專利名稱：早期癌癥腫瘤標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)早期癌癥的腫瘤標(biāo)記。
背景技術(shù)：
癌癥的發(fā)展或擴(kuò)大的程度可被描述為早期癌癥、中期癌癥和晚期癌癥。其中，早期癌癥一般被認(rèn)為是“癌癥進(jìn)展的程度是腫瘤小、轉(zhuǎn)移少并且能夠永久性治愈或通過治療能夠長(zhǎng)期抑制的癌癥”。
早期癌癥基本上是沒有癥狀的。所以，當(dāng)試圖近乎完全地檢測(cè)早期癌癥時(shí)，要檢測(cè)的目標(biāo)是沒有癥狀的對(duì)象。人們將目的是從寬范圍的無(wú)癥狀對(duì)象中尋找受特殊疾病影響的患者或者將該寬范圍縮小到需要進(jìn)一步輔助試驗(yàn)的患者的試驗(yàn)一般稱之為篩選。通常在篩選中，試驗(yàn)對(duì)象的數(shù)量非常大。為了測(cè)試許多對(duì)象，這種篩選首先并且最重要的是應(yīng)該方便并且經(jīng)濟(jì)。盡管腫瘤標(biāo)記試驗(yàn)是很少傷害患者的適當(dāng)?shù)臏y(cè)試方法，但目前人們認(rèn)為通過測(cè)定腫瘤標(biāo)記來檢測(cè)早期癌癥是不可能的。
Midkine(本文以后稱之為”MK”)是發(fā)現(xiàn)可作為對(duì)視黃酸應(yīng)答的基因產(chǎn)物的增生和分化因子，并且是富集堿性氨基酸和半胱氨酸的13-kDa多肽(Kadomatsu，K.等Biochem.Biophys.Res.Commun.，1511312-1318；Tomomura，M.等J.Biol.Chem.，26510765-10770，1990)。在各種惡性腫瘤中MK的水平相比于周圍的正常組織升高，這一事實(shí)顯示了MK在癌發(fā)生中起著重要作用。所以，有人已經(jīng)建議用MK基因作探針的Northern印跡法(未審公開的日本專利申請(qǐng)?zhí)?JP-A)Hei6-113898)和含抗-MK蛋白抗體的癌癥診斷劑(JP-A Hei6-172218)來診斷癌癥。但是，這些公開的專利申請(qǐng)既沒有描述也沒有暗示MK基因或MK蛋白可用于早期癌癥的檢測(cè)中。所以，Ye等已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了在人體結(jié)腸直腸癌的腺瘤階段，癌變前組織的MK表達(dá)升高(Ye C.等Br.J Cancer.，79，179-183，1999)。但是，在這篇報(bào)導(dǎo)中沒有描述或暗示有關(guān)的早期癌癥檢測(cè)的任何內(nèi)容。
所以，期望發(fā)現(xiàn)可由早期癌癥狀況進(jìn)行檢測(cè)的腫瘤標(biāo)記和開發(fā)用于檢測(cè)這種標(biāo)記的試驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用作早期癌癥標(biāo)記的新的多肽。另外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用這種多肽作為指標(biāo)檢測(cè)早期癌癥的方法。而且，本發(fā)明的又一目的是提供可檢出這種多肽的用于早期癌癥的外部診斷劑。
本發(fā)明的發(fā)明人員發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌的早期用抗-MK抗體所檢出的肝細(xì)胞癌患者的MK水平與健康對(duì)象或肝炎患者的相比，不僅在肝細(xì)胞癌組織中，而且在血液和尿液中都有顯著提高。即使在胃癌中，也發(fā)現(xiàn)血液和尿液中MK水平在早期也類似于肝癌顯著升高。而且，在許多類型的癌癥如食管癌、十二指腸癌、結(jié)腸癌、膽管癌和膽囊癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肺癌和乳腺癌中，都可以在它們的早期觀察到血清(serum)MK水平的顯著升高。這表明MK具有對(duì)于檢測(cè)未特別指明癌癥的公知腫瘤標(biāo)記中所看不到的非常廣譜的特異性。
按照這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人說明了MK作為早期癌癥標(biāo)記的實(shí)用性。而且，使用本發(fā)明人所開發(fā)的使用酶免疫測(cè)定(EIA)的簡(jiǎn)單而高度敏感的一步三明治(sandwich)方法通過對(duì)各種癌癥早期患者體液中出現(xiàn)的MK水平的高敏感度的檢測(cè)而使得早期癌癥的篩選診斷成為可能。EIA能夠完全自動(dòng)地并且是非常適合用作目的為檢出早期癌癥的MK測(cè)定法。
也就是說，本發(fā)明涉及早期癌癥的檢測(cè)方法，或者早期癌癥的診斷方法和用于這些方法的診斷劑和試劑盒，具體如下(1)一種檢測(cè)早期癌癥的方法，包括(a)在生物樣本中測(cè)定midkine和/或其片段，以及(b)將步驟a)中所得到的測(cè)定水平與健康對(duì)象的測(cè)定水平相比較。
(2)按照(1)的方法，其中早期癌癥是胃癌。
(3)按照(2)的方法，其中胃癌在第I階段(stage I)。
(4)按照(1)的方法，其中早期癌癥是肝細(xì)胞癌。
(5)按照(4)的方法，其中肝細(xì)胞癌是在第I階段。
(6)按照(1)的方法，其中早期癌癥是肺癌。
(7)按照(6)的方法，其中肺癌是在第I階段。
(8)按照(1)的方法，其中生物樣本是血清或尿。
(9)可識(shí)別midkine和/或其片段的抗體在早期癌癥檢測(cè)中的應(yīng)用。
(10)早期癌癥的診斷劑，包括可識(shí)別midkine和/或其片段的抗體。
(11)用于檢測(cè)生物樣本中早期癌癥的試劑盒，其中該試劑盒(a)包括容器，該容器中裝有可與至少一種midkine和/或其片段的表位(epitope)特異性結(jié)合的抗體，和(b)測(cè)定生物樣本中midkine和/或其片段的存在。
(12)按照(11)的試劑盒，其中抗體被吸收在固體上。
(13)一種評(píng)價(jià)癌癥預(yù)后的方法，包括a)測(cè)定生物樣本中的midkine和/或其片段，以及b)將步驟a)中得到的測(cè)定水平與癌癥預(yù)后相關(guān)聯(lián)(correlating)。
(14)按照(13)的方法，其中癌癥是胃癌、肝細(xì)胞癌或肺癌。定義除非另有說明，說明書中所用下列術(shù)語(yǔ)有下列含義。
“早期癌癥(early cancer)”指的是沒有侵襲到周圍組織的、限制在發(fā)生部位(粘膜內(nèi))的腫瘤，或者是已經(jīng)侵襲但侵襲范圍限制在局部區(qū)域的腫瘤。尤其是，沒有表現(xiàn)出侵襲的腫瘤是本發(fā)明的重要檢測(cè)目標(biāo)，因?yàn)樗鼈兒茈y被公知的腫瘤標(biāo)記檢測(cè)出。這種定義適用于幾乎所有癌癥如皮膚癌、口腔癌、呼吸道癌、胃腸道癌、子宮頸癌、卵巢癌、膽囊癌、膀胱癌等癌癥。早期癌癥包括按照TNM分類的0階段(原位癌)和第I階段。在這些癌癥階段，沒有血管內(nèi)的侵襲或遠(yuǎn)距離的轉(zhuǎn)移，并且僅切除局部腫瘤就會(huì)完全康復(fù)。
在本發(fā)明中，“腫瘤標(biāo)記(tumor marker)”被定義為由腫瘤細(xì)胞或與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的物質(zhì)，它可以在組織、體液、分泌物等中發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)能顯示腫瘤的某些特征，如存在、特點(diǎn)或擴(kuò)展。
術(shù)語(yǔ)“MK”包括全長(zhǎng)MK蛋白和含有具有MK生物活性的任意長(zhǎng)度的氨基酸序列的片段。也包括突變MK如可表達(dá)癌癥特異性的缺少N-區(qū)的突變MK(Kaname T.等Biochem.Biophys.Res.Commun.，219256-260，1996)。在這篇描述內(nèi)容中，由遺傳工程技術(shù)所生產(chǎn)的MK和化學(xué)合成的MK可以互換使用。可編碼人全長(zhǎng)MK的DNA序列是公知的(US 5,461,029)。MK的生物活性不僅包括MK對(duì)細(xì)胞的生理作用，而且也包括與抗-MK抗體的免疫反應(yīng)性。
“敏感性(sensitivity)”是指腫瘤存在組中陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果所占的比例，也稱之為陽(yáng)性比例(positivity ratio)。
“特異性(specificity)”是指沒有腫瘤存在的組中陰性測(cè)定結(jié)果所占的比例，也稱之為陰性比例。
“生物樣本(biological sample)”是指能夠從有機(jī)體獲得的樣本。更具體地說，例如是血液、血清、尿液、其他分泌物等。在這些生物樣本中，尿液可用作具有低侵襲性的樣本。因?yàn)槟蛞后w積變化相當(dāng)大，所以為了更精確地比較尿液成分的濃度，希望對(duì)尿液體積進(jìn)行校正。肌酸酐校正等都是校正尿液體積的公知方法。
“階段分類(stage classification)”一般是指通過用肉眼可觀察到的進(jìn)展而對(duì)癌癥進(jìn)行的分類，國(guó)際上普遍使用TNM分類(tumor-node-metastasisstaging)。本發(fā)明所用的“階段分類”對(duì)應(yīng)于TNM分類(“Rinsho，Byori，Genpatsusei Kangan Toriatsukaikiyaku (Clinical and Pathological Codes forHandling Primary liver Cancer)”第22頁(yè)Nihon Kangangaku Kenkyukai(Liver Cancer Study Group of Japan)版本(第3次修訂本)，Kanehara Shuppan，1992)。
而且，在本發(fā)明中，“癌癥的檢測(cè)(detection of cancer)”是指高可能性地判斷受試驗(yàn)者體內(nèi)癌癥的存在。與檢測(cè)成對(duì)比的是，篩選是表示測(cè)試的術(shù)語(yǔ)，特別地其是以任意組為目標(biāo)，目的是縮小很可能患癌癥的對(duì)象的范圍。以特殊對(duì)象為目標(biāo)的癌癥檢測(cè)稱之為診斷，而篩選是以任意組為目標(biāo)。在本發(fā)明中，篩選和診斷只是目標(biāo)不同，本發(fā)明的檢測(cè)方法包含了這二者。
因?yàn)橹钡桨┌Y生長(zhǎng)到一定大小時(shí)，血液中癌細(xì)胞所產(chǎn)生的標(biāo)記含量才不同于健康對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)值，所以通過血清標(biāo)記的量的增長(zhǎng)來檢測(cè)早期癌癥一般被認(rèn)為是不可能的，這就象上文所提到的那樣。
由于在結(jié)腸直腸癌的癌變前期的MK在mRNA和蛋白質(zhì)水平都有高水平的表達(dá)(Ye C.等Br.J Cancer.，79179-183，1999)，所以發(fā)明人對(duì)各種類型的癌癥患者的血液MK的水平進(jìn)行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者(87％)相比于健康對(duì)象，血液MK水平顯著升高。87％相對(duì)于當(dāng)前的腫瘤標(biāo)記是相當(dāng)高的數(shù)值。在癌癥組織中所表達(dá)的MK可能被分泌到血流中，所以認(rèn)為這導(dǎo)致了血液MK水平的增加。在肝細(xì)胞癌、胃癌、肺癌等中，血液MK水平在癌癥早期都升高。
在第I階段，肝細(xì)胞癌或肺癌患者的血液MK水平與健康對(duì)象血液中的標(biāo)準(zhǔn)值相比已經(jīng)顯著升高，并且在第II到IV階段還會(huì)持續(xù)升高。相比之下，在第I階段的胃癌患者中，該水平比健康對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)值明顯升高，但從第II階段和之后，無(wú)論什么階段，MK水平幾乎都保持相同。所以，這表明通過測(cè)定多種癌癥包括肝細(xì)胞癌、肺癌或胃癌的MK而歸類為第I階段的早期癌癥的檢測(cè)是可能的。而且，MK的測(cè)定不僅可以檢測(cè)早期癌癥，而且也可以檢測(cè)不同階段的癌癥，與癌癥的擴(kuò)展和MK的積累無(wú)關(guān)。這一特點(diǎn)對(duì)腫瘤標(biāo)記是非常重要的，因?yàn)橹辉诎┌Y早期發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)記會(huì)帶來忽略進(jìn)展癌癥(progressed cancer)的危險(xiǎn)。
腫瘤標(biāo)記的實(shí)用性一般可以通過可確定癌癥患者是否為陽(yáng)性的“敏感度”和可確定非癌癥患者是否為陰性的“特異性”來評(píng)價(jià)。但是，各種公知的腫瘤標(biāo)記在敏感度和選擇性上都是有局限性的。
就MK而言，它在血液和尿液中的水平在如實(shí)施例中所述的各種未特別指出類型的癌癥早期都比健康對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)水平高。這可以說明MK在非特別指出類型的癌癥中有廣譜特異性并且有高敏感性。對(duì)廣泛篩選不論何種類型的器官的早期癌癥來說，對(duì)指定類型的癌癥進(jìn)行檢測(cè)的高敏感性和特異性以及在檢測(cè)未特別指出類型癌癥中的廣譜特異性都是所希望具有的。MK被認(rèn)為具有這種篩選所需的敏感性和特異性。
而且，基于本發(fā)明的早期癌癥檢測(cè)方法增加了(augment)已知腫瘤標(biāo)記的敏感性和特異性的局限。已知組合多種腫瘤標(biāo)記能夠提高敏感性同時(shí)保持特異性不變。一般將多種腫瘤標(biāo)記組合以改進(jìn)敏感性和特異性的篩選方法稱之為組合測(cè)定法。
在本發(fā)明中，對(duì)各種類型的惡性腫瘤的早期檢測(cè)能夠通過在無(wú)癥狀的對(duì)象所進(jìn)行的篩選中使用EIA等而測(cè)量測(cè)試對(duì)象的血液和尿液中的MK水平來檢測(cè)。而且，通過結(jié)合其它腫瘤標(biāo)記的測(cè)定，可以提高敏感性和特異性。
當(dāng)進(jìn)行組合測(cè)定時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮兩點(diǎn)。第一點(diǎn)是腫瘤標(biāo)記組合的選擇。一旦決定腫瘤標(biāo)記組合，接下來考慮的就是怎樣設(shè)置截止數(shù)值(cut-off value)。
腫瘤標(biāo)記選擇的要點(diǎn)是選擇相互之間發(fā)生關(guān)聯(lián)的可能性最小的組合。例如，AFP和PIVKA-II，其是肝臟腫瘤標(biāo)記，具有低關(guān)聯(lián)性，并且通過設(shè)置PIVKA-II截止數(shù)值為0.1Au/ml，它們具有接近100％的特異性。同時(shí)，CA19-9和CA-50的組合(它們是胰腺癌標(biāo)記)得到正確的陽(yáng)性狀況一致而錯(cuò)誤的陽(yáng)性狀況不重疊的組合，這些使其成為無(wú)效組合。
一旦選擇好腫瘤標(biāo)記的組合，下一步就是設(shè)置截止數(shù)值。截止數(shù)值是一個(gè)影響敏感度和特異性的重要因素。一般，腫瘤標(biāo)記的敏感度和特異性是一種協(xié)調(diào)(trade-off)關(guān)系，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠按照下述參考文獻(xiàn)(例如，Kawamura，T.Tumer Marker，Nippon Rinsho 541649-1653，1996)設(shè)置適當(dāng)?shù)慕刂箶?shù)值。
在理想的腫瘤標(biāo)記中，對(duì)腫瘤組和對(duì)非腫瘤組的測(cè)定值是不重疊的，并且這些測(cè)定值能夠確定是否存在腫瘤。但是，至今為止這種理想的腫瘤標(biāo)記并沒有被開發(fā)出來。所以，必需設(shè)定最適合于鑒別和分辨腫瘤組和非腫瘤組的截止數(shù)值。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，截止數(shù)值是當(dāng)用固相抗體溫育來自沒有癌癥的患者樣本時(shí)所得到的信號(hào)的平均值。正常情況下，產(chǎn)生相對(duì)于預(yù)定截止數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為三倍的信號(hào)的樣本被認(rèn)為是癌癥陽(yáng)性。經(jīng)常用對(duì)健康對(duì)象測(cè)定水平的分布中的95％置信區(qū)間的上下限(標(biāo)準(zhǔn)范圍)作截止數(shù)值。但是，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)范圍沒有考慮疾病狀態(tài)的分布。所以，優(yōu)選通過清楚定義要用試驗(yàn)分辨的疾病狀態(tài)而確定截止數(shù)值，然后收集疾病組和非疾病組的恒定數(shù)目(constant number)，測(cè)定它們，并考慮兩組測(cè)定值的普遍率(進(jìn)行測(cè)定時(shí)的狀況)和分離程度(試驗(yàn)的可分辨性)。用這種方法所確定的得到具有高于截止數(shù)值的信號(hào)的樣本被認(rèn)為是癌癥陽(yáng)性。
而且，在手術(shù)除去腫瘤后，肝細(xì)胞癌患者中血液MK顯著降低。這表明MK不僅可以用于癌癥的診斷，而且也可以作為監(jiān)控病程的指示劑，作為預(yù)后因素或用于監(jiān)控復(fù)發(fā)。預(yù)后(prognosis)是指患者對(duì)治療的反應(yīng)。所以，如果在腫瘤治療前和治療后測(cè)定到MK數(shù)值的降低，并且該數(shù)值的下降得到確認(rèn)后，人們能夠推測(cè)所進(jìn)行的治療是有效的。而且，如果所測(cè)定的MK數(shù)值下降到健康對(duì)象的水平，人們能夠推測(cè)腫瘤治療已經(jīng)成功。腫瘤治療除了手術(shù)切除外還包括放射療法、免疫療法、化學(xué)療法等。
在其他實(shí)施方案中，MK能夠用作某些類型的癌癥如肝細(xì)胞癌的標(biāo)記。血液MK水平會(huì)隨著肝細(xì)胞癌階段的進(jìn)展而升高。對(duì)癌癥診斷而言，順序(隨著時(shí)間)多次進(jìn)行上述測(cè)定，評(píng)價(jià)MK水平的變化。例如，在6個(gè)月到1年內(nèi)每24小時(shí)到72小時(shí)進(jìn)行這種測(cè)定，之后如果需要的話再進(jìn)行測(cè)定。一般來說，患者體內(nèi)的癌癥不斷發(fā)展，并且其中的可由抗體檢測(cè)的MK值也隨時(shí)間不斷增長(zhǎng)。
在本發(fā)明中，生物樣本中的MK水平能夠通過使用特異性的多克隆或單克隆抗MK的抗體的乳膠凝集、EIA或RIA方法、FIA、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法或ECLIA方法等來測(cè)定。在這些方法中，EIA是優(yōu)選作為本發(fā)明中測(cè)定MK的測(cè)定法。因?yàn)镋IA使用酶作標(biāo)記，所以EIA比伴有半衰期和放射活性廢物問題的RIA更容易操作。而且，理論上，EIA的敏感度比RIA更能提高。
此外，關(guān)于EIA，各種測(cè)定系統(tǒng)對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都是已知的(例如，參見Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。尤其是，為MK的測(cè)定已經(jīng)開發(fā)出一種優(yōu)異的EIA方法(JP-A Hei10-160735)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)需要按照測(cè)定目的而改進(jìn)這種公知方法。
在相關(guān)的實(shí)施方案中，使用將抗體固定在固體膜如硝化纖維上的流通式(flow through)或帶狀(strip)試驗(yàn)類型測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。在流通式試驗(yàn)類型中，當(dāng)樣本通過該膜時(shí)，樣本中的MK與定相在固體上的抗體(solid phasedantibody)結(jié)合。接著，當(dāng)含有第二種抗體的溶液通過該膜時(shí)，所標(biāo)記的第二種抗體結(jié)合抗體-多肽絡(luò)合物。然后，如上所述測(cè)定所結(jié)合的第二種抗體。在帶狀試驗(yàn)類型中，將含結(jié)合抗體的膜的一端浸入含樣本的溶液中。樣本通過膜移動(dòng)從而通過含第二種抗體的區(qū)域，然后移向定相在固體上的抗體區(qū)。在定相在固體上的抗體區(qū)中第二種抗體的濃度表示癌癥的存在。一般在這個(gè)區(qū)域中第二種抗體的濃度會(huì)產(chǎn)生圖案如可見的線。沒有這種圖案的表示陰性結(jié)果。通常，選擇固定在固體膜上的抗體量是為了產(chǎn)生視覺上可分辨的圖案。在這些情況中，生物樣本中的MK水平在兩種抗體的三明治測(cè)定法中是足以引起陽(yáng)性信號(hào)的。固定在固體膜上的抗體量?jī)?yōu)選為約25ng到1μg，更優(yōu)選在大約50ng到500ng。這類試驗(yàn)一般用非常小量的生物樣本進(jìn)行操作。
在流通式類型或帶狀試驗(yàn)類型測(cè)定形式(format)中，通過信號(hào)強(qiáng)度的自動(dòng)讀數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定是可能的?；蛘撸軌蛘{(diào)節(jié)敏感度以使陽(yáng)性結(jié)果只在MK以特定濃度或更高時(shí)出現(xiàn)。通過敏感度的調(diào)整，能夠不用特殊裝置通過視覺確定陽(yáng)性結(jié)果。在這類型測(cè)定形式中調(diào)整敏感度的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。例如，通過調(diào)整所用抗體量來改變敏感度。
當(dāng)然，許多其他測(cè)定方案也適合于使用本發(fā)明的抗原或抗體，所以上述方法僅僅是用來舉例的。
在上述每種類型的測(cè)定方案所需的MK抗體和用作標(biāo)準(zhǔn)樣本的MK可用作早期癌癥檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的早期癌癥檢測(cè)試劑盒包括至少一種抗-MK抗體和用作標(biāo)準(zhǔn)樣本的MK。另外，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒可以結(jié)合有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)組份所需的酶底物、陰性對(duì)照和說明書等。當(dāng)在如EIA方法中使用檢測(cè)試劑盒時(shí)，前面所提到的抗MK抗體能夠預(yù)先與固體支持物結(jié)合。一般將反應(yīng)容器、珠或磁性顆粒等作為固體相。通過事先將抗MK抗體與固體相結(jié)合，EIA不僅能夠容易操作，而且還可以自動(dòng)進(jìn)行。
在上述方法中所用的抗MK抗體能夠用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)生產(chǎn)(例如，參見Harbor和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。抗MK的抗體可以是多克隆的或單克隆的抗體。例如，特異性識(shí)別MK的單克隆抗體如本發(fā)明人的日本專利申請(qǐng)?zhí)?000-272199(2000年9月7日申請(qǐng))可以用于本發(fā)明。含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段也可以用作抗MK抗體。而且，這種抗體可以是單股的、嵌合的、CDR-接枝的或人化的抗體。這種抗體可以用本文所述的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他方法生產(chǎn)。
MK可用作生產(chǎn)本發(fā)明抗MK抗體的免疫原或用作標(biāo)準(zhǔn)物。為這些目的所用的MK包括生物衍生的MK、重組MK或化學(xué)合成MK，以及具有MK生物活性的片段。得到MK作為重組體的方法是公知的(JP-A Hei9-95454)。
本說明書中所引用的所有現(xiàn)有技術(shù)的公開出版物在本文都被作為參考文獻(xiàn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了用實(shí)施例2的(1)所述的一步三明治方法對(duì)76名第I到IV階段的肝細(xì)胞癌患者(第I階段7名患者；第二階段19名患者；第III階段23名患者和第IV階段27名患者)、7名病毒性肝炎患者作比較對(duì)照和135名健康對(duì)象作對(duì)照(**p＜0.01)的血清MK水平的測(cè)定結(jié)果。誤差條(error bar)表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖2類似地顯示了用實(shí)施例2的(2)所述的一步三明治方法對(duì)76名第I到IV階段的肝細(xì)胞癌患者、7名病毒性肝炎患者作比較對(duì)照和376名健康對(duì)象作對(duì)照(**p＜0.01，Mann-Whitney U-試驗(yàn))的血清MK水平的測(cè)定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖3相似地顯示了使用Eitest PIVKA-II(Sanko Junyaku Co.，Ltd.)對(duì)第I到IV階段的肝細(xì)胞癌患者血清中的PIVK-II水平的測(cè)定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖4是相似地顯示了使用α-feto RIA珠(Dainabot)對(duì)第I到IV階段的肝細(xì)胞癌患者的血清中的AFP水平的測(cè)定結(jié)果(*p＜0.01)。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖5類似地顯示了用實(shí)施例2的(1)所述的一步三明治方法對(duì)72名第1到7階段的胃癌患者和135名健康對(duì)象的血清MK水平的測(cè)定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖6類似地顯示了用實(shí)施例2的(2)所述的一步三明治方法對(duì)72名第1到7階段的胃癌患者和376名健康對(duì)象的血清MK水平的測(cè)定結(jié)果(**p＜0.01，Mann-Whitney U-試驗(yàn))。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖7類似地顯示了使用CEA RIA珠(IRMA方法)(Dainabot)對(duì)72名第1到7階段的胃癌患者血清中的CEA水平的測(cè)定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖8類似地顯示了使用Centocor CA19-9試劑盒(IRMA方法)(Centocor)對(duì)72名第1到7階段的胃癌患者血清中的CA19-9水平的測(cè)定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖9顯示了72名癌癥患者(胃癌24名患者；肝細(xì)胞癌24名患者；結(jié)腸癌24名患者)和50名健康對(duì)象的尿液MK水平的分布，其是用肌酸酐數(shù)值校正過的(p＜0.01；統(tǒng)計(jì)軟件StatView-J5.0；使用Mann-Whitney U-試驗(yàn))。
圖10顯示了在第1-7階段的3名膽管癌、3名乳腺癌、6名結(jié)腸癌、3名食管癌、1名膽囊癌、10名肝細(xì)胞癌、3名胰腺癌、7名直腸癌、28名胃癌和1名甲狀腺癌患者共65名患者的尿液MK水平的結(jié)果，其是用肌酸酐數(shù)值校正過的(*p＜0.05，**p＜0.001)。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖11顯示了肝細(xì)胞癌部分切除對(duì)血清中的MK數(shù)值的影響。含點(diǎn)的條表示腫瘤手術(shù)前的數(shù)值(手術(shù)前)，實(shí)體黑條表示腫瘤切除后的數(shù)值(第7天)。
圖12比較了各種類型的癌癥患者血清中MK的水平。粗線表示135名健康對(duì)象血清中MK水平的平均值，點(diǎn)線表示0.50ng/ml截止數(shù)值。各種類型的癌癥名稱下所顯示的數(shù)字表示患者數(shù)、中間值和25％到75％的置信區(qū)間。Asterisks表示與健康對(duì)象相比的顯著差異(significant difference)(Mann-Whitney U-試驗(yàn))。*p＜0.05，**p＜0.01。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下面參考實(shí)施例具體詳細(xì)說明本發(fā)明，但不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。
抗-人MK多克隆抗體的生產(chǎn)按照J(rèn)P-A Hei 9-95454的實(shí)施例1中所述的方法生產(chǎn)免疫接種所用的MK蛋白和用作標(biāo)準(zhǔn)物的重組MK蛋白。
將含有人MK的ORF的cDNA導(dǎo)入有Pichia酵母作為宿主的pHIL-D4表達(dá)載體。將這種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到Pichia酵母G115(Pichia pastoris G115；Research Corporation Technologies)。通過組氨酸和G418選擇獲得表達(dá)克隆的MK。在肝素柱上用離子交換色譜層析法和親和色譜層析法純化MK。純化的MK蛋白的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性相當(dāng)于重組L-細(xì)胞所生產(chǎn)的鼠MK的活性。
每?jī)芍軐?duì)兔和雞進(jìn)行免疫接種注射，給兔接種6次，給雞接種8次。
具體來說，對(duì)兔開始皮下注射400μg混有等量弗氏完全佐劑(Freund’scomplete adjuvant)的MK，從第二次之后，每次皮下注射400μg混有弗氏不完全佐劑的MK。對(duì)雞來說，步驟類似于兔的，除了每次注射的是100μgMK。
從兔得到的抗血清(anti-sera)通過硫酸銨沉淀，然后用蛋白A柱分離IgG，而且將其用已經(jīng)將MK固定在Affigel-10TM(BioRad)的MK親和柱親和純化，獲得純化的兔抗-人MK-特異性抗體。另一方面，用硫酸銨沉淀從雞獲得的抗血清，然后用MK親和柱親和純化得到純化的雞抗-人MK-特異性抗體。這些抗體都用于蛋白質(zhì)印跡分析法中測(cè)定人MK的特異性。
通過一步三明治方法測(cè)定MK(1)將兔的抗-人MK-抗體溶于(5.5μg/ml)含0.1％NaN3的50mM PBS(pH7.2)中，將該溶液的50μl等份放入微量滴定板(polysorp plates，Nunc)的每個(gè)孔中。將該板在室溫下保持16小時(shí)，以吸收抗體到這些孔中。用0.1％吐溫20的PBS沖洗后，通過向各孔中加入150μl的等份的0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS并在37℃溫育2小時(shí)來阻斷這些孔。
另一方面，將10μl各期肝癌的血清(sera)、各期胃癌的血清或健康對(duì)象(對(duì)照)血清與100μl溶于含0.5MKCl、0.5％BSA和0.01％MicrocideI(aMReSCO，Solon，Ohio)的50mM Tris-HCl(pH8.4)中的過氧化酶標(biāo)記的雞抗人-MK抗體(0.1μg/ml)反應(yīng)。將50μl等份的該反應(yīng)溶液加入板孔中，然后在室溫溫育1小時(shí)。用1％吐溫20的PBS將各孔沖洗5次。將100μl等份的底物溶液(0.5mg/ml四甲基聯(lián)苯胺)加入孔中并在室溫溫育30分鐘。加入2N H2SO4終止反應(yīng)，用多板讀數(shù)計(jì)(型號(hào)3550，BioRad)測(cè)定在450nm/655nm的吸收值。在測(cè)定時(shí)，用類似方法測(cè)定已知濃度的MK標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)溶有兔抗-人MK抗體的緩沖液不同于上述提到的(1)的，區(qū)別在于i)用50mM Tris-HCl(pH8.1-8.3)替代50mM PBS，該緩沖液含有0.15M NaCl而抗體濃度是5μg/ml；ii)用含0.1％的酪蛋白的PBS作為阻斷溶液替代0.5％的BSA；iii)溶有過氧化酶(POD)-標(biāo)記的雞抗-人MK抗體緩沖液是含0.5MKCl、0.1％酪蛋白、0.5％BSA、1mg/ml兔γ-球蛋白和0.01％MicrocideI(aMReSCO，Solon，Ohio)的50mM Tris-HCl(pH8.2-8.4)，另外，用類似于上述(1)中的一步三明治方法進(jìn)行MK的測(cè)定。
肝細(xì)胞癌每一階段和血清MK水平之間的關(guān)聯(lián)(correlation)(1)血清樣本的制備從135健康對(duì)象(94名男性和41名女性，年齡在21-75歲之間)、76名肝細(xì)胞癌(HCC)患者(第I階段7名患者；第II階段19名患者；第III階段23名患者；第IV階段27名患者)和肝病對(duì)照、7名病毒性肝炎患者、72名腺癌患者(第I階段23名患者；第II階段9名患者；第III階段7名患者；第IV階段9名患者；第V階段5名患者；第VI階段9名患者；第VII階段10名患者)中收集血樣，然后從中制備血清。馬上將血清冷凍，并在-20℃存放，直到MK測(cè)定時(shí)。
之后，從其他376名健康對(duì)象(152名男性和224名女性)中收集新鮮血樣，然后制備血清。
(2)血清MK水平的測(cè)定用實(shí)施例2中的(1)的方法測(cè)定每個(gè)HCC患者、病毒性肝炎患者和135名健康對(duì)象的血清MK水平(圖1)。圖中的條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。證實(shí)了HCC患者的血清MK水平相對(duì)于健康對(duì)象逐漸顯著高于第II期。
用實(shí)施例2的(2)所述的一步三明治方法測(cè)定上述HCC患者、病毒性肝炎患者和376名健康對(duì)象中每個(gè)的血清MK水平，其中EIA的敏感度是提高的(圖2)。圖中的條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
在第I期HCC患者的血清MK水平是0.22ng/ml(平均值)，明顯較高的值(**p＜0.01；Mann-Whitney試驗(yàn))相比于由健康對(duì)象獲得的數(shù)值0.02ng/ml(平均值)。所以，發(fā)現(xiàn)MK作為早期HCC的血清腫瘤標(biāo)記是非常有用的。
在HCC中用PIVKA-II和AFP的對(duì)比試驗(yàn)?zāi)壳癙IVKA-II和AFP被廣泛用作HCC腫瘤標(biāo)記。PIVKA-II和AFP是互補(bǔ)性的，PIVKA-II和AFP的組合提高了診斷率。所以，PIVKA-II和AFP可以用作比較性對(duì)照腫瘤標(biāo)記。
使用Eitest PIVKA-II(Sanko Junyaku Co.，Ltd.)測(cè)定血清PIVKA-II(圖3)。測(cè)定法是EIA。暗示了HCC從第III期是陽(yáng)性的可能性。
用α-feto RIA珠(Dainabot)測(cè)定血清AFP水平(圖4)。該測(cè)定法是免疫放射性測(cè)定法(IRMA)。在HCC的第I階段沒有檢測(cè)到AFP，暗示了從第II階段的檢測(cè)是可能的。
也就是說，用MK進(jìn)行HCC的早期測(cè)定是可行的，而且證實(shí)了在HCC階段發(fā)展和血清MK濃度的升高之間有密切聯(lián)系(strong correlation)。
在胃癌各階段和血清MK水平之間的關(guān)系(1)血清樣本的制備從72名胃癌患者(第1階段23名患者；第2階段9名患者；第3階段7名患者；第4階段9名患者；第5階段5名患者；第6階段9名患者；第7階段10名患者)中收集血樣，然后制備血清。將血清馬上冷凍，并在-20℃存放，直到進(jìn)行MK測(cè)定時(shí)。分別使用試驗(yàn)例1中獲得的135名健康對(duì)象和376名健康對(duì)象的血清MK水平的數(shù)值。
(2)血清MK水平的測(cè)定圖5顯示了胃癌各階段(1-7)和135名健康對(duì)象的血清MK水平(圖中的條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差)，圖6分別顯示了376名健康對(duì)象的血清MK水平的數(shù)值(**p＜0.01；Mann-Whitney U-試驗(yàn)；圖中的條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差)。
圖6證實(shí)了胃癌患者從第1期起的血清MK水平顯著性地高于健康對(duì)象的數(shù)值。也就是說，發(fā)現(xiàn)MK可用作胃癌早期診斷的腫瘤標(biāo)記。
在胃癌中使用CEA和CA19-9的對(duì)比試驗(yàn)選用CEA和CA19-9作對(duì)照比較的腫瘤標(biāo)記。發(fā)現(xiàn)在消化器官的各種癌癥以及在其他各種癌癥中血清CEA水平升高，由此它被廣泛用于臨床。另一方面，發(fā)現(xiàn)CA19-9在胰腺和膽汁系統(tǒng)的癌癥顯示了較高的陽(yáng)性數(shù)值。當(dāng)前，CA19-9以及CEA都是常規(guī)臨床使用中最為廣泛使用的消化器官癌癥的腫瘤標(biāo)記。
使用對(duì)血清CEA所用的CEA RIA珠(Dainabot)對(duì)胃癌患者測(cè)定血清MK水平(圖7；條帶表示標(biāo)準(zhǔn)誤差)。所用的測(cè)定法是IRMA。盡管可以測(cè)定CEA作為第7階段的陽(yáng)性值，但是由于各階段之間較大的標(biāo)準(zhǔn)誤差不能證實(shí)階段之間的顯著差異。
使用Centocor CA19-9 RIA試劑盒(Centocor；正常值37U/ml或更低)測(cè)定血清CA19-9(圖8；圖中條帶表示標(biāo)準(zhǔn)誤差)。所用測(cè)定法為IRMA。CA19-9僅在第5階段顯示出較高數(shù)值，所以由此推測(cè)它與階段沒有聯(lián)系。
也就是說，發(fā)現(xiàn)MK可用作早期胃癌的血清腫瘤標(biāo)記。
在胃癌患者和肺癌患者中的血清MK水平在胃癌患者和肺癌患者早期調(diào)查血清MK水平(表1)。胃癌患者和肺癌患者二者都顯示出在第I階段的血清MK水平的平均值低于第II到IV階段的，但是它們之間的差異在胃癌患者和肺癌患者中都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。
表1 血清MK水平(ng/ml)
癌癥患者中尿液MK水平的測(cè)定用實(shí)施例2的(2)的方法測(cè)定在健康檢查期間獲得的72個(gè)癌癥患者(胃癌24名患者；肝細(xì)胞癌24名患者和結(jié)腸癌24名患者)的尿液樣本的MK水平和50個(gè)健康對(duì)象的早晨尿液樣本。而且，在相同尿液中測(cè)定肌酸酐的數(shù)值，然后用肌酸酐的數(shù)值校正MK的數(shù)值。圖9顯示了結(jié)果。證實(shí)了在健康對(duì)象和癌癥患者尿液MK數(shù)值之間具有顯著性差異(p＜0.01；使用Mann-Whitney U-試驗(yàn))。
在癌癥患者和癌癥各階段中尿液MK數(shù)值之間的關(guān)聯(lián)研究在癌癥患者和癌癥各階段間尿液MK數(shù)值之間的關(guān)聯(lián)。對(duì)包括3名膽管癌患者、3名乳腺癌患者、6名結(jié)腸癌患者、3名食管癌患者、1名膽囊癌患者、10名肝細(xì)胞癌患者、3名胰腺癌患者、7名直腸癌患者、28名胃癌患者和1名甲狀腺癌患者的總共65名患者進(jìn)行階段分類(第1-7個(gè)階段)。然后，測(cè)定尿液MK水平。圖10中顯示了各階段的MK水平作為尿液MK的校正值(*p＜0.05，**p＜0.01；Mann-Whitney U-試驗(yàn))。發(fā)現(xiàn)癌癥的第I期的尿液MK水平比健康對(duì)象顯著提高。至今為止，沒有報(bào)導(dǎo)過癌癥早期階段增長(zhǎng)的尿液標(biāo)記。也就是說，尿液MK水平可用于各種癌癥的早期篩選。
在HCC中腫瘤部分切除對(duì)血清MK水平的影響對(duì)5名HCC患者研究外科手術(shù)部分切除腫瘤對(duì)血清MK水平的影響(圖11)。在4名患者中，腫瘤摘除后7天血清MK水平顯著下降。也就是說，血清MK的水平反映了對(duì)HCC的治療效果。
各種癌癥的血清MK水平表2詳細(xì)列舉了包括18名食管癌患者、30名胃癌患者、2名十二指腸癌患者、25名結(jié)腸直腸癌患者、25名肝細(xì)胞癌患者、12膽管癌和膽囊癌患者、9名胰腺癌患者、5名甲狀腺癌患者、19名肺癌患者和5名乳腺癌患者總共150名癌癥患者的所處階段。圖12顯示了用EIA測(cè)定這150名癌癥患者的血清MK水平的結(jié)果。150名癌癥患者的血清MK水平與健康對(duì)象的數(shù)值顯示了顯著性差異(p＜0.001，Mann-Whitney U-試驗(yàn))。在87％患者中可見高于0.5ng/ml截止數(shù)值的血清MK水平。
表2


工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種用作診斷早期癌癥的腫瘤標(biāo)記。該腫瘤標(biāo)記可用于進(jìn)行早期癌癥的篩選、某些類型的癌癥的階段和預(yù)后的評(píng)估以及監(jiān)控治療過程。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)早期癌癥的方法，包括a)測(cè)定生物樣本中的midkine和/或其片段，和b)將步驟a)中得到的測(cè)定水平與健康對(duì)象的測(cè)定水平進(jìn)行比較。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中早期癌癥是胃癌。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中胃癌在第I階段。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中早期癌癥是肝細(xì)胞癌。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中肝細(xì)胞癌是在第I階段。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其中早期癌癥是肺癌。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中肺癌是在第I階段。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中生物樣本是血清或尿。
9.可識(shí)別midkine和/或其片段的抗體在早期癌癥檢測(cè)中的應(yīng)用。
10.早期癌癥診斷劑，含有可識(shí)別midkine和/或其片段的抗體。
11.檢測(cè)生物樣本早期癌癥的試劑盒，其中該試劑盒(a)含有容器，該容器中裝有與至少一種midkine和/或其片段的表位特異性結(jié)合的抗體，以及(b)測(cè)定生物樣本中midkine和/或其片段的存在。
12.按照權(quán)利要求11的試劑盒，其中抗體被吸附到固體上。
13.評(píng)估癌癥預(yù)后的方法，包括a)測(cè)定生物樣本中的midkine和/或其片段，和b)將步驟a)獲得的測(cè)定水平與癌癥預(yù)后相關(guān)聯(lián)。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中癌癥是胃癌、肝細(xì)胞癌或肺癌。
全文摘要
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MK(midkine)在早期階段出現(xiàn)在各種類型癌癥患者的血液或尿液中?；谶@一發(fā)現(xiàn),完成了一種涉及測(cè)定血或尿中MK的步驟的測(cè)定早期癌癥的方法。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1390304SQ00815553
公開日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月10日
發(fā)明者村松喬, 岡本好司, 池松真也, 佐久間貞俊, 小田宗宏, 熊井英志 申請(qǐng)人:村松喬