專(zhuān)利名稱(chēng)：肝祖先細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物肝祖先細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的新穎條件，包括多潛能細(xì)胞、干細(xì)胞和其它早期肝祖先細(xì)胞。尤其是，本發(fā)明涉及在協(xié)同培養(yǎng)中使用合成培養(yǎng)基和滋養(yǎng)細(xì)胞繁殖肝祖先細(xì)胞的方法。而且，本發(fā)明涉及用作滋養(yǎng)細(xì)胞且能夠維持肝祖先細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞。
2.背景技術(shù)在哺乳動(dòng)物組織中識(shí)別多潛能祖細(xì)胞群對(duì)于臨床和商業(yè)目的都是重要的，對(duì)理解發(fā)育過(guò)程和組織內(nèi)環(huán)境平衡也是重要的。祖細(xì)胞群是基因治療、細(xì)胞移植和生物人工器官組織工程的理想靶標(biāo)(Millar，A.D.1992 Nature 357，455；Langer，R.和Vacanti，J.P.1993 Science260，920；Gage，F(xiàn).H.1998 Nature 392，18)。
從對(duì)造血干細(xì)胞(Spangrude等人.1988 Science 241，58)、神經(jīng)干細(xì)胞(Davis，A.A.，和Temple，S.1994 Nature 372，263；Stemple，D.L.，和Anderson，D.J.1992 Cell 71，973)和表皮干細(xì)胞(Jones，P.H.，和Watt，F(xiàn).M.1993 Cell 73，713)的研究中，很容易地看到存在組織特異的、“決定的”干細(xì)胞或具有高度生長(zhǎng)潛能和/或多種潛能的祖細(xì)胞，它們每一個(gè)都已經(jīng)采用該組織適用的特定方法被克隆地識(shí)別。這些祖細(xì)胞被認(rèn)為是負(fù)責(zé)正常的造血、神經(jīng)和表皮組織內(nèi)環(huán)境平衡和嚴(yán)重創(chuàng)傷后再生反應(yīng)的細(xì)胞(Hall，P.A.，和Watt，F(xiàn).M.1989 Development106，619)。
盡管肝臟通常是靜止的組織不需快速的更新，但哺乳動(dòng)物的成年肝臟在廣泛的肝毒性損傷或部分肝切除后，具有巨大的恢復(fù)能力(Fishback，F(xiàn).C.1929 Arch.Pathol.7，955)；(Higgins，G.M.，和Anderson，R.M.1931 Arch.Pathol.12，186)。最近通過(guò)連續(xù)的移植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得到的來(lái)自小鼠的數(shù)據(jù)已被闡明，提示成年實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有幾乎無(wú)限的生長(zhǎng)潛能(Overturf等人，1997 Am.J.Pathol.151，1273)；(Rhim，J.A.等人，1994 Science 263，1149)。這些實(shí)驗(yàn)利用限制該能力的不均一肝細(xì)胞群來(lái)證實(shí)在成年實(shí)質(zhì)細(xì)胞、成年實(shí)質(zhì)細(xì)胞亞群和/或非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(即祖細(xì)胞)中觀察到的生長(zhǎng)潛能。此外，研究顯示沒(méi)有膽管上皮分化的證據(jù)，因?yàn)樗玫乃拗魇前椎鞍?尿激酶轉(zhuǎn)基因的，或在另外的情況下是酪氨酸分解酶缺陷的；兩種類(lèi)型的宿主都具備選擇肝細(xì)胞系的條件。因此，該實(shí)驗(yàn)不能檢測(cè)雙能細(xì)胞群。
數(shù)個(gè)組織學(xué)研究確定來(lái)自妊娠中期胚胎的早期肝細(xì)胞具有分化成膽管上皮以及成熟肝細(xì)胞的發(fā)育性雙向潛能(Shiojiri，N.1997Microscopy Res.Tech.39，328-35)。肝臟發(fā)育始于腹側(cè)前腸內(nèi)胚層，在內(nèi)胚層上皮與發(fā)生心臟的中胚層接觸后即刻開(kāi)始(Douarin，N.M.1975 Medical Biol.53，427)；(Houssaint，E.1980 CellDiffer.9，269)。在小鼠，肝臟定型發(fā)生在第8胚胎日(E)。最初階段的肝臟發(fā)育以在內(nèi)胚層誘導(dǎo)血清白蛋白和甲胎蛋白mRNAs而顯現(xiàn)，且在形態(tài)學(xué)改變之前(Gualdi，R.等人，1996 Genes Dev.10，1670)。在小鼠妊娠期的E9.5天，特化的細(xì)胞在那時(shí)增殖并以索狀方式穿入原始橫隔的間葉組織中，形成肝原基。盡管肝臟體積在那時(shí)顯著地增加，但體積增加主要地是由于造血細(xì)胞，該細(xì)胞在小鼠E10天轉(zhuǎn)移至胎肝(Houssaint，E.1981 Cell Differ.10，243)，并影響肝細(xì)胞使之顯示成極其扭曲和不規(guī)則的形狀(Luzzatto，A.C.1981 Cell TissueRes.215，133)。有趣的是，最近來(lái)自基因定向突變小鼠的數(shù)據(jù)顯示，許多基因的損傷在E12至E15期間引起致死性肝衰竭、凋亡和/或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞壞死(Gunes，C.等人，1998 EMBO J.17，2846；Hilberg，F(xiàn).等人，1993Nature 365，1791；Motoyama，J.等人，1997 Mech.Dev.66，27；Schmidt，C.等人，1995 Nature 373，699)。特別地，應(yīng)激活化的級(jí)聯(lián)(Ganiatsas，S.等人，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，6881；Nishina，H.等人，1999Development 126，505)或抗凋亡級(jí)聯(lián)(Beg，A.等人，1995 Nature376，167；Li，Q.等人，1999 Science 284，321；Tanaka，M.等人，1999.Immunity 10，421)之一部分的基因破壞可以引起嚴(yán)重的肝發(fā)育損害，沒(méi)有造血作用，盡管有廣泛的失活基因表達(dá)。不清楚是否肝細(xì)胞對(duì)發(fā)育應(yīng)激刺激固有地敏感，或是特定的胎肝微環(huán)境本身引起這種破壞性作用(Doi，T.S.等人，1999.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，2994)。另一方面，成年肝臟的基本結(jié)構(gòu)有賴(lài)于最初圍繞門(mén)靜脈的膽管上皮柱的出現(xiàn)(Shiojiri，N.1997 Microscopy Res.Tech.39，328)。免疫組織化學(xué)上，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞分化的第一個(gè)信號(hào)是表達(dá)膽管特異的細(xì)胞角蛋白(CK)。CK蛋白，即上皮細(xì)胞的胞漿中間絲(IF)蛋白，是由多基因家族編碼的并以組織和分化特異的方式表達(dá)(Moll，R.等人，1982Cell 31，11)。CK19是最顯著的膽管標(biāo)記物之一，因?yàn)槌赡旮渭?xì)胞完全不表達(dá)CK19，而成年膽管上皮細(xì)胞表達(dá)此蛋白。只有CK8和CK18從早期肝細(xì)胞到成年肝細(xì)胞均表達(dá)(Moll，R.等人，1982 Cell 31，11)。在大鼠發(fā)育的E15.5天，相對(duì)于小鼠的E14天，膽管前體細(xì)胞被CK18和CK8抗體均重染，一些膽管前體細(xì)胞表達(dá)CK19。隨著發(fā)育的進(jìn)程，成熟的膽管逐漸表達(dá)CK19外還表達(dá)CK7，并喪失白蛋白的表達(dá)(Shiojiri，N.等人，1991 Cancer Res.51，2611)。盡管早至E13天的大鼠肝細(xì)胞被認(rèn)為是同質(zhì)的群體，但仍然要看是否所有的早期肝細(xì)胞可以分化成膽管上皮細(xì)胞系，以及它們的結(jié)局是任何確定的。確定性種系標(biāo)記研究，如采用逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體者，還沒(méi)有對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行，而且對(duì)于確定任何雙能肝祖先細(xì)胞所必需的純系生長(zhǎng)條件尚未確定。
對(duì)于純系生長(zhǎng)分析，一個(gè)主要障礙是造血細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，這妨礙了觀察肝細(xì)胞離體擴(kuò)張的能力。因此，必須使用一個(gè)肝細(xì)胞群富集步驟。盡管能夠在胎肝中分離造血細(xì)胞的表面標(biāo)記物已經(jīng)被詳細(xì)研究(Dzierzak，E.等人，1998 Immunol.Today 19，228-36)，但用于肝祖先細(xì)胞者仍然缺少詳細(xì)說(shuō)明，因?yàn)樵撗芯咳蕴幱诔跗陔A段(Sigal，S.等人，1994 Hepatology 19，999)。因此，通常用于成體肝細(xì)胞的離體增殖條件可引起其去分化，并喪失組織特異的功能如表達(dá)白蛋白(Block，G.D.等人，1996 J.Cell Biol.132，1133)。只有在沒(méi)有血清且有限定的激素、生長(zhǎng)因子和/或某些細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物存在的情況下培養(yǎng)的肝細(xì)胞中，合成組織特異的mRNAs和轉(zhuǎn)錄后完全調(diào)節(jié)組織特異基因的能力發(fā)生一些改善(Jefferson，D.M.等人，1984，Mol.Cell.Biol.4，1929；Enat R，等人，1984，81，1411)。但是，增殖的胎肝細(xì)胞在體內(nèi)仍然表達(dá)這些血清蛋白。。在本領(lǐng)域還不清楚的是如何在體外維持和培養(yǎng)肝祖先細(xì)胞。對(duì)于鑒定維持肝祖先細(xì)胞離體擴(kuò)張的條件而言，這是一個(gè)未滿(mǎn)足的需要。同樣地，對(duì)于體外集落形成分析(CFA)，這也是一個(gè)未滿(mǎn)足的需要，其中CFA用于定義剛剛從肝組織分離的肝祖先的集落生長(zhǎng)潛能；克隆生長(zhǎng)被定義為接種到培養(yǎng)物中的單細(xì)胞產(chǎn)生子細(xì)胞群的能力，這些子細(xì)胞群克隆自接種的細(xì)胞。其它人已經(jīng)對(duì)集落生長(zhǎng)進(jìn)行了描述(Block，G.D.等人J.Cell Biol.1996，132，1133)，包括在肝培養(yǎng)物中以高細(xì)胞濃度接種的緊密生長(zhǎng)在一起的細(xì)胞的集合體；然而，在這些現(xiàn)有研究中描述的細(xì)胞集落不能進(jìn)行傳代培養(yǎng)，因此，按照此處的定義，它們不可克隆，只有有限的用途。
其它人已經(jīng)對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞做了一些嘗試。Naughton等人的美國(guó)專(zhuān)利5,510,254請(qǐng)求保護(hù)依賴(lài)于生物相容性的但不是活的物質(zhì)的三維框架的肝細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)于不需要人工構(gòu)架的肝細(xì)胞培養(yǎng)條件，以及提供肝祖先細(xì)胞將被擴(kuò)充且培養(yǎng)的條件，這是一個(gè)未滿(mǎn)足的需要。此外，存在對(duì)于具有如下能力的克隆肝祖先的未滿(mǎn)足的需要需要雙潛能分化能力，這是產(chǎn)生膽和肝細(xì)胞譜系的能力，和除了其它用途之外，用作生物人造肝臟組分的適用性，用于肝毒素試驗(yàn)和藥物開(kāi)發(fā)的適用性。
Naughton等人的美國(guó)專(zhuān)利5,559,022請(qǐng)求保護(hù)與黃色曙紅(EosinY)結(jié)合的肝補(bǔ)充細(xì)胞，其中黃色曙紅是用來(lái)對(duì)“補(bǔ)充細(xì)胞”進(jìn)行特征描述的染色劑，但沒(méi)有使用用于肝細(xì)胞的建立良好的標(biāo)記物，也沒(méi)有提供用于克隆擴(kuò)張的方法，也沒(méi)有提供用來(lái)分離活肝補(bǔ)充細(xì)胞的標(biāo)記物。存在對(duì)于如下方法的未滿(mǎn)足的需要，即教導(dǎo)如何分離且培養(yǎng)具有肝祖先所必需的許多特征的細(xì)胞的方法，這些特征包括至少一種特異性標(biāo)記物的表達(dá)，和分化為肝細(xì)胞或膽細(xì)胞的潛能。也存在對(duì)于肝祖先克隆生長(zhǎng)方法的未滿(mǎn)足的需要。克隆生長(zhǎng)是必需的，作為一個(gè)清楚且精確的多潛能肝祖先細(xì)胞的辨別和鑒定特征。
Ponting的美國(guó)專(zhuān)利5,405,772請(qǐng)求保護(hù)一種用于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。專(zhuān)利5,405,772需要使用3-30μg/ml膽固醇，5-30μg/ml核苷，和或者使用2-100μg/cm2IV型膠原蛋白或者0.5-100μg/cm2纖維連接蛋白。存在對(duì)于對(duì)肝祖先細(xì)胞生長(zhǎng)特異且最優(yōu)的培養(yǎng)基的需求。
Kuri-Harcuch等人的美國(guó)專(zhuān)利4,914,032請(qǐng)求保護(hù)一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法。與本發(fā)明相反，專(zhuān)利4,914,032或者沒(méi)有教導(dǎo)肝祖先的培養(yǎng)，或者沒(méi)有教導(dǎo)肝細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)條件。同樣地，Kuri-Harcuch等人的美國(guó)專(zhuān)利5,030,105請(qǐng)求保護(hù)通過(guò)處理肝細(xì)胞培養(yǎng)物評(píng)價(jià)試劑的方法。存在對(duì)于克隆生長(zhǎng)條件的未滿(mǎn)足的需要，以便于可以用確定的細(xì)胞群來(lái)試驗(yàn)且用于肝祖先細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
Naughton等人的美國(guó)專(zhuān)利5,858,721請(qǐng)求保護(hù)基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。然而，專(zhuān)利5,858,721受到需要生物相容性的且非生活物質(zhì)的框架的限制。相反，在本發(fā)明中存在對(duì)于不需要合成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)條件的未填充的需求。
本發(fā)明者認(rèn)識(shí)到，培養(yǎng)成熟肝細(xì)胞如肝細(xì)胞，而非更有用的肝祖先細(xì)胞，是不完全的。他們仔細(xì)地確定了肝祖先細(xì)胞的分離參數(shù)和純系生長(zhǎng)需要的條件。祖細(xì)胞和選擇、培養(yǎng)祖細(xì)胞的方法有許多用途，包括在治療肝衰竭患者的醫(yī)療實(shí)踐中的應(yīng)用、在毒物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用和在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。
Reid等人的美國(guó)專(zhuān)利5,576,207和5,789,246教導(dǎo)了對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞和含有激素的合成培養(yǎng)基的需求。這些現(xiàn)有研究都主張使用胚胎肝基質(zhì)細(xì)胞，組合使用確定的胞外基質(zhì)基層，和一種不含血清的、含激素的合成培養(yǎng)基，作為擴(kuò)張肝祖先的條件。然而，所用的合成培養(yǎng)基比本發(fā)明所用的培養(yǎng)基復(fù)雜的多；細(xì)胞被鋪平板于純化的基質(zhì)基層(IV型膠原蛋白和層粘連蛋白)上，而此處它們被直接鋪平板于滋養(yǎng)細(xì)胞(該滋養(yǎng)細(xì)胞提供所述基質(zhì))上；且胚胎基質(zhì)細(xì)胞被作為胚胎肝臟的原始培養(yǎng)物制備，不是作為細(xì)胞系建立。通過(guò)使用胚胎基質(zhì)細(xì)胞系，滋養(yǎng)細(xì)胞由一個(gè)更加簡(jiǎn)單的、更加實(shí)用的且更易于重現(xiàn)的支持這些細(xì)胞的方式而提供。而且，可以合理地假設(shè)，STO滋養(yǎng)細(xì)胞將不會(huì)嚴(yán)格地僅支持肝祖先細(xì)胞，而是可以用于多個(gè)組織類(lèi)型的祖先細(xì)胞?，F(xiàn)有專(zhuān)利中，肝祖先細(xì)胞培養(yǎng)物是以高細(xì)胞濃度接種的，且它們的擴(kuò)張以集落形成被觀察到，這意味著細(xì)胞的集合被誘導(dǎo)以繁殖，而不是細(xì)胞的克隆。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種增殖祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物的方法。尤其是，本發(fā)明涉及一種增殖內(nèi)胚層來(lái)源的祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物的方法。這些細(xì)胞來(lái)源于內(nèi)胚層組織。然后這些內(nèi)胚層來(lái)源的祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物在培養(yǎng)基中的含滋養(yǎng)細(xì)胞的層上培養(yǎng)。這些祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物可以是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。這些祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物可以表達(dá)細(xì)胞間粘附分子(ICAM)或ICAM-1陽(yáng)性和經(jīng)典的組織相容性抗原(MHC)I類(lèi)抗原陰性的表現(xiàn)型。經(jīng)典的MHC I類(lèi)抗原也稱(chēng)作MHC Ia類(lèi)抗原。
本發(fā)明也涉及一種培養(yǎng)肝干細(xì)胞和其它祖先細(xì)胞的方法，使用了一種不含血清的、含激素的合成培養(yǎng)基和滋養(yǎng)細(xì)胞。而且，本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)祖先細(xì)胞的后代，或祖先細(xì)胞和祖先細(xì)胞后代的組合的方法。優(yōu)選地，祖先細(xì)胞是肝祖先細(xì)胞。同樣地，本發(fā)明涉及一種用特定培養(yǎng)條件克隆肝多潛能細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種克隆肝多潛能祖先細(xì)胞的方法。肝多潛能祖先細(xì)胞可以來(lái)源于任何無(wú)脊椎動(dòng)物或脊椎動(dòng)物種類(lèi)，更優(yōu)選地來(lái)自哺乳動(dòng)物。甚至更優(yōu)選地，肝多潛能祖先細(xì)胞來(lái)源于人、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、豬、狗、大鼠、兔子或小鼠。最優(yōu)選地，多潛能祖先細(xì)胞來(lái)源于人。本發(fā)明教導(dǎo)了肝祖先細(xì)胞和它們的后代的離體擴(kuò)張所需要的特定培養(yǎng)條件。本發(fā)明也教導(dǎo)了用胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞，如STO小鼠胚胎細(xì)胞，作為肝祖先細(xì)胞的滋養(yǎng)細(xì)胞。滋養(yǎng)細(xì)胞是與本發(fā)明所教導(dǎo)的新穎的不含血清的、含激素的合成培養(yǎng)基(HDM)組合使用的。該組合可以使發(fā)明人從E15大鼠肝臟建立各種大鼠胎兒肝細(xì)胞系，而不會(huì)發(fā)生這些細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。
而且，本發(fā)明涉及克隆滋養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述滋養(yǎng)細(xì)胞可以維持肝祖先細(xì)胞和它們的后代的繁殖。
本發(fā)明也涉及特定細(xì)胞系，當(dāng)用作滋養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞系可以支持肝祖先細(xì)胞生長(zhǎng)。
本發(fā)明還涉及克隆肝祖先細(xì)胞的方法。本發(fā)明教導(dǎo)了，使用肝細(xì)胞系和HDM-STO協(xié)同培養(yǎng)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)體外集落形成分析(CFA)，以定義新鮮分離的肝祖先細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)潛能。當(dāng)CFA與特定抗原輪廓純化的細(xì)胞結(jié)合時(shí)，它揭示出雙潛能肝祖先細(xì)胞。例如，來(lái)自E13大鼠肝臟且具有高生長(zhǎng)潛能的祖先細(xì)胞，在小鼠中相當(dāng)于E11.5，與經(jīng)典MHC I類(lèi)(RT1A1)-，OX18(pan-MHC I類(lèi))dull和細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)+具有相同的表型。
本發(fā)明還涉及能維持克隆肝細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基的特色是具有好幾種特定激素和養(yǎng)分，且不存在血清。
仍然進(jìn)一步，本發(fā)明涉及在含有滋養(yǎng)細(xì)胞生物合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)肝祖先細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化的方法，包括肝細(xì)胞和膽細(xì)胞表現(xiàn)型的產(chǎn)生。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)在本發(fā)明中被教導(dǎo)，不僅影響祖先細(xì)胞集落的生長(zhǎng)，而且影響它們作為肝細(xì)胞或作為膽上皮細(xì)胞的命運(yùn)。
4.附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1C是來(lái)自15天胚胎大鼠肝臟的肝細(xì)胞系的特征。
圖2A-2F是在滋養(yǎng)細(xì)胞上的集落形成試驗(yàn)。
圖3A-3X是成體肝細(xì)胞的各種肝細(xì)胞系上，大鼠細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。
圖4A1-4D4描繪了E13胚胎大鼠肝臟的表現(xiàn)型分析。
圖5A-5D是在沒(méi)有和存在EGF的情況下，肝細(xì)胞集落的特征。
圖6A-6B描繪了在RT1A1-肝細(xì)胞上誘導(dǎo)CK19的表達(dá)。
圖7是在STO5滋養(yǎng)細(xì)胞上肝細(xì)胞集落形成的圖解說(shuō)明。
5.優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明是一種繁殖方法和干細(xì)胞的用途。多種組織是祖先細(xì)胞的適當(dāng)來(lái)源，包括外胚層、中胚層和內(nèi)胚層來(lái)源的組織。外胚層組織可以包括皮膚組織、腦組織和其它神經(jīng)組織。中胚層組織可以包括肌肉、血液和造血系統(tǒng)。內(nèi)胚層組織可以包括與腸道、胃、胰腺，甲狀腺和消化系統(tǒng)相關(guān)的腺體。尤其是，本發(fā)明是一種肝干細(xì)胞和其它肝祖先細(xì)胞的繁殖方法。該方法涉及將分離的肝干細(xì)胞和/或肝祖先細(xì)胞和/或它們的后代的群暴露于能維持克隆生長(zhǎng)的生長(zhǎng)條件下，也就是，以非常低的細(xì)胞濃度生長(zhǎng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法涉及使用一種不含血清的、含激素的合成培養(yǎng)基來(lái)支持肝祖先細(xì)胞在滋養(yǎng)細(xì)胞層上的增殖。滋養(yǎng)細(xì)胞的功能是多方面的，包括提供養(yǎng)分、提供附著面和將肝祖先細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)和/或分化所必需的一些生長(zhǎng)因子和胞外基質(zhì)成分分泌到培養(yǎng)基中。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法涉及選擇能維持肝干細(xì)胞和肝祖先細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞。滋養(yǎng)細(xì)胞可以來(lái)自爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)、甲殼動(dòng)物、魚(yú)、環(huán)節(jié)動(dòng)物、軟體動(dòng)物、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來(lái)自人。優(yōu)選地，滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)自胚胎組織。而且優(yōu)選地，滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)自胚胎組織。而且優(yōu)選地，滋養(yǎng)細(xì)胞可以來(lái)自胚胎肝組織。另外，滋養(yǎng)細(xì)胞可以被遺傳修飾。仍然在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法涉及克隆那些最優(yōu)地維持肝細(xì)胞的滋養(yǎng)細(xì)胞。
任何分離肝干細(xì)胞和肝祖先細(xì)胞的方法是可以接受的，包括通過(guò)基于親和力的相互作用，如親和淘選、結(jié)合補(bǔ)體的免疫手術(shù)法，通過(guò)流式細(xì)胞儀，通過(guò)離心淘析，通過(guò)差速離心等等。分離的肝干細(xì)胞和祖先細(xì)胞有能力表達(dá)一些或全部表現(xiàn)型標(biāo)記物(經(jīng)典的MHC I-類(lèi)，ICAM-1+，OX18dull，甲胎蛋白+，或白蛋白+)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是肝祖先細(xì)胞在集落中表現(xiàn)的生長(zhǎng)模式的特征在于堆積的細(xì)胞形成為集合、集落或簇。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是，肝細(xì)胞可以選擇性地在不含血清的、含激素的合成培養(yǎng)基(HDM)中生長(zhǎng)。
HDM組合物包括一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，包括但不限于，Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基和Ham F12的混合物，該混合物中加入了如下成分高達(dá)大約40ng/ml EGF，高達(dá)大約5-10μg/ml胰島素，高達(dá)大約10-6M地塞米松或其它糖皮質(zhì)激素，高達(dá)大約10μg/ml鐵飽和的轉(zhuǎn)鐵蛋白，高達(dá)大約5×10-2M煙酰胺，高達(dá)大約2％牛血清白蛋白，高達(dá)大約5×10-4M2-巰基乙醇或等效的還原劑，高達(dá)大約8μeq/l游離脂肪酸，高達(dá)大約2×10-2M谷氨酰胺，高達(dá)大約1×10-6M CuSO4，高達(dá)大約3×10-8MH2SeO3，以及任選的抗生素?？股乜梢园ㄇ嗝顾?、鏈霉素、慶大霉素和其它本領(lǐng)域的普通抗生素，以及它們的組合。本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將了解到，其它營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，如Ham F-10，培養(yǎng)基199，或包括MCDB 151和MCDB 302在內(nèi)的MCDB系列中的一種，在最小量測(cè)試后可以被用來(lái)取代DMEM/F12。細(xì)胞擴(kuò)張的最低條件是在不存在任何激素的情況下使用滋養(yǎng)細(xì)胞；上述列出的最關(guān)鍵的激素要求是糖皮質(zhì)激素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和EGF，構(gòu)成用于祖先細(xì)胞擴(kuò)張的嚴(yán)格的激素促分裂原?？梢蕴砑悠渌に匾蜃?，且它們可以具有次生生長(zhǎng)效應(yīng)，但不能取代上述列出的關(guān)鍵要求。同樣地，在激素組成中作一些變化也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以完成的變化。
優(yōu)選的范圍包括10-50ng/ml EGF，2-10μg/ml胰島素，5×10-7M-5×10-6M地塞米松(9α-氟-16α-甲基-脫氫皮質(zhì)甾醇)，5-20μg/ml鐵飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白，2-8×10-3M煙酰胺，0.05-0.5％血清白蛋白，2-8×10-5M2-巰基乙醇，5-10μeq游離脂肪酸混合物，1-3×10-3M谷氨酰胺，0.5-2×10-6M CuSO4，1-5×i0-8M H2SeO3，1-5μm棕櫚酸，0.1-0.4μm棕櫚油酸，0.5-1.2μm硬脂酸，0.5-2μm油酸，1-5μm亞油酸，和0.2-0.8μm亞麻酸。
本發(fā)明的不含血清的、含激素的合成培養(yǎng)基適合于肝細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)。該HDM含有一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是多種選項(xiàng)中的任一種，如Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DME)，Ham F12，RPMI 1640，Williams E培養(yǎng)基，等等。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基和Ham F12的1∶1混合物(DMEM/F12，例如來(lái)自GIBCO/BRL，GrandIsland，NY)?；A(chǔ)培養(yǎng)基含有優(yōu)選濃度為10ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子EGF(例如來(lái)自Collaborative Biomedical Products)，優(yōu)選濃度為5μg/ml的胰島素(例如來(lái)自Sigma)，10-6M地塞米松(例如來(lái)自Sigma)，10μg/ml鐵飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma)，4.4×10-3M煙酰胺(例如來(lái)自Sigma)，0.2％血清白蛋白(例如來(lái)自Sigma)，5×10-5M 2-巰基乙醇(例如來(lái)自Sigma)，7.6μeq/l游離脂肪酸混合物(2.4μM棕櫚酸，0.21μM棕櫚油酸，0.88μM硬脂酸，1μM油酸，2.7μM亞油酸，和0.43μM亞麻酸)，2×10-3M谷氨酰胺(例如來(lái)自GIBCO/BRL)，1×10-6MCuSO4，3×10-8M H2SeO3，和抗生素。滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子包括但不限于，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，白細(xì)胞介素(IL)-6家族，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，它們可以被加入到培養(yǎng)基中來(lái)增強(qiáng)滋養(yǎng)效應(yīng)，但是當(dāng)上述生長(zhǎng)因子單獨(dú)加入或以各種組合加入時(shí)還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)取代滋養(yǎng)效應(yīng)，這意味著滋養(yǎng)細(xì)胞在產(chǎn)生其它仍然未鑒定出的信號(hào)，這些信號(hào)是單獨(dú)需要的或與這些生長(zhǎng)因子的組合是需要的。
本發(fā)明的仍然又一個(gè)實(shí)施方案是，肝祖先細(xì)胞是從單祖先細(xì)胞繁殖的，也就是說(shuō)，這些細(xì)胞是克隆的。在集落中培養(yǎng)細(xì)胞不一定等于克隆生長(zhǎng)，所述克隆生長(zhǎng)被隱含或明確地定義為來(lái)源于單細(xì)胞的細(xì)胞繁殖。本技術(shù)領(lǐng)域已知的幾種克隆方法中的任一種是合適的，包括將祖先細(xì)胞稀釋為每孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中一個(gè)細(xì)胞，或更少，該方法被稱(chēng)作有限稀釋。類(lèi)似地可以用克隆環(huán)克隆祖先細(xì)胞，是通過(guò)選擇性切除，通過(guò)在微粒上稀釋培養(yǎng)物，通過(guò)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行單細(xì)胞分選，通過(guò)用微量移液管或光學(xué)鑷子挑選個(gè)體細(xì)胞，以及通過(guò)瓊脂進(jìn)行的。
本發(fā)明的仍然又一個(gè)實(shí)施方案是，許多克隆的祖先細(xì)胞是可以有絲分裂的。優(yōu)選地，祖先細(xì)胞能有絲分裂至少一個(gè)周期，甚至更優(yōu)選地祖先細(xì)胞能分裂至少10個(gè)周期。
本發(fā)明的仍然又一個(gè)實(shí)施方案是，肝祖先細(xì)胞和它們的后代是在用滋養(yǎng)細(xì)胞的代謝產(chǎn)物和生物合成產(chǎn)物補(bǔ)充的培養(yǎng)基中繁殖的。補(bǔ)充可以采取條件培養(yǎng)基的形式，即，先用活滋養(yǎng)細(xì)胞溫育的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，補(bǔ)充可以采取從滋養(yǎng)細(xì)胞條件培養(yǎng)基中分離出下述因子的形式，所述因子包括維持且增強(qiáng)肝祖先細(xì)胞和它們的后代生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、糖類(lèi)和代謝調(diào)節(jié)劑。蛋白質(zhì)可以包括胞外基質(zhì)的可溶和不可溶成分和生長(zhǎng)因子，包括表皮生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子。
進(jìn)一步優(yōu)選地，肝細(xì)胞可以選擇性地在使用了滋養(yǎng)細(xì)胞層的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在該培養(yǎng)基中那些滋養(yǎng)細(xì)胞是胚胎細(xì)胞或成體細(xì)胞或其它合適的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，滋養(yǎng)細(xì)胞是基質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞或其它合適的細(xì)胞可以被基因修飾，例如通過(guò)轉(zhuǎn)染。優(yōu)選地，成纖維細(xì)胞或其它合適的細(xì)胞，可以是人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、豬、狗、兔子、大鼠或小鼠中胚層細(xì)胞，且其它哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)中胚層細(xì)胞也是合適的。而且，成纖維細(xì)胞可以被克隆且選擇支持肝祖先細(xì)胞的能力。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是，分離的肝祖先細(xì)胞可以通過(guò)選擇性應(yīng)用或者不存在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)或其它分化信號(hào)被定型為肝細(xì)胞或膽細(xì)胞譜系。
本發(fā)明的一個(gè)仍然更優(yōu)選的實(shí)施方案是，分離的干細(xì)胞和其它肝祖先細(xì)胞可以被用作生物人造肝臟的成分，所述生物人造肝臟可以被用作體外肝臟輔助裝置。本發(fā)明的一個(gè)仍然更優(yōu)選的實(shí)施方案是，含有分離的肝祖先細(xì)胞和它們的后代的生物人造肝臟可以被用來(lái)支持患有肝功能失?；蛩ソ叩牟∪说纳?。6.實(shí)施例下述實(shí)施例是本發(fā)明的例證性說(shuō)明，但本發(fā)明絕不限于這些特定實(shí)施例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在這些實(shí)施例中將發(fā)現(xiàn)完成本發(fā)明的方法。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到大量落入本發(fā)明范圍的可選實(shí)施方案。
6.1肝干細(xì)胞和肝祖先細(xì)胞的制備和分析大鼠。從Charles River Breeding Laboratory(Wilmington，MA)獲得懷孕的Fisher 344大鼠。為同步妊娠，動(dòng)物在下午放在一起，觀察到栓子的早晨被指定為0天。雄性Fisher 344大鼠(200-250g)被用于成體肝細(xì)胞來(lái)源。
建立肝細(xì)胞系。制備妊娠15天的胎肝。通過(guò)用0.05％胰蛋白酶和0.5mM EDTA或10單位/ml嗜熱菌蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO)和100單位/ml脫氧核糖核酸酶I(Sigma)在37℃孵育肝臟獲得了單細(xì)胞懸液。細(xì)胞鋪在Ficoll-paque(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)上，以450g進(jìn)行梯度密度離心15min。將底部組分的細(xì)胞接種進(jìn)組織培養(yǎng)皿中，對(duì)th1120-3和rter6或rhe14321，培養(yǎng)皿分別用17mg/ml IV型膠原蛋白(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)或12μg/ml層粘連蛋白(Collaborative Biomedical Products)被覆。無(wú)血清激素限定培養(yǎng)基，HDM，是Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基和Ham F12(DMEM/F12，GIBCO/BRL，Grand Island，NY)的1∶1混合物，其中添加了20ng/ml EGF(Collaborative Biomedical Products)、5μg/ml胰島素(Sigma)、10-7M地塞米松(Sigma)、10μg/ml鐵飽和的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma)、4.4×10-3M煙酰胺、0.2％牛血清白蛋白(Sigma)、5×10-5M 2-巰基乙醇(Sigma)、7.6μeq/l游離脂肪酸、2×10-3M谷氨酰胺(GIBCO/BRL)、1×10-6M CuSO4、3×10-8M H2SeO3和抗生素。給出的每個(gè)濃度是培養(yǎng)基中的終濃度。培養(yǎng)4周后，胰蛋白酶消化的細(xì)胞在滋養(yǎng)層上培養(yǎng)，滋養(yǎng)細(xì)胞是絲裂霉素C處理的STO小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(American Type Culture Collection，Rockville MD)。Th1120-3、rter6和rhel4321是從胎肝細(xì)胞的三個(gè)獨(dú)立標(biāo)本中克隆的并用HDM保存在STO滋養(yǎng)細(xì)胞上。在細(xì)胞系建立后，所有細(xì)胞培養(yǎng)物的EGF濃度減至10ng/ml。
細(xì)胞粘附試驗(yàn)。用0.3至10μg/ml的纖維連接蛋白(Collaborative Biomedical Products)、層粘連蛋白和IV型膠原包被的96孔微滴板(Corning，Cambridge，MA)評(píng)價(jià)細(xì)胞與其的粘附。通過(guò)200g 15min的Percoll(Pharmacia Biotech)梯度密度離心移除STO細(xì)胞后，3×104的肝細(xì)胞系、th1120-3、rter6和rhel4321在每孔內(nèi)用HDM培養(yǎng)10小時(shí)。沖洗兩次移除飄浮細(xì)胞后，添加含有四唑鹽WST-1(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的新鮮培養(yǎng)基以檢測(cè)變化的粘附細(xì)胞的數(shù)量。4小時(shí)后，根據(jù)生產(chǎn)廠商的方案測(cè)定吸光率。
STO亞系。來(lái)自ATCC的100個(gè)親代STO細(xì)胞，在100mm培養(yǎng)皿中，用含10％熱滅活胎牛血清、2×10-3M谷氨酰胺、5×10-5M 2-巰基乙醇和抗生素補(bǔ)充的DMEM/F12，培養(yǎng)7天。選擇4個(gè)亞克隆以根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度進(jìn)一步鑒定。盡管在4個(gè)亞克隆中進(jìn)行了rter6的CFA，其中之一，STO6，在絲裂霉素C處理后不再與培養(yǎng)板附著。用Dr.J.M.Adama，The Walter and Eliza Hall Institute of MedicalResearch惠贈(zèng)的pEF-Hlx-MClneo或pEF-MClneo轉(zhuǎn)染一個(gè)亞克隆STO5。用DOSPER脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Boehringer Mannheim)在Nde I位點(diǎn)向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入線性質(zhì)粒。G418選擇后，分離6個(gè)克隆。三個(gè)克隆的每一個(gè)都用CFA分析。
集落的免疫組化染色。培養(yǎng)板在甲醇-丙酮(1∶1)中室溫固定2min，沖洗并用含20％山羊血清(GIBCO/BRL)的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)4℃阻斷。對(duì)甲胎蛋白和白蛋白的雙免疫組化，培養(yǎng)板用抗大鼠白蛋白抗體(ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA)孵育，接著用得克薩斯紅結(jié)合的抗兔IgG(Vector laboratories，Burlingame，CA)和FITC結(jié)合的抗大鼠甲胎蛋白多克隆抗體(NordicImmunology，Tilburg，Netherlands)孵育。為雙標(biāo)記白蛋白和CK19，抗CK19單克隆抗體(Amersham，Buckinghamshire，England)和FITC結(jié)合的抗小鼠IgG(Caltag，Burlingame，CA)被用來(lái)代替抗甲胎蛋白抗體。
E13胎肝的游離。胎肝被切碎，置入冰冷的含10mM HEPES、0.8mMMgSO4和1mM EGTA(pH7.4)的無(wú)Ca++HBSS中。肝臟用0.2％IV型膠原酶(Sigma)和16.5單位/ml嗜熱菌蛋白酶(Sigma)的HBSS溶液粉碎，HBSS用10mM HEPES、0.8mM MgSO4和1mM CaCl2制備。在37℃孵育10min后，細(xì)胞懸液用0.025％胰蛋白酶和2.5mM EDTA(Sigma)消化10min。然后，通過(guò)添加1mg/ml胰蛋白酶抑制劑(Sigma)抑制胰蛋白酶。最終，用200單位/ml脫氧核糖核酸酶I(Sigma)處理細(xì)胞。在所有實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)肝臟獲得了3-5×105個(gè)細(xì)胞。
成體肝細(xì)胞的分離。進(jìn)行兩步肝灌注法分離肝細(xì)胞。灌注后，以50g離心細(xì)胞1min兩次以濃縮大的實(shí)質(zhì)細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)排除法檢測(cè)細(xì)胞活力＞90％。
流式細(xì)胞儀分析。細(xì)胞在FACScan(Becton-Dickinson，MountainView，CA)上分析，并用Moflow流式細(xì)胞儀(Cytomation，F(xiàn)ortCollins，CO)分類(lèi)。來(lái)自E13胎肝的細(xì)胞懸液用含20％山羊血清(GIBCO/BRL)和1％硬骨魚(yú)明膠(Sigma)的HBSS在冰上孵育，以防止非特異的抗體結(jié)合。沖洗后，細(xì)胞用FITC結(jié)合的抗大鼠RT1Aa，b，l抗體B5(Pharmingen，San Diego，CA)和PE結(jié)合的抗大鼠ICAM-1抗體1A29(Pharmingen)重懸浮。在一些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞用生物素化抗大鼠單態(tài)MHC I類(lèi)抗體OX18(Pharmingen)染色，然后用抗生物素蛋白鏈菌素-紅670(GIBCO/BRL)第二次染色以進(jìn)行三重染色。所有染色都用冰冷的含10mM HEPES、0.8mM MgSO4、0.2mM EGTA和0.2％BSA(pH7.4)的無(wú)Ca++HBSS進(jìn)行。建立的三個(gè)肝細(xì)胞系被胰蛋白酶化，并通過(guò)Percoll密度梯度離心分餾以去除滋養(yǎng)細(xì)胞。大鼠肝癌細(xì)胞系FTO-2B和大鼠肝上皮細(xì)胞系WB-F344以及成體肝細(xì)胞被染色，以與胎肝細(xì)胞系比較。細(xì)胞系分別由Dr.R.E.K.Fournier，F(xiàn)red Hutchinson CancerResearch Center，Seattle，WA和Dr.M.-S.Tsao，University of NorthCarolina，Chapel Hill，NC惠贈(zèng)。細(xì)胞用FITC結(jié)合的B5、OX18，PE結(jié)合的1A29或抗FITC結(jié)合的大鼠整合素β1抗體Ha2/5(Pharmingen)阻斷和染色。FITC結(jié)合的抗小鼠IgG被用于OX18。三個(gè)胎肝細(xì)胞系的細(xì)胞懸液用生物素化抗小鼠CD98染色，隨后用抗生物素蛋白鏈菌素-紅670以及抗大鼠單克隆抗體(moAb)二次染色以圈定出小鼠細(xì)胞群。
各種抗原以不同的相對(duì)數(shù)量由細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。在實(shí)際應(yīng)用中，特定抗原的表達(dá)水平可以是零表達(dá)、低水平表達(dá)、對(duì)于許多抗原來(lái)說(shuō)的正?；虺Ｒ?guī)的表達(dá)水平以及高表達(dá)水平。在該用法中，術(shù)語(yǔ)“低”可以與弱或微弱交換使用。也可以對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行更詳細(xì)的描述，但這四個(gè)表達(dá)水平可以滿(mǎn)足許多目的。應(yīng)該清楚，抗原表達(dá)的測(cè)量，例如通過(guò)流式細(xì)胞儀，提供了一個(gè)連續(xù)范圍的抗原表達(dá)測(cè)定值。
肝細(xì)胞系、分選的細(xì)胞和成體肝細(xì)胞的CFA。肝細(xì)胞系以每9.6cm2500細(xì)胞分三份鋪于絲裂霉素C處理的STO滋養(yǎng)細(xì)胞層上，使用與維持每個(gè)細(xì)胞系相同的HDM。在鋪板之前，細(xì)胞被胰蛋白酶消化，并通過(guò)Percoll密度梯度離心分餾以去除滋養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)物孵育10至14天，每隔一天換一次培養(yǎng)基。然后進(jìn)行甲胎蛋白和白蛋白的雙重免疫熒光染色。通過(guò)集落形態(tài)，P或F型，以及甲胎蛋白和白蛋白的表達(dá)分析集落，每孔100個(gè)集落。用Diff-Quick(Baxter，McGaw Park，IL)染色集落以計(jì)算每孔的集落數(shù)。在初步分選的細(xì)胞和成體肝細(xì)胞的CFA中，鋪置的細(xì)胞數(shù)量按所描述的進(jìn)行改變。作為另一個(gè)較小的修改，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到14至17天之間，且地塞米松的濃度增至10-6M。所有其它的步驟如上進(jìn)行。在成體肝細(xì)胞的CFA中，少量肝細(xì)胞塊沒(méi)有在制備后從細(xì)胞懸液中去除。因此，可能從細(xì)胞塊中產(chǎn)生不確定數(shù)量的集落。對(duì)分選細(xì)胞上膽管分化的CFA，在存在或缺少EGF的每個(gè)培養(yǎng)物中，在第5天進(jìn)行集落的白蛋白和CK19雙重免疫熒光染色。在培養(yǎng)的第5天，超過(guò)一個(gè)CK19+細(xì)胞的任何集落被計(jì)算為CK19+集落。在第10和15天，含有多簇兩個(gè)CK19+細(xì)胞或一簇超過(guò)三個(gè)CK19+細(xì)胞的集落被計(jì)算為CK19+集落。每孔大約計(jì)算100個(gè)集落。每個(gè)點(diǎn)代表來(lái)自三重染色培養(yǎng)物的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。
6.2用激素限定培養(yǎng)基使用小鼠胚胎細(xì)胞滋養(yǎng)層產(chǎn)生和鑒定大鼠胎肝細(xì)胞系嘗試對(duì)大鼠E15肝細(xì)胞進(jìn)行單純長(zhǎng)期培養(yǎng)以觀察胎肝細(xì)胞能夠體外維持和擴(kuò)張產(chǎn)生后代的時(shí)間。經(jīng)過(guò)梯度密度離心取出造血單核細(xì)胞后，胎肝細(xì)胞在被覆IV型膠原或?qū)诱尺B蛋白的培養(yǎng)皿中用HDM培養(yǎng)(見(jiàn)實(shí)施例6.1)。細(xì)胞良好地存活4周以上。但在IV型膠原或?qū)诱尺B蛋白被覆的新培養(yǎng)皿上繼代培養(yǎng)并不能繼續(xù)擴(kuò)張。當(dāng)絲裂霉素C處理的STO胚胎小鼠成纖維細(xì)胞系被用作繼代培養(yǎng)的滋養(yǎng)層時(shí)，可生長(zhǎng)出許多細(xì)胞集落。從4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中最終建立了幾個(gè)穩(wěn)定的肝細(xì)胞系。
在克隆細(xì)胞系之前，在連續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞群中進(jìn)行甲胎蛋白和白蛋白的免疫組織化學(xué)分析。兩種蛋白，甲胎蛋白和白蛋白被用作標(biāo)記物來(lái)證實(shí)這些細(xì)胞群來(lái)自肝細(xì)胞系。有形成細(xì)胞團(tuán)趨勢(shì)的細(xì)胞群，稱(chēng)為P-集落，具有強(qiáng)烈表達(dá)的甲胎蛋白和白蛋白，而另一個(gè)集落則產(chǎn)生扁平的單層，稱(chēng)為F-集落，甲胎蛋白表達(dá)減少，不表達(dá)白蛋白。胚胎小鼠成纖維細(xì)胞，STO，未顯示對(duì)兩種抗體的任何反應(yīng)性。為了進(jìn)一步分析，根據(jù)P型或F型集落的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)從不同的實(shí)驗(yàn)中選擇出三個(gè)克隆肝細(xì)胞系。Rhe14321(圖1a)主要由成堆的小細(xì)胞組成，P型集落，而th1120-3(圖1c)則僅形成扁平單層的F型集落。Rter6(圖1b)是這兩種類(lèi)型的中間表現(xiàn)型。有趣的是，rter6的不均一性在經(jīng)過(guò)扁平集落的三輪連續(xù)克隆后仍然可觀察到。為了觀察來(lái)自rhe14321和rter6中單個(gè)細(xì)胞的集落的不均一性，細(xì)胞在STO成纖維細(xì)胞上，以每9.6cm2(6孔板的一個(gè)孔)500個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)10至14天。然后根據(jù)其形態(tài)學(xué)和甲胎蛋白和白蛋白的表達(dá)來(lái)確定集落的特性。圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f顯示了結(jié)果。在細(xì)胞系rhe14321(圖2b)和rter6(圖2c)中以及克隆前的初始細(xì)胞群中(圖2a)，幾乎所有的P型集落強(qiáng)烈地表達(dá)甲胎蛋白，而F型集落細(xì)胞則不表達(dá)。而且，甲胎蛋白和白蛋白的強(qiáng)烈表達(dá)僅在P型集落中觀察到?？寺「渭?xì)胞系的形態(tài)學(xué)差異與P型集落的百分比相關(guān)(圖2b和圖2c)。在rter6和rhe14321的CFA中P型集落的百分比分別為33.3％(±8.6％SD)和65.7％(±4.0％SD)。計(jì)數(shù)每孔的總集落數(shù)目以計(jì)算純系生長(zhǎng)的效率(集落效率)。rter6和rhe14321的效率分別為45.7％(±1.3％SD)和36.4％(±1.1％SD)。th1120-3細(xì)胞沿著其外側(cè)緣互相緊密貼附，使制備單細(xì)胞懸液很困難。但是，th1120-3細(xì)胞并不產(chǎn)生堆積的集落。
下一步，檢測(cè)每種細(xì)胞系粘附細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)特定成分的偏嗜，因?yàn)樾∈蟾渭?xì)胞與這些ECM蛋白如層粘連蛋白、IV型膠原和纖維連接蛋白的粘附在不同發(fā)育期中是改變的。而IV型膠原在th1120-3(圖1c)的貼附中是最有效的，類(lèi)似于在成體肝細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)，而對(duì)rter6(圖1b)和rhe14321(圖1a)的效果次之。層粘連蛋白對(duì)于rth14321的貼附是最有效的支持物(圖1a)。這種偏嗜類(lèi)似于小鼠胎肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)?？傊?，甲胎蛋白和白蛋白在P型集落中的保守表達(dá)，以及rth14321與層粘連蛋白的優(yōu)先粘附，表明產(chǎn)生P型集落的細(xì)胞群與肝臟祖細(xì)胞更確實(shí)地相關(guān)。
6.3為集落形成實(shí)驗(yàn)分離STO亞克隆肝臟祖細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為了形成CFA系統(tǒng)以鑒定具有高度生長(zhǎng)潛能的雙能肝臟祖細(xì)胞，培養(yǎng)系統(tǒng)必須能夠在克隆接種密度下支持細(xì)胞擴(kuò)張，并保留重要的原始肝臟功能。白蛋白和甲胎蛋白是早期肝臟發(fā)育的最顯著標(biāo)記物中的兩個(gè)。P型集落的優(yōu)化培養(yǎng)條件應(yīng)該是最佳的，因?yàn)镻型，但不是F型集落在純系擴(kuò)張過(guò)程中維持甲胎蛋白和白蛋白的表達(dá)。因此，就其支持rter6的P型集落對(duì)STO亞克隆進(jìn)行了比較。這些克隆中的一個(gè)，STO5，較任何其他亞系和親代細(xì)胞系更支持P型集落形成(圖2d)。Rhe14321的CFA也證實(shí)了STO5較親代STO是更有效的滋養(yǎng)層(圖2e)。小鼠H1x基因產(chǎn)物，在來(lái)自E10.5的內(nèi)襯消化道的間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)胎肝細(xì)胞擴(kuò)張是重要的。盡管H1x基因的mRNA表達(dá)在所有STO亞克隆中被分析，但在亞克隆間其表達(dá)沒(méi)有顯著的差異(數(shù)據(jù)未顯示)。而且，在STO5中，小鼠H1x的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體并不引起集落形成實(shí)驗(yàn)的改善(圖2f)。但是轉(zhuǎn)染體中的一個(gè)克隆被用來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵撧D(zhuǎn)染體在相對(duì)高的代數(shù)時(shí)，更穩(wěn)定地持久維持STO5的原始形態(tài)學(xué)。
6.4采用表面抗原標(biāo)記物和集落形成實(shí)驗(yàn)從E13胎肝中鑒定肝臟祖細(xì)胞肝細(xì)胞生成和大量的血細(xì)胞生成可同時(shí)存在于胎肝中。到目前為止，血細(xì)胞生成祖細(xì)胞的抗原性全貌已經(jīng)被廣泛的分析，而對(duì)于早期肝臟祖細(xì)胞的研究仍然處于起步階段。肝臟細(xì)胞的抗原性全貌可采用在本研究中建立的三種肝細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行分析，它們是成體肝癌細(xì)胞系(FTO-2B)，來(lái)自成年大鼠肝臟的上皮細(xì)胞系(WB-F344)，和新鮮分離的成體肝細(xì)胞。與FTO-2B，WB-F344和成體細(xì)胞相比，最不成熟的胎肝細(xì)胞系，rhe14321的表達(dá)圖譜是非常獨(dú)特的，因?yàn)樗鼪](méi)有經(jīng)典的MHC I類(lèi)(RT1A1)的表達(dá)(圖3a-3x)。細(xì)胞系th1120-3(圖3i-31)在RT1A1，OX18(pan-MHC I類(lèi))和ICAM-1的表達(dá)圖譜上類(lèi)似于rhe14321(圖3a-3d)，而rter6(圖3e-3h)則具有非常高的RT1A1和OX18的表達(dá)(圖3)。另外，來(lái)自一個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中的另一個(gè)細(xì)胞系，與rhe14321具有相同的形態(tài)學(xué)，也是RT1A1-，OX18dull，和ICAM-1+。整合素b1的表達(dá)在所有細(xì)胞系中是相似的，而RT1Aa，b，l和ICAM-1的表達(dá)圖譜在它們中則是獨(dú)特的。成體肝細(xì)胞的抗原性全貌是RT1A1+，OX18+和ICAM-1+。因此，在成年大鼠中，所有的骨髓細(xì)胞除了成熟的紅細(xì)胞外都強(qiáng)烈的表達(dá)MHCI類(lèi)分子，胎肝細(xì)胞群可根據(jù)MHC I類(lèi)的表達(dá)從造血細(xì)胞群中分離出來(lái)。來(lái)自大鼠E13肝臟的細(xì)胞懸液用抗RT1A1和ICAM-1抗體進(jìn)行染色。圖4a顯示了RT1A1和ICAM-1的雙色染色圖譜。為了確定哪個(gè)組分中含有肝細(xì)胞群，5個(gè)組分通過(guò)熒光活化的細(xì)胞分選進(jìn)行分離，然后通過(guò)CFA選擇純系生長(zhǎng)潛能。圖4b代表了經(jīng)過(guò)分選后5個(gè)組分重新分選的結(jié)果。肝細(xì)胞集落，通過(guò)白蛋白和甲胎蛋白的表達(dá)來(lái)確定，在形態(tài)學(xué)上也是可以區(qū)分的，可以對(duì)每孔中肝細(xì)胞集落的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。大多數(shù)肝細(xì)胞集落可在圈定RT1A1dull和ICAM-1+(表1，圖4b圈定2)中被檢測(cè)出來(lái)，P型集落的頻率為75.6％(±4.9％SD)。圈定1顯示了更少數(shù)目的集落，其他的片段含有可忽略數(shù)目的具有集落形成能力的細(xì)胞。在圈定1和2中，甲胎蛋白和白蛋白兩者的表達(dá)可在所有肝細(xì)胞集落中被證實(shí)。來(lái)自圈定2細(xì)胞的一些集落較其他的更大。為了詳細(xì)研究肝細(xì)胞上MHC I類(lèi)的表達(dá)，用RT1A1，ICAM-1，和OX18的三色染色進(jìn)行側(cè)向散射(SSC)作為另一個(gè)參數(shù)來(lái)進(jìn)行細(xì)胞分級(jí)分離。側(cè)向散射(SSC)，細(xì)胞粒度的反射圖，是一個(gè)從造血細(xì)胞中分離肝細(xì)胞的有用參數(shù)，因?yàn)樘ジ渭?xì)胞在早至妊娠E11時(shí)就含有脂滴(Luzzatto，1981)。圖4c 示圈定2含有最多數(shù)目的集落形成細(xì)胞?；赟SC圈定R2，對(duì)應(yīng)于圈定2的種群明顯顯示為RT1A1-和OX18dull表現(xiàn)型(圖4c和圖4d)。CFA證實(shí)了R4較圈定2能夠吸附更多的集落形成細(xì)胞(表1)。這些結(jié)果表明來(lái)自E13大鼠肝臟的RT1A1-，OX18dull，和ICAM-1+種群是產(chǎn)生甲胎蛋白+和白蛋白+集落的肝細(xì)胞。對(duì)于rhe14321細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了相同的抗原性全貌(圖3)。
表1.根據(jù)RT1A和ICAM-1的表達(dá)來(lái)自分選的E13胎肝中肝細(xì)胞集落的頻率
在含有STO5h1x上的形成集落的培養(yǎng)物表明來(lái)自E13胎肝的每個(gè)組分的細(xì)胞數(shù)目。肝細(xì)胞集落的數(shù)目是從三重染色的培養(yǎng)物中建立的(均數(shù)±SD)。集落形成效率表示了接種進(jìn)行培養(yǎng)，在經(jīng)16天培養(yǎng)后形成可被分析的集落的細(xì)胞的百分比。
6.5 E13肝細(xì)胞和成體肝細(xì)胞的不同生長(zhǎng)需求從E13肝臟中分選出來(lái)的肝細(xì)胞的生長(zhǎng)需求采用已確定的STO5滋養(yǎng)層和HDM進(jìn)行研究。EGF很長(zhǎng)時(shí)間被認(rèn)為是一個(gè)成體肝細(xì)胞的有效生長(zhǎng)因子。因此，要研究EGF對(duì)分選的肝細(xì)胞的集落形成的效果。RT1A1-OX18dull，ICAM-1+肝細(xì)胞的集落大小在缺乏EGF時(shí)變得更大，而成體肝細(xì)胞僅在EGF存在的情況下能生成集落(圖6c)。而且，來(lái)自成體肝細(xì)胞的集落形態(tài)學(xué)是經(jīng)典的F型，而所有的RT1A1-肝細(xì)胞不需要EGF就可產(chǎn)生P型的集落。但是，在缺少EGF的情況下集落效率略有下降(圖6a)。有趣的是，缺少EGF的培養(yǎng)條件主要支持兩種類(lèi)型的P-集落，P1和P2。盡管在培養(yǎng)的第12天，大多數(shù)集落是P2類(lèi)型，但準(zhǔn)確區(qū)分兩種類(lèi)型是很困難的，因?yàn)樗鼈冎械囊恍┘洳](méi)有經(jīng)典的如圖6a所示的形態(tài)學(xué)特征。這些結(jié)果表明胎肝細(xì)胞和成體肝細(xì)胞在生長(zhǎng)需求以及RT1A1(圖3和4)的表達(dá)和集落形態(tài)學(xué)上具有本質(zhì)上的不同。
培養(yǎng)3周后，當(dāng)生長(zhǎng)看上去達(dá)到最大程度時(shí)，評(píng)價(jià)RT1A1-，OX18和ICAM-1的表達(dá)。如在圖5b至5d中所示，RT1A1的表達(dá)并未被誘導(dǎo)，而OX18的表達(dá)則減少。ICAM-1的水平?jīng)]有改變。而且，單個(gè)集落的平均細(xì)胞數(shù)可從回收的細(xì)胞數(shù)目，大鼠肝細(xì)胞的百分比和集落效率進(jìn)行計(jì)算。估計(jì)的細(xì)胞數(shù)可達(dá)3至4×103(表2)。這表明在這種培養(yǎng)條件下單個(gè)細(xì)胞形成的集落平均可分裂大約11-12次。
表2.在單個(gè)肝細(xì)胞集落中計(jì)算的細(xì)胞數(shù)接種的 接種密度 培養(yǎng) 回收的細(xì) 大鼠細(xì)胞 集落效率 單個(gè)集落中細(xì)胞數(shù) (細(xì)胞/厘 時(shí)間 胞數(shù) 的百分比 (％) 的平均細(xì)胞米2) (天)(％)數(shù)目500 18 18 1.5×1065841 4.2×1034000 51 21 6.0×1069044 3.1×1034000 51 20 4.0×10669 21 3.3×103在圖4c中從R4中分選的細(xì)胞培養(yǎng)在60mm或100mm培養(yǎng)皿中的STO5h1x滋養(yǎng)層細(xì)胞上。在培養(yǎng)細(xì)胞指定時(shí)期后，回收細(xì)胞并計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)目。根據(jù)大鼠ICAM-1和小鼠CD98的表達(dá)從流式細(xì)胞儀分析中計(jì)算大鼠細(xì)胞的百分比。集落效率表明了接種培養(yǎng)能形成集落的細(xì)胞的百分比。來(lái)自三重染色培養(yǎng)物的數(shù)據(jù)(均數(shù))是從平行進(jìn)行的試驗(yàn)中獲得。
在單個(gè)集落中細(xì)胞的平均數(shù)目＝(回收的細(xì)胞數(shù)×大鼠細(xì)胞百分比/100)/接種細(xì)胞數(shù)×集落效率/100)6.6 RT1AI-肝臟祖細(xì)胞中雙能性的證據(jù)在大鼠E13妊娠中，肝細(xì)胞被認(rèn)為是雙能的祖細(xì)胞，可產(chǎn)生成熟的肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。但是，在本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)之前，還沒(méi)有直接的證據(jù)證明這兩種轉(zhuǎn)歸是否來(lái)自單個(gè)細(xì)胞。為了確定是否RT1A1-OX18dullICAM-1+胎肝細(xì)胞可在這種培養(yǎng)系統(tǒng)中分化成為膽系細(xì)胞，這些集落用抗CK19作為膽管上皮細(xì)胞的特定標(biāo)記物進(jìn)行染色。CK19在大鼠胎肝的15.5天后表達(dá)在膽管上皮祖細(xì)胞上，此時(shí)在細(xì)胞上白蛋白的表達(dá)消失了。分選的RT1A1-ICAM-1+細(xì)胞在存在或缺少EGF的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，它們的命運(yùn)在培養(yǎng)5天后用CK19和白蛋白的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。第一個(gè)5天后，在用EGF處理的培養(yǎng)物中CK19+集落消失了，而少量含有CK19+細(xì)胞的集落出現(xiàn)在缺少EGF的培養(yǎng)物中。盡管CK19表達(dá)的強(qiáng)度很微弱，CK19+細(xì)胞顯示了白蛋白的表達(dá)降低。在培養(yǎng)的第10天，一些集落明顯僅表達(dá)CK19或白蛋白，其他則有雙重陽(yáng)性表達(dá)。在單個(gè)集落中CK19+和白蛋白+細(xì)胞的圖譜是相反的。雙重陽(yáng)性集落和CK19單陽(yáng)性集落的數(shù)目在缺少EGF時(shí)仍然是更高的(圖7a)。在EGF存在時(shí)，許多集落在第10天僅含有白蛋白+細(xì)胞(圖7b)。最后，在缺少EGF的第15天時(shí)，雙重陽(yáng)性集落的百分比達(dá)到近100％(圖7a)。總之，在培養(yǎng)過(guò)程中EGF極大程度地抑制了CK19+集落的出現(xiàn)(圖7b)。這些結(jié)果表明來(lái)自E13胎肝的RT1A1-，OX18dull和ICAM-1+細(xì)胞可朝向膽系細(xì)胞分化，其轉(zhuǎn)歸在體外受EGF影響(圖8)。
6.7.可以維持肝干細(xì)胞和肝祖先細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞的分離和克隆的方案將來(lái)自豬、小獵兔犬、兔子、小鼠或猴子的新鮮胚胎組織或冷凍組織(如肝臟、肺、腎、肌肉、腸)在無(wú)鈣的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中切碎。在用PBS清洗幾次后，用磁力攪拌器攪拌的同時(shí)用0.25％胰蛋白酶溫育細(xì)胞懸液，于37℃10分鐘，或室溫60分鐘。通過(guò)使懸液通過(guò)篩眼過(guò)濾懸液來(lái)除去剩余的細(xì)胞塊。然后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如Eagle’s MEM)在組織培養(yǎng)皿上培養(yǎng)細(xì)胞，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有血清(如10％胎牛血清)和多種生長(zhǎng)補(bǔ)充劑中的任意種(如2mM谷氨酰胺，丙酮酸鈉和MEM非必需氨基酸)。塑料基層和含血清培養(yǎng)基是一般的條件，該條件允許作為支持細(xì)胞(“滋養(yǎng)細(xì)胞”)候補(bǔ)者的細(xì)胞群的擴(kuò)充，其中所述細(xì)胞群最普通的是來(lái)源于中胚層(如基質(zhì)細(xì)胞)，且該條件提供支持另一細(xì)胞類(lèi)型(如祖先細(xì)胞)的存活、生長(zhǎng)和/或功能的因子。當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)或幾乎鋪滿(mǎn)時(shí)，用0.05％胰蛋白酶?jìng)鞔囵B(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞。在幾輪傳代培養(yǎng)后，制備作為冷凍原種的擴(kuò)張的細(xì)胞，且就這樣儲(chǔ)存直至使用。滋養(yǎng)細(xì)胞的另一種來(lái)源可以是商購(gòu)的滋養(yǎng)細(xì)胞或滋養(yǎng)細(xì)胞系的原始培養(yǎng)物。在任何情況下，下述標(biāo)準(zhǔn)是鑒定適當(dāng)?shù)淖甜B(yǎng)細(xì)胞所需要的滋養(yǎng)細(xì)胞支持1)帶有表型標(biāo)記物的肝祖先細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)，其中表型標(biāo)記為經(jīng)典的MHC I類(lèi)抗原陰性，ICAM-1陽(yáng)性，和/或非經(jīng)典的MHC I類(lèi)抗原微弱陽(yáng)性；2)帶有表型標(biāo)記物的有后代的肝祖先細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)，其中表型標(biāo)記為經(jīng)典的MHC I類(lèi)抗原陰性，ICAM-1陽(yáng)性，非經(jīng)典的MHC I類(lèi)抗原微弱陽(yáng)性，甲胎蛋白陽(yáng)性，白蛋白陽(yáng)性或CK19陽(yáng)性；或3)誘導(dǎo)分化成肝譜系和膽譜系，這是定義雙潛能肝祖先細(xì)胞所必需的。
在本領(lǐng)域，經(jīng)典的MHC I類(lèi)抗原也已知為MHC Ia類(lèi)抗原。非經(jīng)典的MHC I類(lèi)抗原也已知為MHC Ib類(lèi)抗原。在不同種屬中MHC抗原具有不同的名稱(chēng)例如在大鼠中為RT1，在小鼠中為H-2，在人中為HLA。
下面描述如上所述的分析肝祖先細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)條件將肝祖先細(xì)胞以500細(xì)胞/9.6cm2鋪平板于生長(zhǎng)停滯的滋養(yǎng)細(xì)胞上，即經(jīng)過(guò)處理以防止增殖的滋養(yǎng)細(xì)胞。滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯是通過(guò)用絲裂霉素C對(duì)其進(jìn)行處理或通過(guò)照射(根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型為3000-5000拉德)實(shí)現(xiàn)的。用不含血清的HDM飼養(yǎng)生長(zhǎng)停滯的滋養(yǎng)細(xì)胞和祖先細(xì)胞。作為一個(gè)例子，用于嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的HDM是Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基和Ham F12的1∶1混合物，該混合物中添加了10ng/ml EGF，5μg/ml胰島素，10-6M地塞米松，10μg/ml鐵飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白，4.4×10-3M煙酰胺，0.2％牛血清白蛋白，5×10-5M 2-巰基乙醇，7.6μeq/l游離脂肪酸，2×10-3M谷氨酰胺，1×10-6M CuSO4，3×10-8M H2SeO3和抗生素。用培養(yǎng)基將培養(yǎng)物培養(yǎng)10-14天，培養(yǎng)基每隔一天換一次。然后進(jìn)行甲胎蛋白、白蛋白和/或CK19的雙重免疫熒光染色，以鑒定后代的命運(yùn)。通過(guò)甲胎蛋白和白蛋白的表達(dá)分析100個(gè)集落。而且，集落形態(tài)，P或F型，可用于鑒定相關(guān)后代。
滋養(yǎng)細(xì)胞和肝祖先細(xì)胞的理想結(jié)合是那些來(lái)源于相同種屬的滋養(yǎng)細(xì)胞和肝祖先細(xì)胞的結(jié)合。優(yōu)選地，滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)自與該肝祖先細(xì)胞來(lái)源相同的組織和種屬。然而，來(lái)自一個(gè)種類(lèi)的滋養(yǎng)細(xì)胞和來(lái)自另一種類(lèi)的祖先細(xì)胞的混合是可能的。例如，甚至嚙齒動(dòng)物滋養(yǎng)細(xì)胞可用于人肝祖先細(xì)胞?？扇芎筒豢扇艿囊蜃?它們可以是種屬特異性的和/或組織特異性的)有助于肝干細(xì)胞或肝祖先細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)。這些因子的來(lái)源是1)來(lái)自最佳種屬和組織的培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。滋養(yǎng)細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類(lèi)型，不僅僅是基質(zhì)細(xì)胞。
2)當(dāng)關(guān)鍵因子已知時(shí)，可以分別通過(guò)導(dǎo)入用于轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)染的互補(bǔ)DNA或mRNA至任何細(xì)胞中產(chǎn)生生物活性滋養(yǎng)細(xì)胞群，互補(bǔ)DNA或mRNA用于合成對(duì)肝祖先細(xì)胞具有活性的來(lái)源于最佳滋養(yǎng)細(xì)胞的相關(guān)分子(信號(hào))。
3)如果關(guān)鍵因子已知，也可以通過(guò)用那些信號(hào)分子補(bǔ)充培養(yǎng)基來(lái)完全取代滋養(yǎng)細(xì)胞，不管它們是蛋白質(zhì)、肽、糖類(lèi)、脂類(lèi)、糖肽、糖蛋白、脂蛋白、糖脂，還是這些成分的組合，它們組成對(duì)肝祖先細(xì)胞具有活性的來(lái)源于最佳滋養(yǎng)細(xì)胞的信號(hào)。
對(duì)上述實(shí)施例的描述僅是為了例證的目，目的不在于限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓桨?。沒(méi)有特定描述的其它實(shí)施方案對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。這樣的其它實(shí)施方案仍然被認(rèn)為落入本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。因此，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的適當(dāng)限定。
此處所引用的所有專(zhuān)利和公開(kāi)文獻(xiàn)均完整引用于此作為參考。
權(quán)利要求
1.一種繁殖內(nèi)胚層來(lái)源的祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物的方法，所述方法包括在存在培養(yǎng)基的情況下在含有滋養(yǎng)細(xì)胞的層上培養(yǎng)內(nèi)胚層來(lái)源的祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物包括脊椎動(dòng)物細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中所述祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物包括人細(xì)胞、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、豬細(xì)胞、狗細(xì)胞、兔子細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或它們的組合。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中所述祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物包括肝臟、肺、腸、胰腺、甲狀腺、性腺祖先或它們的組合。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中所述祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物來(lái)源于肝臟。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包括一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求6的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基和Ham F12。
8.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包括至少一種激素。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中所述激素是胰島素。
10.如權(quán)利要求8的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括一種糖皮質(zhì)激素。
11.如權(quán)利要求8的方法，其中所述糖皮質(zhì)激素是地塞米松。
12.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括鐵飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白。
13.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括煙酰胺。
14.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括血清白蛋白。
15.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括至少一種還原劑。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中所述還原劑是β-巰基乙醇。
17.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包括至少一種脂質(zhì)補(bǔ)充劑。
18.如權(quán)利要求17的方法，其中所述脂質(zhì)補(bǔ)充劑包括一種游離脂肪酸。
19.如權(quán)利要求17的方法，其中所述游離脂肪酸混合物包括棕櫚酸，棕櫚油酸，硬脂酸，油酸，亞油酸，亞麻酸或它們的組合。
20.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包括谷氨酰胺。
21.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括微量元素。
22.如權(quán)利要求21的方法，其中所述微量元素包括CuSO4。
23.如權(quán)利要求21的方法，其中所述微量元素包括H2SeO3。
24.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包括一種抗氧化劑。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中所述抗氧化劑包括H2SeO3。
26.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括抗生素。
27.如權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括表皮生長(zhǎng)因子。
28.如權(quán)利要求1的方法，其中所述滋養(yǎng)細(xì)胞具有包括至少一種脊椎動(dòng)物組織的來(lái)源。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中所述脊椎動(dòng)物包括胚胎。
30.如權(quán)利要求29的方法，其中所述脊椎動(dòng)物包括人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、豬、狗、兔子、大鼠、小鼠或它們的組合。
31.如權(quán)利要求1的方法，其中所述滋養(yǎng)細(xì)胞是克隆的。
32.如權(quán)利要求31的方法，其中所述克隆是STO5。
33.如權(quán)利要求1的方法，其中所述滋養(yǎng)細(xì)胞包括基質(zhì)細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求1的方法，其中所述滋養(yǎng)細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求1的方法，其中所述肝祖先細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間粘附分子(ICAM)抗原，不表達(dá)主要組織相容性抗原(MHC)Ia類(lèi)抗原，表達(dá)MHC Ib dull，表達(dá)OX18 dull，表達(dá)甲胎蛋白，表達(dá)白蛋白，表達(dá)細(xì)胞角蛋白-19，或它們的組合。
36.如權(quán)利要求35的方法，其中所述ICAM是ICAM-1。
37.如權(quán)利要求1的方法，其中所述肝細(xì)胞后代不表達(dá)MHC Ia類(lèi)，表達(dá)MHC Ib類(lèi)，表達(dá)ICAM，表達(dá)OX18 dull，表達(dá)甲胎蛋白，表達(dá)白蛋白，表達(dá)細(xì)胞角蛋白-19，或它們的組合。
38.如權(quán)利要求37的方法，其中所述ICAM是ICAM-1。
39.如權(quán)利要求1的方法，其中所述肝祖先細(xì)胞、它們的后代、或其組合作為堆積集落生長(zhǎng)。
40.如權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括克隆肝祖先細(xì)胞。
41.如權(quán)利要求40的方法，其中所述克隆使用了稀釋的細(xì)胞數(shù)量、克隆托、瓊脂糖中的生長(zhǎng)、珠子上的生長(zhǎng)、流式細(xì)胞儀或它們的組合。
42.如權(quán)利要求1的方法，其中所述肝祖先細(xì)胞經(jīng)受至少一次有絲分裂形式的細(xì)胞分裂。
43.如權(quán)利要求42的方法，其中所述肝祖先細(xì)胞經(jīng)受至少十次有絲分裂形式的細(xì)胞分裂。
44.如權(quán)利要求1的方法，其中所述肝祖先細(xì)胞產(chǎn)生具有獨(dú)立命運(yùn)的子細(xì)胞。
45.如權(quán)利要求44的方法，其中所述子細(xì)胞分化為膽細(xì)胞。
46.如權(quán)利要求44的方法，其中所述子細(xì)胞分化為肝細(xì)胞。
47.一種鑒定肝生長(zhǎng)因子的方法，所述方法包括提供肝祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物和提供一種懷疑包括至少一種肝生長(zhǎng)因子的樣品，將祖先細(xì)胞、它們的后代、或其混合物和該樣品混合，且觀察對(duì)肝祖先細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激作用。
48.一種鑒定肝分化因子的方法，所述方法包括提供肝祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物和提供一種懷疑包括至少一種肝分化因子的樣品，將祖先細(xì)胞、它們的后代、或其混合物和該樣品混合，且觀察肝祖先細(xì)胞的分化。
49.一種鑒定肝毒素的方法，所述方法包括提供肝祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物和提供一種懷疑包括至少一種肝毒素的樣品，將祖先細(xì)胞、它們的后代、或其混合物和該樣品混合，且觀察肝祖先細(xì)胞的死亡情況。
50.一種開(kāi)發(fā)藥物的方法，所述方法包括提供肝祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物和提供一種懷疑能夠影響肝祖先細(xì)胞，新陳代謝的藥物，將祖先細(xì)胞、它們的后代、或其混合物和該樣品混合，且觀察肝祖先細(xì)胞的新陳代謝上的變化。
51.一種鑒定新穎抗菌劑的方法，所述方法包括提供肝祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物和提供至少一種懷疑具有抗菌作用的試劑，將祖先細(xì)胞、它們的后代、或其混合物和該試劑混合，且觀察肝祖先細(xì)胞在生長(zhǎng)上的變化。
52.一種制備體外肝臟的方法，所述方法包括提供肝祖先細(xì)胞、它們的后代或其組合，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述肝祖先細(xì)胞、它們的后代或其組合直到得到足夠的細(xì)胞群，有效地作為體外肝臟發(fā)揮作用。
53.一種繁殖肝祖先、它們的后代或其組合的方法，所述方法包括(a)提供至少一個(gè)肝祖先細(xì)胞(b)在含有至少一種滋養(yǎng)細(xì)胞生物合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)肝祖先細(xì)胞。
54.如權(quán)利要求53的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括糖皮質(zhì)激素、胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、煙酰胺或組合。
55.如權(quán)利要求53的方法，其中所述滋養(yǎng)細(xì)胞生物合成產(chǎn)物包括肽、糖肽、脂肽、脂質(zhì)、糖脂、糖類(lèi)、蛋白、糖蛋白、脂蛋白或它們的組合，其中生物合成產(chǎn)物增強(qiáng)了肝祖先細(xì)胞的繁殖或分化。
56.如權(quán)利要求53的方法，其中所述滋養(yǎng)細(xì)胞生物合成產(chǎn)物包括胰島素樣生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素-6家族生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胞外基質(zhì)或它們的組合，其中生物合成產(chǎn)物生物合成產(chǎn)物增強(qiáng)了肝祖先細(xì)胞的繁殖或分化。
57.如權(quán)利要求53的方法，其中所述至少一種肝祖先細(xì)胞包括至少一種來(lái)自人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、豬、狗、兔子、大鼠或小鼠的細(xì)胞。
58.如權(quán)利要求53的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括克隆至少一個(gè)肝祖先細(xì)胞。
59.如權(quán)利要求53的方法，其中所述方法進(jìn)一步加入了生長(zhǎng)因子。
60.如權(quán)利要求59的方法，其中所述方法進(jìn)一步加入了分化因子以產(chǎn)生肝細(xì)胞、膽細(xì)胞或它們的組合。
全文摘要
開(kāi)發(fā)了一種繁殖哺乳動(dòng)物內(nèi)胚層來(lái)源的祖先細(xì)胞如它們的肝祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中在胚胎哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)哺乳動(dòng)物祖先細(xì)胞、它們的后代或其混合物。培養(yǎng)基可以補(bǔ)充一種或多種激素和其它生長(zhǎng)劑。這些激素和其它生長(zhǎng)劑可以包括胰島素、地塞米松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、煙酰胺、血清白蛋白、β－巰基乙醇、游離脂肪酸、CuSO
文檔編號(hào)G01N33/50GK1461341SQ00820051
公開(kāi)日2003年12月10日 申請(qǐng)日期2000年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月3日
發(fā)明者H·庫(kù)博達(dá), L·M·里德 申請(qǐng)人:北卡羅來(lái)納大學(xué)