參考的美國專利5,976,336中描述的相同方法加樣并注入分離通道內。
圖8A-8D描述了采用分離后處理和未用分離后處理的標準品分離操作在檢測點732處在2100型生物分析儀(Agilent Technologies，Inc.)檢測到的熒光對時間的曲線。具體地說，圖8A和B顯示了在沒有分離后稀釋功能的微流體裝置中進行的空白試驗(樣品中沒有多肽)和蛋白質樣品試驗。該裝置在功能上與圖1所示裝置的通道布局相似。如圖所示，空白和多肽試驗數(shù)據(jù)有高本底以及其它基線問題(包括有大的洗滌劑染料前沿，然后是基線凹陷(divot)，然后是染料峰)。在樣品分離操作中發(fā)現(xiàn)這些相同的基線偏差，從而給分離數(shù)據(jù)的定性和定量帶來很大困難。圖8C和8D描述了采用分離后稀釋步驟進行的同樣的空白試驗和多肽樣品分析，其中在大部分分離通道的下游、檢測點的上游將Tris Tricine緩沖液引入分離通道。如圖所示，分離后稀釋步驟相對于檢測的樣品組分使總體本底熒光比未稀釋的樣品大大降低，同時也減少了與膠束染料結合有關的如圖8A和8B所示的基線上下起伏。
除非另有具體描述，本文提供的所有濃度值均指某給定組分在該組分加入混合物或溶液時的濃度，與該組分加入混合物或溶液中后發(fā)生任何轉變、分解、反應或轉變成一種或多種不同物質無關。
所有出版物和專利申請均納入本文作為參考，正如每一單獨出版物或專利申請具體單獨地表明納入本文作為參考一樣。盡管本發(fā)明為了清楚和理解的目的已經(jīng)通過說明和實施例作了一些詳盡的描述，但在所附權利要求范圍內顯然還能作一些變化和改動。
權利要求
1.一種對第一液體樣品材料進行分析操作的方法，該方法包括提供一種微流體裝置，該裝置具有體部，體部中至少有第一通道，該第一通道包括第一和第二通道段，第一通道段包括與進行第一操作相容的第一液體環(huán)境；使第一樣品材料流動通過第一通道段進行第一操作；使第一樣品材料從第一通道段流入第二通道段；和在第二通道段中引入第一稀釋劑，該稀釋劑在第二通道段內產(chǎn)生了第二液體環(huán)境，該第二環(huán)境比第一環(huán)境與第二操作更加相容。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中第一操作包括分離操作，第二操作包括檢測操作。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中分離操作包括電泳多肽分離，第一液體環(huán)境包括等于或高于該洗滌劑的臨界膠束濃度的洗滌劑濃度。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中第一液體環(huán)境包括濃度大于0.1％的洗滌劑。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中檢測操作包括檢測與第一操作中分離的多肽相結合的親脂性染料，第二液體環(huán)境包括濃度低于該洗滌劑臨界膠束濃度的洗滌劑。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中第二液體環(huán)境包括濃度低于0.1％的洗滌劑。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中第二液體環(huán)境包括濃度為0.05％的洗滌劑。
8.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中提供步驟還包括在至少第一通道段中提供分離緩沖液，該分離緩沖液包含聚合物基質、緩沖劑、第一洗滌劑和親脂性染料。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中分離基質包含非交聯(lián)的聚合物溶液。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中非交聯(lián)的聚合物溶液包括聚二甲基丙烯酰胺線狀聚合物溶液。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中聚丙烯酰胺線狀聚合物在分離緩沖液中的濃度在0.1-20％w/v之間。
12.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中第一洗滌劑包括烷基磺酸鹽洗滌劑。
13.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中第一洗滌劑選自十八烷基硫酸鈉、癸基硫酸鈉和十二烷基硫酸鈉。
14.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中第一洗滌劑是十二烷基硫酸鈉。
15.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中第一洗滌劑在第一通道段中分離緩沖液內的濃度大于0.03％。
16.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中稀釋劑是沒有洗滌劑的緩沖劑。
17.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中緩沖劑是Tris-Tricine。
18.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中緩沖劑在第一通道段中分離緩沖液內的濃度在10mM-100mM之間。
19.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中親脂性染料是熒光親脂性染料。
20.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中親脂性染料在第一通道段中分離緩沖液內的濃度為0.1μM-20μM。
21.一種鑒定多肽的方法，該方法包括提供其中有分離緩沖液的第一毛細管通道，該分離緩沖液包含聚合物基質；緩沖劑；第一洗滌劑；和親脂性染料；其中緩沖劑和洗滌劑在分離緩沖液中的濃度等于或低于臨界膠束濃度；在第二洗滌劑溶液中對多肽進行預處理，第二洗滌劑在第二洗滌劑溶液中的濃度為分離緩沖液中第一洗滌劑濃度的0.05倍至3倍；將多肽引入毛細管通道的一端；施加橫跨毛細管通道長度的電場，該電場以不同的速度將不同大小的多肽輸送通過聚合物溶液；和在多肽經(jīng)過沿毛細管通道長度的一測定點時，檢測該多肽。
22.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中親脂性染料是熒光親脂性染料。
23.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中親脂性染料在分離緩沖液中的濃度在0.1μM-1mM之間。
24.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中親脂性染料在分離緩沖液中的濃度為1μM-20μM。
25.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中聚合物基質包括聚丙烯酰胺線狀聚合物溶液。
26.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中聚合物基質包含二甲基丙烯酰胺線狀聚合物溶液。
27.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中聚丙烯酰胺線狀聚合物在分離緩沖液中的濃度在0.1-20％w/v之間。
28.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中第一洗滌劑包含陰離子洗滌劑。
29.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中第一洗滌劑包含選自烷基硫酸鹽洗滌劑和烷基磺酸鹽洗滌劑的洗滌劑。
30.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中第一洗滌劑選自十八烷基硫酸鈉、癸基硫酸鈉和十二烷基硫酸鈉。
31.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中第一洗滌劑是十二烷基硫酸鈉。
32.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中第一洗滌劑在分離緩沖液內的濃度在0.01-1％w/v之間。
33.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中分離緩沖液中的緩沖劑包含Tris-Tricine。
34.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中緩沖劑在分離緩沖液中的濃度在10mM-100mM之間。
35.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中分離緩沖液中的緩沖劑濃度在20mM-100mM之間。
36.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中預處理步驟中的第二洗滌劑溶液包括濃度低于分離緩沖液中第一洗滌劑濃度的第二洗滌劑。
37.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中預處理步驟中的第二洗滌劑溶液包括濃度在0.05％-2％之間的第二洗滌劑。
38.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中預處理步驟中的第二洗滌劑溶液包括濃度在0.05％-1％之間的第二洗滌劑。
39.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中預處理步驟中的洗滌劑溶液包括低于濃度0.5％的洗滌劑。
40.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中第二洗滌劑選自烷基硫酸鹽洗滌劑和烷基磺酸鹽洗滌劑。
41.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中第二洗滌劑選自十八烷基硫酸鈉、癸基硫酸鈉和十二烷基硫酸鈉。
42.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中第二洗滌劑是十二烷基硫酸鈉。
43.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中第一和第二洗滌劑是相同的洗滌劑。
44.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中提供步驟中提供的毛細管通道在平的體部結構中。
45.根據(jù)權利要求44所述的方法，其中平的體部結構中至少包括第二毛細管通道，第二毛細管通道與第一毛細管通道相交。
46.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中多肽包含在多肽混合物中。
47.根據(jù)權利要求46所述的方法，其中多肽混合物是不同多肽的混合物，每個不同多肽有不同的分子量。
48.根據(jù)權利要求21所述的方法，該方法還包括將檢測到的多肽與至少一種分子量已知的多肽標準品相比較的步驟。
49.根據(jù)權利要求48所述的方法，其中在引入步驟前先使標準品與多肽混合。
50.一種微流體裝置，它包括體部結構；在體部內部的第一通道段，第一通道段內有第一環(huán)境；與第一通道段流體相連的第二通道段；與第二通道段流體相連的至少第一稀釋劑源；和與第一稀釋劑源操作相連的、用于將第一稀釋劑輸送入第二通道段以便在第二通道段中提供第二環(huán)境的流量控制儀。
51.根據(jù)權利要求50所述的微流體裝置，其中第一環(huán)境包括的洗滌劑濃度等于或高于該洗滌劑臨界膠束濃度，第二環(huán)境包括的洗滌劑濃度低于該洗滌劑臨界膠束濃度。
52.根據(jù)權利要求51所述的微流體裝置，其中第一環(huán)境還包括含有聚合物基質和緩沖劑的分離緩沖液。
53.根據(jù)權利要求52所述的微流體裝置，其中洗滌劑是烷基硫酸鹽洗滌劑。
54.根據(jù)權利要求52所述的微流體裝置，其中洗滌劑選自癸基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉和十八烷基硫酸鈉。
55.根據(jù)權利要求52所述的微流體裝置，其中稀釋劑是含有緩沖劑、不含洗滌劑的稀釋緩沖液。
56.根據(jù)權利要求50所述的微流體裝置，它還至少包括與第二通道段流體相連的第二稀釋劑源。
57.一種用于分離多肽的裝置，它包括內部至少有第一毛細管通道的體部結構，置于第一毛細管通道中的分離緩沖液，該分離緩沖液包含非交聯(lián)的聚合物溶液；緩沖劑；第一洗滌劑；和能與一種或多種多肽結合的親脂性染料；和在體部結構內用于將多肽引入第一毛細管通道內的與第一毛細管通道流體溝通的第一端口。
58.根據(jù)權利要求57所述的裝置，其中第一端口內有樣品流體，該樣品流體至少包含感興趣的第一多肽，以及濃度為分離緩沖液中第一洗滌劑濃度的0.05倍至3倍的第二洗滌劑。
59.根據(jù)權利要求57所述的裝置，其中第一端口內有樣品流體，該樣品流體至少包含感興趣的第一多肽，以及濃度低于分離緩沖液中第一洗滌劑濃度的第二洗滌劑。
60.根據(jù)權利要求57所述的裝置，其中第一端口內有樣品流體，該樣品流體至少包含感興趣的第一多肽，以及濃度在0.0025％-1％w/v之間的第二洗滌劑。
61.根據(jù)權利要求57所述的裝置，其中第一端口內有樣品流體，該樣品流體至少包含感興趣的第一多肽，以及濃度在0.0025％-0.5％w/v之間的第二洗滌劑。
62.根據(jù)權利要求57所述的裝置，其中第一端口內有樣品流體，該樣品流體至少包含感興趣的第一多肽，以及濃度低于0.5％w/v的第二洗滌劑。
63.根據(jù)權利要求57所述的裝置，其中體部結構內包含有第一毛細管通道的毛細管組成部分，第一端口至少是第一毛細管通道的第一開口端。
64.根據(jù)權利要求57所述的裝置，其中體部結構是內部有第一毛細管通道的平的基材，端口在體部表面上。
65.根據(jù)權利要求64所述的裝置，它至少還包括在平的基材內部的第二毛細管通道，該第二通道與第一毛細管通道流體相連。
66.根據(jù)權利要求65所述的裝置，其中第二毛細管通道與第一毛細管通道相交并交叉。
67.根據(jù)權利要求65所述的裝置，其中第一端口通過第二毛細管通道與第一毛細管通道流體溝通。
68.根據(jù)權利要求65所述的裝置，它至少還包括在體部結構內并與第一毛細管通道流體溝通的第二端口。
69.根據(jù)權利要求68所述的裝置，其中至少第一和第二端口的每一個通過第二毛細管通道與第一毛細管通道流體溝通。
全文摘要
一種鑒定多肽的方法,包括提供內有分離緩沖液的第一毛細管通道(104),其中分離緩沖液包含非交聯(lián)的聚合物溶液、緩沖劑、洗滌劑和親脂性染料。使得檢測時分離緩沖液中的洗滌劑濃度不高于臨界膠束濃度。將多肽引入毛細管通道的一端。以不同的速度施加橫跨聚合物溶液的電場。然后在多肽通過沿毛細管通道長度的檢測點(176)時檢測該多肽。
文檔編號G01N27/447GK1339104SQ00803287
公開日2002年3月6日 申請日期2000年2月2日 優(yōu)先權日1999年2月2日
發(fā)明者R·S·杜布羅, C·布洛松, C·Y·H·喬, J·W·帕斯 申請人:卡鉗技術有限公司