專利名稱：BMP和TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的拮抗劑的制作方法
獲得本發(fā)明的研究得到國立衛(wèi)生研究院部分資助，資助號為SR01HD3242902。所以，美國政府對本發(fā)明擁有一定權(quán)益。
背景技術(shù)：
實際上，在所有動物門中胚胎發(fā)育的關(guān)鍵步驟受細(xì)胞與細(xì)胞之間的信號或分泌生長因子介導(dǎo)的誘導(dǎo)信號的調(diào)節(jié)。具體來說，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)超家族成員調(diào)節(jié)多種細(xì)胞和發(fā)育過程，例如有絲分裂、細(xì)胞分化、胚胎圖式形成和器官發(fā)生。在脊椎動物胚胎中，各種TGFβ信號影響胚層特化、機(jī)體圖式形成(body patterning)、細(xì)胞生長和分化(1-4)。在兩棲動物爪蟾(Xenopus)胚胎中，不同TGFβ成員誘導(dǎo)不同細(xì)胞命運(yùn)，例如活化素、Vgl和nodal誘導(dǎo)胚胎背中胚層特征，例如脊索和肌肉。Vgl和活化素還誘導(dǎo)內(nèi)胚層特征。相反，骨形成蛋白(BMP)特異性誘導(dǎo)中胚層，例如血液和間充質(zhì)，并調(diào)節(jié)外胚層的表皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化(參見綜述(5))。
通過Smad家族蛋白使信號由細(xì)胞表面受體復(fù)合物直接轉(zhuǎn)導(dǎo)至核DNA靶，從而使細(xì)胞對TGFβ家族配體產(chǎn)生反應(yīng)(參見綜述(4)、(6)、(7)和(52))。
Smad涉及果蠅(Drosophila)Mad(mothers againstdecapentaplegic[dpp])以及3種相關(guān)的線蟲基因Sma2、Sma3和Sma4編碼的蛋白。為了統(tǒng)一命名，術(shù)語Sma和Mad已經(jīng)融合為Smad。Smad家族有8個成員。磷酸化Smad1、5和8在Smad4協(xié)同作用下功能性介導(dǎo)BMP家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad2和3是TGFβ和活化素作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。Smad6和7起抑制TGFβ/BMP超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑作用。有趣的是，Smad7定位在核內(nèi)，在TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用下聚集在細(xì)胞質(zhì)中(73)。而且Smad6和Smad7二者的表達(dá)受TGFb、BMP、生長因子和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，因此對Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)(53-58)。磷酸化Smad1進(jìn)入細(xì)胞核時，與Smad4形成異源聚合(heteromeric)復(fù)合物，而且激活早期應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄。BMP受體也可以通過有絲分裂原活化蛋白激酶發(fā)送信號。BMP可能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，因此控制間充質(zhì)干細(xì)胞分化。
BMP和活化素/TGFβ兩個主要途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)已有詳細(xì)介紹。兩個不同受體亞單位I型和II型跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶與配體結(jié)合時形成活化復(fù)合物。在這兩種復(fù)合物中，II型亞單位激活I(lǐng)型亞單位，I型亞單位直接磷酸化并激活特定的受體調(diào)節(jié)的R-Smad蛋白BMP受體針對Smad1和密切相關(guān)的Smad5和8，而活化素和TGFβ受體針對Smad1和密切相關(guān)的Smad2和3。激活時這些R-Smad與Smad“共同配偶體”Smad4形成異源聚合復(fù)合物。該復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到核，在DNA結(jié)合蛋白協(xié)同下結(jié)合到靶基因的啟動子上，最后通過募集輔激活物激活轉(zhuǎn)錄。第三類抑制性Smad(I-Smad)Smad6和Smad7起阻礙Smad-Smad復(fù)合物形成或Smad-受體相互作用的抑制劑作用。I-Smad結(jié)合到受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或直接結(jié)合Smad1。該途徑所有水平上的組分突變均與胚胎缺陷和各種癌癥有關(guān)，突出說明該生長因子家族在發(fā)育和疾病過程中的重要性(參見綜述(4)、(7))。尤其是Smad2和Smad4缺陷與結(jié)腸癌和肺癌有關(guān)，人Smad4缺陷與胰腺癌有關(guān)。
Smad不具有內(nèi)在酶活性。因此，對Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)性質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)的Smad蛋白水平非常敏感。實際上，細(xì)胞表達(dá)的Smad蛋白量的微小變化就可改變爪蟾胚胎的細(xì)胞命運(yùn)決定(8-11)。所以，調(diào)節(jié)細(xì)胞中的Smad蛋白水平可用作一種通過TGFβ超家族調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的手段。
與遍在蛋白共價連接的蛋白修飾被認(rèn)為是通過蛋白酶體降解靶蛋白的一般信號(參見綜述(12)和(13))。選擇性遍在蛋白化目標(biāo)包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和膜蛋白((12)中的參考文獻(xiàn))。特定目標(biāo)蛋白的選擇性遍在蛋白化和降解可作為控制細(xì)胞周期進(jìn)程、程序性細(xì)胞死亡、分化與胚胎發(fā)育的重要機(jī)制發(fā)揮作用。遍在蛋白化途徑機(jī)能阻礙與疾病和發(fā)育異常有關(guān)。遍在蛋白連接酶是催化12.5kD多肽的遍在蛋白與目標(biāo)蛋白共價連接的多聚復(fù)合物的組成部分。遍在蛋白與其目標(biāo)蛋白的連接用作標(biāo)志通過稱為26S蛋白酶體的細(xì)胞器蛋白酶解遍在蛋白化蛋白的分子“標(biāo)志”。至少有3種酶參與遍在蛋白與目標(biāo)蛋白綴合，即E1、E2和E3。E1酶激活遍在蛋白分子，使其與E2酶結(jié)合，然后E2酶直接使遍在蛋白連接在目標(biāo)蛋白上，或者將其傳送到E3遍在蛋白連接酶上。E3識別特定底物而且指導(dǎo)底物遍在蛋白化。
Dictyostelium(14-16)和Drosophila(17-21)介紹了遍在蛋白化系統(tǒng)調(diào)節(jié)發(fā)育的幾個實例。各種不同系統(tǒng)利用遍在蛋白與受體綴合控制胞吞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及通過蛋白酶體和溶酶體介導(dǎo)的降解二者控制受體穩(wěn)態(tài)水平(59-60)。在許多系統(tǒng)中特征鑒定了膜受體的直接遍在蛋白化，但是在某些情況下遍在蛋白依賴性調(diào)節(jié)似乎不涉及遍在蛋白與受體的直接綴合(61-62)。盡管許多細(xì)胞表面受體受遍在蛋白依賴性途徑的調(diào)節(jié)，但是只明確了很少幾個與膜蛋白結(jié)合而且其作用是使膜蛋白遍在蛋白化的E3遍在蛋白連接酶。Nedd4為C2-WW-HECT結(jié)構(gòu)域E3遍在蛋白連接酶，它可通過與氨氯吡嗪脒敏感型鈉通道羧基末端存在的PPXY基元直接結(jié)合而調(diào)節(jié)所述鈉通道的轉(zhuǎn)化(63-66)。此外，最近證實FING指蛋白c-cbl具有E3遍在蛋白連接酶的作用，c-cbl結(jié)合EGF受體介導(dǎo)遍在蛋白化而且下調(diào)受體復(fù)合物(67-68)。在這些實例中，膜蛋白遍在蛋白化似乎涉及E3連接酶與目標(biāo)蛋白的直接相互作用。不知道連接蛋白是否也可起募集E3連接酶至特定受體復(fù)合物的作用。迄今控制圖式形成中遍在蛋白化的機(jī)制和目的仍然難以捉摸。
在整個說明書中以數(shù)字引用的參考文獻(xiàn)列于實施例之后。本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
發(fā)明概述本發(fā)明有利地提供一類涉及BMP和TGFβ介導(dǎo)性活化的調(diào)節(jié)蛋白。具體來說，這些蛋白調(diào)節(jié)Smad蛋白和/或在Smad蛋白存在下促進(jìn)TGFβ受體復(fù)合物的降解。通過控制本發(fā)明蛋白的活性，熟練技術(shù)人員可通過例如BMP或TGFβ上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞活動。
因此，第一方面，本發(fā)明提供分離的Smurf蛋白、尤其是人Smurf蛋白。在一個實施方案中，Smurf蛋白為Smurf1蛋白。在一個替代性實施方案中，Smurf蛋白為Smurf2蛋白。在具體實施方案中，舉例來說，人Smurf1的氨基酸序列見

圖10(SEQ ID NO2)，人Smurf2的氨基酸序列見圖12(SEQ ID NO4)。本發(fā)明Smurf蛋白可含有SEQ ID NO2和4描述序列的至少約5個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選至少約10個連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還提供特異性結(jié)合Smurf蛋白的抗體。
本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明Smurf蛋白的核酸。在具體實施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3描述的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供在高嚴(yán)格條件下與具有編碼Smurf的序列的核酸或其互補(bǔ)序列特異性雜交的寡核苷酸或核酸。這種雜交核酸包括探針(即它們可以標(biāo)記)、引物(例如用于PCR擴(kuò)增)、反義核酸、核酶和形成三螺旋的核酸。
本發(fā)明還提供包含編碼Smurf的核酸的載體，該載體例如在表達(dá)控制序列控制下。還提供帶有這種載體的宿主細(xì)胞以及通過在允許所述載體表達(dá)Smurf蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞而生產(chǎn)Smurf的方法。
本發(fā)明還考慮了表達(dá)人Smurf蛋白的非人轉(zhuǎn)基因動物和缺失內(nèi)源性Smurf蛋白的非人動物。
本發(fā)明還提供抑制細(xì)胞中的骨形成蛋白或轉(zhuǎn)化生長因子β激活途徑的方法。該方法包括允許細(xì)胞在允許轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中的載體表達(dá)Smurf的條件下生長。另一方面，本發(fā)明提供細(xì)胞中的促進(jìn)骨形成蛋白或轉(zhuǎn)化生長因子β激活途徑的方法，該方法包括抑制細(xì)胞中的內(nèi)源性Smurf表達(dá)。
另外，本發(fā)現(xiàn)允許篩選Smurf活性調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的篩選包括檢測受試化合物對宿主細(xì)胞Smurf活性的調(diào)節(jié)作用(相對于沒有受試化合物的宿主細(xì)胞Smurf活性)。如實施例所述，一種這樣的活性是Smad蛋白遍在蛋白化。另一種活性是增強(qiáng)TGFβ受體的降解。
附圖簡述圖1.Smurf1編碼E3遍在蛋白連接酶。圖中分別以SMURF1、hSMURF1和PUB1給出爪蟾和人Smurf1與酵母(S.pombe)pub1的蛋白序列比較。相同氨基酸為深灰陰影，保守取代為淺灰陰影。根據(jù)一級結(jié)構(gòu)，Smurf1和pub1為E3遍在蛋白連接酶的Hect家族成員，而且它們具有該家族的幾個保守特性脂質(zhì)/Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于N末端(殘基22-37)，在236-271和282-311位置存在2個WW蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域(粗線表示)以及從殘基347開始延伸至C末端的催化性Hect結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用Clustal W分析進(jìn)行序列對比(Mac Vector)。
圖2A和2B.胚胎和成年小鼠組織表達(dá)mSmurf1的RNA印跡。分析等量的指示階段和組織的PolyA+mRNA。(2A)胚胎組織-在該印跡中標(biāo)示了交配后的胚胎天數(shù)。(2B)所示成年組織有T，睪丸；K，腎臟；M，骨骼??；L，肺；Sp，脾；Br，腦；H，心臟。
圖3A和3B.爪蟾Smurf1的發(fā)育表達(dá)。
(A)各階段胚胎cDNA的RT-PCR顯示，爪蟾Smurf1是母源mRNA，卵期、囊胚期和早原腸胚期的水平最高。原腸胚時合子Smurf1mRNA水平下降，但是維持穩(wěn)定表達(dá)直到游泳蝌蚪期。每個檢測道上的數(shù)字相當(dāng)于Nieuwkoop和Faber各期7和9，囊胚期；11和13，原腸胚期；15和20，神經(jīng)胚期；25和35，蝌蚪期。測定細(xì)胞中遍在性表達(dá)的鳥氨酸脫羧酶(ODC)mRNA，以便使RNA回收歸一化。對模擬cDNA進(jìn)行RT-PCR(非反轉(zhuǎn)錄酶)。
(B)爪蟾胚胎發(fā)育中的Smurf1的全樣載片原位雜交。在卵和囊胚期，Smurf1轉(zhuǎn)錄物定位于動物極半球(animal pole half)(卵中劃界(bracket))。表達(dá)彌散于整個外胚層，而且在原腸胚的邊緣帶消失；從動物極(an)和植物極(Veg)觀看。轉(zhuǎn)錄物在神經(jīng)胚期17的神經(jīng)褶存在一定的富集。蝌蚪期25和35時，Smurf1表達(dá)包括腦(b)、眼(e)、聽泡(o)、體節(jié)(s)、咽囊(p)和發(fā)育中的腎臟(k)。
圖4A、4B、4C和4D.Smurf1導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞系Smad1和Smad5穩(wěn)態(tài)水平選擇性降低。用所指示的表達(dá)載體(μg量DNA)瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，2天后使等份的約0.4％總細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡。為了測定Smad穩(wěn)態(tài)水平，用所示的合適Smad抗體探測印跡。通過用抗Flag單克隆抗體探測總的細(xì)胞裂解物印跡，證實了Flag-hSmurf1的表達(dá)水平。
(A)用恒量pCMV5-Smad1和所示的濃度逐漸增加的pCMV5-Flag-hSmurf1轉(zhuǎn)染COS-1或293T細(xì)胞。為了測定Smad1的穩(wěn)態(tài)水平和hSmurf1的表達(dá)，用α-Smad1和α-Flag抗體(α-Smad1和α-Flag印跡)探測兩種細(xì)胞系總細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡。
(B)用pCMV5-Smad1、野生型或活化(Q203D)pCMV5-ALK6-HA以及所示的逐漸遞增劑量的pCMV5-Flag-hSmurf1瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。用α-Smad1抗體(α-Smad1)免疫印跡蛋白質(zhì)印跡中的總細(xì)胞裂解物，從而檢測Smad1的穩(wěn)態(tài)水平。分別用α-Flag(α-Flag)或α-HA(α-HA)抗體免疫印跡總細(xì)胞裂解物，從而檢測hSmurf1和野生型或活化ALK6的表達(dá)水平。
(C)用恒量pCMV5-Smad1或pCMV5-Smad2和指示濃度的pCMV5-Flag-hSmurf1一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。如上檢測細(xì)胞裂解物中的Smad1(α-Smad 1印跡)、Smad2(α-Smad2印跡)和F1ag-hSmurf1(α-Flag印跡)的穩(wěn)態(tài)蛋白水平。
(D)在缺乏或存在pCMV5-Flag-hSmurf1的情況下用Smad1、Smad3、Smad4或Smad5的pCMV5轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。使所述蛋白質(zhì)印跡與Smad1和Smad5的α-Smad1抗體、Smad3的α-Smad3抗體以及Smad4檢測的α-Smad4抗體(α-Smad印跡)溫育，從而檢測總細(xì)胞裂解物中的Smad穩(wěn)態(tài)水平。如上所述(α-Flag印跡)證實了相同的hSmurf1表達(dá)。
圖5A、5B和5C.hSmurf1調(diào)節(jié)Smad1轉(zhuǎn)化和遍在蛋白化hSmurf1增強(qiáng)Smad1轉(zhuǎn)化。
(A)使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑以單獨(dú)的pCMV5-Smad1或Flag標(biāo)記的hSmurf1(F/hSmurf1)瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。2天后，用[35S]蛋氨酸使轉(zhuǎn)染體進(jìn)行脈沖追蹤分析。在追蹤過程中的指定時間裂解細(xì)胞，使其進(jìn)行α-Smad1免疫沉淀。免疫沉淀物通過SDS-PAGE進(jìn)行分離并通過放射性自顯影顯示(左側(cè)組)。還用磷成象定量放射性標(biāo)記的Smad1，將結(jié)果以每個時間點相對于0時間水平的[35S]蛋氨酸標(biāo)記的Smad1量作圖(右側(cè)圖)。
(B)293T細(xì)胞Smad1的遍在蛋白化。用指示組合的HA標(biāo)記的遍在蛋白(HA-Ub)、pCMV5-Smad1和野生型(WT)或遍在蛋白連接酶突變型(CA)Flag標(biāo)記的hSmurf1瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后2天，使裂解物進(jìn)行α-Smad1免疫沉淀(α-Smad1 IP)，然后進(jìn)行SDS-PAGE以及用α-HA單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡(α-HA印跡)。與α-HA呈現(xiàn)免疫反應(yīng)性的蛋白帶用方括號標(biāo)示。分別用α-Smad1多克隆抗體(α-Smad1印跡)或α-Flag單克隆抗體(α-Flag印跡)使總細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡，證實了Smad1或Flag-hSmurf1的表達(dá)。
(C)hSmurf1降低Smad1穩(wěn)態(tài)水平需要Hect結(jié)構(gòu)域的完整遍在蛋白連接酶活性。用Smad1和劑量逐漸增加的野生型(WT)或遍在蛋白連接酶突變體(C710A)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。通過用合適抗體免疫印跡總細(xì)胞裂解物，分析總細(xì)胞裂解物中的Smad1、hSmurf1或hSmurf1(C710A)蛋白，如圖3所示。
圖6A、6B和6C.Smurf1和Smad的相互作用。
(A)Smurf1與Smad1相互作用。對爪蟾Smurf1(Xsmurf)和Smad1、Smad2、核纖層蛋白或單獨(dú)的載體一起聯(lián)合共轉(zhuǎn)化的酵母進(jìn)行酵母雙雜交測定。只有Smad1和Smurf1組合具有明顯的β半乳糖苷酶活性(左圖，復(fù)份測定的染色酵母集落照片)。使35S標(biāo)記的Smurf1和固定在抗Flag親和凝膠基質(zhì)上的體外翻譯的35S-Met痕量標(biāo)記的Flag標(biāo)記Smad1(35S-F/Smad1)、Smad2(35S-F/Smad2)或Smad4(35S-F/Smad4)溫育，從而對體外翻譯的蛋白進(jìn)行共免疫沉淀。洗滌后，洗脫結(jié)合蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE分析(右圖)。
(B)hSmurf1選擇性地與Smad1和Smad5二者相互作用。用只含Smad1(S1)、Smad5(S5)或Smad2的pCMV5表達(dá)載體或用含Smad1(S1)、Smad5(S5)或Smad2和野生型(WT)或遍在蛋白連接酶突變(CA)的Flag標(biāo)記hSmurf1(F/hSmurf1)的pCMV5表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。為了檢測Smad1或Smad5與hSmurf1的相互作用，用α-Smad1多克隆抗體(α-Smad1印跡)探測α-Flag免疫沉淀印跡。為了檢測Smad2與hSmurf1的相互作用，用α-Smad2多克隆抗體(α-Smad2印跡)探測α-Flag免疫沉淀印跡。免疫沉淀中的hSmurf1水平和總細(xì)胞裂解物中的Smad1、Smad5和Smad2水平見下面兩組圖。
(C)hSmurf1對Smad1作用的特異性。hSmurf1相關(guān)性遍在蛋白連接酶Nedd4不與Smad1作用，而且不降低其穩(wěn)態(tài)水平。用所示的Smad1和Flag標(biāo)記的hSmurf(WT或CA)或Nedd4、(WT)或連接酶突變體(CS)瞬時共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。如上所述測定Smad1與hSmurf1的共免疫沉淀(左側(cè)圖)。為了測定Smad1與Nedd4的相互作用，用Hect-Nedd4多克隆抗體(α-Nedd4 IP)使細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀，然后用α-Smad1多克隆抗體(α-Smad1印跡)進(jìn)行免疫印跡，右側(cè)圖。為了檢測樣品中的Nedd4表達(dá)水平，用WW2 Nedd4多克隆抗體(α-Nedd4印跡)再次探測相應(yīng)的印跡。下圖的蛋白質(zhì)印跡顯示這些測定的總細(xì)胞裂解物中的Smad1水平。
圖7A和7B.Smurf1使預(yù)期的腹中胚層背面化而使外胚層神經(jīng)化。
(A)在4細(xì)胞爪蟾囊胚的2個腹側(cè)卵裂球的邊緣帶注射爪蟾SmurfmRNA(50pg Smurf1 mRNA/細(xì)胞)。從注射胚胎發(fā)育的蝌蚪期胚胎形成異位背軸結(jié)構(gòu)(左下圖，箭頭)。同時注射100pg Smad1和50pg Smurf1mRNA挽救所有情況下的異位軸結(jié)構(gòu)(下部蝌蚪)。早期原腸胚形成時，從另一組野生型胚胎或在4細(xì)胞階段的腹側(cè)邊緣帶(VMZ)單獨(dú)注射Smurf1 mRNA或同時注射Smurf1和Smad1的胚胎移植VMZ片。如圖所示在早期原腸胚形成時切除VMZ移植物，然后進(jìn)行培養(yǎng)直到對照胚胎達(dá)到蝌蚪中期28，制備總VMZ RNA后，通過RT-PCR測定紅細(xì)胞特異性α-珠蛋白、肌肉特異性肌動蛋白和作為RNA回收對照的一般細(xì)胞mRNA eF1-a(右下圖)的表達(dá)。對反轉(zhuǎn)錄或沒有反轉(zhuǎn)錄的胚胎總RNA進(jìn)行對照PCR反應(yīng)。
(B)對受精卵動物極注射Smurf1和/或Smad1 mRNA或不注射。在囊胚期8移植動物帽(animal cap)，培養(yǎng)至原腸胚中期11，然后制備總RNA，應(yīng)用RT-PCR分析檢測膠粘腺標(biāo)志物XAG和一般神經(jīng)標(biāo)志物NCAM的表達(dá)。對照同上。
圖8A、8B和8C.Smurf1改變胚胎細(xì)胞對Smad1和Smad2的反應(yīng)能力。
(A)Smurf1阻礙Smad1誘導(dǎo)腹中胚層。在受精卵動物極中只注射入恒量(1ng)Smad1 mRNA或同時還注射入劑量遞增的Smurf1，利用Xhox3和Xcad3同源域基因的引物通過RT-PCR測定動物帽移植物中的腹中胚層誘導(dǎo)情況。從左側(cè)至右側(cè)的各檢測道，分別對動物帽不注射或注射100、0、25、50、100和200pg劑量的Smurf1 mRNA。
(B)Smurf1增強(qiáng)Smad2對背中胚層的誘導(dǎo)。只注射恒量(50pg)Smad2 mRNA或者同時還注射遞增劑量的Smurf1，通過表達(dá)肌肉標(biāo)志性myoD和最常見的背型中胚層(Spemann組織導(dǎo)體(the SpemannOrganizer))表達(dá)的同源域基因goosecoid，從而監(jiān)測背中胚層的誘導(dǎo)情況。注意隨著Smurf1劑量增加，由不可檢測水平引發(fā)goosecoid表達(dá)。與圖a一樣對動物帽進(jìn)行注射。
(C)動物帽對Smad2的劑量反應(yīng)。用合成的Smad2 mRNA注射動物帽。50pg Smad2誘導(dǎo)MyoD，注射100pg或100pg以上Smad2時誘導(dǎo)MyoD達(dá)到最大水平。Smad2在最小250pg劑量時誘導(dǎo)goosecoid。單獨(dú)的250pg Smad2誘導(dǎo)的gooscoid水平與50pg Smad2和100pg Smurf1聯(lián)合誘導(dǎo)的goosecoid水平(圖b)相同。
在各圖中，右側(cè)端兩個檢測道分別為對野生型胚胎RNA加反轉(zhuǎn)錄(RT+)和沒有加反轉(zhuǎn)錄(RT-)的PCR。各圖中eF1-a對照同圖7。
圖9.人Smurf1的cDNA序列[SEQ ID NO1]。
圖10.人Smurf1的蛋白質(zhì)序列[SEQ ID NO2]。
圖11.人Smurf2的cDNA序列[SEQ ID NO3]。
圖12.人Smurf2的蛋白質(zhì)序列[SEQ ID NO4]。
Smurf2是HECT E3遍在蛋白連接酶家族成員。圖示C2(上劃線)、WW(陰影)和HECT(雙上劃線)結(jié)構(gòu)域和Cys716Ala突變(框)。
圖13.Smurf1和Smurf2蛋白的比較。
圖示Smurf1和Smurf2。圖中示出了C2、WW和HECT結(jié)構(gòu)域的氨基酸相同程度(％)。
圖14A和14B.Smurf2在小鼠組織中的表達(dá)。
(A)Smurf2在整個小鼠胚胎發(fā)生中表達(dá)。包含小鼠Smurf2的3’UTR的1 kb XhoI/NotI片段用來探測小鼠胚胎RNA印跡(Clontech)。
(B)Smurf2在成年小鼠組織中的表達(dá)。與圖A一樣，用小鼠Smurf2片段探測多個組織的RNA印跡(Clontch)。
圖15A、15B、15C、15D、15E和15F.Smurf2與Smad7相互作用。
(A和B)Smurf2表達(dá)不會降低Smad的穩(wěn)態(tài)水平。單獨(dú)用Flag標(biāo)記的Smad1、Smad2、Smad4或HA標(biāo)記的Smad7或與Myc標(biāo)記的Smurf2一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。對等份總細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡，以檢測Smurf2和Smad的表達(dá)(圖15A)，或者利用抗Myc抗體使其進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行抗Flag或抗HA免疫印跡，以檢測任何共沉淀的Smad(圖15B)?？筂yc重鏈(IgH)的遷移作為標(biāo)志。
(C)Smurf2表達(dá)不會改變Smad7轉(zhuǎn)化。單獨(dú)用Smad7-HA或與Flag-Smurf2一起轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，用[35S]-蛋氨酸脈沖標(biāo)記轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后在含未標(biāo)記蛋氨酸的培養(yǎng)基中追蹤指定時間。通過磷成象定量抗HA免疫沉淀中的[35S]標(biāo)記Smad7-HA，將相對于0時間含量的對照細(xì)胞(方框)和Smurf2表達(dá)細(xì)胞(圓圈)水平作圖。數(shù)據(jù)為2次實驗的平均值+/-SD。
(D)細(xì)菌表達(dá)的Smurf2和Smad7在體外的相互作用。使細(xì)菌產(chǎn)生的His-Smad7-HA蛋白與Ni2+-NTA、GST和GST-Smurf2溫育。通過SDS-PAGE和利用抗HA抗體的免疫印跡顯現(xiàn)結(jié)合物質(zhì)。通過考馬斯染色測定GST蛋白水平(底圖)。
(E)Smad7的PY基元是介導(dǎo)與Smurf2作用的重要決定因子。單獨(dú)用Flag-Smurf2或與野生型(WT)或突變Y211A(YA)或ΔPY型Smad7-HA一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。使細(xì)胞裂解物進(jìn)行抗Flag的免疫沉淀，通過用抗Smad7抗體的免疫印跡檢測共沉淀的Smad7蛋白。免疫印跡等份的總細(xì)胞裂解物證實了Smad7的表達(dá)(底圖)。
(F)Smurf2的WW結(jié)構(gòu)域是結(jié)合Smad7所必需的。用Smad7-HA和野生型(WT)或突變(ΔWW1、ΔWW2或ΔWW3)型Flag-Smurf2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。使細(xì)胞裂解物進(jìn)行抗Flag的免疫沉淀，通過用抗HA抗體的免疫印跡檢測共沉淀的Smad7。通過免疫印跡等份的總細(xì)胞裂解物證實了Smad7的表達(dá)(底圖)。
圖16.Smad7寡集Smurf2至TGFβ受體復(fù)合物。
用指示的各種組合的TβRII、TβRI-HA、Smad7-HA和野生型(WT)或突變(C716A)Flag-Smurf2轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。用[125I]TGFβ親和標(biāo)記細(xì)胞，而且利用抗Flga或抗Smad7抗體免疫沉淀裂解物。通過SDS-PAGE和放射性自顯影顯現(xiàn)共沉淀的受體復(fù)合物。利用磷成象定量共沉淀TβRI量(右側(cè)圖)。通過放射性自顯影顯現(xiàn)等份的總細(xì)胞裂解物證實了受體的表達(dá)。分別用抗Flag和抗HA抗體免疫印跡等份的總細(xì)胞裂解物證實了Smurf2和Smad7水平。
圖17A、17B、17C、17D和17E.Smurf2誘導(dǎo)TGFβ受體和Smad7降解。
(A)缺乏Smad7的Smurf2表達(dá)不會降低受體穩(wěn)態(tài)水平。用不同組合的TβRII-HA、TβRI-HA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，標(biāo)示了Flag-Smurf2的不同劑量(μg質(zhì)粒DNA)。采用所示的合適抗體免疫印跡等份的總細(xì)胞裂解物，從而測定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
(B)存在Smad7的Smurf2引起穩(wěn)態(tài)受體水平下降。用Smad7-HA、或者TβRII-HA和TβRI-HA(左側(cè))或者組成活性型I受體TβRI-HA(T204D)(右側(cè))和遞增量野生型(WT)或突變Flag-Smurf2(C716A)一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。通過所示抗HA或抗Flag免疫印跡測定受體、Smad7和Smurf2的穩(wěn)態(tài)水平。
(C)Smurf2提高受體復(fù)合物的轉(zhuǎn)化率。單獨(dú)用TGFβ受體(TβRII-HA和TβRI-HA)或與Smad7-HA、Flag-Smurf2或該二者一起轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，用[35S]-蛋氨酸脈沖標(biāo)記轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后在含未標(biāo)記蛋氨酸的培養(yǎng)基中追蹤指定時間。使細(xì)胞裂解物進(jìn)行抗HA的免疫沉淀，通過磷成象定量標(biāo)記受體和Smad7的量，將其相對于0時間含量作圖。
(D)蛋白酶體和溶酶體抑制劑阻礙Smurf2誘導(dǎo)的受體復(fù)合物降解。用TGFβ受體(TβRII-HA和TβRI-HA)、Smad7-HA和Flag-Smurf2轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，以[35S]-蛋氨酸脈沖標(biāo)記轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后在缺乏抑制劑或在30mM lactacystin或0.4mM氯喹存在下追蹤指定時間。使細(xì)胞裂解物進(jìn)行抗HA免疫沉淀，通過SDS-PAGE和放射性自顯影顯現(xiàn)受體和Smad7水平。
(E)Smurf2在所述受體存在下誘導(dǎo)Smad7遍在蛋白化。用HA標(biāo)記的遍在蛋白和所示各種組合的Smad7、TβRII、TβRI-Flag和野生型(WT)或突變(C716A)Myc-Smurf2一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。用抗Smad7抗體使細(xì)胞裂解物進(jìn)行雙向免疫沉淀(double immunoprecipitation)，接著用抗HA抗體進(jìn)行免疫印跡。免疫印跡證實了等份的總細(xì)胞裂解物中的蛋白表達(dá)。
圖18A、18B、18C和18D.Smurf2與Smad7締合增強(qiáng)Smad7抑制活性。
(A)Smad7(Y211A)結(jié)合TGFβ受體，但是使Smurf2寡集至受體復(fù)合物的能力降低。用TGFβ受體(TβRII和TβRI-HA)和野生型(WT)或突變(Y211A)Smad7/HA在缺乏或存在Flag-Smurf2(C716A)下轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。以[125I]TGFβ親和標(biāo)記細(xì)胞，用抗Smad7或抗Flag抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物。通過SDS-PAGE和放射性自顯影顯現(xiàn)共沉淀受體復(fù)合物。應(yīng)用放射性自顯影測定總表達(dá)的受體，并通過抗HA或抗Flag免疫印跡等份的總細(xì)胞裂解物證實Smad7和Smurf2蛋白表達(dá)水平。
(B和C)Smad7(211A)在抑制TGFb依賴性激活轉(zhuǎn)錄方面沒有野生型Smad7有效。單獨(dú)用3TP-Lux報道基因或與不同濃度的野生型(WT)或突變(Y211A)Smad7-HA一起轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。在(B)中，使用0.3ng/ml的各種Smad7質(zhì)粒。在存在或缺乏TGFβ1下溫育細(xì)胞，使熒光素酶活性對b-半乳糖苷酶活性歸一化，以典型實驗的3個復(fù)份的平均值+/-SD作圖。
(D)Smad7和Smurf2介導(dǎo)的TGFβ受體復(fù)合物降解的模式。Smad7直接結(jié)合Smurf2，而且與TGFβ受體復(fù)合物締合。因此，Smad7起介導(dǎo)TGFβ受體復(fù)合物降解的連接蛋白的作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及編碼E3遍在蛋白連接酶(稱為Smurf蛋白)的基因家族，而且包括任何動物、尤其是哺乳動物或兩棲動物、更特別是人來源的全長或天然型基因及其任何功能活性或抗原性片段。在具體實施方案中，特征鑒定了稱為Smurf1和Smurf2的E3遍在蛋白連接酶。
本發(fā)明部分基于這樣的意外發(fā)現(xiàn)2個新型Hect家族遍在蛋白連接酶成員與Smad相互作用。這兩種連接酶命名為Smurf1和Smurf2。其中一個Smurf1特異性針對BMP途徑特異性Smad，因此起B(yǎng)MP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑或負(fù)向調(diào)節(jié)劑的作用。Smurf1直接作用于Smad1和5，而且調(diào)節(jié)其遍在蛋白化、轉(zhuǎn)化和活性。在兩棲動物胚胎中，Smurf1抑制內(nèi)源性BMP信號，導(dǎo)致中胚層和外胚層的圖式形成和細(xì)胞命運(yùn)改變。所以，本發(fā)明提供在遍在蛋白化途徑和細(xì)胞命運(yùn)控制之間起連接作用的獨(dú)特調(diào)節(jié)蛋白，例如在胚胎發(fā)育期間。除了Smurf1蛋白[SEQ IDNO2]及其突變變異體之外，本發(fā)明還提供編碼Smurf1的核酸[SEQID NO1]。
另一個新型Hect家族遍在蛋白連接酶成員是Smurf2。Smurf2為C2-WW-HECT結(jié)構(gòu)域E3遍在蛋白連接酶，它與Smurf1有關(guān)。Smurf2既不與Smad1、2或4作用，也不改變Smad1、2或4的穩(wěn)態(tài)水平。但是，Smurf2的確與Smad7作用，直接結(jié)合Smad7中的PPXY基元。Smurf2作為TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑或負(fù)向調(diào)節(jié)劑，在Smad7協(xié)同作用下參與降解TGFβ受體。激活TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致Smad7依賴性募集Smurf2至TGFβ受體復(fù)合物。缺乏活化TGFβ受體復(fù)合物時，Smurf2不能改變Smad7的穩(wěn)態(tài)水平和轉(zhuǎn)化。Smad7使Smurf2募集至TGFβ受體促進(jìn)通過蛋白酶體和溶酶體途徑二者降解Smad7-TGFβ受體復(fù)合物。本文介紹的研究證實，Smad7起募集Smurf2至TGFβ受體復(fù)合物的連接蛋白作用，以促進(jìn)其降解，因此下調(diào)活化TGFβ受體復(fù)合物。調(diào)節(jié)Smad7定位至核和與Smurf2的作用可用來控制Smad7-Smurf2復(fù)合物的抑制活性。
除了Smurf2蛋白[SEQ ID NO4]及其變異體之外，本發(fā)明還提供編碼Smurf2的核酸[SEQ ID NO3]。
根據(jù)本文論述的發(fā)現(xiàn)可知，E3遍在蛋白連接酶具有高度選擇性底物特異性。例如Smurf1結(jié)合BMP途徑特異性Smad。而且，Smurf1是BMP途徑的獨(dú)特信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，因為它只結(jié)合Smad1和Smad5，對Smad2(TGFβ和活化素受體途徑特異性)的親和力非常弱，而對Smad4(共同Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)配偶體)沒有親和力。因為這種底物特異性，Smurf1可有效干擾或調(diào)節(jié)對BMP的生物反應(yīng)，而對活化素途徑?jīng)]有影響，即對其它TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用是有限的或不存在。
BMP/TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在組織分化、形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞生長控制中起作用(例如(52))。作為TGFβ家族介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的拮抗劑，Smurf1將在體內(nèi)或體外抑制BMP途徑。作為降解TGFβ受體的調(diào)節(jié)系統(tǒng)的有機(jī)組成部分，Smurf2將抑制TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，Smurf將阻礙軟骨發(fā)生、骨發(fā)生、血液分化、軟骨形成、神經(jīng)管圖式形成、腎發(fā)育、心臟的誘導(dǎo)和形態(tài)發(fā)生、毛發(fā)生長、牙齒形成、配子形成以及各種各樣的組織器官形成過程，以及妨礙骨和其它依賴BMP途徑的組織再生、生長、維持等。
在一個實施方案中，如前所述的突變型Smurf蛋白或Smurf的小分子拮抗劑可用于防止蛋白質(zhì)(例如Smad或TGFβ受體)遍在蛋白化，從而保持BMP介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外，可產(chǎn)生結(jié)合Smuff蛋白的Hect結(jié)構(gòu)域的Smad片段，所述結(jié)構(gòu)域具有Smad遍在蛋白化需要的催化活性，或者可產(chǎn)生結(jié)合作用于Smad PPXY結(jié)構(gòu)域的WW結(jié)構(gòu)域的Smad片段，從而防止Smurf1結(jié)合以及遍在蛋白化Smad。這些片段也可用于Smurf-Smad相互作用的小分子抑制劑的篩選測定，例如抑制結(jié)合測定。Smuff蛋白變異體和Smad片段可用來改善因為可能導(dǎo)致疾病狀態(tài)的Smurf過量表達(dá)或Smurf活性增強(qiáng)引起的BMP和/或TGFβ/活化素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷。
BMP控制骨分化和生長，而且已經(jīng)進(jìn)行了與骨生長和結(jié)締組織修復(fù)有關(guān)的臨床實驗和應(yīng)用。Smurf蛋白為發(fā)現(xiàn)藥物的新型靶，所述藥物可影響Smurf功能，由此影響對BMP的細(xì)胞反應(yīng)，因而具有臨床用途。所以，Smurf蛋白可用于篩選可增強(qiáng)BMP途徑或通過分別拮抗或模擬Smurf蛋白活性而抑制BMP途徑的各種藥物和/或抗體。例如因為Smurf1對結(jié)合Smad1和5是高度特異的，所以它可以用來篩選阻止或激活BMP途徑以及選擇性影響對BMP的細(xì)胞反應(yīng)而不影響TGFβ超家族其它成員的藥物。
Smurf蛋白在細(xì)胞內(nèi)的Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平起作用，所以Smurf蛋白提供影響B(tài)MP和TGFβ/活化素信號的替代方法。然而，因為Smurf蛋白是細(xì)胞內(nèi)蛋白，所以目的在于直接改變Smurf活性的任何操作必須在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。這樣的操作包括反義和核酶技術(shù)以及細(xì)胞內(nèi)抗體技術(shù)。
可以按基因治療方案將Smurf傳遞至細(xì)胞，以阻礙Smad(例如為Smurf1或Smurf2靶的Smad)控制的特定生長因子途徑的過度信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文的實施例表明，僅僅升高細(xì)胞中的Smurf1表達(dá)水平就可拮抗Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，通過基因治療過量表達(dá)Smurf可用來校正過度Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的臨床病癥。這樣的病癥包括例如骨、腱或軟骨組織過度增生或利用Smad1或Smad5轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的受體(例如BMP受體)信號調(diào)節(jié)的其它組織形成。
Smurf核酸或其部分序列(例如PCR探針)可用作鑒定人類基因組中的缺陷Smurf基因的分子探針，尤其是當(dāng)發(fā)現(xiàn)Smurf基因突變與特定疾病有關(guān)時。Smuff蛋白可用作鑒定為遍在蛋白化靶的細(xì)胞蛋白的體外測定的試劑。純化Smurf可用純化遍在蛋白化酶(即E1和E2組分)再生，而且可用于功能性(遍在蛋白化)測定，該功能性測定的目的在于鑒定引入所述測定的新型靶蛋白(為純化蛋白或未知身份的翻譯的cDNA)。
按照本發(fā)明，可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)、微生物技術(shù)和重組DNA技術(shù)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。參見例如Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular CloningA LaboratoryManual第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，紐約(本文稱為“Sambrook等，1989”)；DNA CloningA PracticalApproach，第I和II卷(D.N.Glover編著1985)；OgigonucleotideSynthesis(M.J.Gait編著1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames& S.J.Higgins編著(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames& S.J.Higgins編著(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney編著(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(編著)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(1994)。
如果出現(xiàn)在本文中，下列術(shù)語具有以下給出的定義。
術(shù)語“大約”或“約”是指在給定值或范圍的20％以內(nèi)，優(yōu)選10％以內(nèi)，更優(yōu)選5％以內(nèi)。
本文使用的術(shù)語“分離的”是指所指的物質(zhì)不含通常發(fā)現(xiàn)所述物質(zhì)的天然環(huán)境中存在的組分。具體來說，分離的生物物質(zhì)不含細(xì)胞組分。如果為核酸分子，則分離的核酸包括PCR產(chǎn)物、分離的mRNA、cDNA或限制性片段。在另一個實施方案中，分離的核酸優(yōu)選從其可能存在的染色體中切出，更優(yōu)選不再與非調(diào)節(jié)、非編碼區(qū)連接在一起，如果存在于染色體中，更優(yōu)選不與位于所述分離的核酸分子包含的基因上游或下游的其它基因連接在一起。在再一實施方案中，分離的核酸缺乏一個或多個內(nèi)含子。分離的核酸分子可插入質(zhì)粒、粘粒、人工染色體等中。因此在具體實施方案中，重組核酸為分離核酸。分離蛋白可以與其它蛋白或核酸或二者(分離蛋白與其在細(xì)胞中結(jié)合，如果分離蛋白為膜結(jié)合蛋白，則它與細(xì)胞膜結(jié)合)結(jié)合。分離的細(xì)胞器、細(xì)胞或組織從其存在的生物體的解剖部位取出。分離的物質(zhì)可以是但是不需要是純化物質(zhì)。
本文使用的術(shù)語“純化的”是在減少或消除不相關(guān)物質(zhì)即污染物的條件下分離的物質(zhì)。例如，純化蛋白優(yōu)選基本不含在細(xì)胞中與其結(jié)合的其它蛋白或核酸；純化核酸分子優(yōu)選基本不含蛋白質(zhì)或其它與其存在于細(xì)胞中的不相關(guān)核酸分子。本文使用的術(shù)語“基本不含”在分析性測試所述物質(zhì)時的計算上使用。基本不含污染物的純化物質(zhì)優(yōu)選至少為50％純度；更優(yōu)選至少為90％純度，甚至更優(yōu)選至少為99％純度。純度可以通過層析、凝膠電泳、免疫測定、成分分析、生物測定和其它本領(lǐng)域已知方法測定。
“基因”在本文中用以指DNA分子的一部分，它包含與表達(dá)控制序列有效連接的多肽編碼序列。在一個實施方案中，基因可以是基因組序列或部分基因組序列，因為它含有一個或多個內(nèi)含子。在另一個實施方案中，術(shù)語基因是指cDNA分子(即沒有內(nèi)含子的編碼序列)。
DNA“編碼序列”是指當(dāng)處于合適調(diào)節(jié)序列控制下時可在體外或體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯為多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可包括但不限于原核生物序列、真核生物mRNA的cDNA、真核生物(例如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列甚至合成DNA序列。如果編碼序列用于在真核生物細(xì)胞中表達(dá)，則聚腺苷酸信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’端。
“表達(dá)控制序列”(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列)為編碼序列側(cè)翼的調(diào)節(jié)序列，例如啟動子、增強(qiáng)子、阻抑子、終止子等，它們使編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)。在真核細(xì)胞中，聚腺苷酸信號為控制序列。如果為mRNA，核糖體結(jié)合位點是表達(dá)控制序列。
“啟動子序列”是能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶而且啟動轉(zhuǎn)錄下游(3’方向)編碼序列的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。為了定義本發(fā)明，啟動子序列的邊界是從轉(zhuǎn)錄起始位點的3’端向上游(5’方向)延伸至包括以高于本底的可檢測水平起始轉(zhuǎn)錄的最少必需堿基數(shù)或必需元件數(shù)。啟動子序列含有轉(zhuǎn)錄起始位點(通常例如以核酸酶S1作圖定義)以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。
當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄編碼序列為mRNA時，編碼序列處于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制之下”，然后反式RNA剪接mRNA(如果它含有內(nèi)含子)并翻譯為編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。
當(dāng)單鏈型核酸分子可在合適溫度和溶液離子強(qiáng)度條件下退火至另一個核酸分子(例如cDAN，基因組DNA或RNA)時，則所述核酸分子與所述另一個核酸分子“可雜交”(參見上述的Sambrook等)。溫度和離子強(qiáng)度條件決定雜交的“嚴(yán)格性”。對于初步篩選同源核酸，可使用低嚴(yán)格雜交條件，等于Tm為55℃，例如5×SSC，0.1％SDS，0.25％奶而不含甲酰胺；或者30％甲酰胺，5×SSC，0.5％SDS。中嚴(yán)格雜交條件等于Tm更高，例如40％甲酰胺，5×或6×SCC。高嚴(yán)格雜交條件等于Tm最高，例如50％甲酰胺，5×或6×SCC。雜交要求兩種核酸含有互補(bǔ)序列，但是根據(jù)雜交嚴(yán)格性，堿基之間可以錯配。雜交核酸的合適嚴(yán)格性取決于核酸的長度和互補(bǔ)程度，其變化是本領(lǐng)域周知的。兩種核苷酸序列的相似性或同源程度越高，含有這兩種序列的核酸雜交體的Tm值越高。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(等于更高的Tm)按以下順序下降RNARNA、DNARNA、DNADNA。對于長度大于100個核苷酸的雜交體，已有計算Tm的方程(參見例如上述Sambrook等，9.50-9.51)。對于較短核酸(即寡核苷酸)的雜交，錯配位置更重要，而寡核苷酸的長度決定其特異性(參見上述Sambrook等，11.7-11.8)。可雜交核酸的最小長度為至少約10個核苷酸；優(yōu)選至少約15個核苷酸；更優(yōu)選長度至少約20個核苷酸。
在一個具體實施方案中，術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”是指Tm為55℃，而且使用上述條件。在一個優(yōu)選實施方案中，Tm為60℃；在一個更優(yōu)選的實施方案中，Tm為65℃。在一個具體實施方案中，“高嚴(yán)格性”雜交和/或洗滌條件為68℃、0.2×SSC，42℃、50％甲酰胺、4×SSC，或者在獲得相當(dāng)于這兩種條件中任一種下觀測到的雜交水平的條件下。
“載體”是重組核酸構(gòu)建物，例如質(zhì)粒、噬菌體基因組、病毒基因組、粘?；蛄硪籇NA節(jié)段可與其連接的人工染色體。在一個具體實施方案中，載體可使連接的節(jié)段復(fù)制，例如在克隆載體的情況下。DNA節(jié)段在特定限制性位點插入載體。DNA節(jié)段編碼目的多肽，設(shè)計所述DNA節(jié)段和限制性位點以保證所述節(jié)段插入轉(zhuǎn)錄和翻譯的合適讀框。
當(dāng)外源性DNA或異源性DNA導(dǎo)入細(xì)胞時，所述DNA就“轉(zhuǎn)染”了細(xì)胞。當(dāng)轉(zhuǎn)染DNA實現(xiàn)了表型改變時，外源性DNA或異源性DNA就“轉(zhuǎn)化”了細(xì)胞。最好是轉(zhuǎn)化DNA整合(共價連接)入組成細(xì)胞基因組的染色體DNA。
術(shù)語“異源”是指組合的非天然元件。例如異源DNA是指非天然位于所述細(xì)胞或所述細(xì)胞的染色體位點的DNA。最好是異源DNA包含所述細(xì)胞的外源性基因。異源表達(dá)調(diào)節(jié)元件是與不同于其天然有效連接的基因的基因有效連接的元件。在本發(fā)明中，Smurfl或Smurf2基因是質(zhì)粒載體DNA的異源基因，它插入載體DNA中以便克隆或表達(dá)，而且它對表達(dá)它的非人類宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)是異源性的。
“核酸分子”是指磷酸酯聚合型核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)或其單鏈型或雙鏈螺旋的任何磷酸酯類似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。可以為雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。術(shù)語核酸分子、尤其是DNA或RNA分子僅是指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，而沒有限定它為任何特定三級結(jié)構(gòu)形式。因此，該術(shù)語包括特別是以線性或環(huán)形DNA分子存在的雙鏈DNA(例如限制性片段)、質(zhì)粒和染色體。論述具體雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)時，本文可按照只給出沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈(即具有與所述mRNA同源的序列的鏈)的5’至3’方向序列的常規(guī)描述序列?！爸亟MDNA分子”是進(jìn)行了分子生物學(xué)操作的DNA分子。
本發(fā)明提供反義核酸(包括核酶)，它可用來抑制Smurf1表達(dá)，尤其是可用來通過Smad1和4增強(qiáng)BMP途徑。因此，相當(dāng)于Smurf1基因的反義核酸或其片段可用來改變BMP途徑。本發(fā)明還提供抑制Smurf2表達(dá)、增強(qiáng)TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的反義核酸?！胺戳x核酸”是單鏈核酸分子，當(dāng)它與RNA或DNA分子中的互補(bǔ)堿基雜交時，抑制后者的作用。如果RNA為信使RNA轉(zhuǎn)錄物，則反義核酸為反轉(zhuǎn)錄物(countertranscript)或mRNA干擾性互補(bǔ)核酸。目前使用的“反義”大致包括RNA-RNA相互作用、RNA-DNA相互作用、核酶和核糖核酸酶H介導(dǎo)的抑制。反義核酸分子可由在細(xì)胞中表達(dá)的重組基因編碼(例如美國專利號5,814,500；美國專利號5,811,234)，或者它們可合成制得(例如美國專利號5,780,607)。
本文使用的術(shù)語“寡核苷酸”是指可與基因組DNA分子、cDNA分子、或者編碼基因的mRNA分子、mRNA、cDNA或其它目的核酸雜交的核酸，一般至少10、優(yōu)選至少15、更優(yōu)選至少20個核苷酸。例如可用32P核苷酸或標(biāo)記物(如生物素)與其共價結(jié)合的核苷酸標(biāo)記寡核苷酸。在一個實施方案中，標(biāo)記寡核苷酸可用作檢測存在的核酸的探針。在另一個實施方案中，寡核苷酸(可標(biāo)記其中一個或二個核苷酸)可用作PCR引物，該引物用于克隆全長Smurf1或Smurf2或其片段或者用于檢測存在的Smurf1或Smurf2編碼核酸。在再一實施方案中，本發(fā)明寡核苷酸可與Smurf1或Smurf2 DNA分子形成三螺旋。在又一實施方案中，配置在固體支持物上的寡核苷酸文庫如硅晶片或芯片可用來檢測各種目的多態(tài)性。一般優(yōu)選在核酸合成儀上合成制備寡核苷酸。因此，可用非天然磷酸酯類似物鍵如硫酯鍵等制備寡核苷酸。
本發(fā)明設(shè)計的合成寡核苷酸的具體實例包括含有硫代磷酸酯、磷酸三酯、磷酸甲酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵的寡核苷酸。最優(yōu)選具有CH2-NH-O-CH2、CH2-N(CH3)-O-CH2、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2主鏈(其中磷酸二酯為O-PO2-O-CH2)。美國專利號5,677,437介紹了雜芳族寡核苷鍵。氮鍵或含氮基也可以用來制備寡核苷酸模擬物(美國專利號5,792,844和5,783,682)。美國專利號5,637,684介紹了氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯寡聚化合物。還設(shè)計了具有嗎啉基主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(美國專利號5,034,506)。在其它實施方案中，例如肽核酸(PNA)主鏈，可用多酰胺主鏈代替所述寡核苷酸的磷酸二酯主鏈，所述堿基直接或間接與多酰胺主鏈的氮雜原子連接(Nielsen等，Science 2541497，1991)。其它合成寡核苷酸可含有在2’位含一個下列基團(tuán)的取代糖部分OH、SH、SCH3、F、OCN、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n為1至約10；C1-C10低級烷基、取代低級烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-；S-或N-烷基；O-、S-或N-鏈烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷基芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；熒光素部分；RNA離去基團(tuán)；報告基團(tuán)；嵌入劑；改善寡核苷酸藥代動力學(xué)特性的基團(tuán)；或者改善寡核苷酸藥效學(xué)特性的基團(tuán)以及具有相似特性的其它取代基。寡核苷酸也可以含有糖類似物如環(huán)丁基或取代戊糖呋喃糖基(pentofuranosyl)的其它碳環(huán)。可以使用含有腺苷、胞苷、鳥苷、胸苷和尿苷以外的核苷的核苷酸單位(unit)，例如肌苷。
本文使用的術(shù)語其所有語法形式和拼寫變化的“同源”是指具有“共同進(jìn)化來源”的蛋白關(guān)系，包括超家族蛋白(例如TGFβ超家族)和不同物種的同源蛋白(例如Smad(人)、Mad(果蠅)等)(Reeck等，Cell50667，1987)。根據(jù)其高度序列相似性反映的情況，這樣的蛋白及其編碼基因具有序列同源性。
因此，所有語法形式的術(shù)語“序列相似性”是指可能共有或可能不共有共同進(jìn)化來源的蛋白的核酸或氨基酸序列之間的相同或?qū)?yīng)的程度(參見上述Reeck等)。但是，在常規(guī)使用以及本發(fā)明使用中，當(dāng)用副詞如“高度地”修飾時，術(shù)語“同源”是指序列相似性，它可能涉及或可能不涉及共同進(jìn)化來源。
在具體實施方案中，當(dāng)在規(guī)定長度的DNA序列上匹配核苷酸至少約70-75％、最優(yōu)選至少約80-85％時，兩種DNA序列“基本同源”或“基本相似”。這種序列的一個實例是本發(fā)明Smurf基因的等位基因變異體或種變異體。使用序列數(shù)據(jù)庫可獲得的標(biāo)準(zhǔn)軟件比較序列或用例如在所述具體系統(tǒng)定義的嚴(yán)格條件下的DNA雜交實驗，可鑒定基本同源的序列。定義合適雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)，參見例如上述Maniatis等；上述DNA Cloning，第I & II卷；上述Nucleic AcidHybridization。
同樣，在具體實施方案中，當(dāng)70％以上的氨基酸相同或約90％以上相似(功能上相似)時，兩種氨基酸序列為“基本同源”或“基本相似”。最好通過使用例如GCG(Genetics Computer Group，ProgramManual for the GCG Package，第七版，Madison，Wisconsin)堆積程序BLAST和Clustal W分析(Mac Vector)進(jìn)行序列對比，從而鑒定相似或同源序列。序列比較算法也可以在http//www.nwfsc.noaa.gov/bioinformatics.html找到。
術(shù)語“對應(yīng)”在本文用來指相似序列或同源序列，無論確切位置與測定相似性或同源性的分子是相同還是不同。核酸或氨基酸序列對比可包含空位。因此，術(shù)語“對應(yīng)”是指序列相似性，而不計數(shù)氨基酸殘基或核苷酸堿基。
“同源重組”是指載體外源DNA序列插入染色體中。載體最好導(dǎo)向同源重組的特定染色體位點。對于特定的同源重組，載體將含有與所述染色體序列同源的足夠長的區(qū)段，以便允許載體互補(bǔ)結(jié)合并摻入染色體中。更長的同源區(qū)段和更高程度的序列相似性可提高同源重組的效率。
DNA“編碼序列”是當(dāng)處于合適調(diào)節(jié)序列控制下時，在體外或體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯為多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可包括但不限于原核生物序列、真核生物mRNA的cDNA、真核生物(例如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列甚至合成DNA序列。如果編碼序列用于在真核生物細(xì)胞中表達(dá)，則聚腺苷酸信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于所述編碼序列的3’端。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列為DNA調(diào)節(jié)序列，例如啟動子、增強(qiáng)子、終止子等，它們使編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)。在真核生物細(xì)胞中，聚腺苷酸信號為控制序列。
“啟動子序列”為能夠結(jié)合細(xì)胞中的RNA聚合酶并啟動下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)段。為了定義本發(fā)明，啟動子序列的邊界為轉(zhuǎn)錄起始位點的3’末端，向上游(5’方向)延伸至包括以高于本底的可檢測水平起始轉(zhuǎn)錄的最少必需堿基數(shù)或必需元件數(shù)。啟動子序列含有轉(zhuǎn)錄起始位點(通常例如以核酸酶S1作圖定義)以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。
當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄編碼序列為mRNA時，編碼序列處于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制之下”，然后反式RNA剪接mRNA并翻譯為編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。
可從任何來源、尤其是從人類或爪蟾cDNA或基因組文庫分離編碼Smurf家族蛋白(例如Smurf1或Smurf2)的核酸，無論是基因組DNA還是cDNA。如上所述，獲得基因的方法是本領(lǐng)域周知的(參見例如上述Sambrook等，1989)。在具體實施方案中，本發(fā)明提供人Smurf1(hSmurf1)和Smurf2(hSmurf2)基因的cDNA序列[SEQ ID NO1和SEQ ID NO3]。
因此，任何動物細(xì)胞均可有潛力用作分子克隆Smurf基因的核酸來源。所述DNA可用本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從克隆DNA(例如DNA“文庫”)獲得，所述文庫包括EST文庫和從高水平表達(dá)所述蛋白的組織制備的cDNA文庫(例如爪蟾階段9(囊胚)cDNA文庫—最高水平表達(dá)Smuf1的細(xì)胞)?？杀磉_(dá)Smurf1或Smurf2的其它細(xì)胞系有青蛙囊胚和原腸胚外胚層、中胚層和內(nèi)胚層；小鼠胚胎干細(xì)胞；以及各種哺乳動物細(xì)胞，例如NIH3T3、PC12、293T、Hela和COS。編碼Smurf蛋白的DNA也可以通過化學(xué)合成、cDNA克隆或克隆從需要細(xì)胞純化的基因組DNA或其片段獲得(參見例如上述Sambrook等，1989；Glover，D.M.(編著)，1985，DNA CloningA Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.第I、II卷)。從基因組DNA獲得的克隆除了含有編碼區(qū)段之外，還含有調(diào)節(jié)區(qū)段和內(nèi)含子DNA區(qū)段；從cDNA獲得的克隆不含內(nèi)含子序列。無論來源如何，應(yīng)該將所述基因分子克隆入合適載體，以繁殖所述基因。
可用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)鑒定含有需要Smurf基因的特定DNA片段。例如可純化以及標(biāo)記以下例舉的Smurf基因的一部分，以便制備標(biāo)記探針，所產(chǎn)生的DNA可以通過與標(biāo)記探針的核酸雜交進(jìn)行篩選(Benton和Davis，Science 196180，1977；Grunstein和Hogness，Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.723961，1975)。與所述探針基本同源的DNA片段(例如另一個體的等位基因變異體)可雜交。在具體實施方案中，高嚴(yán)格雜交條件用來鑒定同源Smurf1或Smurf2基因。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明Smurf基因(例如Smurf1或Smurf2)的基因編碼類似物和衍生物的克隆載體，所述類似物和衍生物具有相似或同源功能活性。Smurf1和Smurf2有關(guān)衍生物和類似物的產(chǎn)生和使用屬于本發(fā)明范疇。例如可提供截短形式的Smurf1或Smurf2。這樣的截短形式包括具有缺失的Smurf1或Smurf2。在具體實施方案中，所述衍生物或類似物是功能活性物，即能夠呈現(xiàn)一個或多個與本發(fā)明全長野生型Smurf1或Smurf2有關(guān)的功能活性。這樣的功能包括結(jié)合Smad蛋白例如Smad1、Smad5或Smad7，以及催化活化TGFβ受體/Smad復(fù)合物的結(jié)合Smad或TGFβ/活化素途徑的另一蛋白的遍在蛋白化。在另一個實施方案中，所述片段具有結(jié)合親和力，但是缺乏催化能力或催化能力降低。
通過產(chǎn)生功能等同分子的取代、添加或缺失改變核酸編碼序列可制備Smurf衍生物。另一方面，可制備非功能突變型Smurf蛋白，該蛋白例如可與BMP途徑中的野生型Smurf蛋白競爭，但是其對Smad的遍在蛋白化基本無效，它們可用于治療如上所述的與BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受損有關(guān)的疾病。在具體實施方案中，上述突變?yōu)镃710A，詳見實施例介紹。在另一具體實施方案中，Smurf2的突變?yōu)镃716A。
例如如果基因編碼具有本文公開的Smurf蛋白的以下特性的蛋白產(chǎn)物等電性、電泳、氨基酸組成、部分或全部氨基酸序列、抗體結(jié)合活性或配體結(jié)合模式，則可根據(jù)所述基因特性進(jìn)一步進(jìn)行選擇。因此，可通過基于其表達(dá)產(chǎn)物的物理、化學(xué)、免疫或功能特性的測定檢測所述基因存在與否。例如，可對cDNA克隆或雜交選擇合適mRNA的DNA克隆進(jìn)行選擇，所述克隆產(chǎn)生的蛋白例如與所測定的Smurf1或Smurf2具有相似或相同的電泳遷移、等電聚焦或非平衡pH凝膠電泳特性、蛋白酶解消化圖或者抗原性。
本發(fā)明還涉及Smurf蛋白的類似物和衍生物、其它物種的同源物以及突變變異體，它們具有相同或同源功能活性。Smurf蛋白有關(guān)衍生物、類似物和突變變異體的產(chǎn)生和使用屬于本發(fā)明范疇。在具體實施方案中，所述衍生物或類似物是功能活性物，即能夠表現(xiàn)出一個或多個與本發(fā)明全長野生型Smurf1或Smurf2蛋白有關(guān)的功能活性。
通過產(chǎn)生功能等同分子的取代、添加或缺失改變核酸序列可制備Smurf衍生物。最好是制得的衍生物的功能活性相對于原Smurf例如Smurf1或Smurf2增強(qiáng)，或者缺乏功能活性，例如缺乏Smurf蛋白C末端部分的Hect遍在蛋白連接酶結(jié)構(gòu)域的催化活性。在一個具體實施方案中，提供在C710A存在點突變的突變hSmurf1，所述點突變破壞了Hect結(jié)構(gòu)域的催化活性，因此防止Smad1和4遍在蛋白化。在另一個具體實施方案中，提供在C716A存在點突變的突變hSmurf2，所述突變破壞了Hect結(jié)構(gòu)域的催化活性，因此防止蛋白酶降解TGFβ受體-Smad7復(fù)合物。另一方面，Smurf蛋白衍生物可編碼Smurf蛋白結(jié)構(gòu)域(例如WW結(jié)構(gòu)域)的可溶性片段，所述可活性片段對天然配體如Smad1、Smad5或Smad7的親和力相同或更高。這樣的可溶性衍生物可能為配體(即Smad1、5或7)與Smurf蛋白結(jié)合的強(qiáng)抑制劑。
在另一具體實施方案中，可制備Smad1和4的衍生物或片段，它們可結(jié)合Smurf1并防止E3連接酶進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞Smad以及防止其遍在蛋白化。在另一個實施方案中，可制備Smad7的衍生物和片段，它們可減少Smurf2與Smad7和TGFβ受體二者的結(jié)合。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)計了包含具有PPXY序列的R-Smad接頭區(qū)的肽及其核酸序列的應(yīng)用，PPXY序列為WW結(jié)構(gòu)域識別的保守基元(參見Rotin，Curr.Topics Microbiol.Immuno1.，228115-133，1998和(33))，所述WW結(jié)構(gòu)域例如見于Smurf1或Smurf2的結(jié)構(gòu)域。
因為核苷酸編碼序列的簡并性，與Smurf基因編碼基本相同的氨基酸序列的其它DNA序列可用于實施本發(fā)明。這樣的DNA序列包括但不限于等位基因、其它物種的同源基因以及核苷酸序列，所述核苷酸序列包含通過取代編碼所述序列中的相同氨基酸殘基的不同密碼子改變、因此產(chǎn)生沉默突變的Smurf基因全部或部分。同樣，本發(fā)明Smurf衍生物包括但不限于這樣的序列作為一級氨基酸序列，包含全部或部分Smurf蛋白氨基酸序列，所述Smurf蛋白氨基酸序列包括所述序列中的殘基被功能等同氨基酸殘基取代、產(chǎn)生保守氨基酸取代的變化序列。例如所述序列中的一個或多個氨基酸殘基可被另一個作用相同、極性相似的氨基酸取代，導(dǎo)致沉默改變。所述序列氨基酸的取代氨基酸可選自所述氨基酸所屬類別的其它成員。例如非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸有苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。不能預(yù)測這類改變對根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳或等電點測定的表觀分子量的影響。特別優(yōu)選的取代包括-Lys取代Arg，反之亦然，可以保持正電荷；-Glu取代Asp，反之亦然，可以保持負(fù)電荷；-Ser取代Thr，能夠保持游離-OH；以及-Gln取代Asn，能夠保持游離CONH2。
也可以導(dǎo)入氨基酸取代，以具有特別優(yōu)選特性的氨基酸取代另一個氨基酸。例如可將一個Cys導(dǎo)入具有另一個Cys的二硫鍵的潛在位點。作為特別的“催化”位點導(dǎo)入His(即His可起酸或堿作用而且是生化催化中的最常見氨基酸)。因為Pro的特別平面結(jié)構(gòu)可導(dǎo)入Pro，Pro可在蛋白結(jié)構(gòu)中導(dǎo)入b轉(zhuǎn)角(turn)。
可用本領(lǐng)域已知的各種方法制備編碼本發(fā)明Smurf衍生物和類似物的基因?？苫蚧虻鞍姿竭M(jìn)行制備操作。例如可用本領(lǐng)域已知的許多策略(Sambrook等，1989，同上)中任何一種修飾克隆的Smurf1或Smurf2基因序列。可用限制性內(nèi)切酶在合適位點切割所述序列，然后如果需要的話進(jìn)一步進(jìn)行酶修飾，分離以及體外連接。在產(chǎn)生編碼Smurf衍生物或類似物的基因中，應(yīng)注意確保修飾基因仍然在編碼需要活性的基因區(qū)基因的相同翻譯讀框內(nèi)，未被翻譯終止信號間斷。
另外，可在體外或體內(nèi)使Smurf編碼核酸序列突變，以產(chǎn)生和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列；或者產(chǎn)生各種變化的編碼區(qū)和/或形成新的限制性內(nèi)切核酸酶位點或破壞已存在的限制性內(nèi)切核酸酶位點，以有助于進(jìn)一步的體外修飾。最好是所述突變增強(qiáng)突變Smurf基因產(chǎn)物的功能活性?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)，包括但不限于體外定點誘變(Hutchinson，C.等，1978，J.Biol.Chem.2536551；Zoller和Smith，1984，DNA 3479-488；Oliphant等，1986，Gene 44177；Hutchinson等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83710)、使用TAB接頭(Pharmacia)等。優(yōu)選PCR技術(shù)用于定點誘變(參見Higuchi，1989，“將PCR用于工程DNA”，載于PCR TechnologyPrinciples andApplications for DNA Amplification，H.Erlich編著，Stockton Press，第六章，第61-70頁)。
然后可將鑒定分離的基因插入合適克隆載體中。可使用本領(lǐng)域已知的眾多載體宿主系統(tǒng)?？赡艿妮d體包括但不限于質(zhì)?；蛐揎棽《荆禽d體系統(tǒng)必須與所使用的宿主細(xì)胞匹配。載體實例包括但不限于大腸桿菌噬菌體如λ衍生物；或者質(zhì)粒如pBR322衍生物或pUC質(zhì)粒衍生物，例如pGEX載體、pMal-c、pFLAG、pGBT9等。例如可以使所述DNA片段連接入具有互補(bǔ)粘性末端的克隆載體中，從而完成插入克隆載體。然而，如果用以片段化所述DNA的互補(bǔ)限制性位點在克隆載體中沒有，則可以酶性修飾所述DNA分子的末端?；蛘咄ㄟ^使核苷酸序列(接頭)連接入所述DNA末端可以產(chǎn)生任何需要位點；這些連接接頭可包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶識別序列的特別化學(xué)合成的寡核苷酸。重組分子可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔等導(dǎo)入宿主細(xì)胞，這樣可產(chǎn)生無數(shù)拷貝的所述基因序列?？寺』蜃詈冒诖┧筝d體質(zhì)粒上，穿梭載體在克隆細(xì)胞例如大腸桿菌中擴(kuò)增而且有助于純化，以便隨后插入合適表達(dá)細(xì)胞系中，如果需要如此的話。例如通過連接大腸桿菌質(zhì)粒序列與酵母2μ質(zhì)粒序列可制備既可在大腸桿菌中復(fù)制又可在釀酒酵母中復(fù)制的穿梭載體，穿梭載體是可在一種以上生物體內(nèi)復(fù)制的載體。
表達(dá)Smurf多肽編碼Smurf蛋白或其抗原片段、衍生物或類似物或功能活性衍生物(包括其嵌合蛋白)的核苷酸序列可插入合適表達(dá)載體中，合適表達(dá)載體也就是含有轉(zhuǎn)錄和翻譯插入蛋白編碼序列必需的元件的載體。這樣的元件在本文稱為“啟動子”。因此，編碼本發(fā)明Smurf蛋白的核酸與本發(fā)明表達(dá)載體的啟動子有效連接。cDNA和基因組序列二者均可克隆并在這樣的調(diào)節(jié)序列控制下表達(dá)。表達(dá)載體最好還包含復(fù)制起點。
必需轉(zhuǎn)錄和翻譯信號可以提供在重組表達(dá)載體上，或者可由編碼Smurf蛋白的天然基因和/或其側(cè)翼區(qū)提供。
潛在宿主載體系統(tǒng)包括但不限于病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)；病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物，例如含有酵母載體的酵母；或者噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。載體表達(dá)元件隨其強(qiáng)度和特異性而不同。根據(jù)所用的宿主載體系統(tǒng)，可使用眾多合適轉(zhuǎn)錄和翻譯元件的任何一種。在使所述細(xì)胞表達(dá)的條件下在合適細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有包含編碼本發(fā)明Smurf蛋白的核酸的重組載體。表達(dá)Smurf的有效宿主細(xì)胞包括C2C12、293T、CHO、COS、HEK、Hela、HepG2、NIH3T3、PC12、P19和其它細(xì)胞系，以及腎、腦和骨細(xì)胞。
在通過重組整合編碼序列后，染色體可表達(dá)本發(fā)明重組Smurf蛋白或其功能片段、衍生物、嵌合構(gòu)建物或類似物。關(guān)于此，可使用眾多增強(qiáng)系統(tǒng)中的任何一種，以便實現(xiàn)高水平穩(wěn)定表達(dá)基因(參見上述Sambrook等，1989)。
可使用將DNA片段插入克隆載體的任何前述方法構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有合適轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號和蛋白編碼序列組成的基因。這樣的方法可包括體外重組DNA以及合成技術(shù)以及體內(nèi)重組(遺傳重組)。
本領(lǐng)域已知的任何啟動子/增強(qiáng)子元件可控制Smurf蛋白表達(dá)，但這些調(diào)節(jié)元件必須在選定用于表達(dá)的宿主中發(fā)揮作用?？捎糜诳刂芐murf基因表達(dá)的啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)(Benoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)、Rous肉瘤病毒3’長末端重復(fù)序列包含的啟動子(Yamamoto等，1980，Cell 22787-797)、皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，Nature 29639-42)；原核生物表達(dá)載體，例如β內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)或者tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；此外參見“用重組細(xì)菌產(chǎn)生有用蛋白”，載于Scientific American，1980，24274-94；酵母或其它真菌的啟動子元件，例如Gal4啟動子、ADC(乙醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子；以及具有組織特異性而且已經(jīng)用于轉(zhuǎn)基因動物的動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺腺泡細(xì)胞中具有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift等，1984，Cell 38639-646；Omitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；在胰腺β細(xì)胞中具有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，Nature 315115-122)、在淋巴樣細(xì)胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等，1984，Cell 38647-658；Adames等，1985，Name 318533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)、在睪丸、乳腺、淋巴樣細(xì)胞和肥大細(xì)胞中具有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等，1986，Cell 45485-495)、在肝臟中具有活性的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1268-276)、在肝臟中具有活性的α甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer等，1987，Science 23553-58)、在肝臟中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1161-171)、在骨髓細(xì)胞中具有活性的β珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram等，1985，Nature 315338-340；Kollias等，1986，Cell 4689-94)、在腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中具有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，1987，Cell 48703-712)、在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白輕鏈2基因控制區(qū)(Sani，1985，Nature 314283-286)以及在下丘腦中具有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)(Mason等，1986，Science 2341372-1378)。
可用各種各樣的宿主/表達(dá)載體組合表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。例如有效的表達(dá)載體可由染色體節(jié)段、非染色體節(jié)段和合成DNA序列組成。合適載體包括SV40衍生物和已知細(xì)菌質(zhì)粒，例如大腸桿菌質(zhì)粒colE1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith等，1988，Gene6731-40)、pMB9及其衍生物、質(zhì)粒如RP4；噬菌體DNAS，例如噬菌體1的許多衍生物，例如NM989，以及其它噬菌體DNA，例如M13和絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA；酵母質(zhì)粒，例如2m質(zhì)粒或其衍生物；在真核細(xì)胞中有效的載體，例如在昆蟲或哺乳動物細(xì)胞中有效的載體；從組合的質(zhì)粒和噬菌體DNA獲得的載體，例如進(jìn)行了修飾以便使用噬菌體DNA或其它表達(dá)控制序列的質(zhì)粒等。
例如在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中可使用非融合轉(zhuǎn)移載體和融合轉(zhuǎn)移載體，非融合轉(zhuǎn)移載體例如(但不限于)pVL941(BamH1克隆位點；Summers)、pVL1393(BamH1、SmaI、XbaI、EcoR1、NotI、XmaIII、BglII和PstI克隆位點；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI和BamH1克隆位點；Summers and Invitrogen)和pBlueBacIII(BamH1、BglII、PstI、NcoI和HindIII克隆位點，可能帶有藍(lán)色/白色重組篩選；Invitrogen)；融合轉(zhuǎn)移載體例如(但不限于)pAc700(BamH1和KpnI克隆位點，其中BamH1識別位點從起始密碼子開始；Summers)、pAc701和pAC702(與pAc700相同，具有不同讀框)、pAc360(BamH1克隆位點在多角體蛋白起始密碼子下游的36個堿基對；Invitrogen(195))以及pBlueBacHisA、B、C(3種不同讀框，具有BamH1、BglII、PstI、NcoI和HindIII克隆位點，N末端肽用于ProBond純化，以及藍(lán)色/白色重組篩選噬菌斑；InVitrogen(220))。
考慮用于本發(fā)明的哺乳動物表達(dá)載體包括具有誘導(dǎo)型啟動子(如二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子)的載體，例如具有DHFR表達(dá)載體的任何表達(dá)載體；或者DHFR/氨甲蝶呤共擴(kuò)增載體，例如pED(PstI、SalI、SbaI、SmaI和EcoRI克隆位點，表達(dá)克隆基因和DHFR的載體；參見例如Kaufman，Current Protocols in Molecular Biology，16.12(1991))。或者，谷氨酰胺合成酶/蛋氨酸sulfoximine共擴(kuò)增載體，例如pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI和BclI克隆位點，其中所述載體表達(dá)谷胺酰胺合酶和克隆基因；Celltech)。在另一個實施方案中，可以使用在非洲淋巴瘤病毒(EBV)控制下指導(dǎo)附加型表達(dá)的載體，例如pREP4(BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位點，組成型RSV-LTR啟動子，潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pCEP4(BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位點，組成型hCMV立即早期基因，潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamH1克隆位點，誘導(dǎo)型金屬硫蛋白IIa基因啟動子，潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pREP8(BamH1、XhoI、NotI、HindIII、NheI和KpnI克隆位點，RSV-LTR啟動子，組氨醇選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI和BamHI克隆位點、RSV-LTR啟動子，G418選擇標(biāo)記；Invitrogen)以及pEBVHis(RSV-LTR啟動子，潮霉素選擇標(biāo)記，N-末端肽可通過ProBond樹脂純化以及用腸激酶切割；Invitrogen)。用于本發(fā)明的選擇性哺乳動物表達(dá)載體包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI和ApaI克隆位點，G418選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pRc/RSV (HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaI克隆位點，G418選擇標(biāo)記；Invitrogen)等。按照本發(fā)明使用的牛痘病毒哺乳動物表達(dá)載體(參見Kaufman，1991，同上)包括但不限于pSC11(SmaI克隆位點，TK-和b-gal選擇)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI和HindIII克隆位點；TK-和b-gal選擇)以及pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindII、SabI、BamHI和Hpa克隆位點，TK或XPRT選擇)。
也可以按照本發(fā)明使用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Smurf1。例如按照本發(fā)明可以使用非融合pYES2載體(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstX1、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn 1和HindIII克隆位點；Invitrogen)或融合pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI和HindIII克隆位點，N-末端肽用ProBond樹脂純化以及用腸激酶切割；Invitrogen)，在這里就列舉以上兩類。
當(dāng)鑒定分離特定重組Smurf DNA分子后，可使用數(shù)種本領(lǐng)域已知方法使其增殖。建立合適宿主系統(tǒng)和生長條件后，可繁殖并定量制備重組表達(dá)載體。如前所述，可使用的表達(dá)載體包括但不限于以下載體或其衍生物人或動物病毒如牛痘病毒或腺病毒；昆蟲病毒如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如λ噬菌體)和質(zhì)粒以及粘粒DNA載體，在此列舉數(shù)種。
另外，可選擇調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)或者以需要的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。不同宿主細(xì)胞具有翻譯和翻譯后加工以及修飾蛋白質(zhì)特征性具體機(jī)制。可選擇合適細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保按需要修飾和加工表達(dá)的外源蛋白。例如細(xì)菌系統(tǒng)表達(dá)可用來產(chǎn)生非糖基化核心蛋白產(chǎn)物，而酵母表達(dá)可用來產(chǎn)生糖基化產(chǎn)物。真核細(xì)胞表達(dá)可提高異源哺乳動物蛋白“天然”折疊的可能性。而且哺乳動物細(xì)胞表達(dá)可提供重建或組建Smurf活性的工具。此外，本領(lǐng)域已知不同載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可不同程度地影響加工反應(yīng)(例如蛋白酶剪切)。
載體可用本領(lǐng)域已知方法導(dǎo)入需要宿主細(xì)胞，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE萄聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、應(yīng)用基因槍或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)物(參見例如Wu等，1992，J.Biol.Chem.267963-967；Wu和Wu，1988，J.Biol.Chem.26314621-14624；Hartmut等，1990年3月15日提交的加拿大專利號2,012,311)。
分析Smurf功能活性介導(dǎo)的基因表達(dá)在一個實施方案中，寡核苷酸陣列技術(shù)可用來例如評價Smurf1結(jié)合Smad1或Smad5、或者Smurf2結(jié)合Smad7后的基因表達(dá)，并用以鑒定與以下情況的基因表達(dá)有關(guān)或不同的基因表達(dá)TGFβ或BMP治療細(xì)胞的基因表達(dá)、或損傷和/或愈合組織或具有腫瘤形成狀態(tài)細(xì)胞的組織的細(xì)胞基因表達(dá)，以及細(xì)胞和發(fā)育過程中的基因表達(dá)，例如有絲分裂、細(xì)胞分化、胚胎圖示形成和發(fā)育以及器官發(fā)生的基因表達(dá)。例如人們可比較存在或缺乏Smurf表達(dá)下的TGFβ或BMP治療細(xì)胞中的基因表達(dá)。GeneChip表達(dá)分析(Affymetrix，Santa Clara，CA)獲得評價基因表達(dá)分布和其它生物測定的數(shù)據(jù)。寡核苷酸表達(dá)陣列同時定量檢查上千個mRNA轉(zhuǎn)錄物(基因或EST)，簡化了大規(guī)?；蚪M研究。各轉(zhuǎn)錄物可顯示在區(qū)分基因家族密切相關(guān)成員的多探針對的探針陣列上。每個探針室含有成千上萬拷貝的特定寡核苷酸探針，從而允許精確敏感地檢測低密度mRNA雜交模式。差異表達(dá)數(shù)據(jù)可使人們清楚地了解細(xì)胞途徑。
雜交后例如用Hewlett-Packard GeneArrayTM掃描儀強(qiáng)捕獲強(qiáng)度數(shù)據(jù)。可用軟件自動計算各探針室的強(qiáng)度值。探針室強(qiáng)度可用來計算各基因的平均強(qiáng)度，各基因的平均強(qiáng)度與mRNA豐度水平直接相關(guān)。對于任何選定亞組的基因，表達(dá)數(shù)據(jù)可根據(jù)任何分析參數(shù)快速地分類并以各種圖式表示。目前標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)GeneChip表達(dá)探針陣列可用于人類、小鼠、酵母和其它生物。將擴(kuò)展GeneChip產(chǎn)品系列，以包括用于分析其它生物的表達(dá)陣列以及擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域，例如毒理學(xué)和藥物基因組學(xué)。
轉(zhuǎn)基因載體可將Smurf導(dǎo)入細(xì)胞中以治療與過度BMP或TGFβ激活有關(guān)的疾病，例如癌癥。通過在細(xì)胞中導(dǎo)入Smurf載體以及Smurf表達(dá)時監(jiān)測所述細(xì)胞，從而評價Smurf活性。這可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行，或者在體外操作后移植入體內(nèi)，也稱為活體外(exvivo)。另一方面，如上所述，可用調(diào)節(jié)Smad的載體遞送Smurf或Smurf抑制劑(反義核酸、核酶或細(xì)胞內(nèi)抗體)，其目的是例如當(dāng)需要BMP或TGFβ活性(例如骨再生)時防止Smurf調(diào)節(jié)Smad；或者研究Smurf的體內(nèi)調(diào)節(jié)過程。
Smurf活性可用各種方法抑制，包括編碼顯性失活Smurf派生物(例如Cys710突變?yōu)锳la突變體)的載體傳遞至細(xì)胞、反義核酸(包括核酶和形成三螺旋的寡核苷酸；關(guān)于此在上述文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述)以及表達(dá)抗Smurf細(xì)胞內(nèi)抗體，例如單鏈Fv抗體(一般參見Chen，Mol.Med.Today，3160-167，1997；Spitz等，Anticancer Res.，163415-3422，1996；Indolfi等，Nat.Med.，2634-635，1996；Kijima等，Pharmacol.Ther.，68247-267，1995)。
如上所述，載體是將本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中的任何材料。這樣的載體包括病毒載體，例如慢病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。因此，可以用病毒載體或通過直接導(dǎo)入DNA而體內(nèi)、活體外或體外導(dǎo)入編碼功能或突變Smurf蛋白或其多肽結(jié)構(gòu)域片段的基因。通過(例如使用病毒載體或受體配體)將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)向特定細(xì)胞或者通過用組織特異性啟動子或者以上二者，可實現(xiàn)在靶組織中表達(dá)。1995年10月公開的國際專利公布WO95/28494介紹了靶向基因傳遞。
常規(guī)用于體內(nèi)或活體外靶向以及治療方法的病毒載體是DNA型載體和反轉(zhuǎn)錄病毒載體。構(gòu)建和使用病毒載體的方法是本領(lǐng)域已知的[參見例如，Miller和Rosman，Bio Techniques 7980-990(1992)]。最好是病毒載體為復(fù)制缺陷型，也就是說它們不能在靶細(xì)胞中自主復(fù)制。一般來說，在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的復(fù)制缺陷型病毒載體的基因組至少缺乏病毒在感染細(xì)胞中復(fù)制必需的一個區(qū)段。這些區(qū)段可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)消除(全部或部分)或者使其無功能。這些技術(shù)包括完全去除、取代(被其它序列取代，尤其是被插入核酸取代)、部分缺失或增加復(fù)制必需區(qū)的一個或多個堿基。所述技術(shù)可利用遺傳操作技術(shù)或利用誘變劑處理在體外(對分離的DNA)或原位進(jìn)行。最好是復(fù)制缺陷型病毒保持其病毒顆粒包衣殼必需的基因組序列。
DNA病毒載體包括減毒或缺陷型DNA病毒，例如但不限于單純皰疹病毒(HSV)、乳頭瘤病毒、非洲淋巴瘤病毒(EBV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)等。優(yōu)選完全或幾乎完全缺乏病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒導(dǎo)入細(xì)胞后無感染性。使用缺陷型病毒載體允許給予至特定局限區(qū)域的細(xì)胞，而不用擔(dān)心所述載體感染其它細(xì)胞。所以，可特異性導(dǎo)向特定組織。具體載體的實例包括但不限于缺陷型1型皰疹病毒(HSV1)載體[Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.，2320-330(1991)]、缺乏糖蛋白L基因的缺陷型皰疹病毒載體[專利公開RD371005A]或其它缺陷型皰疹病毒載體[1994年9月29日公開的國際專利公開號WO94/21807；1994年4月2日公開的國際專利公開號WO92/05263]；減毒腺病毒載體，例如Stratford-Perricaudet等介紹的載體[J.Clin.Invest.，90626-630，1992；此外還參見La Salle等，Science，259988-990，1993]；以及缺陷型腺伴隨病毒載體[Samulski等，J.Virol.，613096-3101，1987；Samulski等，J.Virol.，633822-3828，1989；Lebkowski等，Mol.Cell.Biol.，83988-3996，1988]。
對于體內(nèi)給予而言，最好是病毒載體例如腺病毒載體與合適的免疫抑制治療聯(lián)合應(yīng)用，以便避免免疫作用使病毒載體和轉(zhuǎn)染細(xì)胞失活。例如可以給予免疫抑制性細(xì)胞因子如白介素-12(IL-12)、干擾素-g(IFN-g)或抗-CD4抗體，以阻斷對所述病毒載體的體液免疫或細(xì)胞免疫反應(yīng)[參見例如Wilson，Nature Medicine(1995)]。另外，最好使用工程表達(dá)最少數(shù)目抗原的病毒載體。
腺病毒載體腺病毒是真核生物DNA病毒，可以對其進(jìn)行改進(jìn)以有效將本發(fā)明核酸傳遞至各種細(xì)胞類型。存在各種血清型腺病毒。在本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選使用這些血清型中的2型或5型人類腺病毒(Ad2或Ad5)或者動物來源的腺病毒(參見WO94/26914)。在本發(fā)明范圍內(nèi)可使用的動物來源腺病毒包括犬、牛、小鼠(例如Mavl，Beard等，Virology 75(1990)81)、綿羊、豬、鳥和猿猴(例如SAV)來源的腺病毒。動物來源的腺病毒優(yōu)選為犬腺病毒，更優(yōu)選CAV2腺病毒(例如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
本發(fā)明復(fù)制缺陷型腺病毒載體最好包含ITR、包衣殼序列和目的核酸。甚至更優(yōu)選至少腺病毒載體的E1區(qū)為非功能區(qū)。E1區(qū)缺失優(yōu)選從Ad5腺病毒序列的核苷酸455延伸至3329(PvuII-BglII片段)或由核苷酸382延伸至3446(HinfII-Sau3A片段)。其它區(qū)段也可以修飾，尤其是E3區(qū)(WO95/02697)、E2區(qū)(WO94/28938)、E4區(qū)(WO94/28152、WO94/12649和WO95/02697)或任何一種晚期基因L1-L5。
在一個具體實施方案中，腺病毒載體E1區(qū)存在缺失(Ad1.0)。EP185,573公開了E1缺失腺病毒的實例，所述專利內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。在另一個實施方案中，腺病毒載體在E1和E4區(qū)中存在缺失(Ad3.0)。WO95/02697和WO96/22378公開了E1/E4缺失腺病毒的實例，所述專利內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。在再一實施方案中，所述腺病毒載體在E4區(qū)和核酸序列插入的E1區(qū)中存在缺失(參見FR9413355，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。
本發(fā)明的復(fù)制缺陷型重組腺病毒可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)(Levrero等，Gene101195 1991；EP 185 573；Graham，EMBO J.32917，1984)制備。尤其是可以通過腺病毒和特別攜帶目的DNA序列的質(zhì)粒之間的同源重組制得。同源重組在所述腺病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入合適細(xì)胞系后實現(xiàn)。使用的細(xì)胞系應(yīng)優(yōu)選(i)可被所述元件轉(zhuǎn)化，以及(ii)含有能夠與復(fù)制缺陷型腺病毒的部分基因組互補(bǔ)的序列，所述腺病毒優(yōu)選為整合型以避免重組的危險?？墒褂玫募?xì)胞系實例有人胚胎腎細(xì)胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.3659 1977)，293細(xì)胞系含有整合入其基因組的Ad5腺病毒基因組的左手部分(12％)，以及能夠與E1和E4功能互補(bǔ)的細(xì)胞系，見WO94/26914和WO95/02697申請介紹。重組腺病毒可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)回收純化。
腺伴隨病毒腺伴隨病毒(AAV)為較小的DNA病毒，它們可以穩(wěn)定地位點特異性整合入它們感染的細(xì)胞的基因組中。它們能夠感染各種各樣的細(xì)胞，而不會對細(xì)胞生長、形態(tài)學(xué)或分化產(chǎn)生任何影響，而且它們似乎與人類病理學(xué)無關(guān)。已經(jīng)對AAV基因組進(jìn)行了克隆、測序和特征鑒定。它包含約4700個堿基，在兩個末端含有約145個堿基的末端反向重復(fù)(ITR)區(qū)段，該區(qū)段起病毒復(fù)制起點的作用。腺伴隨病毒基因組的其余部分分為具有包衣殼功能的2個基本區(qū)段基因組左手部分，該部分含有參與病毒復(fù)制和病毒基因表達(dá)的rep基因；以及基因組右手部分，該部分含有編碼病毒衣殼蛋白的cap基因。
已有關(guān)于使用AAV衍生載體體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的介紹(參見WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368、US5,139,941、EP488528)。這些公開專利介紹了各種AAV衍生構(gòu)建物，其中rep和/或cap基因缺失而且被目的基因取代，以及介紹了使用這些構(gòu)建物體外(轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)細(xì)胞中)或體內(nèi)(直接轉(zhuǎn)移入生物體內(nèi))轉(zhuǎn)移所述目的基因。本發(fā)明復(fù)制缺陷型重組AAV可如下制備使含有目的核酸序列、其兩側(cè)為2個AAV末端反向重復(fù)(ITR)區(qū)的質(zhì)粒和攜帶AAV包衣殼基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入人類輔助病毒(例如腺病毒)感染的細(xì)胞系中。然后可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化產(chǎn)生的AAV重組體。
反轉(zhuǎn)錄病毒載體在另一個實施方案中，所述基因可導(dǎo)入反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，例如見以下文獻(xiàn)介紹Anderson等，美國專利號5,399,346；Mann等，1983，Cell 33153；Temin等，美國專利號4,650,764；Temin等，美國專利號4,980,289；Markowitz等，1988，J.Virol.621120；Temin等，美國專利號5,124,263；EP453242、EP178220；Bemstein等，Genet.Eng.7(1985)235；McCormick，BioTechnology 3(1985)689；Dougherty等1995年5月16日公開的國際專利公開號WO95/07358；以及Kuo等，1993，Blood 82845。反轉(zhuǎn)錄病毒是感染分裂細(xì)胞的整合病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組包含2個LTR、1個包衣殼序列和3個編碼區(qū)(gag、pol和env)。在重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，一般gap、pol和env基因完全或部分缺失，而且被外源目的核酸序列取代。這些載體可用不同類型反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建，例如HIV、MoMuLV(“小鼠摩洛尼白血病病毒”)、MSV(“小鼠摩洛尼肉瘤病毒”)、HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾壞死病毒”)；RSV(“勞斯肉瘤病毒”)和Friend病毒。WO95/02697公開了缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
一般來說，為了構(gòu)建含一種核酸序列的重組反轉(zhuǎn)錄病毒，構(gòu)建含有LTR、包衣殼序列和編碼序列的質(zhì)粒。應(yīng)用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠反式提供所述質(zhì)粒缺陷的反轉(zhuǎn)錄病毒功能。因此，一般來說包裝細(xì)胞系能夠表達(dá)gag、pol和env基因。現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)介紹了這樣的包裝細(xì)胞系，尤其是細(xì)胞系PA317(US4,861,719)；PsiCRIP細(xì)胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12細(xì)胞系(WO89/07150)。另外，重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以含有抑制轉(zhuǎn)錄活性的LTR修飾以及可能包含部分gag基因的擴(kuò)大包衣殼序列(Bender等，J.Virol.61(1987)1639)。重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體可用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。
可構(gòu)建以感染顆粒起作用或只進(jìn)行一輪轉(zhuǎn)染的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在前一情況下，可以改進(jìn)病毒以保留其除了引起致癌性轉(zhuǎn)化特性的基因之外的所有基因而且表達(dá)異源基因?？芍苽淦茐牧瞬《景b信號的非感染性病毒載體，但是保留包裝工程后含有異源基因和包裝信號的共導(dǎo)入病毒需要的結(jié)構(gòu)基因。因此，產(chǎn)生的病毒顆粒不能產(chǎn)生額外病毒。
慢病毒載體在另一個實施方案中，慢病毒載體可用作直接傳遞轉(zhuǎn)基因的因子而且在若干組織類型中持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，所述組織類型包括腦、視網(wǎng)膜、肌肉、肝臟和血液。慢病毒載體可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)所述組織中的分裂和非分裂細(xì)胞，而且維持目的基因長期表達(dá)。
慢病毒含有至少2個復(fù)制必需的調(diào)節(jié)基因tat和rev以及4個編碼重要毒力因子的輔助基因[參見綜述Naldini，L，Curr.Opin.Biotechnol.，9457-63，1998]。因此去除轉(zhuǎn)導(dǎo)非必需病毒序列，由此提高該特定載體的生物安全性。自我失活的HIV-1載體是在包括TATA框的3’長末端重復(fù)序列(LTR)存在缺失的已知載體，它們因為降低了在載體產(chǎn)生細(xì)胞和靶細(xì)胞中產(chǎn)生可復(fù)制反轉(zhuǎn)錄病毒的可能性而顯著提高了HIV衍生載體的生物安全性(Zufferey等，J.Virol.，729873-80，1998)。此外，缺失通過去除以前與轉(zhuǎn)錄干擾和體內(nèi)抑制有關(guān)的LTR序列以及通過允許構(gòu)建更嚴(yán)格組織特異性或調(diào)節(jié)性載體而改進(jìn)所述載體的潛在性能。
各種慢病毒包裝細(xì)胞系可供使用而且它們是本領(lǐng)域普遍了解的。它們有助于產(chǎn)生用于基因治療的高滴度慢病毒載體。一個實例是四環(huán)素誘導(dǎo)型VSV-G假型化慢病毒包裝細(xì)胞系，該細(xì)胞系可以持續(xù)至少3-4天以10(6)IU/ml以上的滴度產(chǎn)生病毒顆粒(Kafri等，J.Virol.，73576-584，1999)。誘導(dǎo)型細(xì)胞系產(chǎn)生的載體可根據(jù)需要濃縮，以便體外和體內(nèi)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞。
非病毒性載體另一方面，可以通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體內(nèi)導(dǎo)入載體。過去十年以來，使用脂質(zhì)體在體外進(jìn)行核酸包膠囊和轉(zhuǎn)染越來越多。可設(shè)計脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染所遇到的困難和危險得到限制的合成陽離子脂質(zhì)，這樣的脂質(zhì)可用來制備用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)記的基因的脂質(zhì)體[Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84，7413-7417，1987；參見Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，858027-8031，1988；Ulmer等，Science，2591745-1748，1993]。使用陽離子脂質(zhì)可促進(jìn)帶負(fù)電荷的核酸的包膠囊化，而且也可以促進(jìn)與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜的融合[Felgner和Ringold，Science，337387-388，1989]。國際專利公開WO95/18863和WO96/17823以及美國專利號5,459,127介紹了轉(zhuǎn)移核酸特別有用的脂質(zhì)化合物和組合物。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染將外源基因體內(nèi)導(dǎo)入特定器官具有一定實用優(yōu)點。脂質(zhì)體分子靶向特定細(xì)胞代表一個特別有益的領(lǐng)域。顯然，直接轉(zhuǎn)染至特定細(xì)胞類型在細(xì)胞異質(zhì)性組織(如胰腺、肝臟、腎臟和腦)方面應(yīng)具有特別優(yōu)勢。脂質(zhì)可與其它分子化學(xué)偶聯(lián)，以便靶向給予[參見Mackey等，同上]。靶向肽例如激素或神經(jīng)遞質(zhì)和蛋白質(zhì)例如抗體或者非肽分子可與脂質(zhì)體化學(xué)偶聯(lián)。
其它分子也可以用于促進(jìn)核酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，例如陽離子寡肽(例如國際專利公布WO95/21931)、DNA結(jié)合蛋白衍生肽(例如國際專利公布WO96/25508)或陽離子聚合物(例如國際專利公布WO95/21931)。
所述載體也可以以裸DNA質(zhì)粒導(dǎo)入體內(nèi)。用于基因治療的裸DNA載體可用本領(lǐng)域已知的方法導(dǎo)入需要的宿主細(xì)胞，所述方法例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE萄聚糖、磷酸鈣沉淀、使用基因槍或使用DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)物[參見例如Wu等，J.Biol.Chem.，267963-967，1992；Wu和Wu，J.Biol.Chem.，26314621-14624，1988；Hartmut等，1990年3月15日提交的加拿大專利號2,012,311；Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882726-2730，1991]。也可以使用受體介導(dǎo)的DNA傳遞方法[Curiel等，Hum.Gene Ther.，3147-154，1992；Wu和Wu，J.Biol.Chem.，2624429-4432，1987]。美國專利號5,580,859公開了在哺乳動物體內(nèi)不用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑傳遞外源DNA序列。
抗Smurf蛋白抗體按照本發(fā)明重組或化學(xué)合成產(chǎn)生的Smurf多肽或其片段、變異體或其它衍生物或類似物(包括融合蛋白)可用作免疫原產(chǎn)生識別Smurf多肽的抗體。這樣的抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段以及Fab表達(dá)文庫。這種抗體是Smurf蛋白特異性的；它可識別突變型Smurf或野生型Smurf。這些抗體可用來通過抑制Smurf蛋白(例如抗Smurf細(xì)胞內(nèi)抗體)改變BMP途徑或者用于診斷目的。
各種本領(lǐng)域已知方法可用于產(chǎn)生抗Smurf多肽或其衍生物或類似物的多克隆抗體。為了產(chǎn)生抗體，可通過對包括但不限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等注射Smurf多肽或其衍生物(例如片段或融合蛋白)免疫各種宿主動物。在一個實施方案中，Smurf多肽或其片段可與免疫原性載體綴合，所述免疫原性載體例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。根據(jù)宿主類型可使用各種佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)，所述佐劑包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油性乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚和潛在有效的人類佐劑如BCG(卡介苗)和小棒桿菌。
為了制備直接針對Smurf多肽或其片段、類似物或衍生物的單克隆抗體，可使用通過連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)。這樣的技術(shù)包括但不限于Kohler和Milstein最初開發(fā)(Nature 256495-497，1975)的雜交瘤技術(shù)以及三瘤(trioma)技術(shù)、人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，Immunology Today 472，1983；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2030，1983)和產(chǎn)生人類單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，載于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁，1985)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可用無菌動物產(chǎn)生單克隆抗體(1989年11月28日公布的國際專利公布號WO89/12690)。實際上，按照本發(fā)明，可使用通過剪接Smurf多肽特異性小鼠抗體分子基因和具有合適生物活性的人抗體分子基因研制用于產(chǎn)生“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等，J.Bacteriol.159870，1984；Neuberger等，Nature 312604-608，1984；Takeda等，Nature 314452-454，1985)；這樣的抗體屬于本發(fā)明范疇。優(yōu)選所述人抗體或人源化嵌合抗體用于人類疾病治療(如上所述)，因為人抗體或人源化抗體自身誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、尤其是過敏反應(yīng)比異種抗體的可能性要低得多。
按照本發(fā)明，介紹用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(Huston的美國專利號5,476,786和5,132,405；美國專利4,946,778)可用于產(chǎn)生Smurf多肽特異性單鏈抗體。本發(fā)明另一實施方案利用介紹用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫的技術(shù)(Huse等，Science 2461275-1281，1989)，以允許快速簡便地鑒定對Smurf多肽或其衍生物或類似物具有需要特異性的單克隆Fab片段。
應(yīng)用已知技術(shù)可制備含有獨(dú)特型抗體分子的抗體片段。例如，所述片段包括但不限于可通過胃蛋白酶消化所述抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段；可通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab’片段以及可通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(一般參見Chen，Mol.Med.Today 3160-167，1997；Spitz等，Anticancer Res.163415-3422，1996；Indolfi等，Nat.Med.2634-635，1996；Kijima等，Pharmacol.Ther.68247-267，1995)，通過表達(dá)抗Smurf細(xì)胞內(nèi)抗體如單鏈Fv抗體也可以抑制Smurf活性。
產(chǎn)生抗體時，可應(yīng)用本領(lǐng)域已知技術(shù)篩選需要抗體，所述已知技術(shù)例如放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“三明治”免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、原位免疫測定(例如應(yīng)用膠體金、酶標(biāo)記物或放射性同位素標(biāo)記物)、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測定(例如凝膠凝集測定、血細(xì)胞凝集測定)、補(bǔ)體固定測定、免疫熒光測定、A蛋白測定和免疫電泳測定等。在一個實施方案中，通過檢測一抗上的標(biāo)記物而檢測抗體結(jié)合。在另一個實施方案中，通過檢測二抗或試劑與一抗的結(jié)合來檢測一抗。在再一實施方案中，標(biāo)記所述二抗。許多免疫測定檢測結(jié)合的方法是本領(lǐng)域已知的而且在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如為了選擇識別Smurf多肽特異性表位的抗體，人們可對所產(chǎn)生的雜交瘤檢測其結(jié)合含有所述表位的Smurf多肽片段的產(chǎn)物。為了選擇具體動物物種Smurf多肽的特異性抗體，人們可以根據(jù)與該動物物種細(xì)胞表達(dá)或分離自該動物物種細(xì)胞的Smurf多肽的正結(jié)合進(jìn)行選擇。
上述抗體可用于涉及Smurf多肽定位和活性的本領(lǐng)域已知方法，例如利用任何上述檢測技術(shù)或本領(lǐng)域已知檢測技術(shù)的蛋白質(zhì)印跡、Smurf多肽原位成象、檢測其在合適生理樣品中的水平等。所述抗體也可以用于配體結(jié)合測定中，例如美國專利號5,679,582所述。
在一個具體實施方案中，可制備增強(qiáng)或拮抗Smurf多肽活性的抗體?？刹捎蒙鲜鰴z測測試這樣的抗體，以鑒定配體。
篩選按照本發(fā)明編碼Smurf基因衍生的核苷酸序列和其產(chǎn)生的肽序列可用作靶，以鑒定有效治療BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的疾病的藥物，如前所述(參見Schmitt等，J.Orthopedic Res.，17269，1999)，所述核苷酸序列或肽序列可用來增強(qiáng)或拮抗Smurf蛋白。藥物靶包括但不限于(i)從編碼Smurf的基因獲得的分離核酸，和(ii)從Smurf多肽獲得的分離肽和多肽。
具體來說，鑒定分離的Smurf蛋白可用于開發(fā)篩選測定、尤其是用于高通量篩選上調(diào)或下調(diào)Smurf活性的分子，例如允許以高于天然來源分離量表達(dá)Smurf蛋白，或者利用特別工程改進(jìn)后指示轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞后從基因表達(dá)Smurf蛋白的活性的指示細(xì)胞。因此，本發(fā)明設(shè)計了應(yīng)用本領(lǐng)域已知的各種篩選測定鑒定Smurf蛋白特異性配體的方法。
本領(lǐng)域已知的任何篩選技術(shù)都可用于篩選Smurf蛋白的激動劑或拮抗劑。本發(fā)明設(shè)計了篩選小分子配體或配體類似物和模擬物以及篩選體內(nèi)結(jié)合并增強(qiáng)或拮抗Smurf蛋白的天然配體。例如可用本發(fā)明的測定篩選天然產(chǎn)物文庫中的增強(qiáng)或拮抗Smurf活性的分子。
對Smurf1和Smurf2的一級序列和與已知功能蛋白質(zhì)序列的相似性的了解為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了確定Smurf蛋白的抑制劑或拮抗劑的有用信息。例如采用X射線結(jié)晶照相術(shù)、中子衍射、核磁共振光譜測定法和其它結(jié)構(gòu)測定技術(shù)確定所述蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)一步有助于鑒定和篩選拮抗劑。這些技術(shù)可用于合理設(shè)計或鑒定激動劑和拮抗劑。
另一種方法采用重組噬菌體產(chǎn)生大文庫。采用“噬菌體法”(Scott和Smith，Science 249386-390，1990；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.，876378-6382，1990；Devlin等，Science，49404-406，1990)可構(gòu)建非常大的文庫(106-108個化學(xué)實體)。第二種方法主要使用化學(xué)方法，其中Geysen方法(Geysen等，Molecular Immunology 23709-715，1986；Geysen等，J.Immunologic Method 102259-274，1987)和Fodor等的方法(Science251767-773，1991)為實例。Furka等(14th International Congress ofBiochemistry，Volume #5，Abstract FR013，1988；Furka，Int.J.PeptideProtein Res.37487-493，1991)、Houghton(1986年11月授予的美國專利號4,631,211)和Rutter等(1991年4月23日授予的美國專利號5,010,175)介紹了產(chǎn)生肽混合物的方法，所述肽混合物作為激動劑或拮抗劑可進(jìn)行測試。
另一方面，合成文庫(Needels等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010700-4，1993；Ohlmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010922-10926，1993；Lam等，國際專利公布號WO92/00252；Kocis等，國際專利公布號WO9428028)等可用來按照本發(fā)明篩選Smurf配體。
從合成或天然化合物大文庫篩選受試化合物。目前眾多方法用來隨機(jī)和定向合成糖、肽和核酸型化合物。合成化合物文庫可在市場上從Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，NJ)、Brandon Associates(Merrimack，NH)和Microsource(New Milford，CT)購得。罕見化學(xué)文庫可從Aldrich(Milwaukee，WI)獲得。另一方面，細(xì)菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫可從例如Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)獲得，或者可以容易地產(chǎn)生。另外，天然和合成獲得的文庫和化合物通過常規(guī)化學(xué)、物理和生化方法(Blondelle等，Tib Tech，1460，1996)可以容易地改進(jìn)。
體外篩選方法在一個系列實施方案中，體外測試包含Smurf基因的分離核酸以序列特異性方式結(jié)合受試化合物的能力。該方法包括(i)提供包含相當(dāng)于整個或部分Smurf蛋白的特定序列的核酸；
(ii)使所述核酸在適合結(jié)合的條件下接觸多個受試化合物；以及(iii)鑒定選擇性結(jié)合所述核酸序列的化合物。
本文使用的選擇性結(jié)合是指任何結(jié)合參數(shù)如結(jié)合親合力、結(jié)合能力等的任何可檢測的差異。
在一個系列實施方案中，體外測試包含Smurf蛋白的分離肽或多肽或其片段以序列特異性方式結(jié)合受試化合物的能力。該篩選方法包括(i)提供相當(dāng)于Smurf蛋白或其片段的肽或多肽或其片段；(ii)使所述肽在適合結(jié)合的條件下接觸多個受試化合物；以及(iii)鑒定選擇性結(jié)合所述肽的化合物。
在優(yōu)選實施方案中，高通量篩選方法用來檢測大量受試化合物以序列特異性方式結(jié)合以上公開的基因或肽的能力。
體內(nèi)篩選方法表達(dá)編碼Smurf蛋白的基因變異體的完整細(xì)胞或整個動物可用于鑒定候選藥物的篩選方法。下列方法適用于正?；蛞吧蚐murf。
在一個系列實施方案中，從表達(dá)變異Smurf基因的個體建立永久細(xì)胞系。另一方面，通過導(dǎo)入合適載體使細(xì)胞(包括但不限于哺乳動物、昆蟲、酵母和細(xì)菌細(xì)胞)程序化表達(dá)包含一種或多種變異Smurf序列的基因?？刹捎萌魏魏线m測定鑒定候選化合物，所述測定包括但不限于(i)檢測受試化合物選擇性結(jié)合Smurf特定變異體的測定；(ii)檢測受試化合物改變(即抑制或增強(qiáng))Smurf的可檢測活性或功能的能力的測定；以及(iii)檢測一種化合物改變(即抑制或增強(qiáng))Smurf基因啟動子(即調(diào)節(jié))區(qū)衍生序列的轉(zhuǎn)錄活性的能力的測定。
在另一個系列實施方案中，制備轉(zhuǎn)基因動物，其中(i)使具有一個或多個突變的人Smurf穩(wěn)定地插入轉(zhuǎn)基因動物基因組中；和/或(ii)使內(nèi)源性Smurf基因失活而且代之以變異的人Smurf基因。參見例如Coffman，Semin.Nephrol.17404，1997；Esther等，Lab.Invest.74953，1996；Murakami等，Blood Press.增刊，236，1996。產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因動物的一種優(yōu)選方法是所謂的“敲入(knock-in)”技術(shù)，其中一種人基因可插入以代替內(nèi)源性基因調(diào)節(jié)元件表達(dá)控制下的內(nèi)源性基因(參見Rodriguez等，Cell，97199，1999)。這種動物可用候選化合物處理并監(jiān)測其BMP和TGFβ/活化素途徑的任何改變。
此外，選擇各種人群用于測試替代療法，所述人群不適合于已確立的用于組織或骨退化(例如骨質(zhì)疏松)或增強(qiáng)再生的療法。而且，可鑒定在普通人群中無效而對選定人群非常有效的療法，否則應(yīng)忽略。這是本發(fā)明特別有效的優(yōu)勢，因為它消除了與臨床試驗有關(guān)的一些隨機(jī)性。
高通量篩選方法通過高通量測定(包括但不限于細(xì)胞型或無細(xì)胞型測定)篩選可鑒定本發(fā)明藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，不同類型的測定可用來檢測不同類型的藥物。為了短期內(nèi)篩選數(shù)萬化合物，近年來開發(fā)了若干自動檢測方法。特別優(yōu)選這樣的高通量篩選方法。本發(fā)明提供的大量純化多肽的利用大大促進(jìn)了使用高通量篩選方法測試藥物。
報道基因Smad蛋白已經(jīng)鑒定為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)超家族各種成員的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中介體，TGFβ超家族成員影響細(xì)胞增殖、分化以及早期脊椎動物發(fā)育中的圖示形成。受體活化后，Smad裝配為途徑限制性Smad和共同的Smad4組成的異源聚合復(fù)合物，然后復(fù)合物轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，認(rèn)為所述復(fù)合物在核內(nèi)對基因轉(zhuǎn)錄起重要作用。在JunB基因啟動子中含有序列CAGACA的Smad結(jié)合元件(SBE)為TGFβ、活化素和骨形成蛋白(BMP)2強(qiáng)烈誘導(dǎo)的立即早期基因(Jonk等，J.Biol.Chem.，27321145，1998)。2個JunB SBE以反向重復(fù)排列，它在Smad3和Smad4共同過度表達(dá)作用下被反式激活，而且顯示誘導(dǎo)性結(jié)合TGFβ處理細(xì)胞的核提取物中含Smad3-和Smad4-復(fù)合物。Smad蛋白直接結(jié)合SBE。多聚SBE產(chǎn)生對活化素和BMP也起反應(yīng)的有效TGFβ誘導(dǎo)型增強(qiáng)子(參見例如Kim等，Nature，388304，1997)。
報道基因表達(dá)可與BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的任何組分的表達(dá)或激活聯(lián)系在一起。可使用本領(lǐng)域已知的任何報道基因。因此，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)分離具有SBE序列的核苷酸序列，并使其與報道基因有效連接，以確定Smurf及其衍生物和變異體是否改變所述啟動子的活性。另外，可使BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的其它已知基因如T1×2或Smad7與報道基因有效連接，所述已知基因具有受Smad1和5調(diào)節(jié)的啟動子。在這些測定中，可測試候選化合物改變表達(dá)Smad1、Smad5、Smad7、Smurf1或Smurf2、或其衍生物或變異體的細(xì)胞的BMP或TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。
各種報道基因測定法是已知的，而且可用于測定Smurf對BMP或TGFβ/活化素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。報道基因包括熒光素酶、β-半乳糖苷酶(β-gal或lac-Z)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。另外，采用特異性抗體可檢測幾乎任何蛋白的表達(dá)。例如綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)檢測允許檢測Smad誘導(dǎo)的SBE活性。已經(jīng)修飾了GFP以產(chǎn)生保留功能但是具有不同熒光特性的蛋白。若干美國專利指出，使用GFP顯示與誘導(dǎo)型啟動子的報道基因有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。例如參見美國專利號5,625,048(導(dǎo)致氨基酸變化的修飾GFP產(chǎn)生可見的不同顏色和強(qiáng)度增強(qiáng)的發(fā)光)、WO96/23898(編碼還含有酶識別位點的修飾GFP的構(gòu)建物)、WO97/11094(強(qiáng)度增強(qiáng)的熒光蛋白)、WO97/266333(優(yōu)化人源化GFP蛋白使哺乳動物細(xì)胞表達(dá)水平更高)、WO97/42320(熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的修飾GFP)、WO98/06737(以綠色和藍(lán)色熒光蛋白容易區(qū)分的修飾GFP)、WO98/21355(使用藍(lán)色和白色光激發(fā)的GFP突變體)。
篩選試劑盒可將實施上述篩選方法需要的組分制成方便使用者的試劑盒形式。這樣的試劑盒優(yōu)選適用于自動篩選儀器使用。鑒定Smurf結(jié)合配偶體除了Smad1、Smad7和Smad5以外，在再一實施方案中，本發(fā)明提供對Smurf結(jié)合配偶體的鑒定，然后可以分析導(dǎo)致BMP或TGFβ/活化素途徑介導(dǎo)的疾病的突變。一種鑒定這樣的結(jié)合配偶體的方法是酵母雙雜交系統(tǒng)，優(yōu)選使用造血干細(xì)胞文庫和重組Smurf轉(zhuǎn)化的酵母。另一方面，Smurf蛋白可用于例如利用內(nèi)源性產(chǎn)生Smurf的細(xì)胞親和純化細(xì)胞制品中的蛋白?？捎脴?biāo)記Smurf蛋白探測部分純化制品，以便例如以蛋白質(zhì)印跡型或其它抗體檢測型系統(tǒng)鑒定特異性結(jié)合配偶體(參見上述關(guān)于這種測定實例的抗體的說明；當(dāng)然可標(biāo)記任何抗體蛋白，然后檢測其與結(jié)合配偶體的結(jié)合)。
實施例參照以下實施例可以更好地了解本發(fā)明，以下實施例不是用來限制本發(fā)明。
實施例1Smurf1針對BMP途徑而且影響胚胎圖式形成TGFβ超家族調(diào)節(jié)各種生物過程，包括細(xì)胞生長、分化和圖式形成。任何TGFβ信號的失調(diào)均可能引起疾病?；罨疶GFβ受體的信號直接由Smad蛋白從受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)。目前確立了遍在蛋白-介導(dǎo)的降解和發(fā)育過程中的形態(tài)發(fā)生信號的調(diào)節(jié)之間的一些聯(lián)系。該實施例說明一種新的E3遍在蛋白連接酶Smurf1，它選擇性地與BMP途徑特異性Smad相互作用，使其遍在蛋白化、降解以及活性喪失。在兩棲動物胚胎中，Smurf1特異性阻斷BMP信號而影響圖式形成。因此，針對Smad的遍在蛋白化可以起控制胚胎發(fā)育和各種各樣對TGFβ信號的細(xì)胞反應(yīng)的作用。
方法酵母雙雜交篩選使爪蟾Smad1 cDNA(36)克隆入pGBT9載體，并用于使用爪蟾Smad1作為誘餌蛋白的酵母雙雜交方法(46)篩選爪蟾卵母細(xì)胞cDNA文庫(Clonetech)。分離以及使用部分cDNA篩選爪蟾階段9(囊胚)cDNA文庫，以獲得全長Smurf1 cDNA[SEQ ID NO1]。在EST數(shù)據(jù)庫中鑒定了編碼前8個氨基酸以外的所有部分的人Smurf1 cDNA(AA292123)，用其構(gòu)建人Smurf1。利用相應(yīng)的爪蟾Smurf1cDNA序列重建前8個氨基酸。在其N末端以FLAG標(biāo)記hSmurfcDNA。采用PCR型方法使丙氨酸取代半胱氨酸710，從而產(chǎn)生遍在蛋白連接酶突變型hSmurf1，通過測序證實了所述突變。
共免疫沉淀對于免疫沉淀測定，在其C末端以FLAG標(biāo)記爪蟾Smad1(36)、小鼠Smad4和人Smad2(47)，并在35S-Met存在下體外進(jìn)行翻譯(兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物；Promega)。使FLAG標(biāo)記Smad結(jié)合到抗FLAG抗體綴合的珠(Kodak)上，以co-IP緩沖液(10mM Tris，pH7.5，90mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton-X100，10％甘油，1mM苯甲基磺酰氟)洗滌，然后在相同緩沖液中與35S-Met標(biāo)記的Smurf1溫育。以co-IP緩沖液洗滌以及用凝膠加樣緩沖液洗脫后，通過SDS-PAGE分離蛋白，而且通過放射自顯影顯現(xiàn)。
胚胎方法和RT-PCR按照文獻(xiàn)所述(36，48)準(zhǔn)備胚胎、制備并注射合成mRNA入胚胎中、動物帽和腹側(cè)邊緣帶測定、分離胚胎RNA、固定胚胎和全樣載片原位雜交以及發(fā)育(develomental)RT-PCR。Smurf1RT-PCR引物為5’-GTCCTGTGACTGGAACCC-3’(有義)[SEQ ID NO5]和5’-GAGGACTGCTAGACAAT-3’(反義)[SEQ ID NO6]，其5’末端分別位于Smurf1 cDNA的482位和726位。
mSmurf1對胚胎和成年小鼠組織表達(dá)的mSmuff1進(jìn)行RNA印跡。分析等量的交配后7、11和15天的胚胎組織的PolyA+mRNA以及睪丸、腎臟、骨骼肌、肺、脾、腦和心臟組織樣品。對相同印跡檢測細(xì)胞骨架肌動蛋白的表達(dá)，證實mRNA荷載在所有檢測道相同。還對小鼠胚胎進(jìn)行了全樣載片原位雜交。
免疫沉淀和免疫印跡分別用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(GibroBRL)和硫酸鈣沉淀法(49)瞬時轉(zhuǎn)染COS-1和293T細(xì)胞。應(yīng)用抗Flag M2單克隆抗體(Sigma)、抗Smad1/5多克隆抗體(50)或抗WW2 Nedd4(51)多克隆抗體按照以前的文獻(xiàn)(50)所述進(jìn)行免疫沉淀和免疫印跡。采用合適HRP綴合山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗以及增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(Amersham)進(jìn)行檢測。
脈沖追蹤分析 如上所述轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后2天，以50μCi[35S]蛋氨酸/ml無蛋氨酸DMEM于37℃標(biāo)記細(xì)胞10分鐘(脈沖)。然后洗滌細(xì)胞層2次，在DMEM+10％FCS中溫育指定時間(追蹤)。在追蹤的各時間點，應(yīng)用抗Smad1多克隆抗體使以含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的TNTE裂解緩沖液(50mM Tris/HCl，pH7.4，150mM NaCl，0.5％Triton X-100和1mM EDTA)制備的細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀。通過SDS-PAGE分離免疫復(fù)合物并通過放射性自顯影顯現(xiàn)。使用磷圖象儀(Molecular Dynamics)定量各時間點存在的代謝標(biāo)記Smad1量。
遍在蛋白化測定 以HA標(biāo)記遍在蛋白、未標(biāo)記Smad1和上述Flag-hSmurf1或Flag-hSmurf1(C710A)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后2天，裂解細(xì)胞，使其進(jìn)行a-Smad1免疫沉淀。然后以TNTE+0.1％triton，SDS-RIPA(TNTE裂解緩沖液，0.1％十二烷基硫酸鈉和1％脫氧膽酸鹽)和500mM LiCl，50mM Tris/HCl，pH7.4以及0.1％triton序貫洗滌免疫沉淀物2次。SDS-PAGE后，以單克隆抗HA 12CA5抗體免疫印跡顯現(xiàn)免疫復(fù)合物中存在的HA遍在蛋白化Smad1。通過以合適抗體免疫印跡等份總細(xì)胞裂解物而分析未標(biāo)記Smad1、Flag-hSmurf1和Flag-hSmmf1(C710A)的蛋白水平。
結(jié)果分離與BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物Smad1相互作用的E3遍在蛋白連接酶為了分離作用于而且潛在調(diào)節(jié)Smad1的因子，我們采用爪蟾Smad1作為誘餌蛋白進(jìn)行了酵母雙雜交篩選。分離了若干種編碼與Hect亞類E3遍在蛋白連接酶(22)顯著同源的蛋白的重疊cDNA。這種新型基因和密切相關(guān)的人同源物(分別為Smurf1和hSmurf1)(對于Smad遍在蛋白化調(diào)節(jié)因子-1)，它們?yōu)?31個氨基酸長度的蛋白質(zhì)，共有91％序列同一性而且在所述分子的C末端部分含有Hect遍在蛋白連接酶結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域是哺乳動物含有的特定類型的E3遍在蛋白連接酶(22)E6-AP和Nedd4(在酵母為RSP5p和Pub1)(23-26)的特征。
鑒定人Smurf1基因組位置人Smurf1基因組克隆位于PAC克隆DJ0808A01，染色體區(qū)域為7q21.1-q31.1，核苷酸位置為2669..53763。對內(nèi)含子/外顯子剪接產(chǎn)物進(jìn)行計算機(jī)預(yù)測獲得了具有直接對應(yīng)于實際克隆人cDNA的可讀框的單一概念mRNA。
E3遍在蛋白連接酶與E1和E2酶一起作用使遍在蛋白與特定蛋白底物結(jié)合，其目的是隨后通過蛋白酶體降解所述蛋白(12)。E1酶募集并激活遍在蛋白，然后遍在蛋白轉(zhuǎn)移至E2即遍在蛋白綴合酶。E2再使遍在蛋白直接與所述蛋白連接以進(jìn)行修飾，或者E2將遍在蛋白轉(zhuǎn)移至E3遍在蛋白連接酶，E3遍在蛋白連接酶使底物選擇性地形成遍在蛋白化復(fù)合物。通過E3募集特定靶蛋白至綴合細(xì)胞器的作用，E3活性賦予遍在蛋白化過程具有選擇性。結(jié)構(gòu)功能各異的蛋白具有E3活性。例如E3可為多聚蛋白復(fù)合物，它有助于識別底物，但可能具有或可能不具有直接的連接酶活性。E3酶實例包括N-末端規(guī)則(end rule)E3和Skp1/Cullin/F-box(SCF)復(fù)合物(27-29)。如果是Hect家族E3遍在蛋白連接酶(Smurf1是其中一員)，單一蛋白既具有底物特異性又具有催化活性(22，30)。
Smurf1還具有若干其它結(jié)構(gòu)特征，這些特征是RSP5、Nedd4和Pub1遍在蛋白連接酶的特征。這樣的特征包括氨基末端磷脂和鈣結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域以及2個WW結(jié)構(gòu)域，WW結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合配偶體蛋白上PPXY基元而有助于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(31-33)?？偠灾?，Smurf1與Pub1關(guān)系最密切(圖1)，Pub1為釀酒酵母(Sacromyces pombe)遍在蛋白連接酶，它通過引導(dǎo)蛋白酶體降解cdc25而調(diào)節(jié)有絲分裂(23)。
mSmurf1在胚胎和成年組織中的表達(dá)mSmurf1的RNA印跡表明，約6kb的轉(zhuǎn)錄物是胚胎表達(dá)的Smurfl的主要形式(圖2A)。在成年組織中觀測到主要轉(zhuǎn)錄物為3.0和6.0kb(圖2B)。在相同印跡上檢測細(xì)胞骨架肌動蛋白表達(dá)，而且證實mRNA荷載在各檢測道相同。從小鼠胚胎至少第7天起，非常早的發(fā)育期就存在mSmurf1。在成年小鼠，mSmurf1在所檢測的大多數(shù)組織中表達(dá)，但是轉(zhuǎn)錄物豐度各不相同。我們在骨骼肌沒有觀測到可檢測的mSmurf1轉(zhuǎn)錄物，而腎臟和脾表達(dá)低水平的大轉(zhuǎn)錄物。小轉(zhuǎn)錄物在睪丸中含量非常豐富，在腎臟、肺、脾、腦和心臟表達(dá)非常弱或者根本沒有表達(dá)。通過在各檢測道加樣等量polyA+RNA而制備兩種印跡，但是為了解釋RNA荷載和轉(zhuǎn)移的任何變化，我們用微管蛋白探針探測了所述印跡，發(fā)現(xiàn)各道之間沒有顯著不同。因此，在印跡中觀測到變化反映了mSmurf1在胚胎和組織中的相對表達(dá)。
對小鼠胚胎進(jìn)行的全樣載片原位雜交提示，Smurf1在神經(jīng)系統(tǒng)、眼、腮弓、軸中胚層(脊索)、體節(jié)和交配后10-14天的肢芽中表達(dá)。
爪蟾Smurf1定位到卵動物極和胚胎外胚層在爪蟾胚胎發(fā)育中，發(fā)現(xiàn)從卵至游泳蝌蚪期均表達(dá)Smurf1 mRNA，在卵、囊胚和原腸胚期的發(fā)育早期觀測到最高表達(dá)水平。接近原腸胚末期Smurf1水平銳減，再以低水平合子表達(dá)至晚期游泳蝌蚪期(圖3A)。全樣載片原位雜交(圖3B)顯示，母源性Smurf1轉(zhuǎn)錄物定位于卵和卵裂囊胚(cleavingblastulae)的動物極半球，這通過對分離自囊胚中期胚胎的動物極半球和植物極半球的RNA進(jìn)行RNA印跡分析(未顯示)得到證實。在原腸胚時，Smurf1表達(dá)在胚胎中更廣泛，同時RT-PCR觀測到其轉(zhuǎn)錄水平下降。然而，神經(jīng)板閉合時，Smurf1表達(dá)定位于正在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)，到蝌蚪期時，Smurf1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼、咽囊和體節(jié)中高度表達(dá)。Smurf1的胚胎表達(dá)模式與囊胚和原腸胚期外胚層以及與蝌蚪期的神經(jīng)系統(tǒng)、眼、體節(jié)和咽囊中的Smad1和BMP-4表達(dá)部分重疊(34-36)。
hSmurf1表達(dá)導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞Smad1和Smad5的穩(wěn)態(tài)蛋白水平選擇性下降Smurf1含有推定E3連接酶或Hect結(jié)構(gòu)域，因此它為作用于Smad1的候選蛋白。為了研究Smurf1是否調(diào)節(jié)Smad1蛋白穩(wěn)態(tài)水平，單獨(dú)用Smad1或與遞增量Flag-hSmurf1一起轉(zhuǎn)染2種哺乳動物細(xì)胞系293T和COS-1。然后用全細(xì)胞裂解物的免疫印跡評價Smad1蛋白穩(wěn)態(tài)水平。缺乏hSmurf1時很容易地檢測到Smad1(圖4A)。然而，hSmurf1表達(dá)即使在蛋白質(zhì)印跡不能很容易檢測到的低水平時，也導(dǎo)致Smad1蛋白水平劑量依賴性顯著下降。hSmurf1表達(dá)最高水平時，沒有檢測到Smad1蛋白。此外，使Smad1磷酸化(37，38)的組成活化I型BMP受體ALK6共表達(dá)不能改變Smad1水平的hSmurf1依賴性下降(圖4B)。因此，hSmurf1表達(dá)引起Smad1穩(wěn)態(tài)水平劑量依賴性下降。這種作用可獨(dú)立于I型BMP受體激活Smad1。
為了研究Smurf1活性是否對Smad1是獨(dú)有的，我們研究了其對Smad2的作用，Smad2是受體調(diào)節(jié)性Smad，它在TGFβ和活化素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用。與對最低劑量hSmurf1敏感的Smad1不同的是，hSmurf1對Smad2蛋白穩(wěn)態(tài)水平只有略微影響，這種低微影響只在最高水平的Flag-hSmurf1表達(dá)時才存在(圖4C)。還測試了其它SmadFlag-hSmurf1對Smad3或Smad4蛋白水平幾乎沒有作用，但是它使Smad5蛋白顯著下降，Smad5蛋白與Smad1密切相關(guān)(圖4D)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)證實hSmurf1優(yōu)選調(diào)節(jié)Smad1和Smad5穩(wěn)態(tài)水平，Smad1和Smad5是在BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用的兩種受體調(diào)節(jié)性Smad。
hSmurf1調(diào)節(jié)Smad1降解和遍在蛋白化 Smurf1包括推定E3連接酶或Hect結(jié)構(gòu)域支持這樣的預(yù)測Smurf1起E3遍在蛋白連接酶的作用。為了研究Smurf1是否調(diào)節(jié)Smad降解，各種研究集中于Smad1(與Smad5的同源性為91％)。應(yīng)用脈沖追蹤實驗分析Smad1轉(zhuǎn)化顯示，缺乏hSmurf時，Smad1的半衰期約6小時。然而存在hSmurf1時，Smad1轉(zhuǎn)化顯著增強(qiáng)(半衰期低于2小時)(圖5A)。因此，hSmurf1增強(qiáng)Smad1轉(zhuǎn)化速率。
為了確定hSmurf1介導(dǎo)的Smad1轉(zhuǎn)化機(jī)制，評價了完整細(xì)胞中的Smad1遍在蛋白化。為了有助于檢測遍在蛋白，用HA標(biāo)記遍在蛋白和Smad1一起在存在或缺乏Flag-hSmurf1下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。缺乏hSmurf1時，Smad1幾乎沒有可檢測的遍在蛋白化。然而，與hSmurf1共轉(zhuǎn)染時，我們觀測到出現(xiàn)遍在蛋白綴合Smad1梯(圖5B)。為了證實Smad1遍在蛋白化需要hSmurf1 Hect結(jié)構(gòu)域的催化活性，在hSmurf1中構(gòu)建點突變(hSmurf1(C710A))。該殘基對Hect結(jié)構(gòu)域催化活性是關(guān)鍵性的，認(rèn)為該突變針對與遍在蛋白形成硫羥酸酯鍵的半胱氨酸殘基(22)。與野生型hSmurf1相反，hSmurf1(C710A)表達(dá)不會產(chǎn)生遍在蛋白化Smad1。而且與野生型hSmurf1相比，hSmurf1(C710A)不影響Smad1穩(wěn)態(tài)蛋白水平，盡管有效表達(dá)了突變蛋白(圖5C)?？傊?，這些數(shù)據(jù)提示，hSmurf1通過其Hect結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)遍在蛋白介導(dǎo)的Smad1降解而改變Smad1穩(wěn)態(tài)水平。
Smurf1在體內(nèi)選擇性作用于Smad1和Smad5 研究了Smurf1與Smad蛋白作用，以評價Smurf1降解Smad1和Smad5的選擇性靶向的基本原理。首先應(yīng)用酵母雙雜交測定測試爪蟾Smurf1與Smad1、Smad4或非特異性對照蛋白核纖層蛋白作用的能力。Smurf1和Smad1共轉(zhuǎn)染的酵母具有顯著的β半乳糖苷酶活性；Smurf1和Smad4或核纖層蛋白共轉(zhuǎn)染酵母不顯示β半乳糖苷酶活性(圖6A，左側(cè))。按照35S-標(biāo)記Smurf1體外結(jié)合并免疫沉淀Smad的能力顯示，Smurf1選擇性結(jié)合Smad1，而不結(jié)合Smad2或Smad4(圖6A，右側(cè))。
為了測試35S-標(biāo)記的Smurf1體外結(jié)合并免疫沉淀Smad的能力，研究了完整細(xì)胞中Smurf1與Smad相互作用的特異性、在293T細(xì)胞中hSmurf1與各種Smad的締合。沒有檢測到野生型hSmurf1與Smad1的相互作用。但是可能在完整細(xì)胞中Smurf1與Smad1相互作用實際上是瞬時性的，因為用其它系統(tǒng)證明了難以證實遍在蛋白連接酶和其底物締合。通過檢測Smad1與遍在蛋白連接酶突變體Flag-HSmurf1(C710A)的相互作用，能夠檢測到所述蛋白的締合(圖6B、C)。而且，這種相互作用不受組成活性I型BMP受體ALK2的共表達(dá)的影響(未顯示數(shù)據(jù))，這與hSmurf1調(diào)節(jié)Smad1轉(zhuǎn)化獨(dú)立于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的看法一致。HSmurf1(C710A)還有效結(jié)合Smad5，但是分析它與Smad2的締合揭示，如果存在相互作用的話，也是非常微弱的(圖6A和B)。
R-Smad接頭區(qū)含有PPXY序列，PPXY序列是如見于Smurf1的WW結(jié)構(gòu)域識別的保守基元。與野生型Smad1不同，其中缺失PY基元的Smad1突變體只與Smurf1微弱締合，并抵抗Smurf1介導(dǎo)的降解作用(資料未顯示)。這些結(jié)果表明，hSmurf1與Smad1和Smad5特異性締合，這種相互作用由Smad1 PY基元和Smurf1 WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合介導(dǎo)。
通過比較hSmurf1與一種結(jié)構(gòu)相關(guān)遍在蛋白連接酶Nedd4的關(guān)系，進(jìn)一步測試了hSmurf1作為遍在蛋白連接酶針對Smad的特異性。盡管Smad1與hSmurf(C710A)有效共沉淀，但是它不作用于相應(yīng)的Nedd4突變體。與此一致的是，過度表達(dá)的Nedd4不影響Smad1蛋白穩(wěn)態(tài)水平(圖6C，下圖)?？傊@些數(shù)據(jù)說明，人Smurf1蛋白和爪蟾Smurf1蛋白二者選擇性與BMP調(diào)節(jié)的Smad1和Smad5締合，而且這種作用是Smurf1獨(dú)有的，而不是Hect類遍在蛋白連接酶的一般特征。
Smurf1拮抗爪蟾胚胎中的內(nèi)源性BMP信號，使腹中胚層背面化和外胚層神經(jīng)化在爪蟾囊胚中，Smurf1表達(dá)定位于動物極外胚層并部分重疊邊緣帶，即一個細(xì)胞帶位于形成中胚層的囊胚中緯線。這種表達(dá)模式與Smurf1作用于BMP途徑特異性Smad、使其遍在蛋白化和降解的能力綜合考慮，說明Smurf1通過Smad1或Smad5拮抗BMP信號而影響外胚層和中胚層圖式形成。
目前在配體水平介紹了TGFβ活性的天然抑制劑。這些因子包括chordin、濾泡素抑制素和頭蛋白，它們通過結(jié)合特定配體(包括BMP和活化素)在細(xì)胞外發(fā)揮作用。爪蟾中胚層誘導(dǎo)和圖式形成時，邊緣帶腹側(cè)部的BMP信號使組織發(fā)育特化，例如血液和間充質(zhì)，這是蝌蚪期腹側(cè)區(qū)的特征。然而，如果BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被配體拮抗劑如chordin、濾泡素抑制素或頭蛋白(背部Spemann組織導(dǎo)體分泌)或被人工抑制劑如顯性失活的BMP配體或受體阻斷，則預(yù)期的腹中胚層分化為背部組織如肌肉和脊索(一種稱為“背面化”的過程)(5，39)。
Smurf1具有調(diào)節(jié)邊緣帶BMP信號的潛力，因此測試了異位Smurf1表達(dá)對腹側(cè)組織圖式形成的干擾。將Smurf1 mRNA于腹側(cè)邊緣帶(VMZ)顯微注射入4細(xì)胞c胚期胚胎，以期在52％蝌蚪期胚胎(n＝25)腹側(cè)區(qū)激發(fā)形成異位第二個軸結(jié)構(gòu)。這些Smurf1誘導(dǎo)的第二軸結(jié)構(gòu)是BMP抑制引起的背面化特征。其形成可通過Smad1和Smurf1一起共表達(dá)得到挽救，證實Smurf1作用限于干擾BMP/Smad1途徑(圖7A)。此外，Smurf1在形成頭和背軸結(jié)構(gòu)的背部邊緣帶(DMZ)細(xì)胞中的過度表達(dá)沒有任何影響(資料未顯示)。后一觀測結(jié)果與本發(fā)明前面關(guān)于Smurf1不針對培養(yǎng)細(xì)胞中的Smad2的發(fā)現(xiàn)一致。
進(jìn)一步用VMZ移植物特征鑒定了Smurf1的背面化作用。在此情況下，Smurf1表達(dá)引起血液分化減弱和伴隨的肌肉分化減弱，與Smurf1背面化作用一致(圖7A，右圖)。與軸形成測定一樣，Smad1和Smurf1共表達(dá)逆轉(zhuǎn)這些背化作用，證實了其BMP途徑特異性。
在外胚層中，內(nèi)源性BMP表達(dá)特化表皮，但是當(dāng)BMP信號減弱或消除時，外胚層分別分化為膠粘腺或神經(jīng)組織(40，41)。Smurf1mRNA定位于爪蟾囊胚和早期原腸胚的外胚層，說明Smurf1可以通過調(diào)節(jié)BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而調(diào)節(jié)外胚層的圖式形成。所以，測試了Smurf1在外胚層組織中的存在情況。發(fā)現(xiàn)Smurf1在動物帽中的過度表達(dá)引發(fā)神經(jīng)和膠粘腺分化，這是BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱的特征。這些作用可以被在動物帽中共表達(dá)Smad1逆轉(zhuǎn)(圖7B)。綜合這些結(jié)果證實，Smurf1可阻斷外胚層和中胚層的BMP信號，提示Smurf1減弱這些組織的BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而影響胚胎圖式形成。
Smurf1抑制胚胎細(xì)胞的Smad1活性但是增強(qiáng)Smad2活性 在培養(yǎng)細(xì)胞中Smurf1激發(fā)BMP途徑特異性Smad遍在蛋白化和降解，而在爪蟾胚胎中Smurf1拮抗內(nèi)源性BMP信號。在爪蟾動物帽中，過量表達(dá)Smad模擬通過特異性R-Smad轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的TGFβ因子的作用。因此，Smad1專一性誘導(dǎo)腹側(cè)/后中胚層，如BMP配體，而Smad2誘導(dǎo)背中胚層(Spemann組織導(dǎo)體)，如活化素、Vgl和nodal。所以，我們測試了Smurf1是否能夠通過在動物帽中過量表達(dá)各Smad和不同量的Smurf1而直接拮抗Smad1或Smad2誘導(dǎo)中胚層的活性。我們發(fā)現(xiàn)，按照表達(dá)腹側(cè)/后中胚層標(biāo)記物Xhox3和Xcad1顯示，只表達(dá)Smad1(1ng mRNA)誘導(dǎo)腹中胚層。但是，Smurf1和Smad1共表達(dá)在所測試的全部Smurf1劑量均阻礙誘導(dǎo)這些標(biāo)記物(圖8A)，證實Smurf1可拮抗Smad1活性。
為了確定Smurf1是否能夠干擾Smad2，使用以足夠誘導(dǎo)myoD(背部/側(cè)中胚層的脊椎動物肌肉標(biāo)志物)但是不足以誘導(dǎo)goosecoid(Spemann組織導(dǎo)體背中胚層的青蛙標(biāo)志物)的Smad2劑量(50pgmRNA)(圖7B、C)。當(dāng)Smurf1與Smad2共表達(dá)時，在所測試的任何Smurf1劑量均不抑制myoD誘導(dǎo)(圖8B)。這與Smurf1不針對Smad2的其它發(fā)現(xiàn)一致。有趣的是，在存在該限制量的Smad2(50pg)的情況下隨著Smurf1的劑量增加，觀測到誘導(dǎo)的goosecoid基因表達(dá)。這種誘導(dǎo)對Smad2表達(dá)是依賴性的，因為單獨(dú)的Smurf1不誘導(dǎo)goosecoid。在限制Smad2存在下帽細(xì)胞對遞增量的Smurf1的反應(yīng)類似于對單獨(dú)的Smad2劑量增加的反應(yīng)(圖8C)。因此，50pg Smad2和100pg Smurf1聯(lián)合誘導(dǎo)goosecoid表達(dá)的水平等于單獨(dú)的Smad2劑量升高5倍(250pg)的水平(圖8C)。因此，Smurf1似乎不是抑制Smad2活性，而是增強(qiáng)動物帽對Smad2的敏感性。這些實驗證實，Smurf1除了阻礙動物極細(xì)胞對BMP途徑的反應(yīng)之外，還增強(qiáng)這些細(xì)胞對活化素途徑的反應(yīng)。盡管本發(fā)明不依賴于任何具體機(jī)制，但是本發(fā)明人提出，Smurf1介導(dǎo)的動物極細(xì)胞反應(yīng)性改變緣于通過Smurf1底物Smad1和Smad5的針對性遍在蛋白化引起的內(nèi)源性BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱。因而，Smurf1在發(fā)育過程中發(fā)揮作用，以通過選擇性失活特定Smad途徑而改變細(xì)胞對多種TGFβ配體的反應(yīng)能力。
討論本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)使人們清楚了解了選擇性遍在蛋白化在調(diào)節(jié)發(fā)育圖式形成中的作用、途徑和機(jī)制。所提供的實施例證實，TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受控于Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的遍在蛋白化，而且這種活性影響發(fā)育。準(zhǔn)確地說，證實一種Hect家族E3遍在蛋白連接酶Smurf1選擇性直接作用于BMP途徑特異性Smad即Smad1和Smad5，引起其遍在蛋白化和降解。然而，Smurf1不作用于或影響TGFβ/活化素途徑特異性Smad2，也不影響Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物中的共同配偶體Smad4。此外，Hect遍在蛋白連接酶針對Smad不是E3連接酶的一般特征，因為Nedd4不作用于Smad。有趣的是，所述結(jié)果表明，Smurf1介導(dǎo)的Smad轉(zhuǎn)化不受BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，提示活化型Smad1或Smad5不需要用作Smurf1的底物。因此，Smurf1不在活化Smad下游起作用而轉(zhuǎn)變BMP信號，而是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞Smad蛋白穩(wěn)態(tài)水平而控制細(xì)胞對BMP的反應(yīng)能力。
mSmurf1基因在發(fā)育早期就表達(dá)，我們預(yù)測此時mSmurf1調(diào)節(jié)細(xì)胞對BMP信號的反應(yīng)。Smurf1存在于成年組織，預(yù)示mSmurf1調(diào)節(jié)晚期BMP信號。可能這些信號在組織停滯或者可能與生長有關(guān)的繼續(xù)分化中發(fā)揮作用。神經(jīng)胚期和此后的小鼠發(fā)育中高度表達(dá)Smurf1與在相似階段的青蛙胚胎中觀測到的表達(dá)模式非常一致。
Smurf1在爪蟾胚胎中的表型效應(yīng)指出，選擇性遍在蛋白化在胚胎發(fā)育過程為誘導(dǎo)信號的重要調(diào)節(jié)劑。Smurf1通過干擾在正常發(fā)育中控制中胚層和外胚層圖式形成的BMP信號而使中胚層背面化和外胚層神經(jīng)化。目前認(rèn)為通過分泌型BMP結(jié)合蛋白如chordin、頭蛋白和濾泡素抑制素調(diào)節(jié)BMP依賴性圖式形成，分泌型BMP結(jié)合蛋白通過直接結(jié)合BMP配體而抑制細(xì)胞外BMP信號。然而，Smurf1提供了調(diào)節(jié)BMP信號的一種新機(jī)制，Smurf1在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平起作用，而且推測Smurf1自然影響細(xì)胞，因為Smurf1是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白。此外，與具有限制性配體特異性的分泌型BMP結(jié)合蛋白不同的是，Smurf1對BMP途徑產(chǎn)生廣泛抑制活性，因為許多I型受體(ALK、ALK2、ALK3和ALK6)通過Smad1和Smad5轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(42)。因此，在胚胎發(fā)育過程中，Smurf1與細(xì)胞外BMP抑制劑協(xié)同作用特化圖式形成。Smurf1是否受某種方式的調(diào)節(jié)仍然是一個未解決的問題。
特別令人關(guān)注的是，Smurf1 mRNA定位于爪蟾卵和囊胚動物極。該區(qū)形成外胚層組織，例如表皮、膠粘腺和神經(jīng)系統(tǒng)，組織命運(yùn)由細(xì)胞感知的BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平控制。當(dāng)動物極外胚層沒有接受內(nèi)源性BMP信號時，神經(jīng)分化自然發(fā)生，但是當(dāng)施加于細(xì)胞的BMP配體水平或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Smad1量逐漸增加時，細(xì)胞命運(yùn)譜從神經(jīng)通過膠粘腺進(jìn)行性特化為表皮。此外，爪蟾胚胎的預(yù)期腹中胚層BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱導(dǎo)致該組織重新特化為背中胚層。因為Smurf1可調(diào)節(jié)細(xì)胞對BMP信號的反應(yīng)性，所以它可以通過控制Smad1或Smad5水平而影響外胚層和中胚層命運(yùn)特性。高水平Smurf1可以完全阻斷細(xì)胞對BMP的反應(yīng)能力，但是中度或低水平Smurf1可以通過控制Smad1蛋白水平調(diào)節(jié)BMP信號強(qiáng)度，從而改變細(xì)胞反應(yīng)的性質(zhì)。結(jié)果Smurf1可以通過建立細(xì)胞內(nèi)形態(tài)發(fā)生梯度的Smad1活性而控制BMP作用下的細(xì)胞命運(yùn)決定。在各種動物中，定位在卵中的母源mRNA起細(xì)胞命運(yùn)決定子的作用(43)。在爪蟾中，編碼Vg1(一個TGFβ成員)和Brat/VgT的mRNA定位于卵植物極，在此它們特化內(nèi)胚層和中胚層(44，45)。該實施例提供的結(jié)果說明，卵動物極中局限化Smurf1可能起外胚層細(xì)胞命運(yùn)決定子的作用。
Smurf1在爪蟾動物帽中過量表達(dá)的一個有趣結(jié)果是改變細(xì)胞對Smad2的反應(yīng)能力，Smad2是活化素/TGFβ途徑特異性Smad。Smurf1增強(qiáng)細(xì)胞對固定水平異位表達(dá)的Smad2的敏感性，因此隨著Smurf1水平升高，誘導(dǎo)的中胚層進(jìn)行性成為更特征化的Spemann組織導(dǎo)體—最常見的背型中胚層。這種反應(yīng)類似于當(dāng)動物帽中單獨(dú)的Smad2水平升高時發(fā)生的影響。因此，Smurf1可同時改變細(xì)胞對不同TGFβ信號的反應(yīng)能力它抑制對Smad1途徑的反應(yīng)，而刺激對Smad2途徑的反應(yīng)。Smurf1對不同TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的各不相同的作用對胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長、組織停滯和TGFβ超家族調(diào)節(jié)的其它生物功能產(chǎn)生重要影響。
實施例2人Smurf2的特征鑒定和克隆應(yīng)用EST數(shù)據(jù)庫中的爪蟾Smurf1序列鑒定和克隆人Smurf2。獲得2個對應(yīng)于hSmurf2的重疊EST克隆，用其構(gòu)建hSmurf2的全長序列。Smurf2與Smurf1密切相關(guān)，與hSmurf1氨基酸序列的同源性約為75％。Smurf2含有一個氨基末端C2結(jié)構(gòu)域，其后為3個WW結(jié)構(gòu)域和一個HECT遍在蛋白連接酶結(jié)構(gòu)域(圖12)。Smurf2與Smurf1密切相關(guān)，但是C2結(jié)構(gòu)域下游具有一個額外WW結(jié)構(gòu)域(圖13)。發(fā)現(xiàn)Smurf2在整個發(fā)育早期表達(dá)，而且存在于大多數(shù)成年組織中，在脾和骨骼肌中的水平較低(圖14A和圖14B)。RT-PCR分析進(jìn)一步顯示，Smurf2在包括P19、HepG2和293T在內(nèi)的各種細(xì)胞系中表達(dá)。
分離人Smurf2和小鼠Smurf2從表達(dá)序列標(biāo)記(EST)數(shù)據(jù)庫中鑒定了若干個與Smurf1具有相似性的重疊人克隆，采用2個重疊EST克隆通過PCR構(gòu)建全長型Smurf2。對于RNA印跡分析，在EST數(shù)據(jù)庫中鑒定了編碼包含終止密碼子的可讀框的225個氨基酸而且與人Smurf2的氨基酸同一性為96％的小鼠部分Smurf2 cDNA克隆(I.M.A.G.E.克隆ID 638876)。
構(gòu)建質(zhì)粒 對于Smurf2的哺乳動物表達(dá)構(gòu)建物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增可讀框，使其按讀框亞克隆入具有氨基末端Flag或Myc標(biāo)記的pCMV5(69)。關(guān)于Smurf2 WW結(jié)構(gòu)域缺失，DWW1缺失氨基酸163-185，DWW2缺失氨基酸257-279，而DWW3缺失氨基酸303-325。為了產(chǎn)生催化活性喪失的Smurf2遍在蛋白連接酶突變體，以丙氨酸代替半胱氨酸716。為了產(chǎn)生Smad7 PY突變體，以丙氨酸代替酪氨酸211(Y211A)，或者缺失氨基酸殘基206-212之間的PPPPY序列(APY)。對于TβRI-Flag，F(xiàn)lag標(biāo)記導(dǎo)入受體的羧基末端。所有構(gòu)建物通過PCR制備而且經(jīng)測序證實。利用常規(guī)限制位點制備細(xì)菌表達(dá)載體pET15-Smad7-HA和pGEX4T-1-Smuf2。
免疫沉淀、免疫印跡和親和標(biāo)記 關(guān)于哺乳動物細(xì)胞的研究，分別用磷酸鈣沉淀或DEAE葡聚糖法瞬時轉(zhuǎn)染293T和COS-1細(xì)胞。應(yīng)用抗HA單克隆抗體(12CA5，Boehringer)、抗HA兔多克隆抗體(SantaCruz)、抗Myc單克隆抗體(9E10腹水，Developmental Studies HybridomaBank)、抗Flag M2單克隆抗體(Sigma)或抗Smad7兔多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀和免疫印跡。關(guān)于抗Smad7抗體，以編碼氨基酸202-260的細(xì)菌產(chǎn)生的GST-Smad7免疫兔。在抗體吸附到G蛋白或A-Sepharose后，用TNTE 0.1％(50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，0.1％Triton X-100)洗滌沉淀物5次，通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上，以合適抗體免疫印跡。采用合適的辣根過氧化物酶(HRP)綴合的綿羊抗小鼠或抗兔二抗和加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(Amersham)進(jìn)行檢測。使細(xì)菌產(chǎn)生的His-Smad7-HA與Ni2+-NTA珠(Qiagen)或GST或GST-Smurf2-結(jié)合谷胱甘肽珠(Amersham)溫育，以TNTE(0.5％Triton X-100)洗滌3次，以抗HA抗體通過免疫印跡分析沉淀物。對于親和標(biāo)記，使轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞與250pM[125I]TGF-b1于4℃溫育1小時，按照文獻(xiàn)所述(70)以DSS使受體與配體交聯(lián)。通過磷成象(Molecular Dynamics)定量結(jié)合Smurf2或Smad7的TβRI量。
脈沖追蹤分析和遍在蛋白化測定 用指定構(gòu)建物轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后2天用50mCi/ml[35S]蛋氨酸(Trans[35S]-標(biāo)記物；圖2B)或150mCi/ml[35S]蛋氨酸(圖5C和D)在無蛋氨酸的Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中于37℃標(biāo)記所述細(xì)胞15分鐘。然后洗滌細(xì)胞層2次，在存在或缺乏30mM lactacystin(得自E.J.Corey，HarvardUniversity)或0.4mM氯喹下在含有10％胎牛血清的DMEM中溫育指定時間。在各時間點，以抗HA單克隆抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物，經(jīng)SDS-PAGE分離并通過放射自顯影顯示。應(yīng)用磷成象定量代謝標(biāo)記的蛋白質(zhì)。關(guān)于遍在蛋白化測定，以HA標(biāo)記遍在蛋白以及組合受體Smad7和Smurf2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。使細(xì)胞裂解物進(jìn)行抗Smad7免疫沉淀，將免疫沉淀物在1％SDS中煮沸5分鐘，以0.1％TNTE稀釋，用抗Smad7抗體再沉淀后，進(jìn)行抗HA免疫印跡。
應(yīng)用免疫熒光去卷積(deconvolution)顯微鏡檢查進(jìn)行亞細(xì)胞定位 用指定構(gòu)建物通過磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染平鋪在明膠包被的Permanox小室片(Nunc)上的Mv1Lu細(xì)胞。按照文獻(xiàn)所述(69)對細(xì)胞進(jìn)行固定、透化處理和與一抗和二抗反應(yīng)。應(yīng)用配置熒光部件和DeltaVision去卷積顯微鏡檢查軟件的Olympus 1X70倒置顯微鏡(Applied Precision)獲取圖象。
轉(zhuǎn)錄反應(yīng)測定 以指定的CMV-βgal、3TP-Lux報道構(gòu)建物和Smad7-HA構(gòu)建物利用磷酸鈣DNA沉淀法瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。通過加入pCMV5空載體保持總DNA恒定。次日，用或不用100pM TGFβ溫育細(xì)胞過夜。以Berthold Lumat LB 96V發(fā)光計利用熒光素酶檢測系統(tǒng)(Promega)檢測熒光素酶活性，而且使其對β-半乳糖苷酶活性歸一化。
結(jié)果Smurf2不調(diào)節(jié)Smad穩(wěn)態(tài)水平 在缺乏或存在Smurf2下293T細(xì)胞表達(dá)Smad。意外的是，與針對Smad1導(dǎo)致遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白酶解的Smurf1不同，Smurf2表達(dá)不改變Smad1、2、4或7的穩(wěn)態(tài)水平(圖15A)。為了確定Smurf2是否可與這些Smad中的任何一種締合，用細(xì)胞裂解物進(jìn)行抗Smurf2免疫沉淀，而且通過免疫印跡檢測締合Smad。在共表達(dá)Smad1、2或4的細(xì)胞中，沒有發(fā)現(xiàn)任何Smad在這樣的條件下與Smurf2共沉淀(圖15B)。相反，在表達(dá)Smad7的細(xì)胞中，檢測到Smurf2和Smad7之間的強(qiáng)烈相互作用。為了證實Smurf2表達(dá)不會改變Smad7轉(zhuǎn)化，我們還對Smad7進(jìn)行了脈沖追蹤分析。在缺乏或存在Smurf2下表達(dá)的Smad7的半衰期相似，約4小時(圖15C)。為了特征鑒定Smad7-Smurf2締合，從細(xì)菌純化GST-Smurf2融合蛋白，使其與細(xì)菌產(chǎn)生的Smad7溫育。在這樣的體外條件下，Smad7有效結(jié)合Smurf2，說明Smurf2直接與Smad7締合(圖15D)。我們還分析介導(dǎo)其相互作用的Smad7和Smurf2上的決定因子。Smad7在其接頭區(qū)具有PPXY序列(PY基元)，PPXY序列可介導(dǎo)與WW結(jié)構(gòu)域如見于Smurf2的WW結(jié)構(gòu)域的相互作用(71)。Smad7 PY基元也可以通過使酪氨酸殘基改變?yōu)楸彼?Smad7(Y211A))或者通過缺失整個基元(Smad7(ΔPY))而改變。Smurf2結(jié)合任一種Smad7突變體的293T細(xì)胞分析顯示，與Smurf2的相互作用減弱，但是并沒有完全消除(圖15E)。說明PY基元對Smad7-Smurf2相互作用產(chǎn)生重要影響，但是不是唯一決定因子，Smad7其它區(qū)也對其締合起一定作用。我們還制備了其中3個WW結(jié)構(gòu)域中各個結(jié)構(gòu)域缺失的Smurf2突變體。Smad7與缺乏第一個WW結(jié)構(gòu)域的Smurf2突變體的作用與野生型Smurf2相當(dāng)，然而缺失WW2或WW3任何一個均消除與Smad7的任何可檢測的作用(圖15F)。因此，介導(dǎo)與Smad7結(jié)合同時需要Smurf2的WW2和WW3兩個結(jié)構(gòu)域?？傊?，這些結(jié)果說明，Smurf2通過WW2和WW3結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合Smad7，但是在缺乏TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下它不會對Smad7產(chǎn)生遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白酶解。
Smad7使Smurf2寡集到與TGFβ受體的復(fù)合物中 Smad7通過與活化I型受體亞單位相互作用結(jié)合TGFβII型(TβRII)和I型(TβRI)受體的異源聚合復(fù)合物(72，56)。因此Smad7和Smurf2的組成型締合產(chǎn)生非常有趣的可能性Smad7可能起募集Smurf2至TGFβ受體復(fù)合物的作用。為了測試此種可能性，我們在存在和缺乏Smad7和Smurf2的情況下在COS-1細(xì)胞中表達(dá)FTGβ受體。然后通過與[125I]-TGFβ交聯(lián)而標(biāo)記受體。經(jīng)自顯影顯現(xiàn)與Smuff2共沉淀的親和標(biāo)記受體復(fù)合物。缺乏或存在Smad7時，發(fā)現(xiàn)幾乎沒有TGFβ受體復(fù)合物與野生型Smurf2共沉淀(圖16)。用Smurf2構(gòu)建Smurf2催化突變體，其中半胱氨酸716轉(zhuǎn)化為丙氨酸殘基(C716A)。該突變針對HECT遍在蛋白連接酶結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基，認(rèn)為該半胱氨酸殘基與遍在蛋白形成硫羥酸酯鍵。當(dāng)只表達(dá)Smurf2(C716A)時，我們檢測到與TGFβ受體的輕微相互作用(圖16)。然而，在存在Smad7時，Smuff2(C716A)與所述受體的作用顯著增強(qiáng)。因而Smad7介導(dǎo)Smurf2與TGFβ受體相互作用。
我們還檢測了與所述受體結(jié)合的Smad7。Smad7通過與活化I型受體亞單位作用而結(jié)合異源聚合TGFβ受體復(fù)合物(72，56)。存在野生型Smurf2時，我們觀測到與Smad7共沉淀的TGFβ受體復(fù)合物量顯著降低(圖16，第3道)。這與這些轉(zhuǎn)染體存在的I型受體總量降低有關(guān)。因為Smad7通過與活化I型受體的作用而結(jié)合受體復(fù)合物，所以這些結(jié)果說明Smurf2降低Smad7結(jié)合受體復(fù)合物的水平。與該觀點一致的是，當(dāng)Smad7與Smurf2催化性失活的突變體共表達(dá)時，沒有觀測到Smad7結(jié)合受體水平下降(圖16，第5道)。這些結(jié)果說明，Smurf2催化活性介導(dǎo)與Smad7結(jié)合的TGFβ受體的下調(diào)。
Smad7控制Smurf2的亞細(xì)胞定位 Smad7定位在核內(nèi)，當(dāng)TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活時輸出到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中Smad7通過與受體I亞單位作用而結(jié)合TGFβ受體(73)。為了研究Smad7是否募集Smmf2至完整細(xì)胞的所述受體上，我們測定了Smad7是否可以調(diào)節(jié)Smurf2定位。為此，我們在缺乏或存在Smad7的情況下表達(dá)TβRII、TβRI和Smurf2(C716A)，通過免疫熒光顯微鏡檢查合適蛋白的亞細(xì)胞分布。
Smad7定位在核內(nèi)，但是存在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時主要見于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中Smad7還與瞬時表達(dá)的TGFβ受體以點狀模式共同定位。以前我們以及其它學(xué)者就觀測到了TGFβ受體的這種分布(74-76)。相似的是，Smurf2主要見于細(xì)胞核中，但是這種定位在存在TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時不發(fā)生改變。然而，當(dāng)Smad7共表達(dá)時，Smurf2的所述亞細(xì)胞分布明顯改變，Smurf2蛋白主要見于細(xì)胞核外而且與TGFβ受體廣泛共定位。這些結(jié)果提示，Smad7表達(dá)導(dǎo)致Smurf2從細(xì)胞核輸出，使Smurf2募集至TGFβ受體復(fù)合物。
Smurf2誘導(dǎo)TGFβ受體和Smad7降解 Smad7締合受體在存在野生型Smurf2而非突變型Smurf2時顯著降低提示這樣的可能性Smurf2可能催化Smad7結(jié)合受體復(fù)合物降解。為了分析TGFβ受體復(fù)合物Smurf2依賴性轉(zhuǎn)化，我們在293T細(xì)胞共表達(dá)TβRII和TβRI。在這樣的條件下，TβRII和TβRI有效裝配為功能性異源聚合復(fù)合物，使我們可以研究整個受體庫的轉(zhuǎn)化。我們首先研究了表達(dá)Smurf2的細(xì)胞中的受體穩(wěn)態(tài)水平(圖17A)，觀測到當(dāng)II型或I型受體單獨(dú)表達(dá)或一起表達(dá)時Smurf2對II型或I型受體的穩(wěn)態(tài)水平影響向最小。然而，存在野生型Smad7時，Smurf2表達(dá)增加導(dǎo)致I型受體的穩(wěn)態(tài)水平顯著下降(圖17B)。相反，Smurf2(C716A)沒有作用。表達(dá)野生型Smurf2時，II型受體水平也下降，可是比I型受體觀測到的下降程度低。這種差異可能緣于這樣的事實Smad7通過活化I型受體結(jié)合受體復(fù)合物而不作用于單獨(dú)的TβRII。我們還測試了Smurf2是否針對組成活化型I型受體TβRI(T204D)。該受體在沒有II型受體的情況下介導(dǎo)TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且也結(jié)合Smad7(72)。與受體復(fù)合物相似，野生型Smurf2而不是Smurf2(C716A)引起活化I型受體穩(wěn)態(tài)水平下降(圖17B)。為了證實受體穩(wěn)態(tài)水平變化反映了受體轉(zhuǎn)化的改變，我們應(yīng)用脈沖追蹤分析分析了TβRII和TβRI的半衰期(圖17C)。對II型受體的分析揭示，新合成的II型受體蛋白的半衰期約1小時。相反TβRI穩(wěn)定得多，其半衰期約4-6小時。此外，當(dāng)Smad7或Smurf2分別與所述受體表達(dá)時，I型受體的半衰期不變。但是，當(dāng)Smurf2和Smad7與TGFβ受體復(fù)合物一起共表達(dá)時，I型受體的半衰期降低至約1小時。因此，Smad7和Smurf2增強(qiáng)I型受體的轉(zhuǎn)化。
遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白酶解膜受體可由蛋白酶體和溶酶體二者共同介導(dǎo)(60)。為了測試Smurf2依賴性增強(qiáng)TGFβ受體降解是否依賴于蛋白酶體和溶酶體作用，我們檢測了存在和缺乏lactacystin和氯喹時的受體轉(zhuǎn)化，lactacystin和氯喹分別抑制通過蛋白酶體和溶酶體降解蛋白。對受體的脈沖追蹤分析顯示，各抑制劑本身對總的TGFβ受體庫中的一個亞組起穩(wěn)定作用(圖17D)。這些結(jié)果說明，蛋白酶體和溶酶體二者對存在Smad7和Smurf2時觀測到的受體轉(zhuǎn)化增強(qiáng)產(chǎn)生作用。
在分析TGFβ受體的過程中，我們還檢測了Smad7蛋白水平。沒有TGFβ受體復(fù)合物時，Smad7穩(wěn)態(tài)水平和轉(zhuǎn)化不受Smurf2的影響(見圖15)。然而存在TGFβ受體復(fù)合物時，Smurf2表達(dá)降低Smad7穩(wěn)態(tài)水平和半衰期(分別見圖17B和17C)。而且，這種Smad7降低取決于Smurf2 HECT結(jié)構(gòu)域的催化活性，因為Smurf2(C716A)突變體表達(dá)不改變Smad7水平。lactacystin和氯喹也穩(wěn)定Smad7轉(zhuǎn)化，提示與受體復(fù)合物一樣，Smad7通過蛋白酶體和溶酶體兩個途徑降解。因此，在存在TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下，Smurf2誘導(dǎo)Smad7降解，其機(jī)制可能是通過針對完整的受體-Smad7復(fù)合物起作用。
為了研究所述受體和Smad7的遍在蛋白化，我們表達(dá)了HA表位標(biāo)記型遍在蛋白，通過免疫沉淀后的免疫印跡檢測了TβRII、TβRI或Smad7的遍在蛋白綴合物。為了保證特異性，在SDS中煮沸免疫沉淀樣品，再用合適抗體沉淀后進(jìn)行免疫印跡。對Smad7遍在蛋白化的分析顯示，缺乏或存在Smurf2只有很少遍在蛋白與Smad7蛋白綴合(圖17E)。然而，當(dāng)Smurf2與Smad7和TGFβ受體共表達(dá)時，我們觀測到高分子量的Smad7遍在蛋白綴合物，而當(dāng)使用Smurf2催化突變體時不能檢測到所述綴合物。與Smad7相反，我們未能檢測到I型受體的明顯Smurf2依賴性遍在蛋白化。因為存在Smurf2和Smad7時受體轉(zhuǎn)化增強(qiáng)，所以不能檢測到遍在蛋白綴合受體可能說明它們在遍在蛋白化時可能發(fā)生受體快速降解。另一方面，Smad7遍在蛋白化可能用作使完整受體-Smad7復(fù)合物靶向蛋白酶體的信號。綜合這些結(jié)果表明，Smad7依賴性募集Smurf2至TGFβ受體，導(dǎo)致蛋白酶體和溶酶體介導(dǎo)性降解TGFβ受體復(fù)合物和Smad7。
Smurf2.締合增強(qiáng)Smad7抑制活性 我們的研究說明，Smurf2可能通過Smad7募集至TGFβ受體復(fù)合物，從而導(dǎo)致所述受體降解。提示遍在蛋白介導(dǎo)的降解可能影響TGFβ途徑的Smad7抑制活性。為了研究這一點，我們首先研究了與Smurf2作用非常弱的Smad7(Y211A)(見圖15D)是否具有改變募集Smurf2至TGFβ受體的能力。為此，在存在或缺乏Smurf2(C716A)的情況下使野生型Smad7或Smad7(Y211A)與TGFβ受體共表達(dá)，通過分析與Smad7或Smurf2共沉淀的親和標(biāo)記受體，檢測受體相互作用。TGFβ受體復(fù)合物與Smad(Y211A)的作用與用野生型Smad7觀測到的作用相當(dāng)(圖18A)，證實PY基元的這種突變不影響Smad7與TGFβ受體的相互作用。然而存在突變Smad7時，Smurf2(C716A)與TGFβ受體締合的能力顯著降低，與觀測到的上述Smurf2和Smad7(Y211A)之間的作用效率降低有聯(lián)系。接下來，我們研究了Smad7(Y211A)是否具有改變抑制HepG2細(xì)胞TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力，所述HeβG2細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性Smurf2。為此，我們利用充分特征鑒定的3TP-lux報道構(gòu)建物檢測了TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。野生型Smad7表達(dá)強(qiáng)烈降低對該報道物的TGF-b依賴性誘導(dǎo)(圖18B)。相反，Smad7(Y211A)突變體的抑制活性顯著降低，盡管它具有與TGFβ受體復(fù)合物有效作用的能力。說明Smurf2與Smad7結(jié)合增強(qiáng)Smad7對TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制活性。
以前的研究證實，結(jié)合TGFβ受體復(fù)合物的Smad7防止Smad2結(jié)合所述受體。因為Smad7(Y211A)有效作用于TGFβ受體，所以我們尋求確定所述突變蛋白是否仍然保留對較高水平表達(dá)的TGFβ途徑的抑制活性。為了檢測這一點，我們比較了Smad7與Smad7(Y211A)在通過改變Smad7表達(dá)量而阻斷TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的相對有效性。野生型Smad7在所檢測的最低劑量水平強(qiáng)烈抑制TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Smad7(Y211A)的抑制效率低得多(圖18C)。然而，在所測試的最高劑量，Smad7(Y211A)能夠抑制TGFβ反應(yīng)性。這些結(jié)果說明，Smad7(Y211A)可能通過其結(jié)合所述受體而防止Smad2或Smad3結(jié)合所述受體的能力而保留了一定的抑制活性。綜合這些數(shù)據(jù)說明，Smurf2與Smad7協(xié)同作用促進(jìn)其抑制活性。
討論該實施例證實鑒定了一種新的遍在蛋白連接酶Smurf2，它與Smad7協(xié)同作用使TGFβ受體降解。Smurf2結(jié)合TGFβ受體非常微弱，而不能影響TGFβ受體的轉(zhuǎn)化。然而，存在Smad7時，Smurf2與異源聚合TGFβ受體形成有效復(fù)合物，導(dǎo)致TGFβ受體降解。因為Smad7直接結(jié)合Smurf2而且也與TGFβ受體復(fù)合物締合，所以這些結(jié)果表明，Smad7起介導(dǎo)Smurf2與TGFβ受體復(fù)合物作用的連接蛋白的作用(圖18D)。與此一致的是，破壞了Smad7-Smurf2相互作用的Smad7 PY基元突變也干擾Smad7募集Smurf2至所述受體的復(fù)合物的能力。這種Smad7突變體還使其阻礙TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力受損，說明Smurf2在介導(dǎo)Smad7抑制作用中具有一定作用。因為Smad7與R-Smad競爭結(jié)合活化TGFβ受體，所以這種協(xié)同作用當(dāng)Smad7瞬時表達(dá)或低水平表達(dá)時特別重要(53-58)。因此，Smurf2通過使受體降解而提供永久失活Smad7結(jié)合受體復(fù)合物的機(jī)制。我們還觀測到，在Smurf2依賴性降解TGFβ受體的同時，TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴性的Smad7降解。
* * *本發(fā)明不限于本文介紹的具體實施方案范圍。實際上，除了本文介紹的具體實施方案之外，根據(jù)上述介紹和附圖，對本發(fā)明的各種改進(jìn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。這樣的改進(jìn)屬于所附權(quán)利要求書的范疇。
進(jìn)一步應(yīng)該知道，所有堿基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值是近似值，提供這樣的近似值只是為了用以說明本發(fā)明。
所有專利、專利申請、公開出版物和本文引用的其它資料均通過引用整體結(jié)合到本文中。
引用的參者文獻(xiàn)1.Hogan，B.L.，Blessing，M.，Winnier，G.E.，Suzuki，N.& Jones，C.M.，發(fā)育生長因子TGF-β目關(guān)多肽信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在胚胎發(fā)生中的作用，Development.(1995)。2.Kingsley，D.M.，TGF-β超家族在不同生物起作用的新成員、新受體和新遺傳學(xué)實驗，Genes and Develop.8，133-146(1994)。3.Roberts，A.B.& Sporn，M.B.，轉(zhuǎn)化生長因子-b，Peptide Growth Factorsand Their Receptors 1，419-472(1990)。4.Whitman，M.，Smad與TGFβ超家族的早期發(fā)育信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Genes andDev.12，2445-2462(1998)。5.Harland，R.& Gerhart，J.，Spemann組織導(dǎo)體的形成和作用，Annu.Rev.Cell Biol.13，611-667(1997)。6.Heldin，C.H.，Miyazono，K.& ten Dijke，P.，TGF-β通過SMAD蛋白使信號從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，Nature 390，465-71(1997)。7.Massague，J.，TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Annu Rev Biochem 67，753-791(1998)。8.Wilson，P.A.，Lagna，G.，Suzuki，A.& Hemmati-Brivanlou，A.，BMP4及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物Smad1使爪蟾外胚層發(fā)生濃度依賴性圖式形成，Development 124，3177-84(1997)。9.Suzuki，A.，Chang，C.，Yingling，J.M.，Wang，X.F.& Hemmati-Brivanlou，A.，Smad5誘導(dǎo)爪蟾胚胎的腹側(cè)命運(yùn)，Dev.Biol.184，402-405(1997)。10.Graff，J.M.，Bansal，A.& Melton，D.A.，爪蟾Mad蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)TGFβ超家族不同亞組信號，CeLL 86，1-20(1996)。11.Baker，J.C.& Harland，R.M.，一種新型中胚層誘導(dǎo)物Madr2在活化素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用，Genes Dev 10，1880-9(1996)。12.Hershko A.& Ciechanover，A.，遍在蛋白系統(tǒng)，Ann.Rev.Biochem.67，425-479(1998)。13.Hochstrasser，M.，遍在蛋白依賴性蛋白降解，Annu.Rev.Genet.，405-439(1996)。14.Pukatzki，S.，Tordilla，N.，F(xiàn)ranke，J.& Kessin，R.H.，真菌盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)發(fā)育需要一種參與遍在蛋白化的新型組分，J Biol Chem 273，24131-8(1998)。15.Lindsey，D.F.等，盤基網(wǎng)柄菌屬發(fā)育而不是生長需要的使游離聚遍在蛋白鏈不能裝配的去遍在蛋白化酶，J Biol Chem 273，29178-87(1998)。16.Chung，C.Y.，Reddy，T.B.，Zhou，K.& Firtel，R.A.，一種新型推定MEK激酶控制盤基網(wǎng)柄菌屬發(fā)育時間和空間圖式形成而且受遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白降解的調(diào)節(jié)[In Process Citation]，Genes Dev 12，3564-78(1998)。17.Epps，J.L. & Tanda，S.，果蠅semushi突變阻礙胚胎發(fā)生過程中的Bicoid的核輸入，Curr.Biol.8，1277-1280(1998)。18.Dickson，B.J.，光感器發(fā)育破除障礙，Curr Biol 8，R90-2(1998)。19.Huang，Y.，Baker，R.T. & Fischer-Vize，J.A.，脂肪面(fat facet)基因編碼的去遍在蛋白化酶對細(xì)胞命運(yùn)的控制，Science 270，1828-31(1995)。20.Jiang，J.& Struhl，G.，F(xiàn)-box/WD40-重復(fù)序列蛋白Slimb對Hedgehog和Wingless信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)，Nature 391，493-6(1998)。21.Muralidhar，M.G. & Thomas，J.B.，果蠅bendless基因編碼遍在蛋白綴合酶相關(guān)性神經(jīng)蛋白，Neuron 11，253-66(1993)。22.Huibregtse，J.M.，Scheffner，M.，Beaudenon，S. & Howley，P.M.，一個在結(jié)構(gòu)和功能上與E6-AP遍在蛋白蛋白連接酶有關(guān)的蛋白家族，Proc Natl Acad Sci USA 92，2563-7(1995)。23.Nefsky，B. & Beach，D.，Publ作為E6-AP樣蛋白遍在蛋白連接酶在降解cdc25中起作用，EMBO J.15，1301-1312(1996)。24.Scheffner，M.，Huibregtse，J.M.，Vierstra，R.D. & Howley，P.M.，HpV-16E6和E6-AP復(fù)合物作為遍在蛋白-蛋白連接酶在p53遍在蛋白化中起作用，Cell 75，495-505(1993)。25.Hein，C.，Springael，J.，Volland，C.，Haguenauer-Tsapis，R. & Andre，B.，一種參與誘導(dǎo)性降解Gap1和Fur4通透酶的基本酵母基因NP11編碼Rsp5遍在蛋白-蛋白連接酶，Mol.Microbiol.18，77-87(1995)。26.Kumar，S.等，關(guān)于小鼠Nedd4基因的cDNA克隆、表達(dá)分析和作圖，Genomics 40，435-43(1997)。27.Kwon，Y.T.等，編碼末端規(guī)則途徑識別組分的小鼠和人基因，ProcNatl Acad Sci USA 95，7898-903(1998)。28.Bartel，B.，Wunning，I. & Varshavsky，A.，N末端規(guī)則途徑的識別組分，Embo J 9，3179-89(1990)。29.Patton，E.E.，Willems，A.R. & Tyers，M.，對遍在蛋白依賴性蛋白酶解的聯(lián)合控制don’t Skp the F-box假說，Trends.Genet.14，236-243(1998)。30.Wang，G.，Yang，J. & Huibregtse，J.M.，rsp5遍在蛋白-蛋白連接酶的功能結(jié)構(gòu)域，Mol Cell Biol 19，342-52(1999)。31.Nalefski，E.A. & Falke，J.J.，C2結(jié)構(gòu)域鈣-結(jié)合基元結(jié)構(gòu)和功能多樣性，Protein Sci.5，2375-2390(1996)。32.Plant，P.J.，Yeger，H.，Staub，O.，Howard，P. & Rotin，D.，遍在蛋白蛋白連接酶Nedd4的C2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Ca2+-依賴性漿膜定位，J BiolChem 272，32329-36(1997)。33.Staub，O. & Rotin，D.，WW結(jié)構(gòu)域，Structure 4，495-499(1996)。34.Fainsod，A.，Steinbeisser，H. & De Robertis，E.M.，關(guān)于BMP-4在爪蟾胚胎邊緣帶圖式形成中的作用，Embo J13，5015-25(1994)。35.Hemmati-Brivanlou，A. & Thomsen，G.H.，爪蟾胚胎腹中胚層的圖式形成BMP-2和BMP-4的表達(dá)模式和活性，Dev Genet 17，78-89(1995)。36.Thomsen，G.H.，爪蟾mothers against decapentaplegic是一種在BMP-2/4受體下游起作用的胚胎腹側(cè)化因子，Development 122，2359-66(1996)。37.Hoodless，P.A.等，在BMP2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用的MAD相關(guān)蛋白MADR1，Cell 85，489-500(1996)。38.Kretzschmar，M.，Liu，F(xiàn).，Hata，A.，Doody，J. & Massague，J.，BMP受體激酶直接磷酸化以及功能活化TGFβ家族中介體Smad1，GenesDev 11，984-95(1997)。39.Thomsen，G.H.，在Spemann組織導(dǎo)體及其附近的拮抗作用BMP及其結(jié)合蛋白在背-腹圖式形成中的作用，Trends Genet.13，209-211(1997)。40.Sasai，Y. & De Robertis，E.M.，脊椎動物胚胎的外胚層圖式形成，Dev Bio1 182，5-20(1997)。41.Hemmati-Brivanlou，A. & Melton，D.，在沒有其它影響因素的情況下脊椎動物胚胎細(xì)胞將發(fā)育為神經(jīng)細(xì)胞，Cell 88，13-17(1997)。42.Kawabata，M.，Imamura，T. & Miyazono，K.，骨形成蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，Cytokine Growth Factor Rev 9，49-61(1998)。43.Bashiriullah，A.，Cooperstock，R.L. & Lipshitz，H.D.，發(fā)育中的RNA定位，Annu Rev Biochem 67，335-94(1998)。44.Kimelman，D. & Griffin，K.J.，中胚層誘導(dǎo)一種后現(xiàn)代觀點，Cell 94，419-21(1998)。45.Joseph，E.M. & Melton，D.A.，突變Vg1配體對爪蟾胚胎的內(nèi)胚層和中胚層形成的破壞作用，Development 125，2677-85(1998)。46.Bartel，P. & Fields，S.，應(yīng)用雙雜交系統(tǒng)分析蛋白-蛋白相互作用，Methods Enzymol.254，241-263(1995)。47.Eppert，K.等，MADR2作圖到18q21而且編碼在直腸癌中功能性突變的TGFβ調(diào)節(jié)性MAD相關(guān)蛋白，Cell 86，543-552(1996)。48.Horb，M.E. & Thomsen，G.H.，植物性定位的爪蟾T-box基因特化中胚層和內(nèi)胚層而且是中胚層形成所必需的基因，Dev.124，1689-
1698(1997)。49.Wigler，M.等，用真核生物和原核生物基因轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞，Cell16，777-85(1979)。50.Macias-Silva，M.，Hoodless，PA.，Tang，S.J.，Buchwald，M. & Wrana，J.L.，BMP7 I型受體ALK2對Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的特異性激活，J Biol Chem 273，25628-36(1998)。51.Staub，O.等，遍在蛋白-蛋白連接酶Nedd4在表達(dá)上皮Na+通道(ENaC)的組織中的免疫定位，Am J Physiol 272，C1871-80(1997)。52.Reddi，A.H.，形成蛋白在骨骼組織工程和再生中的作用，NatureBiotechnology 16，247-252(1998)。53.Afrakhte，M.，Morén，A.，Jossan，S.，Itoh，S.，Sampath，K.，Westermark，B.，Heldin，C.-H.，Heldin，N.-E.和ten Dijke，P.(1998)，TGF-b家族成員對抑制性Smad6和Smad7 mRNA的誘導(dǎo)，Biochem.Biophys.Res.Comm.249，505-511。54.Bitzer，M.，von Gersdorff，G.，Liang，D.，Dominguez-Rosales，A.，Beg，A.A.，Rojkind，M.和Bottinger，E.P.(2000)，NF-kB/RelA抑制TGF-b/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制，Genes Dev.14，187-197。55.Ishiaki，A.，Yamato，K.，Nakao，A.，Nonaka，K.，Ohguchi，M.，ten Dijke，P.和Nishihara，T.(1988)，Smad7是活化素誘導(dǎo)小鼠B細(xì)胞生長停滯和凋亡的活化素誘導(dǎo)型抑制劑，J.Biol.Chem.273，24293-24296。56.Nakao，A.，Afrakhte，M.，Morén，A.，Nakayama，T.，Christian，J.L.，Heuchel，R.，Itoh，S.，Kawabata，M.，Heldin，N.-E.，Heldin，C.-H.和tenDijke，P.(1997)，對TGF-b信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的TGFb誘導(dǎo)型拮抗劑Smad7的鑒定，Nature 389，631-635。57.Takase，M.，Imamura，T.，Sampath，T.K.，Takeda，K.，Ichijo，H.，Miyazono，K.和Kawabata，M.(1998)，骨形成蛋白對Smad6 mRNA的誘導(dǎo)作用，Biochem.Biophys.Res.Commun.244，26-29。58.Ulloa，L.，Doody，J.和Massagué，J.(1999)，干擾素-n/STAT途徑對轉(zhuǎn)化生長因子-b/SMAD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用，Nature 397，710-713。59.Bonifacino，J.S.和Weissman，A.M.(1998)，遍在蛋白以及對分泌和內(nèi)吞途徑蛋白命運(yùn)的控制，Ann.Rev.Cell.Biol.14，19-57。60.Hicke，L.(1999)，遍在蛋白的Gettin下降關(guān)閉細(xì)胞表面受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道，Trends Cell Biol.9，107-112。61.Govers，R.，ten Broeke，T.，van Kerkhof，P.，Schwartz，A.L.和Strous，G.J.(1999)，對配體誘導(dǎo)生長激素受體內(nèi)在化需要的新型遍在蛋白綴合基元的鑒定，EMBO J.18，28-36。62.van Kerkhof，P.，Govers，R.，Alves dos Santos，C.M.和Strous，G.J.(2000)，蛋白酶體依賴性生長激素受體的內(nèi)吞作用和降解，J.Biol.Chem.275，1575-1580。63.Harvey，K.F.和Kumar，S.(1999)，Nedd4樣蛋白一種新形成的參與各種細(xì)胞功能的遍在蛋白-蛋白連接酶家族，Trends Cell Biol.9，166-169。64.Staub，O.，Abriel，H.，Plant，P.，Ishikawa，T.，Kanelis，V.，Saleki，R.，Horisberger，J.D.，Schild，L.和Rotin，D.(2000)，Nedd4和遍在蛋白化對上皮Na+通道的調(diào)節(jié)作用，Kidney Int.57，809-815。65.Staub，O.，Dho，S.，Henry，P.，Correa，J.，Ishikawa，T.，McGlade，J.和Rotin，D.(1996)，Nedd4 WW結(jié)構(gòu)域?qū)iddle綜合征缺失的上皮Na+通道富含脯氨酸的PY基元的結(jié)合，EMBO J.15，2371-2380。66.Staub，O.，Gautschi，I.，Ishikawa，T.，Breitschopf，K.，Ciechnover，A.，Schild，L.和Rotin，D.(1997)，遍在蛋白化對上皮Na+通道(ENaC)穩(wěn)定性和功能的調(diào)節(jié)作用，EMBO J.16，6325-6336。67.Joazeiro，C.A.P.，Wing，S.S.，Huang，H.-K.，Leverson，J.D.，Hunter，T.和Liu，Y.-C.(1999)，作為RING型E2依賴性遍在蛋白-蛋白連接酶的酪氨酸激酶負(fù)向調(diào)節(jié)劑c-cbl，Science 286，309-312。68.Levkowitz，G.，Waterman，H.，Ettenberg，S.A.，Katz，M.，Tsygankov，A.Y.，Alroy，I.，Lavi，S.，Iwai，K.，Reiss，Y.，Ciechanover，A.，Lipkowitz，S.和Yarden，Y.(1999)，遍在蛋白連接酶活性和酪氨酸磷酸化是c-Cbl/Sli-1抑制生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)，Mol.Cell 4，1029-1040。69.Hoodless，P.A.，Haerry，T.，Abdollah，S.，Stapleton，M.，OConnor，M.B.，Attisano，L和Wrana，J.L(1996)，在BMp2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用的MAD相關(guān)蛋白MADR1，Cell 85，489-500。70.Macías-Silva，M.，Abdollah，S.，Hoodless，P.A.，Pirone，R.，Attisano，L.和Wrana，J.L.(1996)，MADR2是TGFβ受體的底物并且其磷酸化是核內(nèi)累積和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需要的，Cell 87，1215-1224。71.Chen，H.I.和Sudol，M.(1995)，Yes-締合蛋白的WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合不同于Src同源性3-結(jié)合分子建立的共有序列的富含脯氨酸的配體，Proc Natl Acad Sci USA 82，7819-7823。72.Hayashi，H.，Abdollah，S.，Qiu，Y.，Cai，J.，Xu，Y.-Y.，Grinnell，B.W.，Richardson，M.A.，Topper，J.N.，Gimbrone Jr.，M.A.，Wrana，J.L.和Falb，D.(1997)，MAD相關(guān)蛋白Smad7與TGFβ受體締合而且起TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑作用，Cell 89，1165-1173。73.Itoh，S.，Landstrom，M.，Hennansson，A.，Itoh，F(xiàn).，Heldin，C.-H.，Heldin，N.-E.和ten Dijke，P.(1998)，轉(zhuǎn)化生長因子b1誘導(dǎo)抑制性Smad7從核內(nèi)輸出，J.Biol.Chem.273，29195-29201。74.Gilboa，L.，Wells，R.G.，Lodish，H.F.和Henis，Y.I.(1998)，I型和II型轉(zhuǎn)化生長因子-b受體的寡聚結(jié)構(gòu)在ER中形成同型二聚體并持續(xù)存在于漿膜，J.Cell.Biol.140，767-777。75.Henis，Y.I.，Moustakas，A.，Lin，H.Y.和Lodish，H.F.(1994)，II和III型轉(zhuǎn)化生長因子-β受體形成同型寡聚體，J.Cell Biol.126，139-154。76.Tsukazaki，T.，Chiang，T.A.，Davison，A.F.，Attisano，L.和Wrana，J.L.(1998)，募集Smad2至TGF-b受體的FYVE結(jié)構(gòu)域蛋白SARA，Cell95，779-791。77.Derynck，R.，Zhang，Y.和Feng，X.-H.(1998)，SmadTGF-b反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，Cell 95，737-740。78.Heldin，C.-H.，Miyazono，K.和ten Dijke，P.(1997)，TGF-b通過SMAD蛋白使信號從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，Nature.390，465-471。79.Massagué，J.和Chen，Y.G.(2000)，控制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Genes Dev.
14，627-644。80.Miyazono，K.(2000)，Smad蛋白的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Cyto.GrowthFactor Rev.11，15-22。81.Wrana，J.L(2000)，Smad活性的調(diào)節(jié)，CeH 100，189-192。82.Imamura，T.，Takase，M.，Nishihara，A.，Oeda，E.，Hanai，J.-I.，Kawabata，M.和Miyazono，K.(1997)，Smad6抑制TGF-b超家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Nature 389，622-626。
權(quán)利要求
1.一種分離的Smurf蛋白。
2.權(quán)利要求1的Smurf蛋白，它為人Smurf蛋白。
3.權(quán)利要求1的Smurf蛋白，它為Smurf1。
4.權(quán)利要求3的Smurf1，它具有對應(yīng)于C710A的突變。
5.權(quán)利要求3的Smurf1，它包含SEQ ID NO2序列描述的至少10個連續(xù)氨基酸殘基。
6.權(quán)利要求3的Smurf1，它包含SEQ ID NO2描述的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的Smurf蛋白，它為Smurf2。
8.權(quán)利要求7的Smurf2，它具有對應(yīng)于C716A的突變。
9.權(quán)利要求7的Smurf2蛋白，它包含SEQ ID NO4描述的至少10個連續(xù)氨基酸殘基。
10.權(quán)利要求7的Smurf2蛋白，它包含SEQ ID NO4描述的氨基酸序列。
11.一種分離的核酸，它編碼權(quán)利要求1的Smurf蛋白。
12.權(quán)利要求11的核酸，其中所述Smurf蛋白為人Smurf蛋白。
13.權(quán)利要求11的核酸，其中所述Smurf蛋白為Smurf1。
14.權(quán)利要求13的核酸，它具有對應(yīng)于C710A的突變。
15.權(quán)利要求13的核酸，其中所述Smurf1包含SEQ ID NO2序列描述的至少10個連續(xù)氨基酸殘基。
16.權(quán)利要求13的核酸，其中所述Smurf1包含SEQ ID NO2描述的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求16的核酸，它具有SEQ ID NO1描述的核苷酸序列。
18.權(quán)利要求11的核酸，其中所述Smurf蛋白為Smurf2。
19.權(quán)利要求18的核酸，它具有對應(yīng)于C716A的突變。
20.權(quán)利要求18的核酸，其中所述Smurf2蛋白包含SEQ ID NO4描述的至少10個連續(xù)氨基酸殘基。
21.權(quán)利要求18的核酸，其中所述Smurf2蛋白包含SEQ ID NO4描述的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求18的核酸，它具有SEQ ID NO3描述的核苷酸序列。
23.一種載體，它包含權(quán)利要求11的核酸。
24.一種宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求23的載體。
25.一種產(chǎn)生Smurf蛋白的方法，該方法包括在允許所述載體表達(dá)Smurf蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞。
26.一種產(chǎn)生Smurf蛋白的方法，該方法包括在允許所述載體表達(dá)Smurf蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞。
27.一種轉(zhuǎn)基因非人類動物，它表達(dá)人Smurf蛋白。
28.一種抑制細(xì)胞中的骨形成蛋白或腫瘤生長因子-β激活途徑的方法，該方法包括在允許導(dǎo)入所述細(xì)胞中的權(quán)利要求23的載體表達(dá)Smurf的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
29.一種抑制細(xì)胞中的骨形成蛋白或腫瘤生長因子-β激活途徑的方法，該方法包括在允許導(dǎo)入所述細(xì)胞中的權(quán)利要求24的載體表達(dá)Smurf的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
30.一種促進(jìn)細(xì)胞中的骨形成蛋白或腫瘤生長因子-β激活途徑的方法，該方法包括抑制所述細(xì)胞內(nèi)源性Smurf表達(dá)。
31.一種篩選Smurf活性調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括檢測存在的受試化合物相對于缺乏該受試化合物的Smurf活性而對Smurf活性的調(diào)節(jié)作用。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述Smurf活性是宿主細(xì)胞Smad蛋白的遍在蛋白化。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述Smurf活性是SmurfWW結(jié)構(gòu)域與Smad蛋白的PPXY結(jié)構(gòu)域的相互作用。
34.權(quán)利要求33的方法，其中篩選所述受試化合物抑制所述相互作用的能力。
35.一種抗體，它特異性結(jié)合Smurf蛋白。
36.一種寡核苷酸或核酸，它在高嚴(yán)格條件下與具有編碼Smurf的序列的核酸特異性雜交。
全文摘要
本發(fā)明提供特異性針對BMP和TGFβ/活化素途徑特異性Smad的Hect家族遍在蛋白連接酶的獨(dú)特成員。所述新型連接酶命名為Smurf1和Smurf2。它們分別與Smad1和5以及Smad7直接作用，從而調(diào)節(jié)這些途徑的Smad和其它蛋白的遍在蛋白化、轉(zhuǎn)化和活性。Smurf1干擾BMP的生物反應(yīng)，但是不會干擾活化素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在兩棲動物胚胎中Smurf1抑制內(nèi)源性BMP信號，導(dǎo)致中胚層和外胚層圖式形成和細(xì)胞命運(yùn)特化改變。本發(fā)明提供了一種在胚胎發(fā)育過程中遍在蛋白化途徑和TGFβ超家族控制細(xì)胞命運(yùn)決定之間的獨(dú)特調(diào)節(jié)連接。因此，Smurf1為Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)節(jié)劑，Smurf1因為對Smad1的作用而阻斷BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在哺乳動物細(xì)胞中，Smurf2抑制TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而在爪蟾中Smurf2阻礙背中胚層形成，導(dǎo)致胚胎前平截。Smurf2與Smad7形成穩(wěn)定的復(fù)合物，它誘導(dǎo)降解和下調(diào)TGFβ/活化素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
文檔編號G01N33/53GK1409722SQ00811354
公開日2003年4月9日 申請日期2000年6月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月11日
發(fā)明者G·H·湯姆森, J·弗拉納 申請人:紐約州州立大學(xué)研究基金會, Hsc研究和發(fā)展合伙人有限公司