專利名稱：層析材料以及使用該材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分離核酸混合物的層析材料以及使用該層析材料分離核酸混合物的方法。
在已知的層析法中，使用具有特定粒徑和孔徑的無機(jī)顆粒狀層析材料，它們的表面已用硅烷化劑進(jìn)行改性，以產(chǎn)生固定相。與形成陰離子或者陽離子交換劑的試劑反應(yīng)，則導(dǎo)致形成最終的層析材料。
例如，國際專利申請公布WO 91/05606描述了層析用載體材料，其適合于分離各種的核酸。合適的載體包括硅膠、氧化鋁、二氧化鈦、多孔玻璃或者樹脂。載體材料應(yīng)具有3-500μm的粒徑，孔徑為約10-1000nm，而比表面積為5-800m2/g。該顆粒狀載體的表面用烷氧基硅烷進(jìn)行硅烷化。因此，還描述了層析載體材料，其是以硅膠為基礎(chǔ)，并具有通過烷氧基硅烷與二級羥胺的反應(yīng)而得到的陰離子交換劑基團(tuán)。
根據(jù)歐洲專利0 104 210，描述了硅膠材料，其粒徑為3-100μm，空隙大小為10-1000nm，而比表面積為5-800m2/g。這些材料用硅烷化劑進(jìn)行表面處理，然后在層析法中與離子交換劑一起使用，用于分離核酸。
最后，歐洲專利0744025公開了一種層析材料，其中硅膠載體用硅烷化劑處理，而且所選擇的載體材料的孔徑為4-6nm。載體的粒徑為1-500μm。
在使用常規(guī)顆粒狀層析材料的核酸混合物的層析分離中，已發(fā)現(xiàn)進(jìn)行此等分離是非常耗時的。例如，如果在使用改性硅膠作為層析載體的某些柱中，預(yù)期核酸在載體上的吸附時間在重力流動條件下至少為20分鐘將是可以接受的。
目前已知的層析材料也具有限定的空隙率，這是因為根據(jù)主流意見，只有多孔載體，即、具有更大表面積的載體，才能保證負(fù)載足夠的離子交換劑。但是，該空隙率也具有缺陷核酸分離的質(zhì)量不是最佳的。這主要是由于以下事實分離期間在混合物中存在的其他物種，如RNA和蛋白質(zhì)，擴(kuò)散至孔中，并由此對分離過程產(chǎn)生負(fù)面影響。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種層析材料，其能夠在盡可能最短的時間內(nèi)進(jìn)行核酸分離，而且同時實現(xiàn)優(yōu)異的核酸混合物拆分，并分離出優(yōu)異純度的核酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種分離核酸混合物的方法，其能夠在盡可能最短的時間內(nèi)最大可能地拆分單個組分，并使它們具有盡可能最高的純度。
本發(fā)明還涉及用根據(jù)本發(fā)明的層析材料分離核酸混合物的方法，其中核酸的層析分離是在力的作用下進(jìn)行的。
最后，本發(fā)明涉及用于分離核酸混合物的試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的層析材料。該試劑盒按照所希望的設(shè)置包括根據(jù)本發(fā)明的層析材料、以及在使用所述層析材料進(jìn)行核酸混合物分離時的相應(yīng)緩沖液。
載體的比表面積在0.05-50m2/g的范圍內(nèi)，優(yōu)選在1-10m2/g的范圍內(nèi)特別是在1-5m2/g的范圍內(nèi)。
適合于改性帶有離子交換劑官能團(tuán)的表面的纖維性材料可用作載體。載體的合適材料例如是微纖維，其中微玻璃纖維是優(yōu)選的。此等材料具有無孔表面。
在優(yōu)選的實施方案中，纖維性材料可以在用作載體之前進(jìn)行酸或堿處理。
纖維性載體可以塊狀形式(in the form of amass)直接用于層析法中。但是，在進(jìn)行分離時也可進(jìn)一步將該塊狀載體處理成合適的形式。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，對于許多的應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的層析材料可有利地包括膜形式的載體。對于層析材料的合適容量，優(yōu)選該膜具有至少0.05mm的厚度，而不管總的表面積如何。
在根據(jù)本發(fā)明的層析材料的優(yōu)選實施方案中，該膜為單層的形式。然而，該膜也可以是多層的形式，這取決于所希望的分離容量。
根據(jù)本發(fā)明的層析材料的載體與硅烷化劑反應(yīng)。例如，硅烷化劑可以是國際專利申請公布WO 91/05606中描述的任意一種。同樣，陰離子交換劑基團(tuán)或者陽離子交換劑基團(tuán)也可按照已知的方法負(fù)載于固定相上。其例子描述在國際專利申請公布WO 91/05606中。
根據(jù)本發(fā)明的層析材料具有以下優(yōu)點在使用該材料時，可在極短的時間內(nèi)分離核酸混合物。其原因在于，即使在強(qiáng)力存在時，例如作用在根據(jù)本發(fā)明的層析材料(其比常規(guī)層析材料具有更高的材料密度)上的真空，對于核酸分離仍有足夠的保留時間。由于可達(dá)到高的材料密度，核酸分離可在非常小的床體積下進(jìn)行。洗滌和洗脫體積也因此較低。
根據(jù)本發(fā)明的層析材料可用于分離核酸混合物，其中所得的餾分具有極高的準(zhǔn)確度和純度。特別是在與常規(guī)顆粒狀層析材料相比時，證實了這一點。為此，在分離為RNA和DNA之前和之后，使核酸混合物在根據(jù)本發(fā)明的層析材料、以及兩種常規(guī)層析材料上于瓊脂糖中流動。
圖2顯示了使用根據(jù)本發(fā)明的層析材料分離核酸混合物組分。單個泳道顯示了柱中的流出物泳道L分離前清除的溶胞產(chǎn)物泳道D柱流動液泳道W1第一洗滌液泳道W2第二洗滌液泳道E洗脫液用常規(guī)層析材料進(jìn)行相同的實驗。為此請參考圖3和4。在泳道中使用相同的柱流動物。
圖2顯示了在泳道E的洗脫物中，由質(zhì)粒DNA中完全分離出RNA。另外，可以清楚地看出，在洗脫之前的單獨運(yùn)行沒有丟失任何DNA。
圖3和4顯示了使用常規(guī)的顆粒狀層析材料分離核酸混合物組分。特別是在圖3所示的純制中，表明在泳道E中丟失了大量的DNA。另外，如泳道W2中所示，RNA濃度的貧化較差，其中在第二洗滌流出液中繼續(xù)存在顯著量的RNA。
如圖4所示，在使用另外一種常規(guī)層析材料時，濃度的貧化也很差。泳道W2表明在第二洗滌液中仍存在相當(dāng)多的RNA。
與常規(guī)顆粒狀層析材料相比，本發(fā)明層析材料的另一個優(yōu)點在于在洗脫物E中不存在層析材料(細(xì)固體)的顆粒。這使得如此得到的核酸的質(zhì)量大大提高。
根據(jù)本發(fā)明使用本發(fā)明的層析材料分離核酸混合物的方法的特征在于，在力的作用下進(jìn)行分離。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法是在施加真空下進(jìn)行的。
例如，在將核酸混合物施放在根據(jù)本發(fā)明的層析材料上后，施加真空，在約20秒的時間內(nèi)進(jìn)行分離。這與常規(guī)硅膠柱完全相反，在使用至少10倍的床體積時，其需要的分離時間在重力流動下至少為20分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的層析材料實際上可用于所有的層析法中。這些層析法包括柱層析、自旋柱或自旋杯(spin cup)中的分離、或者大批量的分離，其中層析材料為懸浮液的形式或者吸附在反應(yīng)容器、微量滴定板、移液管、攪拌棒或者測試條(test strip)上。
在自旋杯中進(jìn)行層析分離時，使用離心力，使得放置在自旋杯上的樣品在離心機(jī)中進(jìn)行層析分離。
在使用本發(fā)明的層析材料時，可以非常有效地分離任何核酸混合物。因此，在包含大量RNA外還包含非常少量DNA的混合物中，可分離出純度極高的DNA。另外，可完全避免使用毒性物質(zhì)，如苯酚、氯仿或者溴化乙錠。再者，在不使用核糖核酸酶的情況下完整地進(jìn)行分離。


圖1顯示了一個裝有根據(jù)本發(fā)明的層析材料的層析柱的例子。底部玻璃料(2)的厚度為1mm，密封住出口。該底部玻璃料(2)放置在常規(guī)的市售塑料柱(1)中，該塑料柱的出口朝向底部變尖，用于施加真空。在該塑料柱上設(shè)置根據(jù)本發(fā)明的層析材料(3)，其為微玻璃纖維膜的形式，厚度為2mm。最后，在塑料柱的頂部設(shè)置厚度為1mm的頂部玻璃料(4)。
在所有的其他層析法中使用類似的設(shè)置，例如在自旋杯中以及在微量滴定板(96孔板)上。
根據(jù)本發(fā)明之使用本發(fā)明層析材料的用于分離核酸混合物的方法以簡單的步驟梯度進(jìn)行，其中包括洗滌負(fù)載有核酸混合物的層析裝置，然后用合適的緩沖鹽溶液洗脫所希望的核酸。在DNA與本發(fā)明的層析材料結(jié)合期間，大多數(shù)的RNA被分離，而殘留的RNA在洗滌操作期間被洗出。因此，用核糖核酸酶進(jìn)行處理不是必須的。
如果層析分離是在柱或者微量滴定板中進(jìn)行的，則例如通過施加真空在極短的時間內(nèi)按組分排列進(jìn)行分離，所述時間例如是約20秒。同樣，在放置于離心機(jī)中的自旋杯內(nèi)可實現(xiàn)效率優(yōu)異的分離，而且由于離心力分離可在非常短的時間內(nèi)進(jìn)行，例如約20秒。
根據(jù)本發(fā)明的層析材料可以各種方式進(jìn)行銷售。例如，以所希望的設(shè)置，與層析法所需要的裝置如緩沖液一起，以試劑盒的形式提供根據(jù)本發(fā)明的層析材料。當(dāng)然也可包括其他市售形式。
以下將根據(jù)實施例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍絕不僅限于這些在小制備中，使用1-3ml含有高復(fù)制質(zhì)粒的培養(yǎng)物或者5-20ml含有低復(fù)制質(zhì)粒的培養(yǎng)物。如果是中等或者大的制備，則相應(yīng)地使用更大的量。實施例2由細(xì)菌中分離DNA在合適的離心容器中，使如實施例1中所述用于小制備的細(xì)菌培養(yǎng)物的量于13000×g下離心3分鐘，然后完全棄掉上清液培養(yǎng)基。用移液管除去由離心容器邊緣流回的任何培養(yǎng)基，而且也棄掉。
通過渦旋將沉淀的細(xì)菌完全重新懸浮在0.4ml由50mM Tris-HCl(pH8.0)/10mM EDTA/100μg/ml核糖核酸酶組成的緩沖液中。必須沒有任何可見的細(xì)胞團(tuán)或者細(xì)胞聚集體。
添加0.4ml由200mM氫氧化鈉/0.1％(w/v)SDS組成的緩沖液，由此使經(jīng)懸浮的細(xì)胞發(fā)生溶胞。上下顛倒多次，由此使懸浮細(xì)胞與溶胞緩沖液混合，直至形成均一相。由于出現(xiàn)了基因組細(xì)菌DNA，該相具有非常高的粘度。在室溫下其保溫最長5分鐘。
添加0.4ml由3.1-3.4M醋酸鉀(pH 5.5，含有醋酸)組成的緩沖液，由此中和溶胞混合物。添加緩沖液后，重復(fù)進(jìn)行上下顛倒，以使混合物攙混在一起，直至得到均一相。該相具有低的粘度。必須沒有任何可見的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的殘留物。
在室溫下，使在中和過程中沉淀出的細(xì)菌蛋白質(zhì)和細(xì)胞殘渣的沉淀物在＞13000×g下離心10分鐘，然后移出澄清的上清液(“澄清的溶胞產(chǎn)物)。實施例3使用根據(jù)本發(fā)明的層析材料制造層析柱將5g無孔的玻璃纖維(其比表面積為5m2/g)與60g的3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷和0.13ml的三乙胺在750ml的無水二甲苯中混合。施加真空三次，然后通入氮氣，由此使反應(yīng)混合物脫氣，接下來在沒有空氣和濕氣的情況下在130℃加熱4小時。過濾混合物，然后用二甲苯和四氫呋喃洗滌。在真空中于50℃下干燥經(jīng)改性的玻璃纖維。
產(chǎn)物接著與750ml以及42g的二乙胺混合，并在回流下加熱18小時。用二氧六環(huán)和甲醇洗滌該產(chǎn)物，然后在真空下于70℃干燥。經(jīng)改性的玻璃纖維塊具有陰離子交換劑官能團(tuán)，進(jìn)一步處理以形成陰離子交換膜。使玻璃纖維塊在丙酮中漿液化，然后卷成適當(dāng)?shù)男问交蛘哌M(jìn)行澆鑄，接著干燥。切割膜，以與柱的直徑相一致，然后按照圖1的設(shè)置插入。
在柱上負(fù)載由實施例2中得到的澄清溶胞產(chǎn)物，并通過施加噴水真空由膜抽吸完全。真空泵運(yùn)行至不再有液體從膜中吸出。然后關(guān)閉真空泵。
為除去非特異性結(jié)合的組分，該柱用2.5ml由100mM NaAc/HAc(pH5.0)/600mM NaCl組成的緩沖液洗滌。為此，將所述緩沖液吸移至所述柱上，然后通過施加噴水真空由膜抽吸完全。真空泵打開，直至不再有液體從基質(zhì)中除去。然后關(guān)閉真空泵。在小制備和中等制備的情況下，重復(fù)該洗滌步驟一次。
使所述柱由真空室脫開，然后添加0.8ml由100mM Tris-HCl(pH8.5)/1250mM NaCl組成的緩沖液，由此將結(jié)合在膜上的質(zhì)粒DNA直接洗脫至合適的容器中。為此，將該緩沖液吸移至所述柱上，然后借助于合適的沖壓，手工迫使緩沖液由膜中通過。為此，應(yīng)使洗脫緩沖液快速地滴過，而絕不是流過。每個小的液滴用肉眼可清楚地辨別。
洗脫液與0.7體積的異丙醇混合至完全(室溫)。以此方式沉淀出的質(zhì)粒DNA在＞13000×g和4℃下離心30分鐘，然后棄掉上清液。沉淀的DNA用80％乙醇洗滌一次，再進(jìn)行離心，然后干燥(在室溫下放置或者在真空中放置)。經(jīng)干燥的DNA最后在37℃下溶解在合適量的TE緩沖液或者水中10分鐘。
用光譜法測量溶解的質(zhì)粒DNA，然后在瓊脂糖凝膠上分析。
圖2顯示了使用TAE緩沖液(pH 8.3)在1％瓊脂糖凝膠上對混合物組分的分離。以下組分施加在單個泳道上泳道L分離前清除的溶胞產(chǎn)物泳道D柱流動液泳道W1第一洗滌液泳道W2第二洗滌液泳道E洗脫液泳道L、D和W1清楚地表明RNA仍存在于制劑中。然而，在泳道E的洗脫液中，清楚地顯示完全分離了核酸混合物組分，僅有質(zhì)粒DNA，而沒有任何RNA污染。
權(quán)利要求
1.一種用于分離核酸混合物的層析材料，其具有載體以及施加在該載體上的離子交換劑官能團(tuán)，其特征在于所述載體包括纖維性材料。
2.如權(quán)利要求1所述的層析材料，其特征在于所述載體的比表面積為0.05-50m2/g。
3.如權(quán)利要求1或2所述的層析材料，其特征在于所述纖維性材料是由微纖維構(gòu)成的。
4.如權(quán)利要求3所述的層析材料，其特征在于所述微纖維是微玻璃纖維。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的層析材料，其特征在于所述纖維性材料為塊狀物的形式。
6.如權(quán)利要求5所述的層析材料，其特征在于所述塊狀物是膜的形式。
7.如權(quán)利要求5或6所述的層析材料，其特征在于所述膜的厚度至少為0.05mm。
8.如權(quán)利要求7所述的層析材料，其特征在于所述膜為單層的形式。
9.如權(quán)利要求7所述的層析材料，其特征在于所述膜為多層的形式。
10.如權(quán)利要求1-9之一所述的層析材料，其特征在于所述載體與硅烷化劑反應(yīng)。
11.如權(quán)利要求10所述的層析材料，其特征在于所述陰離子交換劑基團(tuán)是通過硅烷化劑連接的。
12.如權(quán)利要求10所述的層析材料，其特征在于所述陽離子交換劑基團(tuán)是通過硅烷化劑連接的。
13.使用如權(quán)利要求1-12之一所述的層析材料分離核酸混合物的方法，其特征在于所述層析分離是通過力的作用進(jìn)行的。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于施加真空。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于所述層析分離是在柱中或者在微量滴定板上進(jìn)行的。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述分離是通過離心力進(jìn)行的。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述分離是在離心機(jī)中的自旋杯內(nèi)進(jìn)行的。
18.如權(quán)利要求13-17之一所述的方法，其特征在于所述層析分離是按步驟梯度進(jìn)行的。
19.如權(quán)利要求13-18之一所述的方法，其特征在于不使用核糖核酸酶。
20.用于分離核酸混合物的試劑盒，其包含如權(quán)利要求1-12之一所述的層析材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于分離核酸混合物的層析材料，其具有載體以及施加在該載體上的離子交換劑官能團(tuán)，其特征在于所述載體包括纖維性材料。另外，本發(fā)明還涉及用根據(jù)本發(fā)明的層析材料進(jìn)行核酸分離的方法。
文檔編號G01N30/02GK1413300SQ00817561
公開日2003年4月23日 申請日期2000年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日
發(fā)明者約亨·蒂特根 申請人:蒂特根博士生物技術(shù)公司