專利名稱：用于評(píng)估變應(yīng)原性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性或毒性和用于同時(shí)篩選至少兩種化合物的方法。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明中使用的細(xì)胞類型的鑒定方法，以及用于高通量篩選化合物的鑒定試劑盒。
背景技術(shù)：
許多化合物在動(dòng)物和人體內(nèi)引發(fā)變應(yīng)性或毒性應(yīng)答。與新化合物不斷增加的發(fā)展以及因此對(duì)測(cè)試它們的潛在變應(yīng)原性或毒性的需要一致，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于測(cè)定變應(yīng)原性和毒性的方法。歷史上，在動(dòng)物上而且某種程度在人上進(jìn)行化合物測(cè)試，但是缺乏有用的合格技術(shù)。出于明顯原因，對(duì)于化合物(諸如變應(yīng)原和毒素)的測(cè)試，公眾和專業(yè)存在用體外方法取代體內(nèi)研究的要求和需要。
現(xiàn)有技術(shù)試圖揭示涉及變應(yīng)性應(yīng)答的細(xì)胞類型、細(xì)胞元件、和分子，從而有助于理解這個(gè)反應(yīng)鏈的復(fù)雜性。這樣的一種參與元件是細(xì)胞因子。眾所周知，細(xì)胞因子作為建立不同免疫應(yīng)答的一份子而發(fā)揮作用。
其它參與者包括B和T淋巴細(xì)胞。B和T細(xì)胞是免疫性的介質(zhì)，然而它們的功能受到抗原呈遞細(xì)胞諸如樹(shù)突細(xì)胞的控制。M.P.Everson等人(Journal of Leukocyte Biology，59494-498，1996)公開(kāi)了不同組織如何誘導(dǎo)生成不同的T細(xì)胞細(xì)胞因子模式。研究說(shuō)明，不同的樹(shù)突細(xì)胞群體負(fù)責(zé)誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子生成。H.Secrist等人(J.Exp.Med，1811081-1089，1995)進(jìn)行的研究描述了抗原劑量如何調(diào)控變應(yīng)原特異性記憶CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子模式。他們發(fā)現(xiàn)，在用低濃度變應(yīng)原進(jìn)行刺激時(shí)，CD4+T細(xì)胞生成高水平的細(xì)胞因子白介素-4(IL-4)；而用高濃度變應(yīng)原進(jìn)行刺激時(shí)，生成低水平的IL-4。K.E.Driscoll等人(Environmental Health Perspectives，1051159-1164，1997)描述了吸入微粒諸如有害微粒如何通過(guò)影響肺上皮細(xì)胞而在肺中引發(fā)炎癥。在上皮細(xì)胞上進(jìn)行體外測(cè)試用石英進(jìn)行刺激，引起細(xì)胞因子MIP-2(巨噬細(xì)胞炎性蛋白2)水平上升，即測(cè)量到mRNA水平的上升。研究人員發(fā)現(xiàn)，應(yīng)答顯得與劑量有關(guān)。另一個(gè)研究小組證明，在體外硅石誘導(dǎo)趨化因子(諸如MIP-2)在肺泡上皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)。
現(xiàn)有技術(shù)的研究主要集中于已知變應(yīng)原對(duì)特定細(xì)胞群體的影響，即觀察細(xì)胞的機(jī)制特性和生成的細(xì)胞因子類型。
在專利申請(qǐng)WO 99/07880中，公開(kāi)了用于在體外鑒定人變應(yīng)原和T淋巴細(xì)胞抗原的方法，其中將人幼稚T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、永生化B細(xì)胞與待測(cè)化合物混合，并測(cè)定待測(cè)化合物是否誘導(dǎo)來(lái)自T細(xì)胞的應(yīng)答。測(cè)量的應(yīng)答之一稱為細(xì)胞因子應(yīng)答。
T細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體(它是克隆重組的結(jié)果)的相互作用和MHC分子中的肽(它是個(gè)體依賴的)識(shí)別加工后的抗原。在評(píng)估待測(cè)化合物是否是變應(yīng)原時(shí)，這當(dāng)然顯示不確定性，因?yàn)楂@得的應(yīng)答與細(xì)胞起源的個(gè)體相關(guān)，而與待測(cè)化合物本身無(wú)關(guān)。因而，仍然存在對(duì)通用測(cè)試法的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于在體外評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性的方法，包括下列步驟(a)獲得預(yù)先確定和預(yù)先鑒定的包含至少一種動(dòng)物(包括人)起源細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物，它能夠與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用并在相互作用后以細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行應(yīng)答；(b)使細(xì)胞培養(yǎng)物接觸待測(cè)化合物；(c)通過(guò)針對(duì)至少一種預(yù)先確定的細(xì)胞因子應(yīng)答測(cè)定細(xì)胞的細(xì)胞因子應(yīng)答來(lái)確定特定細(xì)胞因子模式，該細(xì)胞展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用；并(d)使細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性相互關(guān)聯(lián)。
根據(jù)細(xì)胞因子應(yīng)答(即由細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的類型和水平)隨待測(cè)化合物的變應(yīng)原性而變化的發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使待測(cè)化合物接觸能夠引發(fā)細(xì)胞因子應(yīng)答的細(xì)胞并測(cè)定所述應(yīng)答，然后使IgE應(yīng)答與在動(dòng)物中進(jìn)行的變應(yīng)原性研究相互關(guān)聯(lián)，從而本發(fā)明有可能在體外評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性。在本說(shuō)明書(shū)的全文中，變應(yīng)原性具有其普遍含義，即在動(dòng)物(包括人)中引發(fā)IgE應(yīng)答的能力。
本發(fā)明還涉及在至少兩種細(xì)胞培養(yǎng)物(每種包含一種細(xì)胞類型)諸如共培養(yǎng)物中測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答的方法。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，上文所述方法涉及待測(cè)化合物在展示與其發(fā)生顯著的非特異性相互作用的細(xì)胞中誘導(dǎo)的膜標(biāo)記的測(cè)定。
此外，本發(fā)明還描述了用于測(cè)定待測(cè)化合物的變應(yīng)原性和毒性的聯(lián)合測(cè)定法。
本發(fā)明不僅將有益于動(dòng)物和人類，它還將能夠大規(guī)模篩選潛在的變應(yīng)原和毒素，由此將操作花費(fèi)和時(shí)間減到最少。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于同時(shí)篩選至少兩種待測(cè)化合物的變應(yīng)原性的方法，包括下列步驟a)在上文確定的細(xì)胞培養(yǎng)物至少兩個(gè)分開(kāi)的區(qū)室中安排特定細(xì)胞類型；b)使分開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)物區(qū)室分別接觸待測(cè)化合物；c)通過(guò)對(duì)展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用的相應(yīng)細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答來(lái)確定特定細(xì)胞因子模式；并d)使每種細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性相互關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明的還有一個(gè)方面，提供了用于測(cè)定待測(cè)化合物的毒性的方法，遵循上文關(guān)于變應(yīng)原性所述步驟。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是鑒定上文所述細(xì)胞類型的方法，包括下列步驟a)獲得預(yù)先確定的包含一種動(dòng)物(包括人)起源細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞類型能夠與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用并在相互作用后以細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行應(yīng)答；
b)使用非特異性多價(jià)誘導(dǎo)劑鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物在與待測(cè)化合物發(fā)生非特異性相互作用后可表達(dá)的細(xì)胞因子；c)使細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一部分接觸待測(cè)化合物，測(cè)定所鑒定細(xì)胞因子的水平，獲得細(xì)胞因子模式；d)用待測(cè)化合物免疫動(dòng)物并測(cè)定動(dòng)物產(chǎn)生的IgE水平；e)使細(xì)胞因子模式與測(cè)定得到的IgE水平相互關(guān)聯(lián)；并f)重復(fù)步驟c-e直至至少測(cè)試了一種高IgE水平的待測(cè)化合物、一種低IgE水平的待測(cè)化合物、和一種中IgE水平的待測(cè)化合物。
另一個(gè)方面是用于高通量篩選待測(cè)化合物的鑒定試劑盒，包括a)包含至少一種動(dòng)物(包括人)細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物；b)由至少一對(duì)具有特定細(xì)胞因子特異性的單克隆抗體選擇的細(xì)胞因子決定簇，至少一種用于mRNA檢測(cè)的細(xì)胞因子特異性探針，至少一套用于mRNA或cDNA檢測(cè)的細(xì)胞因子特異性引物；c)包含至少兩個(gè)區(qū)室的測(cè)定裝置。
還有，本發(fā)明的一個(gè)方面是將測(cè)定法用于篩選至少兩種待測(cè)化合物的變應(yīng)原性或毒性的使用。
1a-d的表顯示了用脂多糖(LPS)刺激上皮細(xì)胞達(dá)預(yù)定保溫時(shí)間后的細(xì)胞因子應(yīng)答。
圖2顯示了3種不同細(xì)胞因子對(duì)蛋白酶P修飾反應(yīng)的細(xì)胞因子應(yīng)答，其中蛋白酶P進(jìn)行了關(guān)于變應(yīng)原性的修飾。
圖3a-d的圖顯示了與用于修飾蛋白酶P的PEG長(zhǎng)度相關(guān)的IgE水平的降低(a)，3種不同細(xì)胞因子的細(xì)胞因子應(yīng)答(b-d)。
圖4a-c的圖顯示了在用蛋白酶P刺激后3種不同細(xì)胞因子水平與IgE水平之間的相關(guān)性。
圖5的表顯示了在用蛋白酶和立撲萊斯(Lipolase)刺激后的IgE水平和3種不同細(xì)胞因子的細(xì)胞因子應(yīng)答。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性的體外測(cè)定法。如上文所述，通常在動(dòng)物研究中評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性，其中由待測(cè)化合物引起的IgE水平指示待測(cè)化合物的變應(yīng)原性。然而，在實(shí)踐中難以對(duì)大量待測(cè)化合物篩選變應(yīng)原性。通過(guò)動(dòng)物研究測(cè)試化合物的任務(wù)是乏味且昂貴的，而且出于明顯的倫理原因，希望將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用減到最少，反過(guò)來(lái)這又符合關(guān)于動(dòng)物測(cè)試的EU指示。
本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)能夠與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用并在相互作用后以細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行應(yīng)答的細(xì)胞，其細(xì)胞因子應(yīng)答可能與所述待測(cè)化合物在動(dòng)物研究中引發(fā)的IgE應(yīng)答有關(guān)。
術(shù)語(yǔ)“非特異性相互作用”反映如下事實(shí)生物體免疫防衛(wèi)中的有些細(xì)胞與外來(lái)物質(zhì)發(fā)生非特異性相互作用，非特異性與其它細(xì)胞的個(gè)別應(yīng)答(特別是引發(fā)T細(xì)胞)相反?；蚴莾H僅通過(guò)接觸待測(cè)化合物，或是通過(guò)攝取待測(cè)化合物(諸如通過(guò)待測(cè)化合物的胞飲作用)，依照本發(fā)明使用的細(xì)胞將引發(fā)細(xì)胞因子應(yīng)答。因此，相互作用指至少使待測(cè)化合物接觸細(xì)胞并可能由細(xì)胞吸收。在本文中，術(shù)語(yǔ)“非特異性”指待測(cè)化合物將不會(huì)結(jié)合細(xì)胞表面并通過(guò)待測(cè)化合物的特異性受體發(fā)揮作用。這與T細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體的特異性相互作用結(jié)合加工后抗原(諸如變應(yīng)原)相反。正如較早提及的，本發(fā)明細(xì)胞的攝取機(jī)制對(duì)研究中的化合物不是特異性的。
依照本發(fā)明使用的、能夠展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用的細(xì)胞優(yōu)選上皮細(xì)胞，而不考慮在生物體中的部位。上皮細(xì)胞共有的是，它們是生物體針對(duì)外來(lái)物質(zhì)的初級(jí)防衛(wèi)的一部分。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的上皮細(xì)胞衍生自呼吸道上皮細(xì)胞。呼吸道上皮細(xì)胞直接暴露于外部環(huán)境的空氣傳播成份，而且是生物體針對(duì)吸入的外來(lái)物質(zhì)的初級(jí)防衛(wèi)的一部分。在患有哮喘和其它變應(yīng)性呼吸道疾病的個(gè)體中，上皮細(xì)胞常常是受損的。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞是胃腸道上皮細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種細(xì)胞類型是角質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞是表皮的主要成份，擔(dān)當(dāng)保護(hù)下面的組織的任務(wù)。
還有一種用于本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)的至少一種細(xì)胞類型是樹(shù)突細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞的生理學(xué)任務(wù)是捕獲、加工、并呈遞抗原，向淋巴細(xì)胞提供共刺激分子，和分泌適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子以發(fā)動(dòng)免疫應(yīng)答。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，樹(shù)突細(xì)胞能夠通過(guò)與待測(cè)化合物的非特異性相互作用而引發(fā)細(xì)胞因子應(yīng)答。
同樣，可依照本發(fā)明使用通常認(rèn)為是免疫系統(tǒng)中更個(gè)體化和特異性部分的一份子的細(xì)胞，諸如巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、和單核細(xì)胞，即利用它們引發(fā)非特異性細(xì)胞因子應(yīng)答的能力。
巨噬細(xì)胞通過(guò)經(jīng)吞噬作用的攝食來(lái)防衛(wèi)機(jī)體免于入侵的微生物。巨噬細(xì)胞還擔(dān)當(dāng)清道夫，清除受損細(xì)胞和細(xì)胞殘骸。
還有一組細(xì)胞，即內(nèi)皮細(xì)胞，可用于本發(fā)明。
雖然依照本發(fā)明使用的細(xì)胞類型可以來(lái)自任何動(dòng)物，但是優(yōu)選至少一種細(xì)胞類型衍生自人類組織或人類血液細(xì)胞。此外，優(yōu)選所用細(xì)胞類型與所評(píng)估的待測(cè)化合物的主要變態(tài)反應(yīng)定位有關(guān)，即優(yōu)選在使用呼吸上皮細(xì)胞的系統(tǒng)中測(cè)試懷疑引起肺部變態(tài)反應(yīng)的待測(cè)化合物。
細(xì)胞因子是輔助調(diào)控炎癥過(guò)程并在影響針對(duì)抗原(包括變應(yīng)原)的應(yīng)答中扮演重要角色的一類信號(hào)分子。細(xì)胞因子有助于募集炎性免疫細(xì)胞。它們的分泌量小，但是極其有效。它們經(jīng)受體發(fā)生作用，而且不由未刺激細(xì)胞生成。
本發(fā)明細(xì)胞類型的細(xì)胞因子生成可以看成是針對(duì)外來(lái)化合物的初級(jí)應(yīng)答。在細(xì)胞接觸外來(lái)化合物后，細(xì)胞可能通過(guò)非特異性機(jī)制結(jié)合化合物，諸如非特異性受體結(jié)合。接觸后，細(xì)胞可能通過(guò)胞飲作用或吞噬作用將外來(lái)化合物內(nèi)在化。在胞內(nèi)對(duì)外來(lái)化合物的進(jìn)一步酶促降解可觸發(fā)細(xì)胞因子的合成和分泌。在動(dòng)物和人體中，分泌的細(xì)胞因子可擔(dān)當(dāng)信號(hào)分子，影響多種毗鄰細(xì)胞類型，包括免疫細(xì)胞，諸如T細(xì)胞和B細(xì)胞，它們繼而觸發(fā)次級(jí)應(yīng)答。
至今已經(jīng)知道了很多種細(xì)胞因子，然而，不是所有的細(xì)胞類型都產(chǎn)生所有的細(xì)胞因子，而且，不是由特定細(xì)胞類型生成的所有細(xì)胞因子都作為針對(duì)與待測(cè)化合物的非特異性相互作用的應(yīng)答而分泌。
因此，本發(fā)明還涉及用于鑒定為了評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性而預(yù)先確定的細(xì)胞類型的特定細(xì)胞因子的方法，包括下列步驟a)獲得預(yù)先確定的包含一種動(dòng)物(包括人)起源細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞類型能夠與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用并在相互作用后以細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行應(yīng)答；b)使用非特異性多價(jià)誘導(dǎo)劑鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物在與待測(cè)化合物發(fā)生非特異性相互作用后可表達(dá)的細(xì)胞因子；c)使細(xì)胞培養(yǎng)物的一部分接觸待測(cè)化合物，測(cè)定所鑒定細(xì)胞因子的水平，獲得細(xì)胞因子模式；d)用待測(cè)化合物免疫動(dòng)物并測(cè)定動(dòng)物產(chǎn)生的IgE水平；e)使細(xì)胞因子模式與測(cè)定得到的IgE水平相互關(guān)聯(lián)；并f)重復(fù)步驟c-e直至至少測(cè)試了一種高IgE水平的待測(cè)化合物、一種低IgE水平的待測(cè)化合物、和一種中IgE水平的待測(cè)化合物。
一旦鑒定了上文所述的細(xì)胞類型，則有可能依照本發(fā)明將討論中的細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物用于評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性。因而，術(shù)語(yǔ)“預(yù)先鑒定的”指為了評(píng)估變應(yīng)原性已經(jīng)確定了特定細(xì)胞類型的細(xì)胞因子應(yīng)答。
優(yōu)選的是，在評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性的方法中測(cè)定超過(guò)一種的細(xì)胞因子，諸如測(cè)定至少兩種細(xì)胞因子。當(dāng)在本發(fā)明的方法中測(cè)定至少四種細(xì)胞因子時(shí)預(yù)計(jì)可獲得更好結(jié)果。
關(guān)于人肺組織上皮細(xì)胞，測(cè)定的細(xì)胞因子優(yōu)選白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、MCP-1、和GM-CSF。例如，依照本發(fā)明，高變應(yīng)原性待測(cè)化合物將引發(fā)低水平的上文所述細(xì)胞因子，而低變應(yīng)原性待測(cè)化合物將引發(fā)高水平的IL-8和MCP-1以及低水平的IL-6。對(duì)于介于高和低變應(yīng)原性之間的待測(cè)化合物，可看到一種或兩種細(xì)胞因子的高水平，而測(cè)定的其它細(xì)胞因子的水平是低的。因此，根據(jù)通過(guò)本發(fā)明方法獲得的細(xì)胞因子模式，有可能量化待測(cè)化合物的變應(yīng)原性。
所評(píng)估的細(xì)胞因子的數(shù)目和水平是與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性效能有關(guān)的因素。
可以通過(guò)boolean法(即是否高于某個(gè)水平，也就是+/-)或者通過(guò)水平的直接數(shù)值來(lái)量化細(xì)胞因子模式。
關(guān)于人肺組織上皮細(xì)胞，boolean法可例示如表1表1變應(yīng)原性/細(xì)胞因子 IL-8 IL-6 MCP-1高 - - -中高 + + -中低 + + +低 + - +在表1中，+表示細(xì)胞因子的存在水平超過(guò)某個(gè)水平，而-表示不存在或低于特定水平。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)物包含至少一種細(xì)胞類型。然而，可能有利的是，對(duì)于評(píng)估的每種測(cè)定化合物，由超過(guò)一種細(xì)胞類型獲得細(xì)胞因子應(yīng)答。通過(guò)使用超過(guò)一種細(xì)胞類型，有可能比使用一種細(xì)胞類型獲得甚至更改進(jìn)的方法，因?yàn)椴煌?xì)胞類型分泌不同細(xì)胞因子?？梢砸詭追N方式安排使用超過(guò)一種細(xì)胞類型的方法和測(cè)定法。
可以使包含不同細(xì)胞類型的兩種分開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)物接觸相同待測(cè)化合物，而且可以分別由每種細(xì)胞培養(yǎng)物獲得細(xì)胞因子模式。然后可以聯(lián)合細(xì)胞因子模式并與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性相互關(guān)聯(lián)。
然而，在使用超過(guò)一種細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，優(yōu)選的是培養(yǎng)物是共培養(yǎng)的。由此，在更大程度上模擬細(xì)胞的天然環(huán)境，獲得的結(jié)果具有更高敏感性。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，共培養(yǎng)兩種細(xì)胞類型。本發(fā)明的共培養(yǎng)物是其中不同細(xì)胞共享同一培養(yǎng)基的培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，共培養(yǎng)物的兩種細(xì)胞類型在物理上是分開(kāi)的。可以使用允許小分子(例如待測(cè)化合物)和/或待測(cè)物質(zhì)通過(guò)的半透膜將細(xì)胞類型分開(kāi)。共培養(yǎng)物的物理設(shè)置可以是，在一個(gè)區(qū)室中培養(yǎng)一種細(xì)胞類型，在插入第一個(gè)區(qū)室內(nèi)的第二個(gè)區(qū)室(即第一個(gè)區(qū)室的子區(qū)室)中培養(yǎng)另一種細(xì)胞類型。
這種共培養(yǎng)設(shè)置的優(yōu)點(diǎn)可能是第二種細(xì)胞類型不僅將受到待測(cè)化合物的影響，還將受到第一種細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞類型生成的細(xì)胞因子的影響，從而誘導(dǎo)第二種細(xì)胞類型的更天然的細(xì)胞因子應(yīng)答。
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，可以是待測(cè)化合物不能通過(guò)膜。在如此提供的實(shí)施方案中，第二種區(qū)室中的細(xì)胞培養(yǎng)物受到第一種細(xì)胞培養(yǎng)物生成的細(xì)胞因子的影響，而不受實(shí)際的待測(cè)化合物的影響。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，向一種細(xì)胞類型的培養(yǎng)物中加入待測(cè)化合物，然后將上清液轉(zhuǎn)移到第二種細(xì)胞類型的第二種培養(yǎng)物中。在這種情況中，第一種培養(yǎng)物生成的細(xì)胞因子與待測(cè)化合物一起將影響第二種細(xì)胞培養(yǎng)物。
對(duì)于所有上述培養(yǎng)實(shí)施方案，可以在向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入培養(yǎng)基之前向培養(yǎng)基中加入待測(cè)化合物。
共培養(yǎng)細(xì)胞類型的優(yōu)選組合是上皮細(xì)胞類型與非上皮細(xì)胞類型，諸如這樣的組合，其中第一種細(xì)胞類型選自呼吸道上皮細(xì)胞、胃腸道上皮細(xì)胞、和角質(zhì)細(xì)胞，而第二種細(xì)胞類型選自樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、和內(nèi)皮細(xì)胞。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞類型是呼吸道上皮細(xì)胞，而第二種細(xì)胞類型選自樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、和內(nèi)皮細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞類型是呼吸道上皮細(xì)胞，而第二種細(xì)胞類型選自樹(shù)突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
可以通過(guò)任何適用方法來(lái)測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答，諸如使用針對(duì)所生成細(xì)胞因子的抗體形式或針對(duì)所生成細(xì)胞因子的編碼cDNA或mRNA的引物或探針形式的決定簇。
因此，可以使用針對(duì)所測(cè)定的細(xì)胞因子的抗體通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)來(lái)測(cè)定胞外細(xì)胞因子應(yīng)答。由此獲得細(xì)胞應(yīng)答與待測(cè)化合物的相互作用而分泌的細(xì)胞因子的定量測(cè)定。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)上文所述ELISA來(lái)測(cè)量胞外細(xì)胞因子應(yīng)答。
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)原位雜交技術(shù)來(lái)測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答，優(yōu)選使用針對(duì)所測(cè)定細(xì)胞因子的編碼mRNA的探針。
同樣，可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)來(lái)測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答，特別是使用針對(duì)所測(cè)定細(xì)胞因子的編碼mRNA的引物。可以通過(guò)定量PCR技術(shù)或原位PCR技術(shù)的商品化技術(shù)分析來(lái)測(cè)定細(xì)胞因子。
原位PCR與定量PCR之間的本質(zhì)差異是所分析樣品的數(shù)目。為了給出定量數(shù)據(jù)，原位PCR需要大量的相同細(xì)胞培養(yǎng)物(代表研究中的培養(yǎng)物)，對(duì)每個(gè)進(jìn)行不同數(shù)目的PCR循環(huán)，以鑒定所述特定細(xì)胞培養(yǎng)物中特定細(xì)胞因子/膜標(biāo)記的PCR的動(dòng)態(tài)范圍。定量PCR需要每種細(xì)胞培養(yǎng)物的一份樣品。在這種情況中，隨時(shí)間追蹤PCR產(chǎn)物的發(fā)展，由此提供定量數(shù)據(jù)(ABI Prism 7700型序列檢測(cè)系統(tǒng))。
除了測(cè)定所用細(xì)胞類型的細(xì)胞因子應(yīng)答以外，可能有利的是測(cè)定由待測(cè)化合物在展示與其發(fā)生顯著的非特異性相互作用的細(xì)胞中誘導(dǎo)的膜標(biāo)記。在這方面，優(yōu)選的是測(cè)定膜標(biāo)記VCAM-1或ICAM-1。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，所評(píng)估細(xì)胞因子的水平和數(shù)目是與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性效能有關(guān)的因素。為了本發(fā)明的目的，所評(píng)估細(xì)胞因子的水平和數(shù)目是與低變應(yīng)原性待測(cè)化合物有關(guān)的因素，而且所評(píng)估細(xì)胞因子的水平和數(shù)目是與高變應(yīng)原性待測(cè)化合物有關(guān)的因素。
依照本發(fā)明，高變應(yīng)原性待測(cè)化合物可能不引發(fā)任何細(xì)胞因子應(yīng)答，即與基線細(xì)胞因子水平相比。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)于在本發(fā)明所述細(xì)胞類型中測(cè)試的四種細(xì)胞因子，高變應(yīng)原性待測(cè)化合物可能不引發(fā)任何細(xì)胞因子應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，低變應(yīng)原性待測(cè)化合物可能引發(fā)至少一種細(xì)胞因子的細(xì)胞因子應(yīng)答，諸如兩種不同的細(xì)胞因子。而在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，中高變應(yīng)原可能引發(fā)一種細(xì)胞因子的應(yīng)答，諸如IL-8。然而，絕對(duì)分泌量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于低變應(yīng)原性分子的應(yīng)答(以pmol測(cè)量)。
待測(cè)化合物變應(yīng)原性的評(píng)估方法在對(duì)多種待測(cè)化合物篩選變應(yīng)原性中特別有用。
因此，本發(fā)明涉及用于同時(shí)篩選至少兩種待測(cè)化合物的變應(yīng)原性的方法，包括下列步驟a)在上文確定的細(xì)胞培養(yǎng)物的至少兩個(gè)分開(kāi)的區(qū)室中安排特定細(xì)胞類型；b)使分開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)室分別接觸待測(cè)化合物；c)通過(guò)對(duì)展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用的相應(yīng)細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答來(lái)確定特定細(xì)胞因子模式；并d)使每種細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性相互關(guān)聯(lián)。
篩選方法當(dāng)然優(yōu)選同時(shí)用于超過(guò)兩種待測(cè)化合物，諸如大約10種待測(cè)化合物，或者同時(shí)用于甚至大約100種待測(cè)化合物。篩選方法特別適用于測(cè)試針對(duì)變應(yīng)原性進(jìn)行了修飾的化合物。
在待測(cè)化合物中影響其變應(yīng)原性的這些修飾可以通過(guò)突變蛋白質(zhì)變應(yīng)原中的IgE特異性表位來(lái)進(jìn)行。可以通過(guò)幾種技術(shù)來(lái)測(cè)定這些表位的定位，諸如公開(kāi)于U.Lovborg的WO 92/10755；Walshet等人，J.Immunol.Methods，1211275-1280，1989；和Schoofs等人，J.Immunol.，140611-616，1987中的技術(shù)。用于鑒定表位的優(yōu)選方法是用抗體(如IgE抗體)篩選隨機(jī)肽文庫(kù)并比對(duì)高結(jié)合肽序列以鑒定共有序列，繼而將這些共有序列與期望突變后降低變應(yīng)原性的親本蛋白質(zhì)的序列和三維結(jié)構(gòu)比較，以鑒定親本蛋白質(zhì)的線性和結(jié)構(gòu)表位。
在搜索這種具有改進(jìn)特性的蛋白質(zhì)變體時(shí)，可能有利的是建立多樣性突變體文庫(kù)，在每一個(gè)突變體中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)改變的氨基酸，并選擇那些顯示改進(jìn)特性的變體。這種期望特性可以是在本發(fā)明方法中由有利細(xì)胞因子應(yīng)答表達(dá)的變應(yīng)原性降低。
可以通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的一套技術(shù)來(lái)建立多樣性文庫(kù)(M.T.Reetz和K.E.Jaeger，在W.D.Fessner編的《Biocatalysis-from Discovery to Application》一書(shū)中，第200卷，第31-57頁(yè)，1999；Stemmer，Nature，370389-391，1994；Zhao和Arnold，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，947997-8000，1997；Yano等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，955511-5515，1998；和S.J.Deng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92(11)4992-4996，1995)。
這些技術(shù)包括但不限于“剌狀誘變(spiked mutagenesis)”，即使用一種或多種寡核苷酸引物通過(guò)PCR誘變使蛋白質(zhì)序列的某些位置隨機(jī)化，所述引物是使用核苷酸混合物針對(duì)某些位置而合成(T.Lanio和A.Jeltsch，Biotechnoques，25(6)958、962、964-965，1998)?？梢栽O(shè)計(jì)用于每個(gè)三聯(lián)體的寡核苷酸混合物，使得突變型基因產(chǎn)物的相應(yīng)氨基酸以某些預(yù)先確定的分布函數(shù)隨機(jī)化。存在便于這種設(shè)計(jì)的算法(L.J.Jensen等人，Nucleic Acids Research，26(3)697-702，1998)。
用于構(gòu)建多樣性基因文庫(kù)的另一種方法是使用不同但同源的大量基因作為出發(fā)點(diǎn)的“家族改組(family shuffling)”(Stemmer，Natue，370389-391，1994)。將這些基因片段化，并將片段作為模板用于PCR反應(yīng)，產(chǎn)生的雜合基因產(chǎn)物中摻入了來(lái)自幾種親本基因的序列元件。
正如上文所述參考文獻(xiàn)中的描述，這些方法可以平行或連續(xù)的用于生成蛋白質(zhì)主鏈的定向進(jìn)化，以獲得期望特性，諸如低變應(yīng)原性。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)包括下列步驟的方法得到替代1)列出涵蓋幾個(gè)表位區(qū)域的一套替代、添加、和/或刪除，2)設(shè)計(jì)例如通過(guò)隨機(jī)誘變將氨基酸序列的這些改變的隨機(jī)化子集導(dǎo)入靶基因的文庫(kù)，3)表達(dá)文庫(kù)，并使用本發(fā)明的方法選擇優(yōu)選變體。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在能夠以高通量形式處理多樣性文庫(kù)的許多變體的自動(dòng)化測(cè)定系統(tǒng)中選擇優(yōu)選變體。在那種情況中，待測(cè)化合物通常是由可以滴定板形式培養(yǎng)的細(xì)胞(如細(xì)菌或酵母細(xì)胞或者其它細(xì)胞)分泌的蛋白質(zhì)。除了待測(cè)化合物，細(xì)胞上清液還將包含可引起不同于基線的細(xì)胞因子應(yīng)答的大量其它化合物。它們可以是完整細(xì)胞；來(lái)自細(xì)胞裂解的細(xì)胞壁或其它細(xì)胞器碎片；脂多糖；糖蛋白；小分子等。可能有利的是，防止這些化合物接觸本發(fā)明的細(xì)胞，從而將背景信號(hào)降至最低。
在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，平行進(jìn)行至少兩次測(cè)定一次是使用本發(fā)明方法的測(cè)定法，另一次是待測(cè)化合物的功能測(cè)定法。在蛋白酶待測(cè)化合物的情況中，功能測(cè)定法可以是蛋白酶活性測(cè)定法?？梢允褂玫孜颪-Suc-Ala-Ala-Pro-苯丙氨酰基-對(duì)硝基苯胺來(lái)測(cè)定蛋白酶活性。蛋白酶切割肽與對(duì)硝基苯胺之間的鍵，產(chǎn)生看得見(jiàn)的黃色(吸收位于405nm)。因而，混合底物與蛋白酶溶液，并以時(shí)間的函數(shù)監(jiān)測(cè)405nm處的吸光率，作為樣品中蛋白酶活性的量度。本發(fā)明這些實(shí)施方案的范圍絕非限于蛋白酶，它只是提供一個(gè)范例。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種方法添加了額外篩選輪和/或由第一輪篩選進(jìn)行家族改組(J.E.Ness等人，Nature Biotechnology，17893-896，1999)，或者聯(lián)合通過(guò)遺傳手段降低變應(yīng)原性的其它方法(諸如公開(kāi)于WO 92/10755)。
待測(cè)化合物可以是懷疑在動(dòng)物(包括人)體內(nèi)引發(fā)變應(yīng)性應(yīng)答的任何化合物。變應(yīng)性應(yīng)答可以是任何變應(yīng)性應(yīng)答，諸如由吸入化合物引起的肺部變應(yīng)性應(yīng)答，或是由皮膚接觸變應(yīng)原引起的皮膚變態(tài)反應(yīng)，或是甚至由消化后的變應(yīng)原引起的胃腸變態(tài)反應(yīng)。
因此，待測(cè)化合物可以是任何蛋白質(zhì)，諸如糖蛋白、脂蛋白、蛋白脂、或磷脂。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)意欲還包括肽和多肽。
具體而言，待測(cè)化合物可以是酶或其變體，諸如糖基水解酶、糖酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、多糖裂解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、和葡萄糖異構(gòu)酶。具體如下蛋白酶蛋白酶(即依照國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUBMB)的推薦(1992)歸類在酶分類編號(hào)E.C.3.4下的酶)包括屬于這組的蛋白酶。范例包括那些歸類在下列酶分類編號(hào)(E.C.)下的蛋白酶3.4.11(即所謂的氨肽酶)，包括3.4.11.5(脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.9(X-pro氨肽酶)、3.4.11.10(細(xì)菌亮氨酰氨肽酶)、3.4.11.12(嗜熱氨肽酶)、3.4.11.15(賴氨酰氨肽酶)、3.4.11.17(色氨酰氨肽酶)、3.4.11.18(甲硫氨酰氨肽酶)；
3.4.21(即所謂的絲氨酸內(nèi)肽酶)，包括3.4.21.1(胰凝乳蛋白酶)、3.4.21.4(胰蛋白酶)、3.4.21.25(黃瓜素(cucumisin))、3.4.21.32(Brachyurin)、3.4.21.48(Cerevisin)、和3.4.21.62(枯草蛋白酶)；3.4.22(即所謂的半胱氨酸內(nèi)肽酶)，包括3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、3.4.22.3(無(wú)花果蛋白酶(Ficain))、3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、3.4.22.7(蘿摩蛋白酶)、3.4.22.14(獼猴桃蛋白酶)、3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))、和3.4.22.31(Ananain)；3.4.23(即所謂的天冬氨酸內(nèi)肽酶)，包括3.4.23.1(胃蛋白酶A)、3.4.23.18(Aspergillopepsin I)、3.4.23.20(Penicillopepsin)、和3.4.23.25(Saccharopepsin)；和3.4.24(即所謂的金屬內(nèi)肽酶)，包括3.4.24.28(Bacillolysin)。
相關(guān)枯草蛋白酶的范例包括枯草蛋白酶BPN’、枯草蛋白酶amylosacchariticus、枯草蛋白酶168、枯草蛋白酶腸系膜肽酶、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶DY、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147、thermitase、aqualysin、芽孢桿菌PB92蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶TW7、蛋白酶TW3、和芽孢桿菌PD498(WO 93/24623)。
這些易于獲得的商品化蛋白酶的具體范例包括Esperase、Alcalase、Neutrase、Dyrazym、Savinase、Pyrase、胰腺胰蛋白酶NOVO(PTN)、Bio-FeedTMPro、Clear-Lens Pro(所有這些酶都可以由Novo Nordisk A/S獲得)。
其它商品化蛋白酶的范例包括由Gist-Brocades N.V.出售的Maxtase、Maxacal、Maxapem，由Solvay et Cie.出售的Opticlean，由Genencor International出售的Purafect。
蛋白酶變體的范例公開(kāi)于EP 130.756(Genentech)、EP 214.435(Henkel)、WO 87/04461(Amgen)、WO 87/05050(Genex)、EP 251.446(Genencor)、EP 260.105(Genencor)、Thomas等人，Nature，318375-376，1985、Thomas等人，J.Mol.Biol.，193803-813，1987、Russel等人，Nature，328496-500，1987、WO 88/08028(Genex)、WO 88/08033(Amgen)、WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)、WO 91/00345(Novo Nordisk A/S)、EP 525.610(Solvay)、和WO 94/02618(Gist-Brocades N.V.)。
可以如《Methods of Enzymatic Analysis》，第3版，1984，VerlagChemie，Weinheim，第5卷中所述，測(cè)定蛋白酶及其變體的活性。脂肪酶脂肪酶(即依照國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUBMB)的推薦(1992)歸類在酶分類編號(hào)E.C.3.1.1(羧基酯水解酶)下的酶)包括屬于這組的脂肪酶。
范例包括歸類在下列酶分類編號(hào)(E.C.)下的脂肪酶3.1.1(即所謂的羧基酯水解酶)，包括3.1.1.3(甘油三酯脂肪酶)和3.1.1.4(磷脂酶A2)。
脂肪酶的范例包括由下列微生物衍生的脂肪酶。指出的專利發(fā)表物收入本文作為參考腐質(zhì)霉屬(Humicola)，如短孢腐質(zhì)霉(H.brevispora)、H.lanuginosa、H.brevis var. thermoidea、和H.insolens(US4,810,414)；假單胞菌屬(Pseudomonas)，如莓實(shí)假單胞菌(Ps.fragi)、施氏假單胞菌(Ps.stutzeri)、洋蔥假單胞菌(Ps.cepacia)、和熒光假單胞菌(Ps.fluorescens)(WO 89/04361)，或植物假單胞菌(Ps.plantarii)和唐菖蒲假單胞菌(Ps.gladioli)(US 4,950,417，Solvay enzymes)，或產(chǎn)堿假單胞菌(Ps.alcaligenes)和類產(chǎn)堿假單胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，或門多薩假單胞菌(Ps.mendocina)(WO 88/09367；US 5,389,536)；鐮孢屬(Fusarium)，如尖鐮孢(F.oxysporum)(EP 130,064)或豌豆腐皮鐮孢(F.solani pisi)(WO 90/09446)；毛霉屬(Mucor)，也稱為根毛霉屬(Rhizomucor)，如米赫毛霉(M.miehei)(EP 238,023)；色桿菌屬(Chromobacterium)，特別是粘稠色桿菌(C.viscosum)；
曲霉屬(Aspergillus)，特別是黑曲霉(A.niger)；假絲酵母屬(Candida)，如柱狀假絲酵母(C.cylindracea)也稱為皺落假絲酵母(C.rugosa)和C.antarctica(WO 88/02775)，或C.antarctica脂肪酶A或B(WO 94/01541和WO 89/02916)；地霉(Geotricum)，如白地霉(G.candidum)(Schimada等人，J.Biochem.，106383-388，1989)；青霉屬(Penicillium)，如沙門柏干酪青霉(P.camembertii)(Yamaguchi等人，Gene，10361-67，1991)；根霉屬(Rhizopus)，如德列馬根霉(R.delemar)(Hass等人，Gene，109107-113，1991)、雪白根霉(R.niveus)(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.，56716-719，1992)、或米根霉(R.oryzae)；芽孢桿菌屬(Bacillus)，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(Dartois等人，Biochemica et Biophsica acta，1131253-260，1993)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)(JP 64/7744992)、或短小芽孢桿菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。
易于獲得的商品化脂肪酶的具體范例包括Lipolase、LipolaseTMUltra、Lipozyme、Palatase、Novozym435、Lecitase(所有這些酶都可以由Novo Nordisk A/S獲得)。
其它脂肪酶的范例是LumafastTM，來(lái)自Genencor國(guó)際公司的門多薩假單胞菌(Ps.mendocina)脂肪酶；LipomaxTM，來(lái)自GistBrocades/Genencor國(guó)際公司的類產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶；來(lái)自Unilever的腐皮鐮孢脂肪酶(角質(zhì)酶)；來(lái)自Solvay enzymes的芽孢桿菌脂肪酶。可以由其它公司獲得其它脂肪酶。
脂肪酶變體的范例描述于如WO 93/01285和WO 95/22615。
可以如《Methods of Enzymatic Analysis》，第3版，1984，VerlagChemie，Weinheim，第4卷中所述，或者如AF 95/5 GB(可以向NovoNordisk A/S索取)中所述，測(cè)定脂肪酶的活性。氧化還原酶氧化還原酶(即依照國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUBMB)的推薦(1992)歸類在酶分類編號(hào)E.C.1(氧化還原酶)下的酶)包括屬于這組的氧化還原酶。
范例包括那些歸類在下列酶分類編號(hào)(E.C.)下的氧化還原酶甘油-3-磷酸脫氫酶_NAD+_(1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脫氫酶_NAD(P)+_(1.1.1.94)、甘油-3-磷酸1-脫氫酶_NADP_(1.1.1.94)、葡萄糖氧化酶)(1.1.3.4)、己糖氧化酶(1.1.3.5)、兒茶酚氧化酶(1.1.3.14)、膽紅素氧化酶(1.3.3.5)、丙氨酸脫氫酶(1.4.1.1)、谷氨酸脫氫酶(1.4.1.2)、谷氨酸脫氫酶_NAD(P)+_(1.4.1.3)、谷氨酸脫氫酶NADP+_(1.4.1.4)、L-氨基酸脫氫酶(1.4.1.5)、絲氨酸脫氫酶(1.4.1.7)、纈氨酸脫氫酶_NADP+_(1.4.1.8)、亮氨酸脫氫酶(1.4.1.9)、甘氨酸脫氫酶(1.4.1.10)、L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)、D-氨基酸氧化酶(1.4.3.3)、L-谷氨酸氧化酶(1.4.3.11)、蛋白質(zhì)-賴氨酸6-氧化酶(1.4.3.13)、L-賴氨酸氧化酶(1.4.3.14)、L-天冬氨酸氧化酶(1.4.3.16)、D-氨基酸脫氫酶(1.4.99.1)、蛋白質(zhì)二硫化物還原酶(1.6.4.4)、硫氧還蛋白還原酶(1.6.4.5)、蛋白質(zhì)二硫化物還原酶(谷胱甘肽)(1.8.4.2)、漆酶(1.10.3.2)、過(guò)氧化氫酶(1.11.1.6)、過(guò)氧化物酶(1.11.1.7)、脂肪加氧酶(1.13.11.12)、超氧化物歧化酶(1.15.1.1)。
所述葡萄糖氧化酶可衍生自黑曲霉。
所述漆酶可衍生自多孔菌Polyporus pinsitus、Myceliophtorathermophila、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus )、茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)、Rhizoctonia praticola、Scytalidiumthermophilum、和Rhus vernicifera。
膽紅素氧化酶可衍生自疣孢漆斑菌(Myrothecheciumverrucaria)。
過(guò)氧化物酶可衍生自如大豆、辣根、或灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)。
蛋白質(zhì)二硫化物還原酶可以是DK專利申請(qǐng)?zhí)?68/93、265/94、和264/94(Novo Nordisk A/S)(收入本文作為參考)之任一中提到的任何一種，包括牛起源的蛋白質(zhì)二硫化物還原酶、衍生自米曲霉或黑曲霉的蛋白質(zhì)二硫化物還原酶、和衍生自大腸桿菌的DsbA或DsbC。
易于獲得的商品化氧化還原酶的具體范例包括GluzymeTM(可以由Novo Nordisk A/S獲得的酶)。然而，可以由其它公司獲得其它氧化還原酶。
可以如《Methods of Enzymatic Analysis》，第3版，1984，VerlagChemie，Weinheim，第3卷中所述，測(cè)定氧化還原酶及其變體的活性。糖酶糖酶可以確定為能夠水解糖鏈(如淀粉，尤其是5和6元環(huán)結(jié)構(gòu))的所有酶(即依照國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUBMB)的推薦(1992)歸類在酶分類編號(hào)E.C.3.2(糖苷酶)下的酶)。
范例包括歸類在下列酶分類編號(hào)(E.C.)下的糖酶α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶(3.2.1.3)、纖維素酶(3.2.1.4)、內(nèi)切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、幾丁質(zhì)酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-葡萄糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1，6-葡萄糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1，4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-D-葡萄糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精內(nèi)切-1，6-葡萄糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡萄糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖內(nèi)切-1，3-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1，4-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖內(nèi)切-1，6-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.75)、阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5-α-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、幾丁質(zhì)聚糖酶(chitonanase，3.2.1.132)。
相關(guān)糖酶的范例包括衍生自Trichoderma harzianum的α-1，3-葡聚糖酶；衍生自擬青霉屬(Paecilomyces)菌株的α-1，6-葡聚糖酶；衍生自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的β-葡聚糖酶；衍生自Humicola insolens的β-葡聚糖酶；衍生自黑曲霉(Aspergillusniger)的β-葡聚糖酶；衍生自木霉屬(Trichoderma)菌株的β-葡聚糖酶；衍生自溶黃嘌呤厄氏菌(Oerskovia xanthineolytica)菌株的β-葡聚糖酶；衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)的外切-1，4-α-D-葡萄糖苷酶(葡萄糖淀粉酶)；衍生自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的α-淀粉酶；衍生自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusmyloliquefaciens)的α-淀粉酶；衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶；衍生自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶；衍生自非致病性微生物的α-淀粉酶；衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)的α-半乳糖苷酶；衍生自Humicola insolens的戊聚糖酶、木聚糖酶、纖維二糖酶、纖維素酶、半纖維素酶；衍生自Trichoderma reesei的纖維素酶；衍生自非致病性霉菌的纖維素酶；衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)的果膠酶、纖維素酶、阿拉伯糖酶、半纖維素酶；衍生自淡紫青霉(Penicilliumlilacinum)的葡聚糖酶；衍生自非致病性霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶；衍生自Bacillus acidopullyticus的支鏈淀粉酶；衍生自脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromyces fragilis)的β-半乳糖苷酶；衍生自Trichodermareesei的木聚糖酶。
易于獲得的商品化糖酶的具體范例包括Alpha-GalTM、Bio-FeedTMAlpha、Bio-FeedTMBeta、Bio-FeedTMPlus、Bio-FeedTMPlus、Novozyme188、Carezyme、Celluclast、Cellusoft、Ceremyl、Citrozym、Denimax、DezymeTM、DextrozymeTM、FinizymTM、FungamylTM、GamanaseTM、Glucanex、Lactozym、MaltogenaseTM、PentopanTM、PectinexTM、Promozyme、PulpzymeTM、NovamylTM、TermamylTM、AMG(淀粉葡萄糖苷酶Novo)、Maltogenase、Sweetzyme、Aquazym(所有這些酶都可以由Novo Nordi sk A/S獲得)?？梢杂善渌精@得其它糖酶。裂解酶合適的裂解酶包括多糖裂解酶果膠酸酯裂解酶(4.2.2.2)和果膠裂解酶(4.2.2.10)，諸如WO 99/27083中公開(kāi)的來(lái)自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的那些裂解酶。異構(gòu)酶范例包括歸類在下列酶分類編號(hào)(E.C.)下的異構(gòu)酶如木糖異構(gòu)酶(5.3.1.5)。相關(guān)異構(gòu)酶的范例是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，諸如WO95/01425(Novo Nordisk A/S)中公開(kāi)的那種酶。易于獲得的商品化異構(gòu)酶的具體范例是Sweetzyme。
可以如《Methods of Enzymatic Analysis》，第3版，1984，VerlagChemie，Weinheim，第4卷中所述，測(cè)定糖酶或其變體的活性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，待測(cè)化合物是任何成份，諸如用于酶配方的穩(wěn)定劑。特別是關(guān)于酶生產(chǎn)，感興趣的是獲得變應(yīng)原性盡可能小的酶變體，從而降低酶工業(yè)工作人員患上呼吸道變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在測(cè)試懷疑會(huì)引起呼吸道變態(tài)反應(yīng)的待測(cè)化合物，諸如酶及其變體時(shí)，優(yōu)選使用呼吸道上皮細(xì)胞。
待測(cè)化合物自身可能具有免疫原性，或者認(rèn)為是半抗原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，待測(cè)化合物是藥物配方的任何化合物，諸如活性藥物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，待測(cè)化合物可以是用于化妝品的化合物。在這種情況中，具體地是接觸變態(tài)反應(yīng)，而且優(yōu)選的第一種細(xì)胞類型是角質(zhì)細(xì)胞。
同樣，待測(cè)化合物可以是有機(jī)溶劑、染料、或金屬。
依照本發(fā)明，以足以引發(fā)可檢測(cè)細(xì)胞因子應(yīng)答的濃度向選擇的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入待測(cè)化合物。待測(cè)化合物的濃度可以隨討論中的待測(cè)化合物而變化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，待測(cè)化合物濃度可以是1、10、或100μg/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入的待測(cè)化合物濃度可依賴待測(cè)化合物與細(xì)胞培養(yǎng)物的保溫時(shí)間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，待測(cè)化合物的保溫時(shí)間可以是0-16小時(shí)，諸如0、2、4、6、或16小時(shí)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，將本發(fā)明的方法用于評(píng)估待測(cè)化合物的毒性，包括下列步驟
a)獲得預(yù)先確定和預(yù)先鑒定的包含至少一種動(dòng)物(包括人)起源細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞類型能夠與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用并在相互作用后以細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行應(yīng)答；并b)使細(xì)胞培養(yǎng)物接觸待測(cè)化合物；c)通過(guò)針對(duì)至少一種預(yù)先確定的細(xì)胞因子測(cè)定該細(xì)胞的細(xì)胞因子應(yīng)答，由此確定特定細(xì)胞因子模式，該細(xì)胞展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用；并d)使細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的毒性相互關(guān)聯(lián)。
如上文關(guān)于待測(cè)化合物的變應(yīng)原性評(píng)估所述，有可能使待測(cè)化合物的毒性與生成的細(xì)胞因子水平相互關(guān)聯(lián)，因?yàn)榛衔锏亩拘栽礁撸傻募?xì)胞因子水平越低。因而，本發(fā)明還涉及同時(shí)篩選至少兩種待測(cè)化合物的毒性的方法，包括下列步驟a)在至少兩個(gè)分開(kāi)的區(qū)室中安排上文確定的細(xì)胞培養(yǎng)；b)使細(xì)胞培養(yǎng)物分別接觸待測(cè)化合物；c)通過(guò)對(duì)展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用的相應(yīng)細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答來(lái)確定特定細(xì)胞因子模式；并d)使每種細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的毒性相互關(guān)聯(lián)。
在還有一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于在高通量篩選中評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性或毒性的鑒定試劑盒，其中所述鑒定試劑盒包括下列部分a)包含至少一種動(dòng)物(包括人)細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物；b)由至少一對(duì)具有特定細(xì)胞因子特異性的單克隆抗體選擇的細(xì)胞因子決定簇，至少一種用于mRNA檢測(cè)的細(xì)胞因子特異性探針，至少一套用于mRNA或cDNA檢測(cè)的細(xì)胞因子特異性引物；c)包含至少兩個(gè)區(qū)室的測(cè)定裝置。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定試劑盒還涉及至少一對(duì)具有特定膜標(biāo)記特異性的單克隆抗體、至少一種具有特定膜標(biāo)記特異性的單克隆抗體、用于mRNA檢測(cè)的至少一種膜標(biāo)記特異性探針、和用于mRNA或cDNA檢測(cè)的至少一套膜標(biāo)記特異性引物。
如上所述，鑒定試劑盒可包含一種細(xì)胞類型或細(xì)胞類型的聯(lián)合，后者或是共培養(yǎng)或是分開(kāi)培養(yǎng)。此外，鑒定試劑盒可包含用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠容易的確定適用于培養(yǎng)本文指定細(xì)胞的培養(yǎng)基。
優(yōu)選的是，鑒定試劑盒包含變應(yīng)原性標(biāo)準(zhǔn)，即根據(jù)所測(cè)定細(xì)胞因子模式用于評(píng)估討論中的待測(cè)化合物的變應(yīng)原性的標(biāo)準(zhǔn)。變應(yīng)原性標(biāo)準(zhǔn)可以是與鑒定試劑盒有關(guān)的信息的形式，或者是將待測(cè)化合物與變應(yīng)原性已知的化合物一起共評(píng)估由此將由待測(cè)化合物獲得的細(xì)胞因子模式與由已知化合物獲得的模式相互關(guān)聯(lián)的形式。
優(yōu)選將鑒定試劑盒安排用于同時(shí)測(cè)試幾種待測(cè)化合物，諸如同時(shí)測(cè)試至少兩種化合物，更優(yōu)選至少10種待測(cè)化合物，最優(yōu)選能夠同時(shí)評(píng)估大約100種待測(cè)化合物的變應(yīng)原性。
可以將試劑盒看成幾個(gè)部分，即試劑盒可以由幾個(gè)不同部分聯(lián)合而成，諸如來(lái)自一種來(lái)源的細(xì)胞培養(yǎng)物、來(lái)自另一種來(lái)源的決定簇、和來(lái)自第三種來(lái)源的測(cè)定裝置。
測(cè)定裝置是任何適用裝置，諸如具有至少一個(gè)孔的板，其中可以培養(yǎng)細(xì)胞并接觸待測(cè)化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定裝置在每個(gè)孔中包含至少兩個(gè)區(qū)室，從而有可能在相同孔中共培養(yǎng)兩種類型的細(xì)胞，并由上文所述的聯(lián)合來(lái)評(píng)估細(xì)胞因子應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在24、48、或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。為了建立共培養(yǎng)，在不允許細(xì)胞發(fā)生物理接觸之處，可以使用特定插入物，準(zhǔn)確確定的通透膜(Nunc TC插入物)。
鑒定試劑盒可用于評(píng)估任何待測(cè)化合物的變應(yīng)原性和任何待測(cè)化合物的毒性。
實(shí)驗(yàn)下文描述了在實(shí)施例中使用的實(shí)驗(yàn)。方法1.生物測(cè)定法在用溶于水的2％(v/v)Ultroser G預(yù)先包被的培養(yǎng)瓶(Nunc)中以1500-3000個(gè)細(xì)胞/cm2接種人肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B，ATCC#CRL-9609)，并在含2％(v/v)Ultroser G的LHC-9培養(yǎng)基中于37℃、5％CO2進(jìn)行培養(yǎng)。
在達(dá)到匯合前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。除去培養(yǎng)基，并加入新鮮的溶于0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.03％(w/v)EDTA的0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液，直至細(xì)胞離壁(通常于室溫5-10分鐘后)。加入LHC-9培養(yǎng)基，通過(guò)離心(300xg，15min)收集細(xì)胞，并重懸于含2％(v/v)ultroser G的LHC-9培養(yǎng)基。最后，以1500-3000個(gè)細(xì)胞/cm2將細(xì)胞分發(fā)到預(yù)先包被的培養(yǎng)瓶(Nunc)中。
當(dāng)可以獲得足夠細(xì)胞用于進(jìn)行計(jì)劃數(shù)目的測(cè)定法時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，并以1×105個(gè)細(xì)胞/孔轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板(Nunc)中。在含2％(v/v)Ultroser G的LHC-9培養(yǎng)基中于37℃、5％CO2保溫24小時(shí)。然后，除去培養(yǎng)基，并加入新鮮且預(yù)熱的含2％(v/v)UltroserG和所研究蛋白質(zhì)的LHC-9培養(yǎng)基。不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，用100μg大腸桿菌LPS 055B5刺激的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)測(cè)定法一式三份。
通過(guò)ELISA(R&D Systems)評(píng)估選擇的細(xì)胞因子的胞外表達(dá)，作為保溫時(shí)間和蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)。在收集后立即對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行ELISA，或者對(duì)保存于-20℃或更低溫度的培養(yǎng)基進(jìn)行。每次都包括校準(zhǔn)曲線，用于量化檢測(cè)的細(xì)胞因子水平，和用于評(píng)估測(cè)定法的重復(fù)性。2.免疫Brown Norway大鼠每周用100μl 0.9％(w/v)NaCl(對(duì)照組)或100μl上文所述蛋白質(zhì)稀釋液進(jìn)行20次氣管內(nèi)免疫。每組包括10只大鼠。每次在第二次免疫一周后由眼部采集血液樣品(2ml)。通過(guò)血液凝結(jié)和離心獲得血清。3.IgE ELISA使用下列材料進(jìn)行IgE ELISA緩沖液和溶液清洗緩沖液 PBS、0.05％(v/v)吐溫20封閉緩沖液 PBS、2％(w/v)脫脂奶粉稀釋緩沖液 PBS、0.05％(v/v)吐溫20、0.5％(w/v)脫脂奶粉檸檬酸鹽緩沖液 (0.1M，pH5.0-5.2)CovaLink板的激活配制每ml丙酮含10mg氰尿酰氯的新鮮儲(chǔ)液。
臨使用前，一邊攪拌一邊向PBS中加入氰尿酰氯儲(chǔ)液，直至稀釋至終濃度1mg/ml。在CovaLink NH2板的每個(gè)孔中加入100μl稀釋液，并于室溫保溫5分鐘。用PBS清洗3次。
將新鮮制備的激活板于50℃干燥30分鐘。立即用封條密封每個(gè)板。預(yù)先激活的板可以在塑料袋中于室溫保存3周。ELISA流程將小鼠抗大鼠IgE在PBS中稀釋200倍(5μg/ml)。在每個(gè)孔中加入100μl。將板于4℃包被過(guò)夜。
通過(guò)將每個(gè)孔用200μl封閉緩沖液于室溫保溫1小時(shí)來(lái)封閉非特異性吸附。將板用300μl清洗緩沖液清洗3次。
將未知大鼠血清和已知大鼠IgE溶液在稀釋緩沖液中進(jìn)行稀釋，通常未知血清是稀釋10倍、20倍、和40倍，標(biāo)準(zhǔn)IgE由1μg/ml開(kāi)始進(jìn)行稀釋。在每個(gè)孔中加入100μl。于室溫保溫1小時(shí)。
通過(guò)用清洗緩沖液清洗3次而除去未結(jié)合物質(zhì)。將抗大鼠IgE(生物素)在稀釋緩沖液中稀釋2000倍。在每個(gè)孔中加入100μl。于室溫保溫1小時(shí)。通過(guò)用清洗緩沖液清洗3次而除去未結(jié)合物質(zhì)。
將鏈霉親和素在稀釋緩沖液中稀釋1000倍。在每個(gè)孔中加入100μl。于室溫保溫1小時(shí)。通過(guò)用300μl清洗緩沖液清洗3次而除去未結(jié)合物質(zhì)。
將OPD(0.6mg/ml)和H2O2(0.4μl/ml)溶解于檸檬酸鹽緩沖液。在每個(gè)孔中加入100μl。于室溫保溫30分鐘。
通過(guò)加入100μl H2SO4來(lái)終止反應(yīng)。將板于492nm讀數(shù)，620nm作為參考。實(shí)施例1可以在上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的鑒定在這組實(shí)驗(yàn)中，將100μg LPS(脂多糖)用于刺激細(xì)胞。2、4、6、8、和16小時(shí)后進(jìn)行ELISA。表2顯示了在細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(+)，還指出了在用LPS刺激細(xì)胞后在上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中沒(méi)有檢測(cè)到的細(xì)胞因子(-)。
表2細(xì)胞因子 細(xì)胞應(yīng)答IL-1α -IL-1β -IL-2 -IL-4 -IL-5 -IL-6 +IL-8 +IFN-γ -TNF-α -GM-CSF +MCP-1+MIP-1β -RANTES +
圖1a-d顯示了表中指出是陽(yáng)性(+)的細(xì)胞因子的不同動(dòng)力學(xué)。由于IL-8和IL-6展現(xiàn)相似動(dòng)力學(xué)，因此只顯示了IL-8(圖1)。實(shí)施例2由多種蛋白酶衍生物在上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞因子水平的評(píng)估選擇來(lái)自枯草蛋白酶家族的蛋白酶P(CDJ31地衣芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.62))，并用不同大小(具體而言是350、750、1000、2000、和5000Da)的聚乙二醇(PEG)分子進(jìn)行修飾。對(duì)未修飾和已修飾的酶都在上皮細(xì)胞測(cè)定法中評(píng)估它們誘導(dǎo)胞外細(xì)胞因子生成的效能。
為了防止蛋白酶對(duì)細(xì)胞因子的蛋白水解作用，在細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋之前，用PMSF(10mM)抑制前者。通常，在應(yīng)用于細(xì)胞前，將PMSF稀釋大約1000倍。在這些濃度，PMSF及其水解產(chǎn)物對(duì)于細(xì)胞因子生成沒(méi)有可檢測(cè)的影響。
圖2顯示了未修飾和已修飾蛋白酶的IL-8、IL-6、和MCP-1動(dòng)力學(xué)。后者用P-bis-S-PEG2000表示?；€是參照對(duì)照培養(yǎng)基獲得的。對(duì)另一種枯草蛋白酶(PD498芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.66))觀察到幾乎相同的結(jié)果。
為了比較各自的細(xì)胞因子水平，選擇了與100μg蛋白酶保溫4小時(shí)后產(chǎn)生的水平。實(shí)施例3檢測(cè)到的細(xì)胞因子水平和大鼠中的IgE水平與用于酶修飾的PEG分子長(zhǎng)度的相關(guān)性用未修飾和已修飾蛋白酶氣管內(nèi)免疫大鼠，并通過(guò)ELISA檢測(cè)蛋白酶特異性IgE水平。對(duì)整個(gè)研究中檢測(cè)到的IgE水平進(jìn)行積分，并相對(duì)于在用未修飾酶免疫的大鼠中觀察到的水平進(jìn)行比較。在圖3中，(a)顯示了相對(duì)IgE水平隨用于修飾酶的PEG分子的長(zhǎng)度增加而降低。發(fā)現(xiàn)，IL-8水平(b)隨PEG大小的增加而增加，IL-6(c)和MCP-1(d)水平展現(xiàn)鐘形動(dòng)力學(xué)。實(shí)施例4檢測(cè)到的細(xì)胞因子水平與在大鼠中檢測(cè)到的相對(duì)于未修飾酶的IgE水平之間的關(guān)聯(lián)使用實(shí)施例3中獲得的結(jié)果，有可能直接使檢測(cè)到的細(xì)胞因子水平與大鼠中的IgE水平相互關(guān)聯(lián)。
在圖4中，(a)顯示了IL-8水平隨相對(duì)于未修飾酶的IgE水平的增加而降低。相比于未修飾酶，IL-6(b)和MCP-1(c)隨著相對(duì)于未修飾酶的IgE水平升高而急劇升高，隨后急劇降低。
IgE與各種細(xì)胞因子的相互關(guān)聯(lián)可概述如下表3大鼠中的IgE水平(％) IL-8 IL-6 MCP-1＞50 - - -50-25 + + -(p＞0.05)25-10 + + +＜10 + - +實(shí)施例5檢測(cè)到的細(xì)胞因子水平與在使用蛋白酶和立撲萊斯的大鼠中的IgE水平之間的比較在上皮細(xì)胞測(cè)定法中評(píng)估了來(lái)自芽孢桿菌的絲氨酸蛋白酶E.C.3.4.21.66和來(lái)自Humicola lanuginosa的三?；视王；饷?脂肪酶)E.C.3.1.1.3的細(xì)胞因子水平。用相同蛋白酶和脂肪酶氣管內(nèi)免疫大鼠，并通過(guò)ELISA檢測(cè)IgE水平。圖5顯示了經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞因子水平，以及蛋白酶和脂肪酶的IgE水平。
根據(jù)實(shí)施例3表3中顯示的結(jié)果，蛋白酶的變應(yīng)原性高于脂肪酶。因此，由蛋白酶觀察到的所有細(xì)胞因子的低水平符合高IgE水平，而由脂肪酶觀察到的所有細(xì)胞因子的高水平符合顯著較低的IgE水平。
權(quán)利要求
1.用于在體外評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性的方法，包括下列步驟(a)獲得預(yù)先確定和預(yù)先鑒定的包含至少一種動(dòng)物(包括人)起源細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞類型能夠與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用并在相互作用后以細(xì)胞因子表達(dá)的變化進(jìn)行應(yīng)答；(b)使細(xì)胞培養(yǎng)物接觸待測(cè)化合物；(c)通過(guò)就至少一種預(yù)先確定的細(xì)胞因子測(cè)定展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用的細(xì)胞的細(xì)胞因子應(yīng)答，來(lái)確定特定細(xì)胞因子模式；并(d)使細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性相互關(guān)聯(lián)。
2.用于同時(shí)篩選至少兩種待測(cè)化合物的變應(yīng)原性的方法，包括下列步驟a)在權(quán)利要求1中確定的細(xì)胞培養(yǎng)物的至少兩個(gè)分開(kāi)的區(qū)室中安排特定細(xì)胞類型；b)使分開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)物區(qū)室分別接觸待測(cè)化合物；c)通過(guò)對(duì)展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用的相應(yīng)細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答來(lái)確定特定細(xì)胞因子模式；并d)使每種細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性相互關(guān)聯(lián)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種細(xì)胞類型是上皮細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的方法，其中上皮細(xì)胞是呼吸道上皮細(xì)胞。
5.權(quán)利要求3的方法，其中上皮細(xì)胞是胃腸道上皮細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種細(xì)胞類型是角質(zhì)細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種細(xì)胞類型是樹(shù)突細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種細(xì)胞類型是巨噬細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種細(xì)胞類型是肥大細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種細(xì)胞類型是單核細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種細(xì)胞類型是內(nèi)皮細(xì)胞。
12.前述任一權(quán)利要求的方法，包括下列步驟(a)獲得至少兩種細(xì)胞培養(yǎng)物，每種包含一種細(xì)胞類型；(b)使每種細(xì)胞培養(yǎng)物接觸待測(cè)化合物；(c)通過(guò)對(duì)各自展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用的相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答來(lái)確定特定細(xì)胞因子模式；并(d)使細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性相互關(guān)聯(lián)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中將兩種細(xì)胞類型共培養(yǎng)。
14.權(quán)利要求12的方法，其中為所述兩種細(xì)胞類型分別測(cè)定其細(xì)胞因子應(yīng)答。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述兩種細(xì)胞類型的細(xì)胞因子應(yīng)答作為一種應(yīng)答測(cè)定。
16.權(quán)利要求12的方法，其中共培養(yǎng)物中的所述兩種細(xì)胞類型在物理上是分開(kāi)的。
17.權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的方法，其中一種細(xì)胞類型是上皮細(xì)胞，另一種是樹(shù)突細(xì)胞。
18.權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的方法，其中一種細(xì)胞類型是上皮細(xì)胞，另一種是巨噬細(xì)胞。
19.權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的方法，其中一種細(xì)胞類型是上皮細(xì)胞，另一種是肥大細(xì)胞。
20.權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的方法，其中一種細(xì)胞類型是上皮細(xì)胞，另一種是單核細(xì)胞。
21.權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的方法，其中一種細(xì)胞類型是上皮細(xì)胞，另一種是內(nèi)皮細(xì)胞。
22.用于在體外評(píng)估待測(cè)化合物的毒性的方法，包括(a)獲得預(yù)先確定和預(yù)先鑒定的包含至少一種動(dòng)物(包括人)起源細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞類型能夠與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用并在相互作用后以細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行應(yīng)答；并(b)使細(xì)胞培養(yǎng)物接觸待測(cè)化合物；(c)通過(guò)就至少一種預(yù)先確定的細(xì)胞因子測(cè)定展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用的細(xì)胞的細(xì)胞因子應(yīng)答，來(lái)確定特定細(xì)胞因子模式；并(d)使細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的毒性相互關(guān)聯(lián)。
23.用于同時(shí)篩選至少兩種待測(cè)化合物的毒性的方法，包括(a)在至少兩個(gè)分開(kāi)的區(qū)室中安排權(quán)利要求22中確定的細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)使細(xì)胞培養(yǎng)物各自接觸待測(cè)化合物；(c)通過(guò)對(duì)展示與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用的相應(yīng)細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞因子應(yīng)答來(lái)確定特定細(xì)胞因子模式；并(d)使每種細(xì)胞因子模式與待測(cè)化合物的毒性相互關(guān)聯(lián)。
24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)化合物是蛋白質(zhì)。
25.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)化合物是糖蛋白。
26.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)化合物是脂蛋白。
27.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)化合物是蛋白脂。
28.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)化合物是磷脂。
29.權(quán)利要求24-28任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)化合物是酶或其變體。
30.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)化合物用于酶配方。
31.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)化合物是半抗原。
32.權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)化合物是藥物。
33.權(quán)利要求31的方法，其中待測(cè)化合物是化妝品化合物。
34.權(quán)利要求22-23的方法，其中待測(cè)化合物是有機(jī)溶劑。
35.權(quán)利要求31的方法，其中待測(cè)化合物是染料。
36.權(quán)利要求31的方法，其中待測(cè)化合物是金屬。
37.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種細(xì)胞類型衍生自人類組織。
38.權(quán)利要求1-37的方法，其中所述至少一種細(xì)胞類型衍生自人類血液。
39.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中胞外細(xì)胞因子應(yīng)答是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法進(jìn)行分析而測(cè)定的。
40.上述權(quán)利要求1-38任一項(xiàng)的方法，其中胞內(nèi)細(xì)胞因子應(yīng)答是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法進(jìn)行分析而測(cè)定的。
41.上述權(quán)利要求1-38任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞因子應(yīng)答是通過(guò)原位雜交技術(shù)而測(cè)定的。
42.上述權(quán)利要求1-38任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞因子應(yīng)答是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的分析而測(cè)定的。
43.權(quán)利要求42的方法，其中細(xì)胞因子因子是通過(guò)定量PCR技術(shù)的分析而測(cè)定的。
44.權(quán)利要求42的方法，其中細(xì)胞因子應(yīng)答是通過(guò)原位PCR技術(shù)的分析而測(cè)定的。
45.權(quán)利要求41-44的方法，其中測(cè)定胞內(nèi)mRNA。
46.權(quán)利要求1或22的方法，其中測(cè)定了待測(cè)化合物在展示與其發(fā)生顯著的非特異性相互作用的細(xì)胞中誘導(dǎo)的膜標(biāo)記。
47.權(quán)利要求46的方法，其中測(cè)定的膜標(biāo)記是VCAM-1或ICAM-1。
48.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中測(cè)定了超過(guò)一種的細(xì)胞因子。
49.權(quán)利要求48的方法，其中測(cè)定了至少兩種細(xì)胞因子。
50.權(quán)利要求48的方法，其中測(cè)定了至少四種細(xì)胞因子。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所測(cè)定細(xì)胞因子是白介素-8、白介素-6、MCP-1、和GM-CSF。
52.權(quán)利要求1的方法，其中所測(cè)定細(xì)胞因子的水平和數(shù)目是與待測(cè)化合物的變應(yīng)原性效能有關(guān)的因素。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所測(cè)定細(xì)胞因子的水平和數(shù)目是與低變應(yīng)原性待測(cè)化合物有關(guān)的因素。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所測(cè)定細(xì)胞因子的水平和數(shù)目是與高變應(yīng)原性待測(cè)化合物有關(guān)的因素。
55.權(quán)利要求23的方法，其中所測(cè)定細(xì)胞因子的水平和數(shù)目是與待測(cè)化合物的毒性效能有關(guān)的因素。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所測(cè)定細(xì)胞因子的水平和數(shù)目是與低毒性待測(cè)化合物有關(guān)的因素。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所測(cè)定細(xì)胞因子的水平和數(shù)目是與高毒性待測(cè)化合物有關(guān)的因素。
58.用于鑒定上述權(quán)利要求任一項(xiàng)中描述的細(xì)胞類型的細(xì)胞因子應(yīng)答的方法，包括(a)獲得預(yù)先確定的包含一種動(dòng)物(包括人)起源細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞類型能夠與待測(cè)化合物發(fā)生顯著的非特異性相互作用并在相互作用后以細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行應(yīng)答；(b)使用非特異性多價(jià)誘導(dǎo)劑鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物在與待測(cè)化合物發(fā)生非特異性相互作用后可表達(dá)的細(xì)胞因子；(c)使細(xì)胞培養(yǎng)物的一部分接觸待測(cè)化合物，測(cè)定所鑒定細(xì)胞因子的水平，獲得細(xì)胞因子模式；(d)用待測(cè)化合物免疫動(dòng)物并測(cè)定動(dòng)物產(chǎn)生的IgE水平；(e)使細(xì)胞因子模式與測(cè)定得到的IgE水平相互關(guān)聯(lián)；并(f)重復(fù)步驟c-e直至至少測(cè)試了一種高IgE水平的待測(cè)化合物、一種低IgE水平的待測(cè)化合物、和一種中IgE水平的待測(cè)化合物。
59.用于高通量篩選待測(cè)化合物的變應(yīng)原性或毒性的鑒定試劑盒，包括(a)包含至少一種動(dòng)物(包括人)細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)由至少一種對(duì)特定細(xì)胞因子具有特異性的單克隆抗體選擇的細(xì)胞因子決定簇，至少一種用于mRNA檢測(cè)的細(xì)胞因子特異性探針，至少一套用于mRNA或cDNA檢測(cè)的細(xì)胞因子特異性引物；(c)包含至少兩個(gè)區(qū)室的測(cè)定裝置。
60.權(quán)利要求59的鑒定試劑盒，包括至少一種對(duì)特定膜標(biāo)記具有特異性的單克隆抗體、至少一種對(duì)特定膜標(biāo)記具有特異性的單克隆抗體、至少一種用于mRNA檢測(cè)的膜標(biāo)記特異性探針、和至少一套用于mRNA或cDNA檢測(cè)的膜標(biāo)記特異性引物。
61.權(quán)利要求59和60的鑒定試劑盒，其中還包括變應(yīng)原性標(biāo)準(zhǔn)物。
62.權(quán)利要求59-61的鑒定試劑盒用于高通量篩選至少兩種待測(cè)化合物的變應(yīng)原性的用途。
63.權(quán)利要求62的鑒定試劑盒的用途，用于同時(shí)評(píng)估至少10種待測(cè)化合物的變應(yīng)原性。
64.權(quán)利要求62的用途，用于同時(shí)評(píng)估大約100種待測(cè)化合物的變應(yīng)原性。
65.權(quán)利要求60的鑒定試劑盒用于高通量篩選至少兩種待測(cè)化合物的毒性的用途。
66.權(quán)利要求65的鑒定試劑盒的用途，用于同時(shí)評(píng)估至少10種待測(cè)化合物的毒性。
67.權(quán)利要求65的用途，用于同時(shí)評(píng)估大約100種待測(cè)化合物的毒性。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性或毒性和用于同時(shí)篩選至少兩種化合物的方法。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明的細(xì)胞類型的鑒定方法,以及用于化合物高通量篩選的鑒定試劑盒。通過(guò)使至少一種動(dòng)物起源的細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物接觸待測(cè)化合物并測(cè)量細(xì)胞因子應(yīng)答,可以評(píng)估待測(cè)化合物的變應(yīng)原性。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1379859SQ00814212
公開(kāi)日2002年11月13日 申請(qǐng)日期2000年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月15日
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