專利名稱：柯薩奇病毒b抗原酶免試劑盒及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術產品，具體涉及一種柯薩奇病毒(Cox)B1-6混合型抗原試劑盒及制備方法。
柯薩奇病毒B1-6對易感人群具有高度的傳染性，兒童是最敏感的人群，病毒流行期兒童的感染率通常為10-20％家庭中所有敏感成員通常都被感染，因此，柯薩奇病毒B感染所致的相關疾病發(fā)病率較高，尤其柯薩奇病毒性心肌炎對兒童具有很大威脅和危害。臨床的早期診斷和有效治療有很重要意義。以往柯薩奇病毒B感染和致病的病原學確診法是病毒分離和心肌熒光染色，但這兩種方法的標本采集和處理較復雜，病毒分離和取心肌熒光染色程序煩瑣，實驗時間很長，于臨床確診越早其療效越好。因此病毒分離技術和取心肌熒光法的臨床早期診斷優(yōu)勢不大。CoxB1-6病毒符合一般病毒感染后抗原和抗體(IgM、IgG)出現規(guī)律。病毒(抗原)血癥期，首先在患者血中檢測到病毒(抗原)，此期可持續(xù)1個月左右。病毒(抗原)出現1-2周后，出現CoxB1-6 IgM(可持續(xù)1-2周)，而后大約2周出現CoxB1-6-IgG，因此CoxB1-6混合抗原(CoxB1-6Ag)試劑盒能從血清中直接檢測病毒是病毒早早期感染和復制的最主要標志。
本發(fā)明的目的在于克服以往方法的不足之處，研制一種靈敏度高和特異性高的能直接檢測出CoxB1-6型病毒感染診斷試劑盒，可以比CoxB1-6IgM和IgG更早的確診病原。
本發(fā)明提供了一種CoxB1-6-Ag ELISA試劑盒，該試劑盒用CoxB病毒B1-6混合型單克隆抗體包被，兔抗CoxB1-6病毒抗體IgG聯接辣根過氧化物酶為檢測抗體，檢測血清中的CoxB病毒B1-6混合型抗原，試劑盒由下列組成預包被反應條48孔/96孔酶標記液 1瓶(3ml)樣品稀釋液 1瓶(6ml) 陽性對照 1支(200μl)陰性對照1支(200μl) 20倍濃洗滌液 1瓶(13ml)顯色劑A 1瓶(3ml) 顯色劑B1瓶(3ml)終止液 1瓶(3ml)本發(fā)明的另一目的是提供了上述柯薩奇病毒B1-6混合型抗原ELISA試劑盒的制備方法，該方法包括下列步驟一、原材料及其規(guī)格(一)試劑盒制備用的原料病毒B1-6混合單克隆(Mc)抗體1∶10000陽性對照診斷心肌炎患者血清，用本試劑盒測定A值＞0.8，放置-20
℃?zhèn)溆?。陰性對照選正常人血清，用本試劑盒測定A值＜0.09，放置-20℃?zhèn)溆谩Ｃ笜丝贵w兔抗CoxB1-6病毒IgG-HRP，辣根過氧化物酶，RZ＞3.0Sigma進口酶標記兔抗CoxB1-6病毒IgG，雙擴散1∶64。其它試劑Na2CO3A.RNaHCO3A.R小牛血清 杭州四季清廠生產Na2HPO4.12H2O A.RNaH2PO4.2H2O A.RNaCL A.RTweel-20 化學純甘油 化學純H2O2A.R檸檬酸.H2O A.RTMB 熔點168℃EDTA A.RH2SO4A.RTris A.R蒸餾水必需符合《中國藥典》(1990)之規(guī)定細胞及動物要求(1)Hela細胞(ATCC CCL-2)(2)新西蘭大白兔 2公斤左右二、包被抗體(CoxB病毒1-6混合單克隆抗體)的制備。(一)CoxB病毒1-6型的制備(1)CoxB病毒1-6型毒種來源昆明生物所(2)Hela細胞來源中科院細胞所(3)細胞傳代①培養(yǎng)劑配制PRMI1640基礎培養(yǎng)過濾除菌，200ml基礎培養(yǎng)劑中含牛血清10％青霉素4萬單位鏈霉素4萬單位6％NaHCO34ml3％谷氨酰胺6ml②胰酶(DT)配制用無Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細胞。③細胞傳代將成片的細胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進行細胞消化，觀察細胞已呈疏松網狀，既倒去DT，加入營養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)培養(yǎng)3-5天。(4)病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定①將形態(tài)完整、成片的單層細胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗液洗一次。②細胞感染病毒后，在37℃吸附1小時。③補充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)。④逐日觀察細胞至所有細胞產生細胞病變后，用無菌方法收獲病毒。⑤微量平底板進行病毒濃度的滴定和病毒鑒定。病毒滴定用10倍的倍比稀釋的方法進行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每個稀釋度加4孔，然后加入細胞50μl，設細胞對照，按Reed-Muench方法計算病毒的TCID50；病毒的鑒定應用免疫電鏡法及應用中和試驗方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25μl/孔，每個稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時。然后每孔內加Hela細胞50μl，同時設病毒陰性、陽性對照，逐日觀察細胞病變。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現CPE；(5)抗原的制備、濃縮和純化①病毒滅活；②去除病毒碎片用冷凍離心的方法去除細胞碎片；③初步濃縮、提純用PEG方法進行提純；④病毒的進一步純化用葡聚糖過柱、洗脫的方法，然后在A280的分光光度計進行蛋白含量的測定；(二)CoxB病毒1-6型混合單克隆(Mc)抗體的制備(1)CoxB病毒1-6型混合后，免疫Balb/c小鼠；(2)SP2/0骨髓瘤細胞培養(yǎng)準備；(3)細胞融合、篩選、克?。?4)單克隆鼠抗CoxB1-6型混合抗體IgG鑒定，滴度＞10-6，特異性符合要求。三、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗體IgG的制備用已制備、濃縮和純化好的CoxB病毒1-6型制備兔抗體IgG(1)CoxB病毒1-6型混合后取1mg/ml加等量完全福氏佐劑缽中研磨乳化。
(2)每只兔頸背部多點皮內注射，每兩周1次共5-6次。
(3)雙擴散效價達1∶64以上時采集血清。
(4)辛酸法純化抗血清IgG部分(5)抗血清IgG蛋白定量。四、酶標記抗體制備用過碘酸鈉法把兔抗CoxB病毒1-6型混合抗體IgG與辣根過氧化物酶偶聯對PBS充分透析，加等體積甘油，-20℃以下保存，效價＞1∶1000(用方陣滴定法測定)。五、兔抗CoxB病毒1-6型抗體IgG濃度測定采用方陣滴定法選擇酶標記抗體工作濃度為1∶1000六、預包被抗體板及試劑盒原料的制備(1)包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水 500ml加入適量CoxB病毒1-6混合型Mc抗體，調整PH至9.5加入板條各孔中，置濕盒中加蓋，4℃過夜后甩干。(2)洗滌Tris 2.42g重蒸水 1000ml加入板條各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復3次，以除去剩余抗原。(3)封閉蔗糖 100g羊血清 25ml0.1MPBS1000ml加入板條各孔中放入濕盒中(加蓋)37℃2h，棄去液體，吸水紙上拍干重復一次，待干燥后，放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4℃。(4)陽性對照制備診斷心肌炎患者的血清，60℃放置1小時，除菌過濾，用本試劑盒測定A值＞0.8備用，分裝。(5)陰性對照的制備正常人血清用本試劑盒測定A值0-0.09用萬分之二硫柳汞防腐備用分裝。(6)酶標記抗體配制30％小牛血清兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP 50％0.15MPBS20％甘油→稀釋20倍分裝(7)酶標記抗體稀釋液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml調PH至7.2(8)顯色劑ANa2HPO4·12H2O1.7g檸檬酸·H2O 0.5g3％H2O2200ul重蒸水 100ml調PH至5.0(9)顯色劑BEDTA 17.5mg檸檬酸.H2O 0.5g重蒸水 100ml加入10mlDMSO 含60mg TMB的溶液25ul(10)終止液濃H2SO410ml蒸餾水 80ml(11)20X洗滌液Tris 4.84g重蒸水 100ml(12)CoxB1-6混合抗原檢測流程夾心法如下①予包板Mc板②加待測患者血清③酶標記兔抗CoxB1-6混合病毒抗體IgG④加顯色劑A、B⑤450nM波長讀O.D值⑥結果判定七、半成品的檢定(1)包被板的檢定CV(％)＜10％(n-10)(2)穩(wěn)定性檢定①陰性對照和陽性對照+4℃-+8℃的穩(wěn)定性檢定試劑盒內設定陰性對照及陽性對照均+4℃-+8℃放置12個月，再用該試劑盒測定吸光度在正常范圍內。②試劑盒37℃穩(wěn)定性檢定裝配前一星期將兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP(1+100)(同一批CoxB病毒1-6型IgG-HRP檢測一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各測定一次，并用兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP置-20℃作對照，測得質控血清7天基本不變，則可以使用。(3)特異性檢定用62份質控參比血清來檢測半成品，陰性參比血清42份允許出現陽性1份，陽性參比血清20份允許出現陰性1份。
陰性質控血清組成T1-3HAV抗體陽性血清，T4-6HCV抗體陽性血清T7-9HEV抗體陽性血清，T10-14HBV表面抗體陽性血清，T15-24CoxB-IgM陰性血清，T25-27類風濕因子陽性血清，T28-30TB陽性血清，T31-33EBV陽性血清，T34-36CMV陽性血清，T37-39Hopl陽性血清，T40-42抗核抗體陽性血清。42份特異性血清應允許1份為陽性。
陽性質控血清20份組成Y1-20 CoxB1-6抗原陽性血清，20份陽性血清，應允許1份為CoxB1-6抗原陰性，其余19份應檢測為陽性。(4)靈敏度檢定①組成L1#按以下稀釋度稀釋1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀釋度稀1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀釋度稀1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判斷標準L1#靈敏度應檢測到1∶64L2#靈敏度應檢測到1∶128L3#靈敏度應檢測到1∶32(5)精密度測定將同一樣品平行加樣10孔，其檢測值的變異系數小于15％(CV％＜15)。(6)酶標抗體稀釋液，顯色劑經過37℃細菌培養(yǎng)試驗，發(fā)現無菌生長。八、試劑盒組裝(1)上述制備步驟所用試劑用過濾器除菌過濾后GMP車間中超凈分裝。(2)試劑盒必需有外包裝盒，海棉墊，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，說明書，內標簽紙9張，外標貼紙1張，批號lot/EXP，48T/96T。九、成品檢定(1)物理檢查①藥盒外包裝，標簽，批號，規(guī)格(48T/96T)有無遺漏。②藥盒內試劑瓶完整無滲漏，試劑瓶數和說明書無欠缺，標簽完整，有效期應清楚明晰。③藥盒試劑(酶標抗體稀釋液，顯色劑A，顯色劑B，洗滌液)核對PH值及溶液是否澄清。(2)穩(wěn)定性檢定完全同半成品檢定(3)特異性檢定完全同半成品檢定。(4)靈敏度完全同半成品檢定。(5)精密性完全同半成品檢定。(6)抽樣合格后，留下5個試劑盒剩余入庫。
3個試劑盒4℃ 2個 隔一個月測定1次37℃ 1個 第一次隔三天測定1次，以后每星期測定1次，記錄數據，繪制圖表。
2個試劑盒留庫備查十、保存與有效期保存于2-8℃，自檢定后合格之日起有效期為12個月。
柯薩奇病毒于1948年在美國柯薩奇地區(qū)分離而得名，屬小RNA病毒，分為A、B兩組，其中B組病毒(稱CoxB1-6病毒)在人類病毒性心肌炎，呼吸道感染等疾病中占有重要地位，為了進一步認識人CoxB1-6病毒感染的特征，特作臨床應用。
本發(fā)明的柯薩奇B1-6病毒ELISA檢測試劑盒經第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院臨床結果如下1.試劑盒《CoxB1-6病毒混合型抗原檢測試劑盒》和《CoxB1-6混合型抗體IgM檢測試劑盒》均由上海新新醫(yī)學生物工程公司生產、提供。
檢測CoxB1-6型混合抗原(Ag)系采用夾心ELISA法，檢測CoxB1-6IgM抗體系采用間接ELISA法。2.血清標本本院兒科經院患兒148例和體檢正常兒童30例的血清標本。3.檢測結果3.1.CoxB1-6病毒Ag和抗CoxB1-6IgM陽性檢出率見表1表1 CoxB抗原和抗CoxB IgM抗體陽性率診斷例數 CoxB-Ag(+) 陽性率(％) CoxB IgM抗體(+) 陽性率(％)呼吸道感染 80 19 23.8 31 38.8心肌炎 51 12 23.5 19 37.3非感染疾患 17 0 01 5.9正常兒童30 0 00 0
經數據統(tǒng)計分析，呼吸道感染與心肌炎間的CoxB抗原和IgM抗體陽性檢出率無明顯差異，但這二組的二項指標陽性率明顯高于非感染疾患組和正常兒童組，P＜0.01。在病程觀察中，發(fā)現凡CoxB1-6病毒Ag(+)的血清標本均出現了CoxB1-6病毒IgM抗體陽性，而有部分CoxB1-6 IgM抗體陽性血清抗原檢測為陰性，這說明該公司生產的CoxB1-6病毒抗原和抗體檢測試劑盒測定結果較可靠。3.2.CoxB1-6病毒Ag持續(xù)時間的檢測結果見表2表2 兩組CoxB Ag動態(tài)觀察結果診斷 例數 ＜2W消失 2-3W消失＞3W仍陽性n％ n％ n％呼吸道感染 19 12 2 631.615.3心肌炎 12 325.0650.0325.0檢測結果顯示，大約有一半病例的CoxB1-6病毒Ag陽性，可以在二周內轉陰(15/31例，48.4％)，超過3周，仍未轉陰的病例占12.9％(4/31)，在呼吸道感染和心肌炎這二種疾病中，前者的2周轉陰率明顯高于后者，這也與疾病的病程相一致。4.討論動物實驗資料顯示，CoxB1-6病毒感染后2-3天出現病毒血癥，15天后血液中病毒開始消退，一個月后消退90％以上。但臨床上如何監(jiān)測CoxB1-6病毒感染狀態(tài)？CoxB1-6病毒IgM指標能反映有近期感染，對CoxB病毒感染的診斷有價值，但該指標并不能直接說明CoxB1-6病毒是否存在于機體之中。病毒分離和病毒PCR技術因方法復雜，耗時太長以及后者特異性又不甚理想等原因，現一般無法在臨床常規(guī)中應用，國內也未見有其它檢測CoxB1-6病毒Ag試劑盒供應。因此，上海新新醫(yī)學生物工程公司生產的CoxB1-6病毒Ag和Ab試劑盒為柯薩奇感染性疾病的診斷提供了有效的檢測手段。本研究結果顯示，在131例心肌炎和呼吸道感染病例中，CoxB1-6病毒Ag(+)31例，陽性率23.7％，而47例非感染患者和正常兒童中，CoxB1-6病毒Ag全部陰性。對CoxB1-6病毒Ag(+)病例的追蹤觀察結果表明，其中48.4％病例該指標在2周內轉陰，持續(xù)3周以上仍陽性的病例占12.9％。心肌炎與呼吸道感染相比較，前者的CoxB1-6病毒Ag二周內轉陰率明顯比后者低，這與疾病的病程規(guī)律相符。檢測結果說明上海新新醫(yī)學生物工程公司生產的CoxB1-6病毒Ag和IgM抗體ELISA試劑盒質量較好。
經第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院臨床結果如下一、材料和方法1.標本本院兒科住院病人172例，其中心肌炎30例，上呼吸道感染29例，下呼吸道感染113例。2.試劑盒《柯薩奇B1-6Ag和IgM抗體ELISA試劑盒由上海新新醫(yī)學生物工程公司生產提供。檢測CoxB1-6病毒Ag為ELISA夾心法，檢測CoxB1-6病毒IgM為ELISA間接法。按試劑盒說明書嚴格操作。3.統(tǒng)計學處理組間陽性率顯著性比較采用X2檢驗。二、結果1.心肌炎病例中CoxB1-6病毒陽性例數見表3表3
如表1所示，在30例心肌炎病例中，檢測血清CoxB1-6病毒IgM抗體(+)者10例，血清CoxB1-6病毒Ag(+)者也是10例，因此，CoxB1-6病毒抗原和抗體的陽性率各為33.3％，但CoxB1-6病毒Ag(+)CoxB1-6病毒IgM(-)及CoxB1-6病毒Ag(-)CoxB1-6病毒IgM(+)者各有7例，由此，CoxB1-6病毒抗原或抗體一項以上陽性的病例共17例(56.5％)，這17例可確診為病毒性心肌炎。呼吸道感染CoxB1-6病毒Ag和IgM的陽性檢出率見表4表4呼吸道感染CoxB1-6病毒Ag和抗體IgM陽性檢出率診斷 例數CoxB1-6 Ag CoxB1-6 IgM共同(+) ％一項以 ％(+) ％(+) ％上(+)上呼吸道感染 29 8 27.6 10 34.5 4 13.81448.3下呼吸道感染 11323 20.4 40 35.4 10 8.8 5346.9X20.70.008 0.630.017P ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05表4中說明，在上、下呼吸道感染中有48.3％和46.9％病例伴有CoxB1-6病毒感染，且它們各有27.6％和20.4％的病例血清中CoxB1-6病毒Ag(+)，但兩組的各項陽性率經X2檢驗處理，差異均不顯著。三、討論1.從表3和表4可以看出，心肌炎和呼吸道感染中均存在部分CoxB1-6病毒Ag(+)而CoxB1-6病毒IgM(-)的病例，因此CoxB1-6病毒Ag的檢測使CoxB1-6病毒感染的診斷的正確性更加提供，在30例心肌炎病例中，若單檢測CoxB1-6病毒IgM指標，其陽性率為33.3％，同時再檢CoxB1-6病毒Ag指標，使CoxB1-6病毒感染的總陽性率為56.6％，同樣對上下呼吸道感染。CoxB1-6病毒IgM(+)各為34.5％和35.4％，而結合CoxB1-6病毒Ag指標，CoxB1-6病毒感染的陽性率各為48.3％和46.9％。國內尚未見有其它公司生產CoxB1-6病毒Ag檢測試劑盒。因此，上海新新醫(yī)學生物工程公司研制的CoxB1-6病毒Ag試劑盒對研究CoxB1-6病毒在多種疾病的發(fā)病機理有重要意義。
2.呼吸道感染屬急性感染性疾病入院較早，病程較短，但在上下呼吸道感染中各有34.5％和35.4％已出現CoxB1-6病毒IgM(+)，但此時同時存在CoxB1-6病毒Ag(+)只有13.8％和8.8％，也即各有20.7％和26.6％是處于CoxB1-6病毒IgM(+)而CoxB1-6病毒Ag(-)，由此可推斷在柯薩奇感染中CoxB1-6病毒的病毒血癥期較短。
3. 80年代以來，呼吸道合胞病毒已替代腺病毒成為小兒呼吸道感染的首位病毒病原體，其它常見的呼吸道病毒是流感，副流感和鼻病毒等。但近年來研究小兒呼吸道感染的病毒譜已遠遠超出上述范圍，國內已有急性上呼吸道炎合并CoxB1-6病毒感染的報導，而對下呼吸道感染與CoxB1-6病毒關系的研究較少，在血液中檢測到CoxB1-6病毒Ag或CoxB1-6病毒IgM均可視為CoxB1-6病毒感染，本組142例上下呼吸道感染中的陽性率各為48.3％和46.9％，提示CoxB1-6病毒感染在小兒呼吸道感染中占有重要地位。
經上海華東醫(yī)院臨床結果如下1998年4月至2000年3月期間我們使用上海新新醫(yī)學生物工程公司的CoxB1-6病毒Ag和CoxB1-6IgM抗體酶標試劑盒對852例門診和住院病例進行了血清CoxB1-6病毒檢測，結果見表5和表6。
表5 CoxB1-6病毒抗原和抗體檢測陽性率診斷 例數 CoxB1-6Ag(+) (％)CoxB1-6IgM(+) (％)上感 72 24 33.3 21 29.2急性支氣管炎 48 12 25.0 10 20.8慢性支氣管炎 90 3 3.318 20.0支氣管肺炎35 8 22.8 11 31.4肝炎 27 1 4.25 18.5冠心病112 4 3.620 17.9心律失常 75 0 0 8 10.7高血壓83 1 1.27 8.4糖尿病47 0 0 2 4.2腦血管意外21 0 0 1 4.8其它疾病 24.2 11 4.518 7.4合計 852 64 7.512114.2
表6 同份血清CoxB1-6Ag和CoxB1-6 IgM陰陽性分析診斷 例數 Ag(+) (％) Ag(+) (％) Ag(-) (％) 總陽性數 (％)IgM(+) IgM(-)IgM(+)上感 72 15 20.89 12.56 8.3 3041.7急性支氣管炎 48 816.74 8.3 2 4.2 1429.2慢性支氣管炎 90 33.3 0 0 1516.71820.0支氣管肺炎35 514.33 8.5 6 17.11440.0肝炎 27 13.7 0 0 4 14.85 18.5冠心病11232.6 1 0.891715.22118.8分析和評價1.CoxB1-6病毒Ag和IgM陽性是CoxB1-6病毒現行感染的指標，表5結果說明多種疾病同時伴有CoxB1-6病毒感染，尤其是感染性疾病同時伴發(fā)CoxB1-6感染的陽性率較高，非感染性疾病出現CoxB1-6感染的陽性率較低。
2.急性感染性疾病的CoxB1-6Ag陽性率與CoxB1-6 IgM陽性率接近、如上感、急性氣管炎和急性支氣管肺炎。而對病程較長的疾病，CoxB1-6Ag陽性率明顯低于CoxB1-6IgM陽性率。
3.在急性感染性疾病中，由于發(fā)病較早，病程較短，故有部分病例出現CoxB1-6Ag(+)而CoxB1-6IgM(-)，如上感、急性支氣管炎和支氣管肺炎，這種情況的陽性率分別為12.5％、8.3％和8.5％，使CoxB1-6病毒的總陽性率高于CoxB1-6Ag及CoxB1-6IgM單項陽性率，而對病程較長的疾病，CoxB1-6Ag(+)而CoxB1-6IgM(-)的陽性率幾乎接近于0；也即入院檢測時，CoxB1-6病毒已經消失，使CoxB1-6病毒的總陽性率不明顯高于CoxB1-6IgM單項陽性率，由此提示，CoxB1-6Ag的檢測對急性感染性疾病的診斷較重要，而對慢性疾病意義不大。
4.國內尚未見，其它公司有CoxB1-6Ag檢測試劑盒，而上海新新公司生產的該試劑盒，在急性感染性疾病中陽性率較高，而在慢性感染性疾病以及非感染性疾病中的陽性率很低，表5中有3種疾病計143例陽性率為0，這說明該試劑盒的特異性較好，對CoxB病毒感染的診斷有很高的價值。
本申請的柯薩奇病毒B1-6抗原ELISA試劑盒。其檢測方法簡便快速，收費低廉，靈敏度和特異性均較高，可以直接檢測出CoxB1-6型病毒，它是柯薩奇病毒B感染疾病早早期診斷的鑒別診斷的可靠病原學指標，對于越早明確病原治療效果越好的CoxB病毒感染，臨床應用價值較CoxB-IgM和CoxB-IgG試劑盒更高，有明顯的社會和經濟效益。
實施例檢測CoxB1-6混合型抗原試劑盒的制備。一、主要原材料1.Hela細胞中科院細胞所2.Na2HPO4.12H2O 上海新華化工廠3.Nacl上海試劑一廠4.Kcl 江蘇常熟化工廠5.Cacl2 江蘇常熟化工廠6.葡萄糖 成都化學試劑廠7.EDTA上海試劑一廠8.水解乳蛋白 上海試劑二廠9.谷氨酸 上海試劑二廠10.谷氨酰胺 上海化學試劑分裝廠11.L賴氨酸上海生化所12.L精氨酸L組氨酸L蛋氨酸上海試劑二廠13.小牛血清 杭州四季青生物材料工程公司14.胰蛋白酶 美國Sigma公司15.氯化銫 美國Sigma公司16.辣根過氧化物酶 美國Sigma公司17.TMB上海東風試劑廠18.高碘酸鈉 上?；瘜W試劑分裝廠19.硼氫化鉀 上海試劑一廠20.酶標板 華東理工大學新分離技術研究室二、CoxB1-6包被病毒抗體的制備(一)CoxB1-6病毒抗原的制備1.CoxB病毒1-6型毒種來源昆明生物所2.Hela細胞來源中科院細胞所3.細胞傳代①培養(yǎng)劑配制PRMI1640基礎培養(yǎng)劑過濾除菌，200ml基礎培養(yǎng)劑中含牛血清 10％青霉素 4萬單位鏈霉素 4萬單位6％NaHCO3 4ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用無Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細胞。③細胞傳代
將成片的細胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進行細胞消化，觀察細胞已呈疏松網狀，即倒去DT，加入營養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)3-5天。4.病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定①將形態(tài)完整、成片的單層細胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗液洗一次。②細胞感染病毒后，在37℃吸附1小時。③補充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)。④逐日觀察細胞，至所有細胞產生細胞病變后，用無菌方法收獲病毒。⑤微量平底板進行病毒濃度的滴定和病毒鑒定；病毒滴定用10倍的倍比稀釋方法進行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每個稀釋度加4孔，然后加入細胞50μl，設細胞對照，按Reed-Muench方法計算病毒的TCID50，本法培養(yǎng)病毒效價為TCID50＞10-5。病毒的鑒定A.應用免疫電鏡法；B.應用中和試驗方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25μl/孔，每個稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時。然后每孔內加Hela細胞50μl，同時設病毒陰性、陽性對照，逐日觀察細胞病變。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現CPE；(二)抗原的制備、濃縮和純化1.病毒滅活；2.去除病毒碎片用冷凍離心的方法去除細胞碎片；3.初步濃縮、提純用PEG方法進行提純；4.病毒的進一步純化用葡聚糖過柱、洗脫的方法，然后在A280的分光光度計進行蛋白含量的測定；(三)CoxB病毒1-6型混合單克隆(MC)抗體的制備；1.CoxB病毒1-6型混合后，免疫Balb/c小鼠；2.SP2/0骨髓瘤細胞培養(yǎng)，準備；3.細胞融合(瘤細胞與Balb/C小鼠融合)篩選，克隆得MC-IgG；4.單克隆鼠抗CoxB病毒1-6型混合抗體IgG鑒定，滴定＞10-6，特異性符合要求。三、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗體IgG制備①1mg/ml CoxB1-6混合抗原加等量福氏完全佐劑研缽中研磨乳化。②每只兔頸背部多點注射3mg抗原，2周—1個月1次，共5-8次，雙擴效價達1∶64以上時采集血清。③辛酸法純化CoxB1-6混合抗原抗血清IgG部份，蛋白定量。四、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗體IgG酶標記物的制備。1.稱5mg辣根過氧化物酶加0.5ml蒸餾水，再加0.5ml 60mM過碘酸鈉液氧化15’4℃中。2.加0.16M乙二醇0.5ml中止氧化，4℃30’。3.加10mg/ml兔抗CoxB病毒1-6型混合抗體IgG 0.5ml，裝袋對碳酸鈉緩沖液透析過夜。4.加5mg/ml硼氫化鉀0.2ml，4℃3h再裝透析袋對PH7.2 0.01M PBS透析24h，換液4-5次。5.取出兔抗CoxB病毒1-6型混合抗體IgG-HRP作工作濃度測定，配成1mg/ml濃度時的工作效價為1∶2000。五、陰，陽性對照血清配制。
從病毒攻擊的細胞保護試驗篩選陰性和陽性對照血清，并將陰陽性血清定值。六、顯色劑配制A液1.各稱磷酸氫二鈉18.4克，檸檬酸5克，PM50mg放入容量瓶中，加雙蒸水至1000ml，攪拌溶解后再加30％雙氧水400ul。2.過濾除菌后分裝小瓶。
B液1.稱EDTA150mg加入1000ml雙蒸水中，加熱溶解。2.上液冷卻后加檸檬酸1.05克，再加用二甲亞砜溶解的TMB250mg。3.分裝入黑色小瓶中備用。七、CoxB1-6混合抗原檢測方法的建立1.CoxB1-6病毒混合McAb包被用20mM Tris-Hcl液稀釋CoxB1-6病毒混合Mc IgG為1∶1000濃度，各反應微孔中加0.1置4℃中24h，棄去上清液，拍干；2.取出已包被條孔，插入支架上，用膠布固定，以防脫落；3.各孔中分別加待檢血清50μl，同時做陽性對照1孔，陰性對照1孔(各加50μl)，空白對照1孔(孔含蒸餾水100μl)；除空白對照孔外每孔滴加酶標記液1滴(50μl)，置37℃中反應1小時。4.取出反應板甩去孔內液體先在草紙上拍2-3下，然后用洗滌液洗5次，每次加滿后停留30分鐘，每次甩去洗滌液后都要在草紙上拍干，以便洗滌徹底(10倍濃洗滌液1ml+9ml蒸餾水即為工作濃度)。5.各孔滴加顯色劑A、B各1滴，置37℃中反應10-15分鐘再每孔滴加終止液1滴，置酶標儀中450nm波長讀數；6.結果判定陰性對照A值×2.5＝臨界值，凡待檢標本孔A值大于臨界值即為陽性。陰性對照小于0.08按0.08計算；八、靈敏度、特異性精密度試驗和穩(wěn)定性試驗1.靈敏度測定將細胞中和實驗中滴定為效價64u/0.1ml(640u/ml)，16u/0.1ml(160u/ml)及2u/0.1ml(20u/ml)的3份陽性血清用樣品稀釋液作不同濃度的稀釋后，按實驗操作方法作靈敏度測定，結果如下方法靈敏度測定檢測 抗體效價(u/ml)血清 640 320 160 8040302015105 2.5陽性血清1 ＞2*＞2 1.91 1.53 1.06 0.63 0.41 0.27 0.15 0.11 0.08陽性血清2 ＞2 1.88 1.72 1.13 0.93 0.64 0.41 0.24 0.13陽性血清30.63 0.44 0.29 0.16 0.09 0.07*450值陰性血清測定值1 2 3 4 5 60.090.080.100.070.090.11A陰性平均值為0.09，陽性臨界值＝0.09×2.5＝0.225則本檢測方法對3份陽性血清的檢測靈敏度分別為15u/ml，5u/ml和15u/ml，平均為11.7u/ml2.特異性測定將細胞中和實驗中判為陰性的血清20份按實驗操作方法測定，結果如下待檢血清測定值1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.07 0.13 0.08 0.07 0.12 0.11 0.14 0.06 0.05 0.11111213141516171819200.04 0.09 0.10 0.08 0.07 0.05 0.07 0.12 0.11 0.09用6份小牛血清液按實驗操作方法測定的A值分別為0.100.110.090.100.040.07平均值為0.085 陽性臨界值＝0.085×2.5＝0.213則上面20份細胞中和實驗陰性血清用本ELISA法測定也全部陰性，特異性100％。3.精密度測定取實驗吸光度分別為高中低A值的3份陽性血清做精密度試驗，批內試驗為每份血清同時做10個復孔，批間試驗為每份血清間隔2-3天，實驗1次，共測定6次，結果如下
批內試驗1 2 3 4 5 6 7 8 9 10X S CV(％)1 1.27 1.30 1.25 1.24 1.31 1.25 1.23 1.32 1.26 1.33 1.276 0.036 2.82 0.76 0.65 0.66 0.68 0.71 0.73 0.70 0.69 0.74 0.77 0.709 0.041 5.73 0.36 0.38 0.36 0.37 0.37 0.41 0.35 0.40 0.37 0.34 0.371 0.021 5.7平均批間CV＝4.73％批間試驗1 2 3 4 5 6 X SCV(％)1 1.291.401.101.301.321.151.26 1.113 8.92 0.770.620.650.810.730.610.715 0.071 103 0.350.400.370.340.330.400.365 0.030 8.3平均批間CV＝9.1％4.CoxB1-6混合型抗原三批試劑盒置37℃溫箱中保存的穩(wěn)定性試驗。
第980519批試劑盒
第980603批試劑盒
第980615批試劑盒
CoxB病毒1-6型混合抗原試劑盒的靈敏度高、特異性好、精密度高和穩(wěn)定性好。
權利要求
1.一種柯薩奇病毒B1-6混合型抗原ELISA試劑盒，其特征在于該試劑盒用CoxB病毒B1-6混合型單克隆抗體包被，兔抗CoxB1-6病毒抗體IgG聯接辣根過氧化物酶為檢測抗體，檢測血清中的CoxB病毒B1-6混合型抗原，試劑盒由下列組成預包被反應條48孔/96孔 酶標記液 1瓶(3ml)樣品稀釋液 1瓶(6ml) 陽性對照 1支(200μl)陰性對照1支(200l) 20倍濃洗滌液 1瓶(13ml)顯色劑A 1瓶(3ml) 顯色劑B 1瓶(3ml)終止液 1瓶(3ml)
2.一種如權利要求1所述的一種柯薩奇病毒B1-6混合型抗原ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟一、包被抗體(CoxB病毒1-6混合單克隆抗體)的制備(一)CoxB病毒1-6型的制備(1)CoxB病毒1-6型毒種來源昆明生物所(2)Hela細胞來源中科院細胞所(3)細胞傳代①培養(yǎng)劑配制PRMI1640基礎培養(yǎng)過濾除菌，200ml基礎培養(yǎng)劑中含牛血清10％；青霉素4萬單位鏈霉素4萬單位6％NaHCO34ml3％谷氨酰胺6ml②胰酶(DT)配制用無Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細胞；③細胞傳代將成片的細胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進行細胞消化，觀察細胞已呈疏松網狀，既倒去DT，加入營養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)培養(yǎng)3-5天；(4)病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定①將形態(tài)完整、成片的單層細胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗液洗一次；②細胞感染病毒后，在37℃吸附1小時；③補充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)；④逐日觀察細胞至所有細胞產生細胞病變后，用無菌方法收獲病毒；⑤微量平底板進行病毒濃度的滴定和病毒鑒定；病毒滴定用10倍的倍比稀釋的方法進行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每個稀釋度加4孔，然后加入細胞50μl，設細胞對照，按Reed-Muench方法計算病毒的TCID50；病毒的鑒定應用免疫電鏡法及應用中和試驗方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25μl/孔，每個稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時；然后每孔內加Hela細胞50μl，同時設病毒陰性、陽性對照，逐日觀察細胞病變；是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現CPE；(5)抗原的制備、濃縮和純化①病毒滅活；②去除病毒碎片用冷凍離心的方法去除細胞碎片；③初步濃縮、提純用PEG方法進行提純；④病毒的進一步純化用葡聚糖過柱、洗脫的方法，然后在A280的分光光度計進行蛋白含量的測定；(二)CoxB病毒1-6型混合單克隆(Mc)抗體的制備(1)CoxB病毒1-6型混合后，免疫Balb/c小鼠；(2)SP2/0骨髓瘤細胞培養(yǎng)準備；(3)細胞融合、篩選、克隆；(4)單克隆鼠抗CoxB1-6型混合抗體IgG鑒定，滴度＞10-6，特異性符合要求；二、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗體IgG的制備用已制備、濃縮和純化好的CoxB病毒1-6型制備兔抗體IgG(1)CoxB病毒1-6型混合后取1mg/ml加等量完全福氏佐劑缽中研磨乳化；(2)每只兔頸背部多點皮內注射，每兩周1次共5-6次；(3)雙擴散效價達1∶64以上時采集血清；(4)辛酸法純化抗血清IgG部分(5)抗血清IgG蛋白定量；三、酶標記抗體制備用過碘酸鈉法把兔抗CoxB病毒1-6型混合抗體IgG與辣根過氧化物酶偶聯對PBS充分透析，加等體積甘油，-20℃以下保存，效價＞1∶1000(用方陣滴定法測定)；四、兔抗CoxB病毒1-6型抗體IgG濃度測定采用方陣滴定法選擇酶標記抗體工作濃度為1∶1000五、預包被抗體板及試劑盒原料的制備(1)包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水 500ml加入適量CoxB病毒1-6混合型Mc抗體，調整PH至9.5加入板條各孔中，置濕盒中加蓋，4℃過夜后甩干；(2)洗滌Tris 2.42g重蒸水 1000ml加入板條各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復3次，以除去剩余抗原；(3)封閉蔗糖 100g羊血清 25ml0.1MPBS 1000ml加入板條各孔中放入濕盒中(加蓋)37℃2h，棄去液體，吸水紙上拍干重復一次，待干燥后，放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4℃；(4)陽性對照制備診斷心肌炎患者的血清，60℃放置1小時，除菌過濾，用本試劑盒測定A值＞0.8備用，分裝；(5)陰性對照的制備正常人血清用本試劑盒測定A值0-0.09用萬分之二硫柳汞防腐備用分裝；(6)酶標記抗體配制30％小牛血清兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP 50％0.15MPBS20％甘油→稀釋20倍分裝(7)酶標記抗體稀釋液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml調PH至7.2(8)顯色劑ANa2HPO4·12H2O 1.7g檸檬酸·H2O 0.5g3％H2O2200μl重蒸水 100ml調PH至5.0(9)顯色劑BEDTA 17.5mg檸檬酸.H2O 0.5g重蒸水 100ml加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25μl(10)終止液濃H2SO410ml蒸餾水 80ml(11)20X洗滌液Tris 4.84g重蒸水 100ml(12)CoxB1-6混合抗原檢測流程夾心法如下①予包板Mc板②加待測患者血清③酶標記兔抗CoxB1-6混合病毒抗體IgG④加顯色劑A、B⑤450nM波長讀O.D值⑥結果判定六、半成品的檢定(1)包被板的檢定CV(％)＜10％(n-10)(2)穩(wěn)定性檢定①陰性對照和陽性對照+4℃-+8℃的穩(wěn)定性檢定試劑盒內設定陰性對照及陽性對照均+4℃-+8℃放置12個月，再用該試劑盒測定吸光度在正常范圍內；②試劑盒37℃穩(wěn)定性檢定裝配前一星期將兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP(1+100)(同一批CoxB病毒1-6型IgG-HRP檢測一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各測定一次，并用兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP置-20℃作對照，測得質控血清7天基本不變，則可以使用；(3)特異性檢定用62份質控參比血清來檢測半成品，陰性參比血清42份允許出現陽性1份，陽性參比血清20份允許出現陰性1份；陰性質控血清組成T1-3HAV抗體陽性血清，T4-6HCV抗體陽性血清T7-9HEV抗體陽性血清，T10-14HBV表面抗體陽性血清，T15-24CoxB-IgM陰性血清，T25-27類風濕因子陽性血清，T28-30TB陽性血清，T31-33EBV陽性血清，T34-36CMV陽性血清，T37-39Hopl陽性血清，T40-42抗核抗體陽性血清；42份特異性血清應允許1份為陽性；陽性質控血清20份組成Y1-20 CoxB1-6抗原陽性血清，20份陽性血清，應允許1份為CoxB1-6抗原陰性，其余19份應檢測為陽性；(4)靈敏度檢定①組成L1#按以下稀釋度稀釋1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀釋度稀1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀釋度稀1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判斷標準L1#靈敏度應檢測到1∶64L2#靈敏度應檢測到1∶128L3#靈敏度應檢測到1∶32(5)精密度測定將同一樣品平行加樣10孔，其檢測值的變異系數小于15％(CV％＜15)；(6)酶標抗體稀釋液，底物液經過37℃細菌培養(yǎng)試驗，發(fā)現無菌生長；七、試劑盒組裝(1)上述制備步驟所用試劑用過濾器除菌過濾后GMP車間中超凈分裝；(2)試劑盒必需有外包裝盒，海棉墊，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，說明書，內標簽紙9張，外標貼紙1張，批號lot/EXP，48T/96T；八、成品檢定(1)物理檢查①藥盒外包裝，標簽，批號，規(guī)格(48T/96T)有無遺漏；②藥盒內試劑瓶完整無滲漏，試劑瓶數和說明書無欠缺，標簽完整，有效期應清楚明晰；③藥盒試劑(酶標抗體稀釋液，底物液甲，底物液乙，洗滌液)核對PH值及溶液是否澄清；(2)穩(wěn)定性檢定完全同半成品檢定(3)特異性檢定完全同半成品檢定；(4)靈敏度完全同半成品檢定；(5)精密性完全同半成品檢定；(6)抽樣合格后，留下5個試劑盒剩余入庫；3個試劑盒4℃ 2個 隔一個月測定1次37℃1個 第一次隔三天測定1次，以后每星期測定1次，記錄數據，繪制圖表；2個試劑盒留庫備查九、保存與有效期保存于2-8℃，自檢定后合格之日起有效期為12個月；
全文摘要
本發(fā)明公開了一種柯薩奇病毒B1－6混合型抗原試劑盒。該試劑盒用CoxB病毒B1－6混合型單克隆抗體包被,免抗CoxB1－6病毒抗體IgG聯接辣根過氧化物酶為檢測抗體,檢測血清中的CoxB病毒B1－6混合型抗原。本發(fā)明的試劑盒靈敏度和特異性高。本發(fā)明提供了制備方法。
文檔編號G01N33/569GK1382989SQ0111270
公開日2002年12月4日 申請日期2001年4月24日 優(yōu)先權日2001年4月24日
發(fā)明者杜鳳鳴 申請人:杜鳳鳴