專利名稱：用于高通量熒光探測的新型掃描光譜儀的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用雙光柵單色儀而非濾光片的波長掃描熒光光譜儀，用于選擇光的激發(fā)和輻射波長并探測和量化從同一樣品中從多個熒光團的同時熒光輻射。
背景技術：
定義1)熒光某種自然界存在的礦物質(zhì)、多芳香核碳氫化合物和其它的雜環(huán)的電子能量吸收和釋放的多級過程的結果。
2)激發(fā)由光源提供能量光子e＝hνexc并被一個熒光團的外層電子吸收，外層電子從基態(tài)S0躍升為單一的電子激發(fā)態(tài)S’1。
3)激發(fā)態(tài)壽命一個受激電子保持在一種單一態(tài)的一段有限的時間，典型值為1～20ns，在該階段內(nèi)熒光團經(jīng)歷各種變化，包括結構的變化和與溶劑相互作用的改變。做為這些變化的結果，S’1態(tài)單電子的能量部分地損耗為弛豫單激發(fā)態(tài)S1，其間發(fā)生能量的熒光輻射，電子返回到基態(tài)S0。
4)輻射激發(fā)態(tài)電子釋放的能量光子e＝hνexc，使熒光團返回到基態(tài)。由于激發(fā)態(tài)壽命期間的能量損耗，這些光子的能量低于激發(fā)光子的能量，并且輻射的光屬于長波。能量之差(或波長)稱作斯托克斯平移，該平移值是在選擇用作標簽或用在探針中的染料時的一個重要特征。斯托克斯平移越大，越容易從背景激發(fā)光中區(qū)分少量的光子。
5)熒光團熒光分子統(tǒng)稱為熒光團。當熒光團被用于給其它的分子增加顏色時，熒光團被稱作熒光染料，并且組合物被稱作熒光探針。熒光探針設計成1)把可視目標定位并抑制在生物樣品的特定區(qū)域之內(nèi)，或，2)響應于一種特定的刺激。
6)電磁波譜所有類型的電和磁輻射的整個波譜，被認做是一個連續(xù)譜，從波長為0.001埃的伽馬射線到波長大于1,000,000千米的長波，還包括紫外、可見和紅外波譜。
7)熒光光譜除非熒光團不穩(wěn)定(光褪色)，在樣品被照明期間激發(fā)和輻射是一個重復的過程。對于溶液中的多原子分子，不連續(xù)的電子躍遷分別被稱作熒光團激發(fā)和熒光團輻射譜的寬能量帶取代。
8)單色儀一種允許從電磁波譜開始的很寬頻譜范圍的波長經(jīng)入射腔進入、并通過在空間色散波長而使得只能夠在出射口得到窄頻帶的預定波長的儀器。濾色片不同于單色儀之處在于濾色片通過透射選定波長而非空間色散地提供波長選擇。單色儀的第二個區(qū)別特征在于輸出波長、以及在很多情況下的輸出頻譜帶寬可以是連續(xù)選擇地。單色儀的最小光學元件典型地包括(a)提供一個窄的光學圖象的入射狹縫；(b)確保從狹縫進入的光線平行的準直器；(c)一些用于把進入的光線色散成空間分離的波長的元件；(d)由選取的波長重新建立狹縫圖象的聚焦元件；和(e)隔離所需波長的光的出射狹縫。
在一個單色儀中，波長選擇通過一個驅(qū)動系統(tǒng)實現(xiàn)，該系統(tǒng)使色散元件繞經(jīng)過其中心的軸系統(tǒng)性地旋轉(zhuǎn)。在單色儀中狹縫是具有可調(diào)節(jié)尺寸的窄腔。狹縫影響所需波長的選擇并且它們的尺寸可以調(diào)節(jié)。
9)雙單色儀兩個串接的單色儀。第二個單色儀接受第一個單色儀選擇的光的波長，并進一步將預定的波長與無用的波長分開。
10)波長掃描離開單色儀出射狹縫的預定輸出波長的連續(xù)改變。在一個光譜儀中，由激發(fā)光單色儀掃描電磁波譜的波長以確定或規(guī)定熒光團被激發(fā)處的波長；由發(fā)射光單色儀進行的波長掃描被用于確定并探測熒光團發(fā)射熒光處的波長。在自動的熒光團光譜儀中，激發(fā)光單色儀和發(fā)射光單色儀既可以單獨地工作，也可以共同地(同步)工作。
11)區(qū)域掃描區(qū)域掃描不同于波長掃描，它是在限定的二維空間中對局域熒光團強度的集中測量。結果是一個強度圖象、數(shù)據(jù)庫或圖表，映射出在二維樣品中實際位置處的熒光團強度。在一個其最簡單的例子中，區(qū)域掃描可以是一幅相機拍攝的照片，其中一致地受激所有的數(shù)據(jù)?；蛘撸梢园褬悠芬七^一個探測器，探測器測量在限定的樣品分區(qū)中的熒光團。收集的信息形成一個涉及熒光團強度的矩陣，其中其位置處可以產(chǎn)生代表原始樣品中熒光團的圖象、圖表或曲線。
12)熒光探測器在最近的二十年里在實驗室通過使用熒光團建立了五個元件的熒光探測器(a)一個激發(fā)光源；(b)一個熒光團；(c)某種類型的濾波器，用于分開發(fā)射光子和激發(fā)光子；(d)某種類型的光敏響應元件，把發(fā)射光子轉(zhuǎn)變成一種可記錄的形式，典型的是電子信號或照片圖象，和(e)限制環(huán)境光的閉光外殼。
熒光探測器主要有四種類型，每一種提供不同的信息(a)相機通過捕獲一幅圖象而將熒光分辨為二維空間坐標[a]做為高敏感性膠片上的一幅照片圖象，或[b]做為捕獲到電荷耦合器件(CCD)中象素陣列上的重現(xiàn)圖象。
(b)熒光顯微鏡還將熒光分辨為二維或三維空間坐標。顯示外在同一時間對一個規(guī)定的視場收集一個圖象的所有信息，既不用移動樣品，也不用移動目鏡。顯微鏡可以通過利用相機捕獲圖象而引入對熒光團濃度的量的估算，其中測量結果是曝光時間的函數(shù)。
(c)血細胞流量器測量流體中每個生物細胞中的熒光團，使得能夠識別、量化以及在某些情況下分離細胞混合物內(nèi)的亞種群。流量器不能用于產(chǎn)生限定區(qū)的圖象或執(zhí)行波長掃描。激發(fā)光光源永遠是一個激光器，波長的識別通過可調(diào)諧染料激光器和濾光器的某種組合來完成。雖然這些設備可以采用光電倍增管探測一個可測量的信號，但沒有采用單色儀進行波長掃描的流量器。
(d)分光熒光計(光譜儀主要采用PMT探測熒光，而且還測量(a)熒光產(chǎn)生的平均電流(信號平均)，或(b)單位時間里由樣品發(fā)出的光子數(shù)(光子計數(shù)))。
熒光光譜儀是一種分析儀器，其中的熒光染料或探針可以由特定波長的光激發(fā)，從而探測并分析其發(fā)射光以識別、測量和量化探針的濃度。例如，一套DNA可以與熒光染料分子化學連接或由其標識，當該熒光染料分子暴露在規(guī)定波長的光照下時吸收能量，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。如上所述，激發(fā)態(tài)分子通過各種途徑釋放過剩的能量，包括熒光發(fā)射。發(fā)射的光可以集中和分解?；蛘叻肿拥奶匦钥梢耘c酶共軛，酶可以把特定的襯底分子從非熒光轉(zhuǎn)變成熒光產(chǎn)物，之后可以如上所述地激發(fā)并探測該熒光產(chǎn)物。
用在熒光光譜儀中的激發(fā)和發(fā)射波長的范圍一般限定在電磁波譜的紫外和可見部分。為了熒光探測的目的，有用的染料是那些被激發(fā)并發(fā)射少量的窄帶波長的熒光，波長處在電磁波譜的近紫外和可見部分。激勵特定的熒光分子的所需波長可以如下產(chǎn)生1)光通過一系列帶通濾波器(透射所需波長的光并對其它光不透明的材料)或截止濾波器(透過所有長于或短于規(guī)定值的波長的材料)的寬帶光源，2)窄帶光源，如激光器，或3)一個適當?shù)膯紊珒x。
對于寬帶光源，主要通過帶通濾波器分離對熒光染料曝光的光，從而從紫外或可見光譜中選擇所需的波長用于激發(fā)。在基于單色儀的儀器中，當光源發(fā)出的光被色散成一個光譜時獲得波長的選擇，從中選取所需的波長。無論是什么光源都主要通過帶通濾波器、截止濾波器或發(fā)射光單色儀離析熒光發(fā)射，通過除去規(guī)定波長以外的所有任何波長而選取用于探測的所需波長。大部分熒光探測包括對處于液相的樣品檢查。液體可以包含在玻璃、塑料或石英腔中，可以以例如單獨的比色杯、流經(jīng)盒或管、顯微鏡滑片、柱狀或矩形多腔板、或是可具有許多核酸或保護它們的連接面的硅微陣列等形式攜帶?；蛘?，液體也可以收集在二維聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠中。在這些每個情形中，已穿過濾光片以選擇用于激發(fā)的正確波長的光對腔或凝膠中的樣品照明；同時也收集發(fā)射的光，使其穿過第二組濾光片以離析發(fā)射波長，并再利用相機或光傳感器進行探測。
用在熒光探測器中的濾光片呈現(xiàn)出的特性在于限定熒光探測的敏感度、動態(tài)范圍和靈活性，包括經(jīng)過系統(tǒng)時導致效率損耗的光吸收；固有的自發(fā)熒光，產(chǎn)生強背景信號；所需帶寬的波長以外的其它波長的透射，它反之限定敏感度和動態(tài)范圍。濾光片必需設計并制造成選擇不連續(xù)范圍的波長(“中心寬度的帶通”)，把熒光探測限定到利用被激發(fā)的化合物并在適用于那些濾光片的波長處發(fā)射。開發(fā)具有非常特性的新熒光染料必需設計新的激發(fā)/發(fā)射濾光片對。
為了提高熒光比色杯光譜儀的效率以及提供波長的連續(xù)選擇，已知利用光柵或基于棱鏡的單色儀從激發(fā)光源色散入射光、選擇窄帶激發(fā)波長，并分別選擇發(fā)射波長。光柵可以有多種形式，但蝕刻有把寬帶光色散成許多波長的線。
單色儀主要包括一個帶有入射狹縫和出射狹縫的閉光腔。從光源發(fā)出的光聚焦到入射狹縫上。殼內(nèi)的準直反射鏡把接收到的光束導向平面光柵，光柵把光波色散到出射狹縫上。通過旋轉(zhuǎn)光柵移動波長的線性陣列超過出射狹縫來選擇所需波長的光，使得只有較窄帶寬的波長能夠從單色儀出射。選取的光波的實際范圍由狹縫的尺寸決定。
從一個連續(xù)譜的所有波長中連續(xù)選擇窄帶波長的過程被稱作波長掃描，并且散射光柵相對于入射和出射狹縫的角度旋轉(zhuǎn)與單色儀的輸出波長相關。為了更精確地選擇激發(fā)和熒光探測的波長，已知在每個單色儀中使用兩個光柵以增強對熒光光譜儀中激發(fā)和發(fā)射光的波長選擇。
雖然單色儀潛在地消除了對利用濾光片進行波長選擇的需要并且使科學家不受濾光片的限制，但它們的使用增加了對儀器靈敏度和設計的其它限制。例如，有著上述結構的單色儀具有至少需要四個反射鏡和兩個色散元件、并且相關的光阻擋入射和出射狹縫的缺點。因此，這種裝置較為復雜，并且與基于濾光片的儀器相比較為低效。
利用熒光光譜儀分析多腔板中的多種樣品是高度專業(yè)化的。典型的做法是激發(fā)光從腔上方的一個小角度進入到腔中，從而使得能夠通過一個透鏡或反射鏡校正一個腔內(nèi)從樣品發(fā)射的大部分熒光。但是，隨著每個板上的腔數(shù)增加(如從每個板96個腔增加到超過每個板9600個腔)，此種側照明結構變得不利，因為大部分入射的激發(fā)光照射到腔的側面而非樣品。由于這些腔一般具有黑側腔，所以大部分激發(fā)光被損失。
如上所述，用于克服側照明結構局限性的一種方法是利用光纖把激發(fā)光直接導向位于一個腔之上的光纖的一個照明端。用第二束光纖收集腔中的光并將其傳遞到PMT。在這種設計的一種改型中，位于一個微腔之上的二分叉光纖被用于把光載入并載出該腔。但是，光纖一般帶來吸收損耗，并且在某些波長處還有自發(fā)熒光。因此，這種方法不是特別有效。
另一種方法是采用具有透明底面的多腔板，并將一個腔內(nèi)的樣品暴露于從底面而來的激發(fā)光下，同時從口渴的頂部收集發(fā)射光。雖然此方法在某些情況下是有價值的，但光被吸收以及被腔底的塑料散射而損耗。
另外，透明板材本身可以是自發(fā)熒光的。此外，還沒有實現(xiàn)腔底面材料的腔對腔的光可再現(xiàn)性，這限制了基于腔對腔或板對板的相關測量。因此，這種方法被證明是比從樣品的同側照明并收集光低效的。
現(xiàn)有的使用光纖光路的一個例子包括Molecular Device于1998年引進的一種單體單一熒光微滴板探測器(“Spectromax GEMINT”)，它采用單光柵、單色儀、濾光片、反射鏡和光纖、以及“Fluorolog-3”模塊設備和“Skin-Sensor”、一個單元化設備的混合式結構，由Instrument SA制造，二者都采用二分叉光纖束從激發(fā)光單色儀導入光，并在光透到激發(fā)單色儀之后從一個樣品處收集光。
應該注意，熒光單色儀的微滴板應用也被限制到具有384、96或更少腔的微腔板，即1536的腔的微板以及包含2500個腔、3500個腔、甚至9600個腔的納米板不能與基于目前的光纖/單色儀的儀器一起使用。這種板的探測器主要使用激光器和與共焦顯微鏡結合的濾光片。
對于大量包括玻璃顯微鏡滑片、聚丙烯酰胺凝膠或標準的96腔、384腔和1536腔微腔板的應用，希望有一個熒光光譜儀提供高效、高精度連續(xù)選擇激發(fā)和發(fā)射波長并提供很大的動態(tài)范圍、消除使用光纖和濾光片(即光路不通過任何光學材料除空氣)的熒光光譜儀，該光譜儀具有把激發(fā)光導向樣品并從微滴腔中或一個二維表面上的樣品收集發(fā)射光的高效結構，其中二維表面譬如是一個玻璃顯微鏡滑片、聚丙烯酰胺凝膠、硅片微陣列或其它固體表面。
一般地，熒光光強度、即亮度的測量定義為每單位時間發(fā)出的光子數(shù)。從原子或分子發(fā)射的熒光可用于量化樣品中發(fā)射物質(zhì)的量。熒光強度和被分析物濃度的關系是F＝kQeP0(1-10[Ebc])這里的F是測得的熒光強度，k是儀器的幾何因子，Qe是量子效率(發(fā)射光子/吸收光子)，P0是激發(fā)概率，該值是激發(fā)源輻射功率的函數(shù)，ε是與波長有關的摩爾吸收率系數(shù)，b是路徑長度，c是被分析物的濃度。在前面的應用中，通過擴展方程并減去高階項而把上述方程簡化為F＝kQeP0(2.303*ε*b*c)過去這個關系式被接收是因為熒光強度顯現(xiàn)出與被分析物的濃度成正比。但是此方程不能提供不同熒光團之間熒光強度的比較，因為熒光強度的測量極大地依據(jù)于k這一儀器幾何因子。
不同類型的探測器在進行測量的時間階段內(nèi)以及在光子可以區(qū)分時的速度方面有所變化，其特征在比較兩個熒光團的發(fā)光度時是至關重要的?？紤]兩個熒光染料，二者的不同之處僅在于其中一個的激發(fā)態(tài)壽命比另一個熒光團的激發(fā)態(tài)壽命長十倍(如分別是1ns和10ns)。當利用已曝光了限定曝光時間的照相膠片進行探測時，短壽命的熒光染料在曝光膠片上明顯地更為明亮。但是，如果使用一個采用連續(xù)激發(fā)的探測器，其中該探測器不能以足夠高的頻率區(qū)別光子，則短激發(fā)態(tài)壽命的熒光團實際上將能夠發(fā)射更多的光子，但探測器會錯誤地表示兩種染料的熒光強度相同。
光譜儀中通過在一個適當?shù)墓饷羝骷绻怆姳对龉芑蚱渌墓饷羝骷挟a(chǎn)生光電流而探測熒光，兩種光敏器件的特點均在于低水平的背景或隨機電子噪音。為此，熒光發(fā)射過程的最佳特點在于泊松統(tǒng)計和熒光既可以通過光子計數(shù)也可以通過信號平均測量。
光子計數(shù)是一項用于測量低水平電磁輻射的高靈敏技術。在光子技術探測中，光子以足夠的能量碰撞到光電倍增管的陽極、引發(fā)電子雪崩而產(chǎn)生的電流通過一個識別電路測試，從而區(qū)分隨機電子噪音和真實信號。在這種光水平下，光子的分立性支配測量并要求這樣的技術，即能夠區(qū)分光子引發(fā)的電脈沖與由于其它原因起源于探測器(如光電倍增管)的暗電流脈沖。
在以前的光子計數(shù)應用中，探測的動態(tài)范圍受探測器區(qū)分時間上緊密相關的光子的能力的制約。另外，在光子計數(shù)中的信噪比也是光強度的函數(shù)。假設入射到光陰極的穩(wěn)定光通量每秒鐘產(chǎn)生m個光電子。在任何一秒內(nèi)入射到光陰極上的光平均是m個光電子，標準偏差是m1/2。在測量中的信噪比是S/N＝m/m1/2＝m1/2(1)
根據(jù)它們的頻率和能量，可以利用具有足夠大增益的探測器對各個光電子計數(shù)，但任何測量的精度絕不會好于方程(1)規(guī)定的限度。在其最簡單的形式中，實用的光子計數(shù)儀器由一個快速放大器和一個設置在相對于輸入低閾值的識別器組成，識別器低閾值的典型值為-2mV，經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)該值對應于電子拾波器的靈敏度和光電倍增管在過增益下的工作之間的最佳平衡。
理論上由于小于光子計數(shù)的靈敏性以及對電子漂移的較大的靈敏性，信號平均把光電流用作入射光信號的直接測量?？紤]到系統(tǒng)帶寬(響應頻率)B，與光電流Ik有關的噪音由散粒噪音公式給出S/N＝(Ik/2e IkB)1/2(2)這里的e是電子電荷。方程1和2的形式相似，因為它們是針對相同的現(xiàn)象并且實質(zhì)上預測相同的結果。與光子計數(shù)相反，該方法中信號被固有地數(shù)字化，其動態(tài)范圍受計時器速度的限制，在方程2中信號被認做是光電流的連續(xù)變量，并且可以獲得較大的動態(tài)范圍。但是在實際中，由于與大于16位分辨率的A/D轉(zhuǎn)換器有關的較慢的響應時間，模式-數(shù)字轉(zhuǎn)變過程嚴重地限制動態(tài)范圍。
在熒光探測儀器的一般目的中，光源可以是一個石英鹵燈、氙燈或類似的氣體放電燈、光電二極管或多種類型激光器中的一種。典型的做法是把樣品曝光在連續(xù)的照明之下，把總熒光團中百分比穩(wěn)定的一部分保持在激發(fā)態(tài)。在這種儀器中，樣品被照明的界面尺寸主要由狹縫決定。在更復雜的儀器中，其中包括各種實用成象光、共焦光學元件或點光源照明，激發(fā)光束被透鏡和反射鏡整形并聚焦到樣品中的一個點上和一個焦平面上。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的各個實施例，提供一種波長和區(qū)域掃描熒光光譜儀，該光譜儀包括一個激發(fā)光雙單色儀，一個共軸激發(fā)/發(fā)射光傳遞模塊，一個發(fā)射光雙單色儀，一個高速計時器-計數(shù)器電路板和一個用于相對于激發(fā)光的焦平面定位樣品的精確的x-y-z安裝表。每個元件的工作通過計時器-計數(shù)器板指導和調(diào)節(jié)。每個單色儀包括一對精確安裝的全息凹形光柵，用于從入射的寬帶光束中精確地選擇所需的波段。選取的激發(fā)光通過光傳遞模塊導向到樣品腔上或二維表面上，如聚丙烯酰胺凝膠或顯微鏡滑片，其中光傳遞模塊包括一個共軸激發(fā)反射鏡，該反射鏡放置成把激發(fā)光直接導向多腔板的一個腔中或凝膠的特定區(qū)域、顯微鏡滑片或微陣列上。射出樣品的發(fā)射光通過有較大前表面的反射鏡會集。會集的發(fā)射光通過發(fā)射雙單色儀選擇波長。兩個單色儀包含三個精確匹配的狹縫，狹縫設置在限制無需用光的位置，同時產(chǎn)生一個所需波長的“近似點”光源，用于光路的后續(xù)階段。以這種方式離析的發(fā)射光投射到光電探測器模塊上，光電探測器模塊把接收到的能量轉(zhuǎn)換一個代表樣品熒光強度的數(shù)字。
一個實施例包括一個有光源的熒光光譜儀系統(tǒng)；一個第一雙單色儀，用于分開并輸出光源發(fā)出的選定波長的光做為激發(fā)光；一個光傳遞模塊，用于把基本上所有的激發(fā)光直接導向樣品，并會集、聚焦和導引來自樣品的熒光做為發(fā)射光；一個第二雙單色儀，用于分開并輸出選定波長的發(fā)射光；和一個光電探測器和分析器，用于探測選定波長的發(fā)射光并輸出這一探測的指示。
另一實施例包括一個具有接收光的入射狹縫的雙單色儀；一個第一光柵，放置在攔截并色散來自入射狹縫的接收光的位置；一個第一選擇狹縫，放置在至少攔截一部分來自第一光柵的色散光并選擇和通過此色散光的很窄范圍內(nèi)的波長的位置；一個第二光柵，放置在攔截并色散從第一選擇狹縫通過的光；和一個第二選擇狹縫，放置在至少攔截一部分來自第二光柵的色散光并選擇和通過此色散光的很窄范圍內(nèi)的波長的位置。另一個實施例包括一個具有輸入反射鏡的光傳遞模塊，放置成與被照明的區(qū)域共軸的位置，用于導引入射光照明該區(qū)域；和一個輸出反射鏡，放置成與被照明的區(qū)域共軸并與入射反射鏡反射對齊的位置，用于在照明時會集、聚焦并導引該區(qū)域發(fā)射的光。
另一個實施例包括一個光子計數(shù)光電探測器和一個高速計時器-計數(shù)器板，極大地消除儀器偏差，提供更高的靈敏度，同時能夠高頻率鑒別最大分辨率地區(qū)分光子并進行量化，并且因此提供更大的動態(tài)范圍。
下面通過參考附圖對本發(fā)明的一個或多個實施例的細節(jié)進行描述。本發(fā)明的其它特點，目的和優(yōu)點將從下面的說明、附圖及權利要求書中變得更加清晰。
附圖簡述

圖1是熒光光譜儀系統(tǒng)的簡圖；
圖2A是雙單色儀的另一實施例簡圖；圖2B是用于轉(zhuǎn)動圖2A所示雙單色儀光柵的張緊帶致動機構的簡圖；圖3是圖1所示光傳遞模塊的實施例簡圖；圖4是根據(jù)本發(fā)明的熒光光譜儀簡化版簡圖；圖5A表示本發(fā)明第一替換雙路徑實施例；圖5B表示本發(fā)明第二替換雙路徑實施例。
在各個附圖中相同的標號和標識表示相同的元件。
詳細描述圖1是根據(jù)本發(fā)明熒光光譜儀系統(tǒng)的簡圖。寬帶光源100照明反射鏡102，該反射鏡適當?shù)貜澢瑥亩压饩劢沟诫p單色儀104。在另一種結構中，可以用一種窄帶光源如光電二極管或激光器代替寬帶光源，但與相同結構的單色儀儀器一起使用。
所需波長的光通過雙單色儀104到達光傳遞模塊(LTM)106。LTM106把激發(fā)光從單色儀104導向樣品108，樣品例如是微腔板的一個腔或一維聚丙烯酰胺凝膠的一個窄帶。樣品發(fā)射的任何鎖定熒光都被LTM 106會集，LTM 106把光導向發(fā)射光雙單色儀110的入射狹縫。調(diào)節(jié)發(fā)射光單色儀以通過樣品的熒光發(fā)射譜中的某些波長，并將這些波長導向光電探測器112，在那兒測量發(fā)射光的能量。
光電探測器112可以是任何一種合適的光敏器件，包括但不限于光電倍增管、光電晶體管或光電二極管。光電探測器112的電子輸出施加到一個自動處理單元114，產(chǎn)生一個表示探測選取的發(fā)射光的信號，該信號以適于進一步分析的數(shù)字形式儲存。一般地，在此儀器中光路上的所有元件，包括雙單色儀104和110以及LTM 106，都應該隔離在內(nèi)部涂敷有非熒光吸收性材料的閉光箱中，以減少反射和來自其它光源的光如室內(nèi)光。
圖2A是根據(jù)本發(fā)明的雙單色儀實施例簡圖。圖中所示的結構既可以用于激發(fā)光單色儀104，也可以用于發(fā)射光單色儀110。
寬帶光通過雙單色儀中的一個狹縫200引入并從繞軸203旋轉(zhuǎn)的第一全息凹形光柵202的前表面反射。利用前表面反射，通過避免光學支撐結構、如在后表面反射玻璃鏡內(nèi)的光吸收而提高了雙單色儀的效率。凹形光柵的使用允許光色散成可選擇的波長而無需補充性的準直反射鏡。這種設計使得能夠消除常規(guī)雙單色儀儀器中使用的每個光柵的兩個準直反射鏡。使用全息光柵還減少了象散象差，并因而減小了無用波長(雜散光)的光量。
每個雙單色儀都有三個狹縫一個入射狹縫，光首先通過該狹縫進入單色儀；一個內(nèi)部選擇狹縫；和一個出射選擇狹縫，光通過該狹縫離開單色儀。第一凹形光柵202把入射光波反射成第一空間色散的光束204。此第一空間色散光束204的每一種波長都以相對于其它波長的特有角度反射。通過繞其軸203轉(zhuǎn)動第一凹形光柵202，可以把所需的波段導經(jīng)單色儀腔內(nèi)的內(nèi)部選擇狹縫206。
然后，選取范圍的波長208反射離開第二全息凹形光柵210，該第二全息凹形光柵210把第一空間色散光束204的波長反射為第二空間色散光束212。通過繞其軸211旋轉(zhuǎn)第二凹形光柵210，可以把所需的窄波段214導經(jīng)出射選取狹縫216。
選擇狹縫206和216的寬度決定離開單色儀的光的選取波長。較寬的狹縫允許更大的光量通過單色儀，而且光包括很寬的波段；較窄的狹縫減少通過單色儀的光量，而且光包括很窄的波段。寬狹縫的使用提高了探測的靈敏性，這對測量一個區(qū)域或體積內(nèi)的總熒光是有益的，與在微腔內(nèi)測量的情形一樣。相反，窄狹縫的使用提高了空間分辨率，這對在特定位置區(qū)分不同熒光是有益的，與利用聚丙烯酰胺凝膠中分開的波段的情形一樣。即狹縫尺寸越小，樣品處的探測面積越小。在激光光源和針孔狹縫的情況下，在任何指定時刻的激發(fā)區(qū)是一個對應于一對具體數(shù)據(jù)點，該數(shù)據(jù)代表熒光強度和位置。
在光學系統(tǒng)中每個光學元件都會減少光通量，這是一個一般規(guī)律。圖2A所示結構的優(yōu)點包括但不限于刪除用于在雙單色儀中重新導向光柵的準直反射鏡，如在利用傳統(tǒng)的單色儀的情況。在本實施例中，只需要兩個光導向元件(第一和第二全息凹形光柵202、210)，因而提高了總體光效率。
在圖2A所示的結構中，第一凹形光柵202和第二凹形光柵210相反地并通過適當?shù)臋C構串聯(lián)地旋轉(zhuǎn)。根據(jù)一個實施例的機構使用張緊帶致動機構旋轉(zhuǎn)光柵202、210，如圖2B所示。光柵202、210分別關于樞軸輪250、252共軸安裝。杠桿臂254的一端連接到樞軸輪250，另一端連接到螺旋驅(qū)動機構256。杠桿臂254沿棒258傳動時旋轉(zhuǎn)樞軸輪250。樞軸輪250通過張緊帶262連結到樞軸輪252。根據(jù)本實施例，張緊帶262為0.003英寸的不銹鋼帶。張緊帶262導致樞軸輪252和光柵210與樞軸輪250和光柵202串聯(lián)地反向旋轉(zhuǎn)。連結在腔體和樞軸輪252之間的彈簧264維持張緊帶262中的張力。光柵的位置可以通過連結到樞軸輪傳感器266和螺旋驅(qū)動傳感器268的微控制器決定和控制。
圖3是圖1所示LTM 106的實施例簡圖。激發(fā)光經(jīng)入射腔進入LTM 106，在那兒通過或不通過一個或多個反射鏡300導向共軸激發(fā)光反射鏡302。共軸激發(fā)光反射鏡302可以是平的，也可以是有點兒彎曲，以便根據(jù)需要聚焦或色散光束。共軸激發(fā)光反射鏡302放置在把激發(fā)光導向樣品108上的位置。更具體地說，共軸激發(fā)光反射鏡302可以放置成與樣品108有一點兒偏軸，但應該放置成基本上所有的激發(fā)光都入射到樣品上以實現(xiàn)最大照明。
在一種應用中，多腔板的每個板都可以通過LTM 106或多腔板的X-Y平移放置在共軸激發(fā)光反射鏡302之下。在另一個包括配備有任選的顯微鏡光學裝置的單色儀的應用中，可以通過利用光路上的光學元件并通過LTM 106或玻璃滑片或培養(yǎng)片的X-Y平移把樣品放置到共軸激發(fā)光反射鏡302之下而可以單獨對安放在玻璃滑片或培養(yǎng)片上的完整生物細胞的不同區(qū)域成象。從樣品中一個或多個熒光團發(fā)射的任何熒光都被共軸發(fā)射光反射鏡304會集。共軸發(fā)射光反射鏡304必須是凹形的，從而直接地或通過一個或多個光導向反射鏡306聚焦并導引發(fā)射光從LTM 106的出射口出射。在圖3所示的實施例中，發(fā)射光從LTM 106上與激發(fā)光進入時相同的一側出射。但是入射和出射口的不同放置可以被光導向元件300、306的適當布局所利用。
激發(fā)光反射鏡302和發(fā)射光反射鏡304的共軸分布確保高百分比的激發(fā)光被導向一個腔108中的樣品上，并且從敞開腔中發(fā)出的高百分比的熒光被會集以用于分析。
在優(yōu)選實施例中，LTM 106內(nèi)的所有反射鏡包括前表面反射鏡，即“第一”表面反射鏡。此反射鏡具有一種涂敷在襯底如玻璃或陶瓷表面上的反射性材料，如鋁，光被導向該襯底表面。涂層用作反射表面，使得光不會穿過襯底，如同在普通的第二表面反射鏡中一樣。此第一表面反射鏡實質(zhì)上更高效。
本領域的普通技術人員應該理解，如果需要，可以用多個不同的反射鏡把光導入LTM 106中。但是，希望此反射面的數(shù)量最少以便提高LTM 106的效率。在優(yōu)選實施例中，共軸激發(fā)光反射鏡302是一個尺寸約為6×9mm的橢圓反射鏡，而共軸發(fā)射光反射鏡直徑約為75mm。也可以采用其它的尺寸，并且一般隨儀器整體的尺寸而變。
圖4是根據(jù)本發(fā)明實施例的熒光光譜儀簡化版簡圖。在此實施例中，通過激發(fā)光雙單色儀104從寬帶光源100中選擇激發(fā)光波長。激發(fā)光被共軸激發(fā)光反射鏡302導向腔108內(nèi)的樣品。發(fā)射的熒光被與共軸激發(fā)光反射鏡302反射對齊的共軸發(fā)射光反射鏡304會集并聚焦。共軸發(fā)射光反射鏡304把會集并聚焦的光指向發(fā)射光雙單色儀110。發(fā)射光雙單色儀110選擇所需的發(fā)射波長并把該波長導向光電探測器112，用于計數(shù)和分析。此實施例將LTM 106中的反射面減為最少。
圖4中所示實施例的一個方面在于它的緊湊結構允許該儀器用作雙路徑光譜儀。即樣品可以從腔108敞開的一側或從腔的底側激發(fā)。
圖5A表示本發(fā)明第一種替換雙路徑實施例。光源100和激發(fā)光雙單色儀104均可以任選地從它們的正常位置平移到多腔板以下的位置，以致于激發(fā)光入射到底照明共軸激發(fā)光反射鏡302’，該反射鏡將激發(fā)光導經(jīng)腔108的透明的底部襯底。(如果光源不平移，則可以插入光導向反射鏡以把光引到乳劑發(fā)光雙單色儀104)。從腔108的敞口發(fā)出的熒光被共軸發(fā)射光反射鏡304會集。當構成成底部照明時，可以從光路中移去頂部照明共軸激發(fā)光反射鏡302，以便使發(fā)射光反射鏡304會集的熒光量被最大化。或者，可以把頂部照明激發(fā)光反射鏡302(圖5A中未示出)留在適當?shù)奈恢?，如圖4所示。在任何一種情況下，底部照明激發(fā)光反射鏡302’都處于與發(fā)射光反射鏡304對齊的方向(與反射對齊相反)。
圖5B表示本發(fā)明第二種替換雙路徑實施例。在此結構中，從底部照明，在從激發(fā)光雙單色儀104發(fā)出的正常光路中插入一組一個或多個重新定向的反射鏡303A、303B，以便攔截激發(fā)光。攔截的激發(fā)光重新定向入射到底部照明的共軸激發(fā)光反射鏡302’，該反射鏡把激發(fā)光導經(jīng)腔108的透明的底部襯底。
頂部照明的共軸激發(fā)光反射鏡302可以留在適當?shù)奈恢?，如圖所示，或者也可以當把重定向反射鏡303A、303B移入適當位置中時將反射鏡302移出其位置。這種移動例如可以通過一個車架的平移運動來完成，其中車架上安置所有的四個反射鏡302、303A、303B、302’。另外，底部照明的激發(fā)光反射鏡302’處于與發(fā)射光反射鏡304對齊的方向(與反射對齊相反)。
在圖4、5A和5B所示的所有結構中，附加的重定向反射鏡可以用于把光適當?shù)貙騼x器中所需的位置。
根據(jù)一個實施例，使用一種以超過100MHz的頻率工作的計時器-計數(shù)器。識別器模塊可以以高達30MHz的頻率響應于光子。此系統(tǒng)的動態(tài)范圍從零到超過30×106個光子，由此消除了動態(tài)范圍的限制，這在以前限制了熒光探測中光子計數(shù)的使用。如果從PMT觀察到的電流大于在識別器中建立的規(guī)定的閾值電流，則產(chǎn)生5V的電脈沖，該脈沖具有大約2ns的持續(xù)周期；計時器-計數(shù)器電路對這些脈沖計數(shù)以作為時間的函數(shù)，即對單位時間的光子建立一個直接的定量。
在根據(jù)一個實施例的光譜儀中，把包含熒光標記的核酸或蛋白質(zhì)放置在本發(fā)明定位機構中的平板上，LTM的正下方。通過設置在適合于熒光標記的波長的激發(fā)光和發(fā)射光單色儀，凝膠在LTM下方前后移動，直到所有的凝膠區(qū)都被橫向往返移動到。在此往返運動的每一點進行熒光閱讀，并儲存為代表在每個凝膠點處發(fā)射熒光的二維陣列。
點之間的距離調(diào)節(jié)成產(chǎn)生對于給定數(shù)據(jù)獲取時間的最佳響應。在實際實驗中，凝膠也掃描成代表從凝膠頂部的樣品腔到凝膠的根部的電泳路徑的“通道”，因為電泳凝膠中的熒光團被排列成一條線而不是一個點。從樣品腔到凝膠的底部掃描每個通道，以達到基本上減少整個數(shù)據(jù)會集時間。作為一個背景基準，掃描空白通道，并且對于包含熒光團的通道點對點地從對應于數(shù)據(jù)中減去該數(shù)據(jù)。然后以兩種方式分析該校正的數(shù)據(jù)。在一種分析中，一幅圖象由原始凝膠構成，將該圖象與相同凝膠的標準實驗室照片比較以計算標準凝膠參數(shù)，如分別由數(shù)字圖象和膠片確定的遷移距離、分子分離和分子種類的濃度。在另一種分析中，利用平臺掃描探測器創(chuàng)建與自動射線攝影膠片的凝膠通道產(chǎn)生的相同的“光密度測量”曲線。從關于一條通道的熒光強度的數(shù)據(jù)庫確定每個熒光譜段的中心，并且制作作為遷移距離函數(shù)的熒光強度的橫截面曲線。從利用相同熒光標識的核酸的不同量制備的凝膠的使用中確定標準曲線，建立靈敏度、分辨率和凝膠探測的總動態(tài)范圍的上下限。
在熒光探測的未來發(fā)展中一個和兩個光子系數(shù)過程的“平方強度點擴散函數(shù)”和“縱向穿透深度”特性被認為是非常重要的特征。這兩個特征通過把毫微微秒的短脈沖激光聚焦到待研究的樣品中的焦平面上來實現(xiàn)。在根據(jù)另一個實施例的光譜儀中，來自適當激光器的激光束被用于激發(fā)的石英鹵燈或氙燈光源代替。激光束用于照明激發(fā)光單色儀的入射狹縫。在某些情況下需要的附加的改型例如包括使用一個或兩個針孔狹縫而不用標準的矩形狹縫，在光通過單色儀之后插入物鏡以對其聚焦。發(fā)射的熒光先經(jīng)光傳遞模塊會集，并且作為時間的函數(shù)測量熒光，或在某些成象和區(qū)域掃描的情況下作為樣品上光傳遞模塊的位置以及時間的函數(shù)，與上述的凝膠分析一樣。在此結構中，激發(fā)光單色儀上的針孔出射狹縫用于在一個樣品上用光成象，并且圖象的每個點用于激發(fā)熒光。以x-y-z的方式移動樣品位置，使得樣品區(qū)域的掃描產(chǎn)生一幅圖象或數(shù)據(jù)庫。對于共焦顯微術需要如下的兩個針孔狹縫。對于多光子應用，只用一個針孔狹縫作為激發(fā)光單色儀的出射狹縫。對于雙光子發(fā)光，如果需要聚焦光束以便高透射，則可以使用微透鏡陣列。一般地，雖然在某些偏振應用中該結構是表層熒光，但激發(fā)是從底部進行并且從頂部會集光束。
在另一實施例中，本發(fā)明用于制作掃描熒光偏振探測器。當用平面偏振光激發(fā)時，如果分子在熒光團的激發(fā)周期內(nèi)保持穩(wěn)定，則溶液中的熒光分子將發(fā)射光束回到固定平面中(即光保持偏振)。但是溶液中的分子隨機翻滾和旋轉(zhuǎn)，并且如果在激發(fā)態(tài)壽命起見以及發(fā)射之后發(fā)生旋轉(zhuǎn)，則光射入的平面可以與用于原始激發(fā)的光的平面非常不同。
分子的偏振值與其旋轉(zhuǎn)弛豫時間成正比，該時間通常定義為分子旋轉(zhuǎn)68.5°所需的時間。旋轉(zhuǎn)弛豫時間涉及溶液粘滯度(η)、絕對溫度(T)、分子體積(V)和氣體常數(shù)(R)偏振值∝旋轉(zhuǎn)弛豫時間＝3ηV/RT如果粘滯度和溫度是常數(shù)，則偏振值直接涉及分子體積(分子大小)，而體積通常與分子的重量相關。分子體積的變化由幾種原因?qū)е?，包括衰變、變性、構造形態(tài)的變化或連桿分子的鍵聯(lián)或分離。這些任何一種變化都可以探測為溶液偏振值變化的函數(shù)。具體地說，激發(fā)態(tài)壽命期間在溶液中自由旋轉(zhuǎn)的小熒光分子可以在非常不同于入射光平面的平面中發(fā)光。如果相同的小分子鏈接到大分子，則小分子的旋轉(zhuǎn)速度則降低，并且探測到偏振值減小的結果。結果的測量要求由偏振光激發(fā)，而偏振光可以利用一束激光或通過使用偏振濾光片的光選擇而獲得，偏振濾光片只透射在單一平面?zhèn)鞑サ墓?。在一個實施例中，通過本發(fā)明激發(fā)光單色儀獲得的確定波長的光穿過稱為“起偏器”的偏振濾光片而細化，獲得單色的、用于激發(fā)的平面偏振光(對于本發(fā)明目的，指定“垂直偏振光”)。同樣地，會集發(fā)射光的光路通過引入稱為“檢偏器”的第二偏振濾光片而類似地改進，檢偏器既可以旋轉(zhuǎn)到激發(fā)光平面的垂直位置，也可以旋轉(zhuǎn)到水平位置。當把溶液型的熒光樣品放入在“起偏器”和“檢偏器”之間的光路中時，只有那些被適當?shù)囟ㄏ驗槲展獯怪逼衩娴姆肿颖患ぐl(fā)，并且隨后發(fā)射光。通過旋轉(zhuǎn)檢偏濾光片，則可以測量垂直和水平平面中的發(fā)射光量，并且用于估算溶液中的小熒光分子在鏈接到大分子之前和之后的旋轉(zhuǎn)程度。
在另一種應用中，本發(fā)明用在共焦顯微鏡中，一種消除熒光顯微鏡的一個基本困難、即由于散焦光而降低顯微鏡焦平面上的空間分辨率的方法。根據(jù)另一實施例的光譜儀用于由以上所述的激光激發(fā)的基本實施例制造一個新型共焦顯微鏡，并且光束圖象聚焦到整個細胞載片上并實現(xiàn)樣品中熒光標識的多光子和單光子激發(fā)。沒被聚焦的平面中的熒光團不被照明并且不發(fā)熒光。
在共焦成象中，光圈用在激發(fā)光和發(fā)射光光路中，以便減少散射和平面外的熒光。鎖模染料激光器已經(jīng)達到同時進行多光子激發(fā)，因為這種激光器能夠以非常簡單的脈沖并以足夠大的效率給焦點輸送激發(fā)能，從而達到雙光子激發(fā)。在多光子成象中，激光提供的焦點激發(fā)一個足夠小的體積，當與本發(fā)明的光傳遞模塊儀器一起使用時，能夠會集所有的發(fā)射光而無需在發(fā)射面上有第二針孔狹縫。發(fā)射光圈不變化是必須的。
以上描述了本發(fā)明的多個實施例。毋庸贅述，在不脫離本發(fā)明構思和范圍的前提下可以進行各種改變。例如，本發(fā)明的雙單色儀可以用在其它類型的儀器中，并且LTM可以用在基于濾光片的光譜儀或其它光學儀器中。作為另一個例子，LTM可以用于把入射光導向被照明的區(qū)域，并且有效地會集、聚焦和導引該照明區(qū)的發(fā)射光(如既可以是發(fā)射光，也可以是熒光)。因此，其它實施例也將處于下面權利要求的范圍中。
權利要求
1.一種熒光光譜儀系統(tǒng)，包括(a)一個光源；(b)一個第一雙單色儀，用于分開并輸出光源發(fā)出的選定波長的光做為激發(fā)光；(c)一個反射光傳遞模塊，用于把基本上所有的激發(fā)光導向樣品，并會集、聚焦和導引來自樣品發(fā)射的熒光做為發(fā)射光；(d)一個第二雙單色儀，用于分開并輸出選定波長的發(fā)射光；和(e)一個光電探測器和分析器，用于探測選定波長的發(fā)射光并輸出這一探測的指示。
2.如權利要求1所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于第一雙單色儀或第二雙單色儀包括(a)用于接收光的入射狹縫；(b)一個第一光柵，放置在攔截并色散來自入射狹縫的接收光的位置；(c)一個第一選擇狹縫，放置在攔截至少一部分來自第一光柵的色散光并選擇和通過此色散光的很窄范圍內(nèi)的波長的位置；(d)一個第二光柵，放置在攔截并色散從第一選擇狹縫通過的光的位置；和(e)一個第二選擇狹縫，放置在至少攔截一部分來自第二光柵的色散光并選擇和通過此色散光的很窄范圍內(nèi)的波長的位置。
3.如權利要求2所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于第一光柵和第二光柵都是凹形光柵。
4.如權利要求3所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于凹形光柵是全息凹形光柵。
5.如權利要求2所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于第一光柵和第二光柵繞旋轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動，用于選擇作為旋轉(zhuǎn)角函數(shù)的所需波長范圍內(nèi)的光。
6.如權利要求2所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，還包括一個耦合到第一光柵和第二光柵的帶驅(qū)動器，用于同步旋轉(zhuǎn)第一光柵和第二光柵。
7.如權利要求1所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于反射光傳遞模塊包括(a)一個激發(fā)光反射鏡，放置在基本上與包含樣品的腔共軸的位置，用于導引激發(fā)光對樣品照明；和(b)一個發(fā)射光反射鏡，放置在基本上與包含樣品的腔共軸的位置，用于會集、聚焦和導引樣品發(fā)射的熒光。
8.如權利要求7所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于發(fā)射光反射鏡是一個球面鏡。
9.如權利要求7所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于激發(fā)光反射鏡和發(fā)射光反射鏡是第一表面反射鏡。
10.如權利要求7所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于激發(fā)光反射鏡位于把激發(fā)光導入腔的開口的位置，發(fā)射光反射鏡位于會集從腔的開口發(fā)射的熒光的位置。
11.如權利要求7所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于所述的腔有一個透明的底部襯底，激發(fā)光反射鏡位于把激發(fā)光經(jīng)透明的底部襯底導入腔中的位置，發(fā)射光反射鏡位于會集從腔的頂部開口發(fā)射的熒光的位置。
12.如權利要求11所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于移動的光源和第一雙單色儀二者或其中之一，以把激發(fā)光直接導向激發(fā)光反射鏡。
13.如權利要求11所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于將一個或多個光導向反射鏡放置成把從第一雙單色儀發(fā)出的激發(fā)光導向激發(fā)光反射鏡的位置。
14.如權利要求1所述的熒光光譜儀系統(tǒng)，其特征在于光電探測器和檢偏器對探測到的發(fā)射光選定波長的光子數(shù)進行計數(shù)。
15.一種雙單色儀，包括(a)用于接收光的入射狹縫；(b)一個第一光柵，放置在攔截并色散來自入射狹縫的接收光的位置；(c)一個第一選擇狹縫，放置在至少攔截一部分來自第一光柵的色散光并選擇和通過此色散光的很窄范圍內(nèi)的波長的位置；(d)一個第二光柵，放置在攔截并色散從第一選擇狹縫通過的光的位置；和(e)一個第二選擇狹縫，放置在至少攔截一部分來自第二光柵的色散光并選擇和通過此色散光的很窄范圍內(nèi)的波長的位置。
16.如權利要求15所述的雙單色儀，其特征在于第一光柵和第二光柵都是凹形光柵。
17.如權利要求16所述的雙單色儀，其特征在于凹形光柵是全息凹形光柵。
18.如權利要求15所述的雙單色儀，其特征在于第一光柵和第二光柵繞旋轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動，用于選擇作為旋轉(zhuǎn)角函數(shù)的所需波長范圍內(nèi)的光。
19.如權利要求15所述的雙單色儀，還包括一個耦合到第一光柵和第二光柵的帶驅(qū)動器，用于同步旋轉(zhuǎn)第一光柵和第二光柵。
20.一種反射光傳遞模塊包括(a)一個輸入反射鏡，放置在基本上與照明區(qū)域共軸的位置，用于導引激發(fā)光對該區(qū)域照明；和(b)一個輸出反射鏡，放置在基本上與照明區(qū)域共軸并與輸入的射鏡反射對準的位置，用于會集、聚焦和導引由照明區(qū)域發(fā)射的光。
21.如權利要求20所述的反射光傳遞模塊，其特征在于發(fā)射光反射鏡是一個球面鏡。
22.如權利要求20所述的反射光傳遞模塊，其特征在于激發(fā)光反射鏡和發(fā)射光反射鏡是第一表面反射鏡。
全文摘要
一種熒光光譜儀,具有一個激發(fā)光雙單色儀(104),一個共軸激發(fā)/發(fā)射光傳遞模塊(106),和一個發(fā)射光雙單色儀(110)。每個單色儀包括一對全息凹形光柵(203,210),用于從入射的寬帶光中精確選擇所需的波段而無需其它的光學元件如反射鏡。選取的激發(fā)光被包括一個共軸激發(fā)光反射鏡(302)的光傳遞模塊(106)導入樣品腔(108)中。射出腔開口的熒光被較大的共軸發(fā)射反射鏡(304)會集。會集的發(fā)射光是由發(fā)射光雙單色儀(110)選取波長。選取的發(fā)射光通過光電探測器模塊(112)探測。
文檔編號G01J3/06GK1357104SQ00809250
公開日2002年7月3日 申請日期2000年4月20日 優(yōu)先權日1999年4月21日
發(fā)明者G·R·古爾德, M·康拉德 申請人:克羅馬根公司