專利名稱：鑒別和富集細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒別和富集細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的方法，特別是鑒別細(xì)胞表面的細(xì)胞特異性蛋白組合模式和富集這種細(xì)胞的方法。
鑒別細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)對(duì)于驗(yàn)證可能導(dǎo)致生物體內(nèi)無法估計(jì)的作用的細(xì)胞—細(xì)胞相互作用是關(guān)鍵的。特別地，了解疾病特異性靶結(jié)構(gòu)是開發(fā)有效的同時(shí)副作用很小的藥物的決定性必要條件。
現(xiàn)有技術(shù)已知免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)表達(dá)特異組合的蛋白質(zhì)，也稱為蛋白質(zhì)組合模式，簡(jiǎn)稱PCP，其負(fù)責(zé)結(jié)合腦和肌肉組織中的血管的內(nèi)皮樣細(xì)胞。其他蛋白質(zhì)組合卻不導(dǎo)致與這種內(nèi)皮樣細(xì)胞的結(jié)合。令人驚奇地，這些特異的組合是個(gè)體間一致的，總是顯示相同的結(jié)合功能。其結(jié)果是，所述特異性蛋白質(zhì)組合模式似乎是細(xì)胞表面的個(gè)體間一致的淋巴細(xì)胞結(jié)合密碼，用于結(jié)合存在細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的器官特異性內(nèi)皮樣細(xì)胞表面。細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)因此可顯示相當(dāng)特異的蛋白質(zhì)組合模式。
浸潤性腫瘤細(xì)胞表面也顯示特異性蛋白質(zhì)組合模式，其將導(dǎo)致目的明確的即器官選擇性浸潤行為。為此，這種蛋白質(zhì)組合模式組成了可能的藥物的靶結(jié)構(gòu)。
然而，開發(fā)這種高選擇性藥物的—不可避免的必要條件是這種靶結(jié)構(gòu)的分子組成的知識(shí)。
現(xiàn)有技術(shù)中公開了鑒別靶結(jié)構(gòu)的方法，其是基于分析疾病組織或細(xì)胞的基因表達(dá)模式，與健康組織或細(xì)胞的基因表達(dá)模式相比較，蛋白質(zhì)表達(dá)模式和信使核糖核酸(mRNA)均意在提供新蛋白質(zhì)的表觀、疾病組織或細(xì)胞中失控的或異常修飾的蛋白質(zhì)的信息(例如F.Lottspeich/H.Zorbas；Bioanalytik；Spektrum Analytischer Verlag；Heidelberg，1998)。
但是，這些方法均使用細(xì)胞勻漿物，其通?；趲浊€(gè)或幾百萬個(gè)細(xì)胞，因?yàn)閮H能通過這樣大量的細(xì)胞才能產(chǎn)生上述的表達(dá)模式。在細(xì)胞勻漿物中，細(xì)胞以破碎的開放形式存在，從而可通過生物化學(xué)方法進(jìn)行抽提和分離。
這些現(xiàn)有技術(shù)方法不適合鑒別蛋白質(zhì)組合模式，因?yàn)檫@種蛋白質(zhì)組合模式中的各個(gè)蛋白質(zhì)組分由于產(chǎn)生細(xì)胞勻漿物和隨后的抽提步驟而完全分離，由此喪失了其細(xì)胞和組織拓?fù)鋵W(xué)位置的相關(guān)信息。另外，破壞細(xì)胞區(qū)室使得不能獲得這些細(xì)胞區(qū)室內(nèi)的蛋白質(zhì)組合及其相關(guān)拓?fù)鋵W(xué)相互關(guān)系的信息。
現(xiàn)有技術(shù)方法的另一缺點(diǎn)是制備組織或細(xì)胞的步驟從它們的取出或收集直至分離蛋白質(zhì)的步驟可能受到各種可變的外部影響，不能控制和標(biāo)準(zhǔn)化。
另外，現(xiàn)有技術(shù)方法另一缺點(diǎn)是它們不能在一個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行分析，從而不能指出各個(gè)細(xì)胞的不同方式的蛋白質(zhì)組合模式。再者，僅以少量存在的蛋白質(zhì)不能由現(xiàn)有技術(shù)方法檢測(cè)。這在例如僅存在于少數(shù)致病性疾病特異性細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或特異性蛋白質(zhì)組合的情況下尤其如此。
因此，本發(fā)明的目的在于提供能夠鑒別和富集細(xì)胞特異性組合模式的方法，其克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)。
本發(fā)明目的通過鑒別和富集細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)、特別是鑒別細(xì)胞表面上的細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)組合模式以及富集這些細(xì)胞的創(chuàng)造性方法而實(shí)現(xiàn)，該方法具有權(quán)利要求1的特征。
本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案在從屬權(quán)利要求中描述。
本發(fā)明的用于鑒別和富集細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)、特別是鑒別細(xì)胞表面上的細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)組合模式以及富集這些細(xì)胞的方法包括如下步驟(a)將不均一細(xì)胞混合物沉積在具有預(yù)定結(jié)構(gòu)的—或多個(gè)表面上，使具有相應(yīng)靶結(jié)構(gòu)的細(xì)胞與這種表面結(jié)合；(b)從所述表面除去所述細(xì)胞混合物中任何未結(jié)合的細(xì)胞；(c)鑒別負(fù)責(zé)細(xì)胞與所述表面結(jié)合的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)；(d)在所述表面上選擇并富集具有相同細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的細(xì)胞；以及(e)生物化學(xué)鑒定步驟(d)中選擇的靶結(jié)構(gòu)。這一方法使得可以鑒別那些負(fù)責(zé)與預(yù)定結(jié)構(gòu)結(jié)合的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)，特別是細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)組合。另外，可以富集這些細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)如均勻細(xì)胞表面，從而隨后使之進(jìn)行生物化學(xué)分析方法分析。這例如也可使得僅以少量存在的蛋白質(zhì)得以富集和分析。這在例如僅存在于少數(shù)致病性疾病特異性細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或特異性蛋白質(zhì)組合的情況下尤其如此。因此，以這種方式，可以提供高度選擇性結(jié)合的一種相同功能類型的細(xì)胞，以進(jìn)一步分析由它們表達(dá)的蛋白質(zhì)。有利地，所選擇和富集的靶結(jié)構(gòu)在步驟(e)中經(jīng)分子或分子復(fù)合物分離方法如蛋白質(zhì)分離方法，特別是2D凝膠電泳而生物化學(xué)鑒定。
進(jìn)行本發(fā)明的步驟(a)至(b)的一個(gè)實(shí)施方案包括下述部分方法1)將液體不均一細(xì)胞混合物導(dǎo)入或施加入分析裝置的管道中和具有含預(yù)定結(jié)構(gòu)的固定表面的樣品玻片上；2)經(jīng)所述管道的縫隙除去任何未結(jié)合的細(xì)胞并將所述物質(zhì)收集在一容器中；3)經(jīng)樣品玻片溫度調(diào)節(jié)裝置冷卻樣品玻片，和4)固定結(jié)合在所述樣品玻片上的細(xì)胞。
在本發(fā)明方法的一個(gè)有利的實(shí)施方案中，不均一細(xì)胞混合物分離自人或動(dòng)物組織或者人或動(dòng)物體液，或者其由培養(yǎng)的細(xì)胞組成，所述的表面是人或動(dòng)物組織切片和/或內(nèi)皮樣細(xì)胞和/或蛋白質(zhì)晶片和/或一片培養(yǎng)的人或動(dòng)物組織。這能夠保證細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的快速而有目的的鑒別，以用于開發(fā)藥物。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)通過包括如下步驟的方法鑒別(I)將包括至少一種標(biāo)記分子的試劑溶液Y1自動(dòng)沉積在所述細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)上；(II)使試劑溶液Y1反應(yīng)，并自動(dòng)檢測(cè)用試劑溶液Y1標(biāo)記的靶結(jié)構(gòu)的至少一種標(biāo)記模式；(III)在檢測(cè)該標(biāo)記模式之前或之后除去所述試劑溶液Y1，并用其他試劑溶液Yn(n＝2，3，...，N)重復(fù)步驟(I)和(II)，每種試劑溶液均含有所述的至少一種標(biāo)記分子和/或至少另一種標(biāo)記分子；以及(IV)組合步驟(II)中檢測(cè)的標(biāo)記模式以得到細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的復(fù)合分子組合模式。這一鑒別方法使得能夠快速而有目的的鑒別細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)如細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)組合模式。
在本發(fā)明的另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，在步驟(d)后進(jìn)行如下步驟(d1)針對(duì)步驟(d)中選擇的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的一或多個(gè)成分進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)所述成分的結(jié)合層次，所述成分是細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)組合模式的單一或多個(gè)蛋白質(zhì)。這使得能夠確定蛋白質(zhì)層次中的哪些蛋白質(zhì)對(duì)于這種選擇性結(jié)合是特別相關(guān)的，而哪些蛋白質(zhì)不是特別相關(guān)的。相關(guān)的蛋白質(zhì)組成了開發(fā)高選擇性藥物的靶。
在本發(fā)明的另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，以下述步驟替換步驟(e)(f)將包括至少一種標(biāo)記分子的試劑溶液Y1自動(dòng)沉積在所述的所選擇和富集的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)上；(g)使試劑溶液Y1反應(yīng)，并自動(dòng)檢測(cè)用試劑溶液Y1標(biāo)記的靶結(jié)構(gòu)的至少一種標(biāo)記模式；(h)在檢測(cè)該標(biāo)記模式之前或之后除去所述試劑溶液Y1，并用其他試劑溶液Yn(n＝2，3，...，N)重復(fù)步驟(f)和(g)，每種試劑溶液均含有所述的至少一種標(biāo)記分子和/或至少另一種標(biāo)記分子；以及(i)組合步驟(g)中檢測(cè)的標(biāo)記模式以得到所選擇和富集的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的復(fù)合分子組合模式。已根據(jù)本發(fā)明富集和選擇的相同類型的細(xì)胞隨后使得能更詳細(xì)地檢查由步驟(f)至(i)制備的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)。
總之，本發(fā)明方法使得能通過生物學(xué)選擇性機(jī)制鑒別靶結(jié)構(gòu)以有效地發(fā)現(xiàn)相關(guān)活性靶結(jié)構(gòu)，用以開發(fā)藥物。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒別和富集細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)、特別是鑒別細(xì)胞表面上的細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)組合模式并富集這些細(xì)胞的方法，其中所述方法包括如下步驟(a)將不均一細(xì)胞混合物沉積在具有預(yù)定結(jié)構(gòu)的一或多個(gè)表面上，使具有相應(yīng)靶結(jié)構(gòu)的細(xì)胞與這種表面結(jié)合；(b)從所述表面除去所述細(xì)胞混合物中任何未結(jié)合的細(xì)胞；(c)鑒別負(fù)責(zé)細(xì)胞與所述表面結(jié)合的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)；(d)在所述表面上選擇并富集具有相同細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的細(xì)胞；以及(e)經(jīng)生物化學(xué)鑒定步驟(d)中選擇的靶結(jié)構(gòu)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述不均一細(xì)胞混合物分離自人或動(dòng)物組織或者人或動(dòng)物體液，或者其由培養(yǎng)的細(xì)胞組成。
3.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述的表面是人或動(dòng)物組織切片和/或內(nèi)皮樣細(xì)胞和/或蛋白質(zhì)晶片和/或一片培養(yǎng)的人或動(dòng)物組織。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)通過包括如下步驟的方法鑒別(I)將包括至少一種標(biāo)記分子的試劑溶液Y1自動(dòng)沉積在所述細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)上；(II)使試劑溶液Y1反應(yīng)，并自動(dòng)檢測(cè)用試劑溶液Y1標(biāo)記的靶結(jié)構(gòu)的至少一種標(biāo)記模式；(III)在檢測(cè)該標(biāo)記模式之前或之后除去所述試劑溶液Y1，并用其他試劑溶液Yn(n＝2，3，...，N)重復(fù)步驟(I)和(II)，每種試劑溶液均含有所述的至少一種標(biāo)記分子和/或至少另一種標(biāo)記分子；以及(IV)組合步驟(II)中檢測(cè)的標(biāo)記模式以得到細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的復(fù)合分子組合模式。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在步驟e)中所選擇的靶結(jié)構(gòu)經(jīng)分子或分子復(fù)合物分離方法特別是蛋白質(zhì)分離方法而生物化學(xué)鑒定。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的蛋白質(zhì)分離方法是2D凝膠電泳。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在步驟(d)后進(jìn)行如下步驟(d1)針對(duì)步驟(d)中選擇的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的一或多個(gè)成分進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)所述成分的結(jié)合層次。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述成分是細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)組合模式的單一或多個(gè)蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)行以下述步驟替換步驟(e)(f)將包括至少一種標(biāo)記分子的試劑溶液Y1自動(dòng)沉積在所述的所選擇和富集的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)上；(g)使試劑溶液Y1反應(yīng)，并自動(dòng)檢測(cè)用試劑溶液Y1標(biāo)記的靶結(jié)構(gòu)的至少一種標(biāo)記模式；(h)在檢測(cè)該標(biāo)記模式之前或之后除去所述試劑溶液Y1，并用其他試劑溶液Yn(n＝2，3，...，N)重復(fù)步驟(f)和(g)，每種試劑溶液均含有所述的至少一種標(biāo)記分子和/或至少另一種標(biāo)記分子；以及(i)組合步驟(g)中檢測(cè)的標(biāo)記模式以得到所選擇和富集的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的復(fù)合分子組合模式。
全文摘要
一種用于鑒別和富集細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)、特別是鑒別細(xì)胞表面上的細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)組合模式并富集這些細(xì)胞的方法,其中所述方法包括如下步驟:(a)將不均一細(xì)胞混合物沉積在具有預(yù)定結(jié)構(gòu)的一或多個(gè)表面上,使具有相應(yīng)靶結(jié)構(gòu)的細(xì)胞與這種表面結(jié)合;(b)從所述表面除去所述細(xì)胞混合物中任何未結(jié)合的細(xì)胞;(c)鑒別負(fù)責(zé)細(xì)胞與所述表面結(jié)合的細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu);(d)在所述表面上選擇并富集具有相同細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的細(xì)胞;以及(e)經(jīng)生物化學(xué)鑒定步驟(d)中選擇的靶結(jié)構(gòu)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1332375SQ0110972
公開日2002年1月23日 申請(qǐng)日期2001年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月24日
發(fā)明者瓦爾特·舒伯特 申請(qǐng)人:瓦爾特·舒伯特