專(zhuān)利名稱(chēng)：莽草酸的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及莽草酸的檢測(cè)方法，更具體說(shuō)，本發(fā)明涉及能夠檢測(cè)植物材料中莽草酸的方法。
背景技術(shù)：
莽草酸是D-葡萄糖生物合成芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的重要的中間體。
除草劑草甘膦〔即，N-(磷?；谆?甘氨酸〕抑制了芳香族氨基酸的生物合成，這最終導(dǎo)致了莽草酸在植物中的積累。草甘磷是5-烯醇丙酮?；?莽草羧基-3-磷酸(EPSP)合成酶的強(qiáng)抑制劑，此酶在芳香族氨基酸生物合成途徑中是一個(gè)關(guān)鍵酶。草甘磷先導(dǎo)致EPSP合酶的底物——莽草羧基-3-磷酸的積累，后者隨后在植物中被水解成莽草羧基。檢測(cè)植物中的莽草酸，能夠用來(lái)確定植物是否接觸過(guò)草甘磷，還能夠用來(lái)測(cè)定該植物是否對(duì)這種除草劑有抗性。
Gaitonde和Gordon，J.Boil.Chem.，vol.230，no.1，p.1043-1050公開(kāi)了一種定量測(cè)定莽草酸的方法，其中，用高碘酸氧化莽草酸的溶液，加入氫氧化鈉以形成黃色的生色團(tuán)，并加入甘氨酸以穩(wěn)定該色彩。然后在該溶液加入氫氧化鈉后的十分鐘內(nèi)測(cè)量該溶液的光密度。
Millican，Methods in Enzymology，vol.17A，p.352-353，1970公開(kāi)了一種檢測(cè)莽草酸的方法，其中，用高碘酸鹽氧化含莽草酸的溶液，然后用亞砷酸鹽處理。加入硫代巴比妥酸，溶液呈紅色。然后用環(huán)己酮抽提該溶液。澄清的上層環(huán)己酮相呈紅色，測(cè)定其光密度。
Singh和Shaner，Weed Technology，vol.12，p.527-530，1998公開(kāi)了一種檢測(cè)植物組織中莽草酸的方法，其中，用高碘酸氧化含有莽草酸的試驗(yàn)樣品。然后將樣品與氫氧化鈉混合，加入甘氨酸測(cè)量其光密度。
Sichl，在Herbicide ActivityToxicology Biochemistry and molecular Biology中(由R.M.Roc等人編輯，IOS出版，1997，p.37-65)公開(kāi)了一種DAHP酶的試驗(yàn)方法，其中，該酶在存在其底物磷酸烯醇丙酮酸和丁糖-4-磷酸下培育。加入高碘酸停止該反應(yīng)。隨后加入亞硫酸鈉，以還原過(guò)量的高碘酸。然后加入硫代巴比土酸，接著在十分鐘內(nèi)加入二甲亞砜。測(cè)定其549nm吸收值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測(cè)水溶液中莽草酸的方法，它包括a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸(高碘酸和所述試劑在本文同指高碘酸鹽)的試劑氧化莽草酸；b)加入強(qiáng)堿以產(chǎn)生生色團(tuán)；c)加入亞硫酸鹽以穩(wěn)定生色團(tuán)；d)檢測(cè)生色團(tuán)的存在。還可包括步驟e)定量測(cè)定生色團(tuán)。生色團(tuán)的存在表明在該水溶液中存在莽草酸。生色團(tuán)的量與水溶液中的莽草酸的量有直接的關(guān)系。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟b和c加入含有亞硫酸鹽和強(qiáng)堿的混合物同時(shí)進(jìn)行，這樣，過(guò)量高碘酸鹽的還原和生色團(tuán)的產(chǎn)生同時(shí)發(fā)生。
申請(qǐng)者已發(fā)現(xiàn)，同時(shí)使用高碘酸和高碘酸鹽與莽草酸反應(yīng)，比單獨(dú)使用高碘酸具有更快的反應(yīng)時(shí)間，特別是當(dāng)氧化反應(yīng)在溫度高于環(huán)境室溫進(jìn)行時(shí)。
另外，申請(qǐng)者還發(fā)現(xiàn)，使用亞硫酸鹽來(lái)還原多余的高碘酸和高碘酸鹽大大地增進(jìn)了加入強(qiáng)堿氧化莽草酸后產(chǎn)生的生色團(tuán)的穩(wěn)定性。
申請(qǐng)者的方法也可用于檢測(cè)組織尤其是植物組織中的莽草酸。因此，本發(fā)明另一方面提供了一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中的莽草酸的方法，該方法包括(a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑處理試驗(yàn)樣品；(b)將強(qiáng)堿加入試驗(yàn)樣品中以產(chǎn)生生色團(tuán)；(c)用亞硫酸鹽穩(wěn)定生色團(tuán)；(d)檢測(cè)生色團(tuán)的存在。該方法還可以包括步驟(e)定量測(cè)定生色團(tuán)。較佳的方法是，步驟b和c用含有亞硫酸鹽和強(qiáng)堿的混合物同時(shí)進(jìn)行，這樣，過(guò)量的高碘酸鹽的還原和生色團(tuán)的產(chǎn)生同時(shí)發(fā)生。
與現(xiàn)有的檢測(cè)莽草酸的一些方法不同，申請(qǐng)者的方法能直接應(yīng)用于組織抽提液。適當(dāng)?shù)慕M織抽提液可不用研磨而得到，或者延長(zhǎng)植物材料的回流而得到。另外，與現(xiàn)有的其他一些方法不同，申請(qǐng)者的方法提供了更穩(wěn)定的生色團(tuán)，這樣，生色團(tuán)的檢測(cè)不需要在高碘酸氧化反應(yīng)結(jié)束后盡可能快的進(jìn)行。本發(fā)明方法直接用于組織樣品的適用性、可以延遲對(duì)生色團(tuán)的檢測(cè)至少一小時(shí)、以及可任選地對(duì)生成的生色團(tuán)進(jìn)行定量測(cè)定使得本發(fā)明非常適合于以高通量對(duì)組織樣品進(jìn)行篩選。
本發(fā)明這些和其他方面的內(nèi)容將在以下的本發(fā)明的詳細(xì)描述中進(jìn)行陳述。
發(fā)明的詳細(xì)描述高碘酸氧化莽草酸產(chǎn)生反式-烏頭酸和一個(gè)二醛。當(dāng)通過(guò)加入足量的氫氧化鈉去除多余的高碘酸以將pH值升至10以上時(shí)，產(chǎn)生了顯著的強(qiáng)烈的黃色。已發(fā)現(xiàn)只有莽草酸、奎尼酸和色氨酸在用高碘酸處理后，在堿性條件下產(chǎn)生黃色的生色團(tuán)。莽草酸形成的黃色是幾種檢測(cè)莽草酸方法的基礎(chǔ)，這種黃色可能是形成的二醛的特征。呈黃色的生色團(tuán)不穩(wěn)定，一些方法使用一種化合物如甘氨酸來(lái)穩(wěn)定該顏色。申請(qǐng)者已發(fā)現(xiàn)，亞硫酸鹽比已知的方法能更好得多地穩(wěn)定生色團(tuán)，并提供了一種可直接用于組織樣品的方法。
本發(fā)明提供一種檢測(cè)水溶液中莽草酸的方法，該方法包括a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸(在這里同指高碘酸鹽)的試劑氧化莽草酸；b)加入強(qiáng)堿以產(chǎn)生生色團(tuán)；c)加入亞硫酸鹽以穩(wěn)定生色團(tuán)；d)檢測(cè)生色團(tuán)的存在。并可任選地包括步驟e)定量檢測(cè)生色團(tuán)。生色團(tuán)的存在表明水溶液中存在莽草酸。生色團(tuán)的量與水溶液中的莽草酸的量有直接的關(guān)系。可能已知水溶液含有莽草酸，如當(dāng)將已知數(shù)量的莽草酸加入到水溶液中以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，或者懷疑含有莽草酸，如試驗(yàn)樣品。
檢測(cè)植物中的莽草酸可用來(lái)確定一種植物是否接觸過(guò)除草劑草甘膦，也可用來(lái)測(cè)定植物是否對(duì)該除草劑有抗性。因而，本發(fā)明的方法可用于需要檢測(cè)和/或定量莽草酸的情況。例如，本發(fā)明的方法可用來(lái)篩選植物或植物組織或細(xì)胞，以確定其對(duì)除草劑草甘膦的抗性，或者用來(lái)測(cè)試農(nóng)作物，以確定其是否接觸過(guò)草甘膦。
本發(fā)明的方法可在水溶液中方便地進(jìn)行。該水溶液可以是水，或者水與可水溶和的有機(jī)溶劑的混合液。本發(fā)明的方法適用于不同類(lèi)型的組織，包括植物、動(dòng)物和微生物組織。植物組織較佳。當(dāng)使用組織樣品時(shí)，需先將莽草酸抽提到一種合適的溶劑中，如一種水溶液和可水溶和的有機(jī)溶劑，然后如有必要，澄清得到的溶液。
使用合適的方法可從組織中抽提莽草酸。申請(qǐng)者已發(fā)現(xiàn)，在室溫下，使用含有水和可水溶和的有機(jī)溶劑的溶液可不難且大量地從植物組織中抽提出莽草酸。較佳的是，該植物組織事先已被冷凍至-4℃以下。用來(lái)從組織中抽提莽草酸的溶液的pH可以是堿性的或酸性的?？伤芎偷挠袡C(jī)溶劑可以是莽草酸能溶于其中的任何溶劑，較佳的是低分子量的酒精，更佳的是異丙醇。在抽提液中培育該組織，直到全部或足夠量的莽草酸被抽提出來(lái)。一般大約24小時(shí)后完成抽提，但通常在16到24小時(shí)后完成，或甚至更短。
抽提莽草酸的溶液較佳的是體積比為2∶1的0.05M堿金屬氫氧化物(水溶液)和異丙醇。堿金屬氫氧化物以氫氧化鈉或氫氧化鉀較佳。
在從植物組織中抽提莽草酸的一個(gè)較佳的方法中，將冷凍至-4℃以下的組織切成小片，將其沉浸在足量的體積比為2∶1的0.05M氫氧化鈉或氫氧化鉀(水溶液)和異丙醇的混合液中。一般情況下，為了方便，每0.1克的植物組織用1毫升的抽提混合液，但其他抽提混合液與組織的比例也是合適的。抽提可以在室溫進(jìn)行，直到?jīng)]有另外的莽草酸被抽提到溶液中。通過(guò)這些步驟，許多植物組織的莽草酸可在16-22小時(shí)里被全部抽提出來(lái)。
按照本發(fā)明的方法而無(wú)需額外的操作，可分析上述抽提混合液各等份中是否存在莽草酸，使大量的樣品分析能方便地進(jìn)行。例如，可在96孔或更小的塑料板中對(duì)少量的植物組織進(jìn)行組織抽提，用自動(dòng)處理裝置從板孔中取出等份抽提液，測(cè)定其吸收值，從而確定植物樣品中的莽草酸量。
可以用高碘酸或含有高碘酸和高碘酸鹽的試劑(高碘酸鹽試劑)來(lái)進(jìn)行莽草酸的氧化反應(yīng)。為了易于參考，高碘酸和含有高碘酸和高碘酸鹽的試劑一般稱(chēng)為高碘酸鹽。較佳的是，用含有比例為1∶1的高碘酸和高碘酸鹽試劑來(lái)進(jìn)行氧化反應(yīng)。該試劑可以用水配成0.5％(重量/體積)的高碘酸和0.5％(重量/體積)偏高碘酸鈉水溶液。將高碘酸鹽加到含有或懷疑含有莽草酸的水溶液中。將足量的高碘酸鹽加到該水溶液中，這樣，在該水溶液中就有超過(guò)已知量或懷疑量的莽草酸的摩爾濃度大大過(guò)量的高碘酸鹽。
莽草酸的氧化反應(yīng)可在環(huán)境室溫或高的溫度下進(jìn)行。較佳的是，氧化反應(yīng)在25-65℃之間進(jìn)行，更佳的在35-50℃之間。申請(qǐng)者已發(fā)現(xiàn)，在37℃時(shí)莽草酸的氧化反應(yīng)在30到45分鐘后完成。當(dāng)氧化反應(yīng)在環(huán)境室溫下進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)要花3小時(shí)。
在水溶液中加入強(qiáng)堿，停止或結(jié)束莽草酸的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生生色團(tuán)；然后加入亞硫酸鹽，以還原過(guò)量的高碘酸鹽，穩(wěn)定該生色團(tuán)。較佳的是，同時(shí)將含有強(qiáng)堿和亞硫酸鹽的混合物加到該水溶液中以結(jié)束該反應(yīng)和穩(wěn)定生色團(tuán)。然而，分別地加入堿和新配置的亞硫酸鹽溶液也能實(shí)現(xiàn)這些步驟。
堿是強(qiáng)堿較佳，如氫氧化物，是堿金屬氫氧化物更佳，如氫氧化鈉或氫氧化鉀，最佳的是氫氧化鈉。加入足量的堿，使水溶液堿性pH超過(guò)10，超過(guò)11較佳。較佳的是，用水或其他溶劑混合堿，本發(fā)明方法中更佳的是使用堿與水的混合液。在該水溶液中加入堿和亞硫酸鹽產(chǎn)生穩(wěn)定的生色團(tuán)，在加入堿和亞硫酸鹽后大約1小時(shí)可在該水溶液中檢測(cè)到該生色團(tuán)的存在。
將數(shù)量足以穩(wěn)定生色團(tuán)的亞硫酸鹽分別或與強(qiáng)堿混合加入到該水溶液中，這些生色團(tuán)因?qū)?qiáng)堿加入完成的高碘酸鹽氧化反應(yīng)而產(chǎn)生。亞硫酸鹽被加入到水溶液中，因此，溶液中亞硫酸鹽比高碘酸鹽有更多的摩爾。過(guò)量的亞硫酸鹽并不干擾本發(fā)明的方法。任何溶液形式的亞硫酸鹽都可用于本發(fā)明的方法，例如鈉鹽或鉀鹽，較佳的是亞硫酸鈉。亞硫酸鹽宣與水或其它的溶劑混合，更佳的在本發(fā)明方法中采用亞硫酸鹽與水的混合液。
水溶液中表明有莽草酸的生色團(tuán)的存在可用任何適合的方法檢測(cè)，例如用分光光度計(jì)測(cè)量382nm的光密度，或者目測(cè)水溶液是否呈黃色。任選地也可以定量測(cè)定試驗(yàn)樣品的生色團(tuán)，因而可提供水溶液中的莽草酸量。定量測(cè)定可用任何適合的方法進(jìn)行，例如與標(biāo)準(zhǔn)莽草酸比較，該標(biāo)準(zhǔn)樣品是用本發(fā)明方法由已知數(shù)量的莽草酸制成。本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，水溶液的光密度是用分光光度計(jì)測(cè)量382nm得到的，通過(guò)與用已知量莽草酸配制的并用分光光度計(jì)測(cè)量382nm光密度的莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的比較而確定生色團(tuán)的量。
本發(fā)明方法的實(shí)施中，較佳的是，對(duì)于未處理對(duì)照植物試驗(yàn)樣品，它的生色團(tuán)的檢測(cè)至少有0.05吸光度單位(AU)的吸收值，為了從分光光度計(jì)測(cè)量生色團(tuán)獲得最佳效果的含最大量莽草酸/莽草羧基的試驗(yàn)樣品，其生色團(tuán)的檢測(cè)少于2.0AU吸收值。申請(qǐng)者已發(fā)現(xiàn)，用致死量的草甘膦處理過(guò)的植物，大多數(shù)都積累了莽草酸/莽草羧基到如下水平可將150mg葉組織以8倍(w/v)0.25N的鹽酸研磨制成的水溶液5-10μL，加入250μL的高碘酸鹽試劑和水而得到0.5毫升。在上述水溶液中，莽草酸/莽草羧基與高碘酸鹽試劑反應(yīng)之后，加入0.5毫升含有亞硫酸鹽和氫氧化鈉的混合液終止反應(yīng)，得到1毫升溶液，其吸收值大約為1.8AU，而未處理的對(duì)照植物產(chǎn)生的吸收值大約為0.1AU。
本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，用本發(fā)明方法來(lái)測(cè)定植物組織的酸性水抽提液中的莽草酸的存在和/或水平。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例中，組織的試驗(yàn)樣品，宜是含有按本文所述用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑處理，使莽草酸氧化制得的植物組織的水溶液的試驗(yàn)樣品。將強(qiáng)堿加入該試驗(yàn)樣品中，以產(chǎn)生生色團(tuán)，再用亞硫酸鹽穩(wěn)定生色團(tuán)。然后檢測(cè)生色團(tuán)的存在，從而表明試驗(yàn)樣品中莽草酸的存在?？扇芜x的，定量測(cè)定該試驗(yàn)樣品中的生色團(tuán)的量，以提供試驗(yàn)樣品中的莽草酸量。
延遲檢測(cè)和/或定量測(cè)定生色團(tuán)達(dá)到至少1小時(shí)的能力，和不用額外的操作即能運(yùn)用組織抽提的能力使得本發(fā)明方法非常適合于高通量篩選，以及其它的檢測(cè)大量樣品的情況。
例如，組織抽提可在96孔板或更小的塑料板中的少量的植物組織上進(jìn)行，通過(guò)自動(dòng)采樣處理裝置從中取出等份抽提液，以測(cè)定其吸收值。植物樣品中的莽草酸量可以通過(guò)與莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸收值比較而確定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1-試劑的背景吸收將250μL水、250μL高碘酸鹽試劑、0.3毫升1N的NaOH和0.2毫升0.056M的Na2SO3混合，測(cè)定382nm的吸收值。吸收值是0.047，在5分鐘內(nèi)沒(méi)有明顯的漂移。選擇0.056M的亞硫酸鈉，是因其與加入的高碘酸鹽的摩爾相等。
高碘酸鹽試劑系將重量百分比0.5％的高碘酸和重量百分比0.5％的偏高碘酸鈉溶于水中制成。
表1加入試驗(yàn)溶液 T＝0分時(shí)T＝5分時(shí)T＝30分時(shí)T＝60分時(shí)的物質(zhì)的A(382) 的A(382)的A(382) 的A(382)先加NaOH，0.949 0.949 0.9410.924然后加Na2SO3加混合溶液 0.959 0.957 0.9530.930加堿后再加入亞硫酸鈉，使生色團(tuán)具有超過(guò)30分鐘的優(yōu)異穩(wěn)定性，60分鐘后僅有大約3％的吸收值損失；而加入混合試劑，稍微增加了其敏感性，穩(wěn)定性相當(dāng)?；旌先芤菏覝貢r(shí)可穩(wěn)定大約12小時(shí)，但另外的試驗(yàn)可能顯示它能穩(wěn)定更長(zhǎng)的時(shí)間。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將表2的每一個(gè)條目所顯示2mM莽草酸量加到在1.5毫升聚丙烯微型試管中，并加入水至250μL。然后加入250μL的高碘酸鹽試劑，將該試管37℃放置30分鐘。在第30分鐘時(shí)加入NaOH/Na2SO3混合試劑。在5分鐘內(nèi)測(cè)完各生成溶液的382nm吸收值，將兩組試驗(yàn)結(jié)果平均，其值列于表2中的第2欄。
表2加2mM莽草酸的 僅加水的A(382)加了植物抽提液的A體積(μL)值 (382)值0 0.0660.0952 0.2180.2664 0.4090.4796 0.5750.66410 0.9441.02814 1.2431.320將黑麥草(Lolium perrenne)培養(yǎng)在溫室的土壤中2-3周，直到它長(zhǎng)出3-4片葉子。采集其在空氣中的部分，然后立即將此部分冷凍，維持在-80℃。為了制備植物抽提液，將大約1克的組織樣品解凍并稱(chēng)量。在液氮中將組織冷凍，并用研缽和杵將其研磨成細(xì)粉末。然后加入相當(dāng)于4倍組織重量體積的0.25N鹽酸，再將得到的漿研磨5分鐘。將此材料以25000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，用移液管將上清液移到琥珀色玻璃小瓶中。
重復(fù)上述繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，但將5μL未處理的黑麥草(Lolium)抽提液加到每個(gè)試管中。其結(jié)果列在表2中的第三欄。如果將這些數(shù)據(jù)繪制成吸收值對(duì)所加莽草酸的曲線，將得到兩條平行的直線。僅對(duì)于莽草酸而言，其研究數(shù)據(jù)表明，在這個(gè)試驗(yàn)步驟中，存在的莽草酸和其385nm的吸收值有直接的關(guān)系，其吸收值至少達(dá)到1.25AU。加入植物抽提液及莽草酸后所得的研究數(shù)據(jù)表明，未處理黑麥草(Lolium perrenne)抽提液含有少量的莽草酸，以及加入的植物抽提液并不影響到莽草酸的化學(xué)測(cè)試。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)水溶液中莽草酸的方法，其特征在于，它包括(a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑氧化莽草酸；(b)加入強(qiáng)堿，產(chǎn)生生色團(tuán)；(c)用亞硫酸鹽穩(wěn)定所述生色團(tuán)；(d)檢測(cè)所述生色團(tuán)的存在；以及可任選地(e)定量測(cè)定所述生色團(tuán)的量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述強(qiáng)堿是氫氧化鈉。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述亞硫酸鹽是亞硫酸鈉。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述步驟(b)和(c)是通過(guò)加入含有亞硫酸鹽和強(qiáng)堿的混合液同時(shí)進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(a)用含高碘酸和高碘酸鹽的試劑進(jìn)行。
6.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中的莽草酸的方法，它包括(a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑處理試驗(yàn)樣品；(b)在所述試驗(yàn)樣品中加入強(qiáng)堿，產(chǎn)生生色團(tuán)；(c)用亞硫酸鹽穩(wěn)定所述生色團(tuán)；(d)檢測(cè)所述生色團(tuán)的存在；以及可任選地(e)定量測(cè)定所述生色團(tuán)的量。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述強(qiáng)堿是氫氧化鈉。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述試驗(yàn)樣品是植物組織樣品。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述亞硫酸鹽是亞硫酸鈉。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述步驟(b)和(c)加入含有亞硫酸鹽和強(qiáng)堿的混合液同時(shí)進(jìn)行。
11.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，步驟(a)使用含高碘酸和高碘酸鹽的試劑進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)莽草酸的方法,它包括:用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑氧化莽草酸;加入強(qiáng)堿,以產(chǎn)生生色團(tuán);加入亞硫酸鹽,以穩(wěn)定生色團(tuán);檢測(cè)生色團(tuán)的存在;還可任選地進(jìn)行生色團(tuán)的定量測(cè)定。本發(fā)明的方法可直接應(yīng)用于組織抽提液,應(yīng)用于植物組織抽提液較佳。
文檔編號(hào)G01N33/66GK1351711SQ00806428
公開(kāi)日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年2月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月19日
發(fā)明者T·H·克羅馬蒂, N·D·波爾格 申請(qǐng)人:先正達(dá)有限公司