專利名稱：中藥特征指紋譜的建立及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥分析方法，具體涉及一種中藥特征指紋譜地建立及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中藥的鑒定是比較復(fù)雜的工作，色譜指紋譜的誕生，為中藥的鑒定指出了新的研究方向。色譜指紋譜是將波動(dòng)性較大的色譜圖轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定性較好的數(shù)據(jù)化色譜指紋譜。本發(fā)明人曾在《中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)代化與色譜指紋譜》世界科學(xué)科技技術(shù)——中藥現(xiàn)代化2000年第二卷第六期第20頁，《從中醫(yī)藥中來，回到中醫(yī)藥中去》上海中醫(yī)藥雜志2000年第一期第7頁，《中藥質(zhì)量控制的新技術(shù)、新趨勢(shì)——數(shù)據(jù)化的色譜指紋譜》現(xiàn)代中醫(yī)藥2001年第一期第28頁，《柴胡屬19種植物揮發(fā)油的GC分析》藥學(xué)學(xué)報(bào)1988年(11)839，《GC-FPS在檀香木質(zhì)量研究中的應(yīng)用》上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)1990(2)54，《HPLC相對(duì)保留值指紋譜鑒別大黃》中國中藥雜志(11)650，《麝香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初探》中國中藥雜志1991(4)230上公開了色譜指紋譜的建立情況。但由于中藥及其產(chǎn)品的組分十分復(fù)雜，如何根據(jù)色譜分析所提供的大量信息對(duì)它們進(jìn)行鑒定和進(jìn)行質(zhì)控，建立質(zhì)標(biāo)，目前尚無可行、可信的方法，是中藥現(xiàn)代化必須解決的問題。色譜峰的分離狀況是否完全，每個(gè)色譜峰是否只包含一個(gè)組分等等，還存在一定的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于利用色譜分析提供的信息，創(chuàng)建一整套原理來解決上述問題，根據(jù)中藥生物品在色譜指紋譜中所反映的特性和共性，構(gòu)成中藥生物體所特有的指紋，來鑒定中藥和鑒別中成藥所含藥味。
本發(fā)明提供了一種中藥特征指紋的建立及根據(jù)特征指紋進(jìn)行鑒定時(shí)所運(yùn)用的計(jì)算公式和相關(guān)術(shù)語、定義。
現(xiàn)將特征指紋的選擇原則和操作步驟敘述于下。
(1)標(biāo)準(zhǔn)藥材的選取，收集業(yè)經(jīng)生藥鑒定的該品種藥材五個(gè)以上的批號(hào)。能有更多的批號(hào)則更佳。因?yàn)榭紤]到生物樣品的個(gè)體差異，只有在相當(dāng)數(shù)量的樣品中，才能清楚地顯現(xiàn)出它的特征。此時(shí)還需注意中藥樣品批號(hào)的含義，除樣品的產(chǎn)地、采收時(shí)間和季節(jié)，以及藥用部位外，氣侯的影響，儲(chǔ)運(yùn)保管條件以及某些人為因素均應(yīng)顧及。因此樣品批號(hào)宜多不宜少。
(2)規(guī)范化的操作條件和步驟應(yīng)從兩方面的工作于以規(guī)范化。一是樣品的預(yù)處理，生物樣品都需經(jīng)預(yù)處理后方能進(jìn)行色譜分析。預(yù)處理的方法有多種，例如超聲萃取，加熱萃取，pH萃取等各種萃取技術(shù)。二是萃取樣品量的大小和樣品粉碎程度，以及萃取液是否再經(jīng)處理等因素，總之所有樣品處理過程都必須保持一致以保證樣品液的分析具有良好的精密度、正確性、重現(xiàn)性和相互間的可比性。
(3)最佳色譜條件的建立色譜條件包括色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)器等的選擇。要建立良好色譜條件使中藥樣品中所含之成分盡可能地獲得分離，也即分得的色譜峰愈多愈好，可以說是多多益善，使中藥的內(nèi)在特性都顯現(xiàn)出來，為鑒定提供足夠的信息。色譜柱的選擇可根據(jù)中藥所含的主要成分而定，例如含生物堿類化合物為主的中藥，可選用離子交換柱；含多糖類化合物為主的中藥可選用凝膠柱，含甾體類化合物為主的中藥可選用c-18反相柱；......等。流動(dòng)相的組成除應(yīng)考慮化合物的性質(zhì)外，因?yàn)橹兴幩煞侄喽s，采用常規(guī)的等梯度洗脫難以使各種性質(zhì)的成分獲得分離，使色譜圖中所出現(xiàn)的峰數(shù)較少，不能給出足夠的鑒定所需的信息。在大多數(shù)的情況下以采用梯度洗脫為宜。在合適的梯度條件下，使性質(zhì)差異較大的各種化合物均被分離，可充分提供鑒定所需的信息。分得的色譜峰越多越有利于鑒定。目前可供選擇的檢測(cè)器，在氣相色譜中有氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)、熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)、電子捕獲檢測(cè)器(ECD)、火焰光度檢測(cè)器(FPD)等，其中以FID最為常用，凡以碳、氫、氧等元素組成的有機(jī)化合物均可被檢出，對(duì)中藥所含之揮發(fā)性成分的分析是十分有效的。在高效液相色譜中有可變紫外-可見光(UV-VIS)檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、示差折射檢測(cè)器(RID)、蒸發(fā)光散射光檢測(cè)器(ELSD)等。其中紫外-可見光檢測(cè)器用得較多，適宜于化合物中有共軛雙鍵的成分分析，而大量的不含共軛雙鍵的化合物不能被檢出。近十年來，ELSD檢測(cè)器的發(fā)展，使中藥中甾體類、皂甙類、多糖類等化合物均可采用ELSD作檢測(cè)。
(4)特征指紋的確立對(duì)上述五個(gè)以上批號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)藥材，在優(yōu)化的提取條件下制備供試液，以及在最佳色譜條件下進(jìn)行分析，每個(gè)樣品同品種的中藥五個(gè)以上的批號(hào)，分別進(jìn)樣三次，由此獲得五個(gè)批號(hào)樣品的十五張色譜圖，并轉(zhuǎn)化為十五張色譜指紋譜?，F(xiàn)將這十五張色譜指紋譜中的相對(duì)保留值匯集并列成表(見表1)，以便選擇特征色譜峰來建立特征指紋。
表1 色譜指紋譜匯集表(面積歸一化值)總峰數(shù)61
列表的原則與鑒定原則相同，首先設(shè)定一窗口，設(shè)定為1％，即各樣品中相對(duì)保留值的差異在1％的范圍內(nèi)者，可列于同一項(xiàng)中，可認(rèn)為它們是相同化合物的色譜峰。表中α值為該項(xiàng)中相對(duì)保留值的平均值，表格中數(shù)字為色譜峰的歸一化面積值。
表1清楚地表明了有些色譜峰可在所有樣品中均存在，而有些色譜峰則不然，僅在部分樣品中出現(xiàn)。那些所有樣品中均存在著的色譜峰可以認(rèn)定是這品種所特有，由于它們并非系一、二個(gè)色譜峰，而是有相當(dāng)數(shù)量的一大群色譜峰所構(gòu)成，對(duì)一個(gè)個(gè)色譜峰稱為特征指紋峰，由一大群特征指紋峰構(gòu)成了特征指紋。由此實(shí)現(xiàn)了從多組分的角度來反映中藥樣品的內(nèi)在特征。因此，根據(jù)中藥的色譜指紋譜中的特征指紋來判別和鑒定中藥時(shí)，使它的結(jié)論將具有更客觀、更科學(xué)和更公正的特點(diǎn)。
特征指紋峰的入選條件，首先應(yīng)是全部樣品所共有，其次是百分之九十以上樣品所共有者，在比較分散的情況下，可以考慮百分之八十以上樣品所共有者。另外，已被認(rèn)定是這類藥材的有效成分或特殊成分。例如麝香中的麝香酮，牛膝中的齊墩果酸，何首烏中的白藜蘆醇甙，細(xì)辛中的黃樟醚、黃芪中的黃芪甲甙。這些成分有些是藥效成分，有些是能獲得其標(biāo)準(zhǔn)品的特征成分。它們的存在對(duì)藥物的鑒定具有重要的意義。在表1中也看到有些色譜峰僅為個(gè)別或少數(shù)中藥樣品所含有，可認(rèn)為是樣品的個(gè)體差異或其他特殊情況，對(duì)中藥的品種鑒定無實(shí)質(zhì)性意義，作模糊處理，可予以忽略。此外，尚需考慮特征指紋峰在總數(shù)中所占比例，如所占比例較小，則說明只抓小頭放了大頭。因此要求特征指紋中色譜峰數(shù)目以大于總數(shù)的百分之六十為宜。如達(dá)不到該指標(biāo)，說明在取樣中存在問題，即所選的這些標(biāo)準(zhǔn)藥材間有較大差異，需進(jìn)一步探究它們的來源，包括品種的基源，產(chǎn)地，采集時(shí)間，藥用部位，保存方式和時(shí)間等諸因素。也需對(duì)操作步驟，色譜條件，數(shù)據(jù)處理等諸方面進(jìn)行復(fù)核。還需指出，由于中藥為生物樣品，其指紋特征不可能一成不變，隨著時(shí)日變遷，盡管都是同一品種、統(tǒng)一產(chǎn)地，相同采集、保管方式，但生物體的變異是絕對(duì)的。所以，對(duì)特征指紋要經(jīng)常修正。建議，在做鑒定時(shí)應(yīng)隨行由中國藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)藥材同步測(cè)試，使統(tǒng)一在國家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。按上述原則所確立的特征指紋和對(duì)各待鑒藥材的鑒定情況列于表2。
表2 七個(gè)藥材的特征指紋譜鑒定表
*α-標(biāo)準(zhǔn)藥材特征指紋峰的相對(duì)保留值。
**Ar-標(biāo)準(zhǔn)藥材特征指紋峰的歸一化面積均值。
***特征指紋值—國家標(biāo)準(zhǔn)藥材特征指紋歸一化面積值。
*****特征指紋差異率—國家標(biāo)準(zhǔn)藥材與標(biāo)準(zhǔn)藥材特征指紋歸一化面積值差異率。
表2以某中藥為例，列出了經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理后標(biāo)準(zhǔn)藥材的特征指紋及每個(gè)特征指紋峰的面積歸一化均值，同時(shí)還列出了國家標(biāo)準(zhǔn)藥材和6個(gè)待檢藥材的特征指紋與標(biāo)準(zhǔn)藥材的差異率和總差異率以及各藥材的特征指紋檢出率。該表將各項(xiàng)重要的鑒定參數(shù)綜合在一起，便于分析研究。表2充分顯示了國家標(biāo)準(zhǔn)藥材在指紋譜鑒定中的良好表現(xiàn)，其總差異率為0.102％，特征指紋檢出率為100％，重疊率也為100％；而待鑒藥材4，其總差異率為0.669％，特征指紋檢出率為37％，重疊率為54％，將被判為不合格品種。為了直觀地看到鑒定的情況，還可以特征指紋為基準(zhǔn)，繪出他們的差異率折線圖，見圖一。
本發(fā)明又提供了上述一種中藥特征指紋譜的相似率和差異率。
以上內(nèi)容所涉及的共有峰、重疊峰、n強(qiáng)峰、特征指紋和歸一化面積值等參數(shù)分別從定性鑒別和量化描述兩個(gè)方面反映了中藥樣品的內(nèi)在特性。但在對(duì)中藥作出明確的鑒定時(shí)，尚需有數(shù)據(jù)作依據(jù)。為此需將上述各項(xiàng)參數(shù)按其貢獻(xiàn)予以綜合表達(dá)。
相似率和差異率是一個(gè)表示待檢藥材與標(biāo)準(zhǔn)藥材間的相似程度的數(shù)據(jù)，它將定性信息與定量數(shù)據(jù)綜合于一體，作為最終鑒定的重要依據(jù)。
相似率，是以特征指紋為基礎(chǔ)，對(duì)此求出待檢藥材與標(biāo)準(zhǔn)藥材間相似或差異，通過它可顯示出兩者在特征指紋上的相似性。首先計(jì)算每個(gè)特征指紋間的相似率，見下式
某個(gè)特征指紋的相似率＝AI鑒/AI標(biāo)*100％
然后對(duì)所有的特征指紋相似率求和得其總相似率，見下式
總相似率＝∑(AI鑒/AI標(biāo))/n...........................................(1)
Ai鑒待檢藥材中某個(gè)特征指紋的歸一化面積值
Ai標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)藥材中某個(gè)特征指紋的歸一化面積值
n特征指紋的總數(shù)
∑求和符號(hào)
按(1)式計(jì)算時(shí)，可能會(huì)遇到下列兩種情況，當(dāng)Ai鑒都小于Ai標(biāo)時(shí)，結(jié)果很清楚，其求和后之相似率比小于“1”，其間各值在求和過程中雖有一定的“拉平”作用，但這都是在標(biāo)準(zhǔn)以下的平均。但若出現(xiàn)多個(gè)Ai鑒大于Ai標(biāo)時(shí)，且大出好幾倍時(shí)，該求和過程已不再是拉平作用，而變成“填平”作用，因?yàn)樗梢詫⒃S多小坑，即較小的差異都填平了，這有違于建呂相似率時(shí)的原意。此外，按相似率的含義，當(dāng)相似率等于1時(shí)，表示兩者完全相同；若小于1時(shí)，則表示兩者的相似程度；當(dāng)大于1時(shí)，就不易解釋清楚了。為能客觀地表示待檢藥材的鑒定結(jié)果，在此基礎(chǔ)上提出了差異率的概念。差異率的定義是以每個(gè)特征指紋峰與其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)特征指紋峰的面積歸一化值間的比值來表示兩者間的差異程度，總差異率則是將每個(gè)特征指紋峰的差異率求和即得總差異率愈大，表示比較雙方相差愈大，說明待檢藥材不可能是欲鑒定的品種，而總差異率愈小，則為欲鑒定品種的可能性愈大。另外，待鑒藥材與標(biāo)準(zhǔn)特征指紋相比較，可得到特征指紋檢出率，此也是表示差異的重要數(shù)據(jù)?，F(xiàn)對(duì)每個(gè)特征指紋計(jì)算其差異率，計(jì)算式如下
特征指紋差異＝|AI標(biāo)-AI鑒|AI標(biāo)........................................(2)
材中無某個(gè)相應(yīng)的特征指紋時(shí)，Ai鑒＝0，則該特征指紋差異率為1；若Ai標(biāo)＜Ai鑒時(shí)，則取絕對(duì)值。因此，在計(jì)算總差異率時(shí)是所有差異的求和，避免了填平作用，能客觀地反映待鑒藥材的差異情況，總差異率可按下式計(jì)算
總差異率＝∑(|AI標(biāo)-AI鑒|/AI標(biāo))/n..................................(3)
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供了上述一種中藥特征指紋譜的應(yīng)用。
共有峰和重疊率是中藥鑒定中的重要參數(shù)，也是構(gòu)成色譜指紋譜的基礎(chǔ)。共有峰是重疊率的基礎(chǔ)，它反映了待鑒藥材中有多少成分與標(biāo)準(zhǔn)藥材相同，顯示了兩者間的相似程度。可以說，在所有涉及的參數(shù)中，重疊率是最全面、最客觀地反映了兩個(gè)參與比較藥材間的相似或差異。由于所有的色譜峰均被計(jì)入重疊率計(jì)算之中，因此一些反映個(gè)體特性的色譜峰也計(jì)入，這對(duì)品種的鑒定將會(huì)造成一定的干擾使重疊率偏低。這情況在前期的應(yīng)用中已時(shí)有遭遇，有些藥材在鑒定過程中證明其與標(biāo)準(zhǔn)藥材同樣含有那些有效成分、主要成分(含量較高的成分)或指標(biāo)成分、特殊成分，在內(nèi)在特性的重要內(nèi)容方面是相符的，但兩者的重疊率較低。此時(shí)若輕率地作出否定的結(jié)論，顯然不合適。若能將反映個(gè)體差異的色譜群予以模糊處理使品種的特征被顯示出來，則將會(huì)得到更真實(shí)的鑒定結(jié)果。
特征指紋，是模糊處理的結(jié)果，作為植物種屬的代表性特征。使進(jìn)一步的鑒定工作更客觀和合理，必須有一規(guī)范化的設(shè)計(jì)。首先是取材問題，要有幾個(gè)批號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)藥材，所謂幾個(gè)批號(hào)是指同一產(chǎn)地和不同產(chǎn)地在不同的取樣點(diǎn)取多批樣品。樣本數(shù)大小的問題，原則上是愈大愈好，一般說來，應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求，至少5個(gè)以上，建議在20左右，使符合中藥質(zhì)量分析要求。因此使特征指紋并非得自某一標(biāo)準(zhǔn)藥材，而是十個(gè)、二十個(gè)樣品的統(tǒng)計(jì)值，特別是每個(gè)α值所對(duì)應(yīng)的面積歸一化只是個(gè)樣品的均值，其次是標(biāo)準(zhǔn)化的色譜操作條件，以增強(qiáng)其可比性。
特征指紋峰檢出率，這是在鑒定工作中經(jīng)常用的，即在待鑒藥材與特征指紋作比較時(shí)，能在待鑒藥材中找到的特征指紋峰數(shù)與特征指紋峰總數(shù)的比值。
特征指紋檢出率＝待鑒藥材中的特征指紋峰數(shù)/特征指紋峰總數(shù)
該檢出率是鑒定藥材時(shí)的重要依據(jù)，檢出率達(dá)100％者，說明該藥材在內(nèi)在品質(zhì)的主要方面已達(dá)到該品種的質(zhì)量要求，但這還不能作為鑒定的唯一依據(jù)，尚需對(duì)其所含各特征指紋峰進(jìn)一步作量的方面考察，以保證藥用的安全性。
特征指紋的差異率，特征指紋的檢出率，僅指明了特征指紋峰的有或無，“無”為零是顯而易見的，“有”則究竟有多少，這也是個(gè)重要的問題，在目前，一不知它們?yōu)楹挝?，二不具有它們的?biāo)準(zhǔn)品，怎樣進(jìn)行量化。顯然，不可能絕對(duì)定量，但相對(duì)定量是完全可能的。上節(jié)對(duì)差異率和總差異率均已有詳細(xì)說明，具體的運(yùn)作可見下章所列各例。特別提請(qǐng)讀者注意的是，在中藥鑒定過程中會(huì)遇到各種特殊情況，需謹(jǐn)慎處之。
特征指紋曲線
特征指紋曲線是由特征指紋和各指紋峰相應(yīng)的面積歸一化值所構(gòu)成，以曲線圖的方式說明某中藥特征指紋的情況。它是一種直觀圖，以曲線的形式同時(shí)將每個(gè)特征指紋峰的質(zhì)和量顯示出來。如在同一坐標(biāo)系統(tǒng)內(nèi)將待鑒藥材與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的特征指紋峰同時(shí)顯示出來，則將清楚地看到兩者的相似程度。雖然，這是一種直觀感覺，進(jìn)一步的闡明尚有賴于其它參數(shù)的應(yīng)用，但他對(duì)鑒定的結(jié)果可起到良好的輔助作用。
特征指紋的用途不僅限于含有相同有效成分的不同中藥間區(qū)分和鑒別，而主要用于品種的鑒定，因?yàn)橥瑢俨煌贩N間的區(qū)分和鑒定需要更多而細(xì)致的信息，特征指紋正好滿足這一要求。特征指紋還能為中成藥所含藥味的鑒定提供依據(jù)，解決了長期來一直令人困惑的難題。它不僅可以明確地告知該味中藥的存在與否，還能區(qū)分摻偽作假或誤用同屬植物。


圖1 黔嶺淫羊藿葉(貴州黔嶺山)HPLC圖譜圖2 黔嶺淫羊藿葉(上海市藥材公司)HPLC圖譜圖3 黔嶺淫羊藿莖(貴州黔嶺山)HPLC圖譜圖4 巫山淫羊藿葉莖(貴州)HPLC圖譜圖5 巫山淫羊藿根(陜西安康)HPLC圖譜圖6 巫山淫羊藿莖(陜西安康)HPLC圖譜圖7 巫山淫羊藿葉(陜西安康)HPLC圖譜圖8 煎葉淫羊藿莖(陜西安康)HPLC圖譜圖9 煎葉淫羊藿葉(陜西安康)HPLC圖譜圖10 煎葉淫羊藿葉(安徽)HPLC圖譜圖11 煎葉淫羊藿莖(安徽)HPLC圖譜圖12 煎葉淫羊藿葉莖(廣西靈山)HPLC圖譜圖13 寶興淫羊藿葉(云南)HPLC圖譜圖14 寶興淫羊藿莖(云南)HPLC圖譜圖15 寶興淫羊藿葉莖(湖南)HPLC圖譜圖16 柔毛淫羊藿莖(四川灌縣)HPLC圖譜圖17 柔毛淫羊藿葉(四川灌縣)HPLC圖譜圖18 朝鮮淫羊藿葉(河南洛陽)HPLC圖譜圖19 朝鮮淫羊藿葉莖(遼寧)HPLC圖譜圖20 朝鮮淫羊藿葉莖(青海藥檢所)HPLC圖譜圖21 淫羊藿葉莖(江蘇無錫)HPLC圖譜圖22 淫羊藿葉莖(浙江臨安)HPLC圖譜圖23 淫羊藿葉莖(陜西)HPLC圖譜圖24 1號(hào)樣品生半夏的HPLC圖譜圖25 2號(hào)樣品生半夏的HPLC圖譜圖26 3號(hào)樣品生半夏的HPLC圖譜圖27 4號(hào)樣品生半夏的HPLC圖譜圖28 5號(hào)樣品制半夏的HPLC圖譜圖29 6號(hào)樣品制半夏的HPLC圖譜圖30 11號(hào)樣品制半夏的HPLC圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
植物樣品1.北柴胡 Bupleurum chinense DC2.多枝柴胡B.polycloxum Y.LIetS.L.Pan3.線葉柴胡B.angustissmum[Franch]Ditagawa4.窄竹葉柴胡 B.margInatum Wall.Ex DC var stenophyllum
[Wolff]shan et Li5.瀘西柴胡B.luxiense Y.LI et S.L.Pan6.麗江柴胡B.rocfkiI Wolff7.韭葉柴胡B.kunmingense Y.Li et S.L.Pan8.小柴胡 B.hamiltonii Belak9.空心柴胡B.longicaule Woll.ex DC.var.franchetii de Boiss10.柴首柴胡 B.chaIshoui Shan et Sheh11.紅柴胡 B.scorzonerifolIum Willa12.汶川柴胡 B.wenchuanse Shau et Y.Li13.馬爾康柴胡 B.malconense Shan et Y.Li14.黑柴胡 B.Smithii Wolff15.大苞柴胡 B.euphorbIoIdes Nakai16.小葉黑柴胡 B.Smithii Wolff var.parvIfoluim Shan et Y.Li17.竹葉柴胡 B.marginatum Wall.ex DC18.大葉柴胡 B.1ongiradiatum Turcz19.青海柴胡 B.qinghaiense Y.Li et Guo sp.nov.
樣品制備
分別取上述19種植物樣品粗粉各300克，以水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，然后配成1％乙醚溶液備用。
儀器及色譜條件
儀器GC-R1A[日本-島津]
色譜條件色譜柱Chromosorb W AW DMCS 10％PEG-20M；
柱溫 170c 進(jìn)樣溫度 220c
載氣 N2 40ml/min檢測(cè)器 FID
靈敏度 1 衰減 2
進(jìn)樣量 0.5微升分析時(shí)間 60min
定量方法 面積歸一化法
氣相色譜相對(duì)保留值指紋譜的建立
由于植物揮發(fā)油的組成十分復(fù)雜，色譜峰多而密集，難以插入一個(gè)合適的外參照物。為此，本研究采用內(nèi)參照物，選擇一個(gè)在19個(gè)揮發(fā)油樣品中均存在的成分作為內(nèi)參照烽，它的出峰時(shí)間接近中心出峰時(shí)間，又與鄰近組分能較好地分離，且有一定的峰面積。按前面章節(jié)所介紹的方法對(duì)各樣品中之待定內(nèi)參照峰進(jìn)行定位，即在19個(gè)樣品中分別加入相同的標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)樣分析，由所得色譜數(shù)據(jù)求出各樣品中待定位內(nèi)參照峰與加入標(biāo)淮品的相對(duì)保留值，核對(duì)各樣品的α值使它們的內(nèi)參照峰獲得正確定位，保證所有的樣品色譜指紋譜均建立在統(tǒng)一內(nèi)標(biāo)峰的基礎(chǔ)上，大大增強(qiáng)了它們間的可比性。在建立色譜指紋譜時(shí)，首先將各色譜峰的相對(duì)保留值按大小依次排隊(duì)，并在每個(gè)α值項(xiàng)下標(biāo)出該色譜峰所對(duì)應(yīng)的相對(duì)百分含量。隨即得到某樣品的GC-相對(duì)保留值指紋譜，見表3。
表3 GC-FPS of species of Bupleurum genus
表3 GC-FPS of species of Bupleurum genuscontinued
表3 GC-FPS of specieS of Bupleurum genus continued
由表3所列數(shù)據(jù)可看到許多有意義的情況。首先，19個(gè)樣品所顯示的色譜峰是有差異的，其中有的僅為少數(shù)樣品所共有，甚至僅為某個(gè)樣品所獨(dú)有。當(dāng)然，其中也有為18或19個(gè)樣品所共有的，顯示了柴胡屬或某個(gè)品種植物的特征。
指紋譜的各項(xiàng)參數(shù)
重疊率 以北柴胡的指紋譜為基準(zhǔn)，將北柴胡出峰數(shù)與欲對(duì)比樣品出峰數(shù)之和作為分母，兩者相互共有峰數(shù)之兩倍作分子，以此分別求出18種柴胡屬植物揮發(fā)油色譜峰的重疊率，見表4。由表列數(shù)據(jù)可知，一般柴胡屬植物的重疊率均低于70％，僅14號(hào)，16號(hào)，18號(hào)，19號(hào)四個(gè)樣品超過70％。因此需格外關(guān)注這四個(gè)樣品的其它指紋譜參數(shù)。
表4 柴胡屬植物與北柴胡的重疊率樣品序號(hào)重疊率序號(hào)重疊率 樣品序號(hào) 重疊率256.3 8 59.4 14 78.3364.5 9 48.5 15 61.3459.6 10 59.4 16 74562.5 11 68.6 17 62.7663.5 12 50.8 18 75.8766.7 13 58.6 19 74.2
八強(qiáng)峰綜合各樣品的出峰情況，出峰總數(shù)為68，大部分樣品的出峰數(shù)在32個(gè)左右，其中有兩個(gè)樣品的差異較大，小葉黑柴胡出峰多達(dá)41個(gè)，馬爾康柴胡最少，僅26個(gè)。因此在決定n強(qiáng)峰時(shí)，規(guī)定n＝8?，F(xiàn)將19個(gè)樣品的八強(qiáng)峰情況列表于下。
表5 柴胡屬19個(gè)樣品的八強(qiáng)峰產(chǎn)品1 234 5 6 7 8序號(hào)％ α％α％α ％α ％α％ α ％α ％α 1 21.6 1.00 14.6 .660 5.72 .535 5.21 .715 5.14 1.44 5.08 1.80 4.12 .1953.51 .274 2 18.4 .066 10.9 .660 8.30 .222 7.80 .184 5.40 .057 4.30 1.00 3.90 .1303.10 1.44 3 35.2 .052 21.6 .062 5.60 .070 4.40 .173 2.40 .274 1.90 .350 1.75 1.001.70 .291 4 22.6 .660 15.2 .173 9.60 1.00 5.10 .209 4.20 .525 4.20 .366 4.00 .2293.80 .291 5 13.5 .222 7.19 .070 6.13 .057 5.91 1.00 5.70 .066 5.21 2.20 5.02 .1094.90 2.07 6 16.0 1.80 15.0 1.00 6.70 .370 6.40 .229 6.20 .660 3.50 .130 3.20 2.352.90 1.16 7 7.20 1.00 4.80 .222 4.10 .660 3.40 .109 2.30 .070 2.10 .098 2.00 1.801.90 2.35 8 25.0 1.00 6.07 1.44 4.90 .660 4.86 .159 4.84 .370 4.81 1.80 4.40 1.542.58 1.20 9 20.4 1.00 13.8 .660 5.60 .130 5.40 .184 5.20 1.44 5.10 1.80 4.40 1.204.20 .78810 15.4 1.00 11.2 .660 9.85 .184 6.11 .252 4.61 1.80 4.47 .715 3.66 1.303.51 1.2011 9.68 .660 9.22 .788 8.56 1.00 8.06 1.59 4.91 .535 4.75 1.80 4.22 .3703.84 2.0712 21.3 .046 18.7 .070 16.5 .222 5.06 .184 3.39 .118 2.97 .660 2.19 .1302.17 .06213 18.3 .229 13.4 .195 11.0 .370 9.93 1.00 7.22 .660 4.36 .081 3.37 .140 3.19 1.8014 14.8 1.00 13.3 .057 9.19 .252 7.97 .062 7.76 .173 4.15 .046 3.87 .291 3.59 .27415 18.3 1.59 8.60 .350 7.55 2.20 5.67 1.44 5.29 .252 4.74 .118 4.65 .195 4.50 1.8016 21.8 .052 7.87 .062 7.16 .252 6.77 .070 6.32 .046 5.66 1.00 5.41 .173 3.97 .27417 12.2 .081 11.7 .660 10.1 .195 7.57 .046 5.20 1.00 4.92 .229 4.85 .274 3.29 .25218 17.3 .062 12.0 .252 9.66 .274 7.49 .209 6.40 .184 6.09 .195 4.90 .046 4.37 .66019 20.6 .062 12.5 .274 11.7 .052 8.37 .155 6.90 .070 4.90 .310 4.30 .252 3.00 .173
結(jié)果與討論
由于北柴胡的樣品批號(hào)太少，僅一個(gè)，無法從統(tǒng)計(jì)角度得出其特征指紋，只能直接從各樣品與北柴胡的重疊率和八強(qiáng)峰間的比較來判斷它們與北柴胡的相似程度。雖然顯得較粗糙，但還是能說明一定問題。有四個(gè)樣品，14，16，18，19等，它們與北柴胡的重疊率均超過70％，說明它們所含的組分與北柴胡很相似，但從八強(qiáng)峰觀之，則差異較大。說明主要組分的含量有較大差異，因此，在作品種鑒定時(shí)將可據(jù)此給出待鑒樣品非北柴胡的結(jié)淪。以有毒的大葉柴胡[18號(hào)]為例，其重疊率高達(dá)75.8％，其八強(qiáng)峰中有三個(gè)與北柴胡相同，但三者在大葉柴胡的揮發(fā)油總量中僅占20.1％，說明該三個(gè)組分并非是大葉柴胡揮發(fā)油的主成分。八強(qiáng)峰的比較結(jié)果明確顯示了兩者間的差異，為鑒定堤供判斷依據(jù)。又，當(dāng)判定青海柴胡為柴胡屬植物的新種時(shí)，單憑外形鑒定感到困難，色譜指紋譜將為此堤供必要的證明。青海柴胡雖有高達(dá)74.2％的重疊率，但在八強(qiáng)峰的比較中僅一個(gè)與北柴胡相同，其量僅為12.5％，據(jù)此判斷青海柴胡為柴胡屬植物的一個(gè)新種。
表3的指紋譜還提供了各色譜峰在19個(gè)樣品中的出現(xiàn)情況，其中α值為0.66和1.00兩個(gè)色譜峰系19種植物揮發(fā)油所共有的組分，α值為1.44和1.80兩個(gè)色譜峰為18個(gè)樣品所共有，α值為0.13色譜峰為17種樣品所共有，α值為0.070，0.788，和2.07三個(gè)色譜峰系16種樣品所共有。這些色譜峰可以考慮作為柴胡屬植物揮發(fā)油的特征峰，并可認(rèn)作柴胡屬植物的特征指紋。至於北柴胡的特征指紋必須從多個(gè)批號(hào)的樣品獲得[見下節(jié)內(nèi)容]。但此處所得結(jié)倫與以下章節(jié)內(nèi)容也是相互呼應(yīng)的。
柴胡屬植物的HPLC相對(duì)保留值指紋譜研究
本研究在上海醫(yī)科大學(xué)生藥教研室的支持配合下，提供了十九個(gè)不同產(chǎn)地的北柴胡和柴胡屬二十五個(gè)品種共四十五個(gè)樣品，為研究工作的開展創(chuàng)造了不可多得的機(jī)會(huì)，在此再次向潘勝利教授表示深深的感謝和由衷的敬意。下列各樣品不僅給出了它們的學(xué)名，并標(biāo)出了它們的產(chǎn)地。特別是十九個(gè)不同產(chǎn)地的北柴胡樣品形成了不同批號(hào)的樣品，為北柴胡的指紋譜研究提供了極好的機(jī)會(huì)，使北柴胡樣品的色譜指紋譜具有統(tǒng)計(jì)意義，并大大增強(qiáng)了特征指紋的適應(yīng)性，實(shí)用性，代表性。其它的柴胡屬植物樣品，例如窄竹葉柴胡有來自五個(gè)產(chǎn)地的樣品，銀州柴胡有來自四個(gè)產(chǎn)地的樣品，線葉柴胡有來自三個(gè)產(chǎn)地的樣品，紅柴胡[窄葉柴胡]有來自三個(gè)產(chǎn)地的樣品，小葉黑柴胡有來自八個(gè)產(chǎn)地的樣品，多枝柴胡和錐葉柴胡也各有二個(gè)產(chǎn)地的樣品。這為同品種不同產(chǎn)地的樣品間的比較提供了可能，也為今后建立GMP基地提供重要的信息和選擇產(chǎn)地的依據(jù)?，F(xiàn)將各樣品按不同品種分列于下
柴胡屬植物樣品
1.北柴胡B.chinese D C共十九個(gè)樣品編號(hào) 1 31 32 33 34 35產(chǎn)地 石家莊福州 泉州西安廈門 洛陰編號(hào) 3637 38 39 40 41產(chǎn)地 天津 沈陽 慶安贊皇鄭州 高安編號(hào) 4243 44 45 46 47產(chǎn)地 萍鄉(xiāng) 承德 武漢阜陽太原 南寧編號(hào) 48產(chǎn)地 臨安
2.窄竹葉柴胡B.marginatum var.stenophyllum共五個(gè)樣品編號(hào)14 55 56 57 58產(chǎn)地會(huì)澤廣州電白南寧柳州
3.銀州柴胡B.yinchowense共四個(gè)樣品編號(hào)4 27 59 60產(chǎn)地吳中合水黑水鎮(zhèn)寧
4.線葉柴胡B.angustissimum共三個(gè)樣品編號(hào)3 28 64產(chǎn)地固陽包頭禮縣
5.狹葉柴胡[紅柴胡]B.scorzonerifolium共三個(gè)樣品編號(hào)8 62 63產(chǎn)地天津金華承德
6.錐葉柴胡B.bicaule共二個(gè)樣品編號(hào)5 65產(chǎn)地錫林浩特 錐葉
7.多枝柴胡B.polyclomum共二個(gè)樣品編號(hào)11 61產(chǎn)地會(huì)澤多枝
8.小葉黑柴胡B.smithii var.parvifolium編號(hào)6 29 49 50 51 52產(chǎn)地同仁榆中榆中包頭同仁銀川編號(hào)53 54產(chǎn)地玉山天祝
9.其他不同品種柴胡共十八個(gè)樣品編號(hào) 樣品品種產(chǎn)地2大葉柴胡B.longiradiatum 通化7黑柴胡B.smithii 沈陽9阿爾泰柴胡 烏魯木齊10 四川柴胡B.sIchuanense 汶川12 韭葉柴胡B.kunmIngense 昆明13 瀘西柴胡B.luxiense 建水15 川滇柴胡B.candollei 會(huì)澤16 柴首柴胡B.chaishoui 汶川17 空心柴胡B.longicaule var畢節(jié)
franchetii18 汶川柴胡B.wenchuanense 汶川19 麗江柴胡B.rockii麗江20 細(xì)莖有柄柴胡B.petiolulatum 麗江
var.tenerum21 小柴胡B.hamiltonii 昆明22 矮小柴胡昆明23 馬爾康柴胡B.malconense 汶川24 黃花鴨跖柴胡B.commelynoideum
var.flavifloum湟中 湟中25 三島柴胡B.falacatum 日本26 韓國柴胡韓國
標(biāo)品與試劑
標(biāo)準(zhǔn)品 柴胡皂甙A，C，D[簡寫為Ssa，SSc，SSd]購自中國藥
品生物制品檢定所
試劑 甲醇，乙晴[以上均為色譜純?cè)噭，呲啶，氨水[以上均
為A.R.級(jí)試劑]，重蒸水
標(biāo)品與樣品液的制備
柴胡皂甙單體標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
準(zhǔn)確稱取柴胡皂甙A，C，D標(biāo)準(zhǔn)品各約1mg，用甲醇溶解后分別置于1ml容量并中，定容至刻度。
柴胡皂甙混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
準(zhǔn)確稱取柴胡皂甙A，C，D標(biāo)準(zhǔn)品5.10mg，5.15mg，5.255mg，用甲醇溶解后置于5ml容量瓶中，定容至刻度。
柴胡樣品溶液的制備
分別取各編號(hào)已干燥的柴胡樣品適量，粉碎，過20目篩。準(zhǔn)確稱取各樣品粗粉0.25mg，置10ml容量瓶中，加5％氨水-甲醇溶液8ml，潤濕0.5小時(shí)，定容至10ml，密閉，超聲提取1小時(shí)。離心，取上清液8ml，室溫?fù)]干，加適量甲醇溶液，移入2ml容量瓶內(nèi)，定容至刻度。臨用前過0.45微米濾膜，作進(jìn)樣溶液。
儀器與色譜條件
儀 器 高效液相色譜儀PERKIN ELMER[series 200
LCpump，DAD235C]，超聲波器，離心機(jī)。
色譜條件 色譜柱 LUNA C-18[2] 250mm-4.6mm 5微米
流動(dòng)相 乙睛-水 梯度洗脫，梯度變化見下表
時(shí)間[min] 010 1530 4055
乙睛％ 525 2840 6080
UV檢測(cè)波長 210nm 柱溫 室溫[25c]
靈敏度 0.2AUFS 流速 1ml/min
進(jìn)樣量 20微升
不同產(chǎn)地北柴胡HPLC相對(duì)保留值指紋譜的建立
按上述實(shí)驗(yàn)條件對(duì)各樣品進(jìn)樣分析，得到它們的色譜圖和相應(yīng)的數(shù)據(jù)，根據(jù)前述的指紋譜原理建立各樣品的色譜指紋譜。首先要做的工作是對(duì)各樣品中的內(nèi)標(biāo)峰進(jìn)行定位，接著求取各樣品中每個(gè)色譜峰的相對(duì)保留值，以大小為序排列，然后附上各色譜峰相對(duì)應(yīng)的相對(duì)面積值或歸一化面積值，即得各樣品的相對(duì)保留值指紋譜?，F(xiàn)將十九個(gè)不同產(chǎn)地的北柴胡樣品的指紋譜匯集于表6。不同產(chǎn)地北柴胡指紋譜的各項(xiàng)參數(shù)
根據(jù)前述定義建立不同產(chǎn)地北柴胡指紋譜的各項(xiàng)參數(shù)，分述如下
共有峰在十九個(gè)樣品中全可檢測(cè)到的色譜峰，它們的α值分別為0.123，0.821，1.000和1.204等四個(gè)，在十八個(gè)樣品中可檢測(cè)到的有α值為0.284，0.309，0.350等三個(gè)，在十七個(gè)樣品中可檢測(cè)到的有α值為0.039，0.050，0.400，0.420，0.475，0.513，0.676和0.859等八個(gè)，在十六個(gè)樣品中可檢測(cè)到的有α值為1.063，0.708和0.456等三個(gè)，在十五個(gè)樣品中可檢測(cè)到的有α值為0.088，0.244，0.388，0.572，0.604和0.761等六個(gè)，由于十五個(gè)樣品已占樣品數(shù)的78.9％，因此以上各α值的色譜峰在大多數(shù)樣品中具有較高的出現(xiàn)機(jī)率，這些色譜峰對(duì)北柴胡的品種鑒定具有特別重要的意義，為北柴胡特征指紋的選擇和確定提供依據(jù)。
重疊率 此處的樣品均為同品種的北柴胡，只是產(chǎn)地不同，很難判定以何者做基準(zhǔn)，暫以柴胡皂甙A，C，D含量較高的48號(hào)樣品為基準(zhǔn)，計(jì)算北柴胡不同產(chǎn)地各樣品與48號(hào)樣品間的重疊率。見表6。
表6不同產(chǎn)地北柴胡的HPLC-FPS
continued
十強(qiáng)峰 根據(jù)各樣品的出峰數(shù)在36-49個(gè)之間，在選擇n強(qiáng)峰時(shí)，認(rèn)為以n＝10為宜?，F(xiàn)從各樣品的指紋譜中選出含量較高的前十個(gè)色譜峰，列于表7。
表7 不同產(chǎn)地北柴胡樣品的十強(qiáng)峰
特征指紋綜合共有峰和十強(qiáng)峰所提供的信息，可從中挑選合適的色譜峰作為特征指紋。十九個(gè)樣品合計(jì)共出峰76個(gè)?，F(xiàn)按下列三個(gè)條件進(jìn)行初選，共有樣品數(shù)超過十五個(gè)者，凡進(jìn)入十強(qiáng)峰者，具有特殊活性和具有標(biāo)準(zhǔn)品者。按此要求列出特征指紋初選表，見表8。
表8 特征指紋初選表
α 十強(qiáng)峰中出現(xiàn)頻次/十強(qiáng)峰中排列名次共有樣品數(shù)
.0392/8、1/9、 1/6 17
.0703/1、、3/2、2/3、2/4、1/5、2/9、1/1017
.0553/2、1/710
.0748/1、2/210
.0842/2、1/5 5
.0885/2、6/3、2/4、1/8 15
.1231/1019
.2301/3 8
.2731/4 9
.2841/6、2/8、1/9、1/10 18
.3091/6、2/7、3/8、2/9、1/1018
.3261/1、1/3、 14
.3502/3、3/4、3/6、1/7、2/8、1/918
.3671/2、2/3、1/5、1/8、1/9、1/10 14
.3721/5、1/6、1/78
.3881/3、2/5、2/7、2/9 15
.4002/6、3/7、1/8 17
.4201/2、1/6、3/7、2/9、1/1017
.4342/4、1/710
.4431/3、2/4、1/5、1/6、2/7、1/10 14
.4561/6、1/9、3/10 16
.4662/7、6
.4751/4、1/5、1/6、1/8、2/1017
.4941/9 11
.5041/6 13
.5133/5、1/817
.5371/8、1/10 14
.5561/6、2/811
.6041/1015
.6761/9 17
.7081/6 16
.7411/1013
.7731/7 15
.821 1/1019
1.0001/2、3/3、1/4、3/5、1/6、1/8、2/9 19
1.0631/4、1/516
1.2044/4、2/5、2/6、1/7、1/8、1/9、2/10 19
表8說明有37個(gè)色譜峰進(jìn)入特征指紋的初選行列。對(duì)此再作進(jìn)一步挑選，那些在十強(qiáng)峰中出現(xiàn)頻次不高者，或名次靠后者，或共有樣品數(shù)較低者可作進(jìn)一步篩除。例如α值為0.070者在十強(qiáng)峰中出現(xiàn)的頻次僅為4，樣品共有數(shù)也僅達(dá)10個(gè)；α值為0.084者，在十強(qiáng)峰中出現(xiàn)的頻次為3，樣品共有數(shù)為5個(gè)；α值為0.230，0.273，0.372，0.434，0.466，0.494，0.504，0.741，0.773等色譜峰均因上述相同原因而被刪除。有些色譜峰雖在十強(qiáng)峰中出現(xiàn)頻次較低，甚至根本就沒列入過十強(qiáng)峰，但它是許多樣品所共有，例如α值為0.244，0.572，0.761和0.859者，均因它們的樣品共有數(shù)達(dá)到或超過15而被入選特征指紋。另，三個(gè)已知成分，并具有其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品者，柴胡皂甙A，C，D均被選入特征指紋。現(xiàn)將三十個(gè)特征指紋列表于下
表9北柴胡的特征指紋α 十強(qiáng)峰出現(xiàn)頻次 樣品共有數(shù) α 十強(qiáng)峰出現(xiàn)頻次樣品共有數(shù).039 4 17.456516.055 14 17.475617.074 10 10.513417.088 14 15.537214.123 1 19.556311.244 0 15.572015.284 5 18.604115.309 9 18.676117.326 2 14.708116.350 12 18.761015.367 7 14.821119.388 7 15.859017.400 6 171.000 1219.420 8 171.063 216.443 8 141.204 1319
表9是根據(jù)十九個(gè)不同產(chǎn)地北柴胡的指紋譜綜合而得，具有一定的統(tǒng)計(jì)意義，是北柴胡在鑒定時(shí)可于依賴的特征。北柴胡樣品幾乎遍及東西南北中，表明全國各地都有北柴胡資源。因而有關(guān)北柴胡的質(zhì)控和質(zhì)標(biāo)工作已為燃眉之事。
表10列出了十九個(gè)不同產(chǎn)地北柴胡的特征指紋檢出情況，在30個(gè)特征指紋中，石家莊[1]，福州[31]，天津[36]和高安[41]產(chǎn)的北柴胡可檢出23個(gè)特征指紋，是各樣品中檢出最少的。檢出數(shù)最高的是西安[33]產(chǎn)北柴胡，共檢出29個(gè)特征指紋，沈陽[37]，太原[46]，二地所產(chǎn)北柴胡均可檢出28個(gè)特征指紋，廈門[34]，鄭州[40]和臨安[48]，三地所產(chǎn)的均可檢出27個(gè)特征指紋，承德[43]和贊皇[39]均可檢出26個(gè)特征指紋，洛陽[35]，阜陽[45]和南寧[47]三地所產(chǎn)的也均可檢出25個(gè)特征指紋。它們的特征指紋檢出率在76.6％-96.6％的范圍內(nèi)，這些數(shù)據(jù)為北柴胡品種的鑒定提供了判斷的依據(jù)?，F(xiàn)以上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，建議凡特征指紋檢出率大于75％時(shí)，應(yīng)考慮待鑒藥材是北柴胡。另，上表清楚顯示，有四個(gè)成分在十九個(gè)北柴胡樣品中均存在，它們的α值分別為0.123，0.821，1.000和1.204，后三個(gè)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品核對(duì)分別是柴胡皂甙C，柴胡皂甙A和柴胡皂甙D，它們是北柴胡品種必定具有的成分，也即是鑒定中必須檢出的成分。
表10 不同產(chǎn)地北柴胡樣品的特征指紋檢出表.\編號(hào)131 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 共有數(shù)0.039 VVV V V VVVVVVVVVVVV 170.055 VVV V V VVVVVVVVVVVV 170.074 V V V V V V VV V V 100.088 VVVV V VVVV VVVVVV 150.123 VVVV V V V VVVVVVVVVVVV 190.244V V V V VVVVVVV VVVV 150.284 VVVV V V VVVVVVVVVVVV 180.309 VVVV V V V VVVVVVVVVVVV 180.326 VV V V VVVVVVV VVV 150.350 VVVV V V VVVVVVVVVVVV 180.367 V V V V VVVVV VV VVV 140.388 VV V V V VVVVVVV VV V 150.400 VVVV V V VVVVVV VVVVV 170.420 VVVV V V V VV VVVV VVVV 170.443 V VV V V VV V VVVVV V 140.456 VVVV V V V VVVVVV VVV 160.475 V VV V V VVVVVVVVVVVV 170.513 VV V V V V VVVVVVV VVVV 170.537 VVVV V V V VVVV V V V 140.556V V V VVV VVVVV 110.572 VVVV V V V V V V VVVV V 150.604 VVVV V V V VV V VV VVV 150.676 VVVV V V V VVVV VVV VVV 170.708 VV V V V VVV VVVVVVVV 160.761 V VV V V V V VV VVVVV V 150.821 VVVV V V V VVVVVVVVVVVV 190.859 VVVV V VVVVVVVVVVVV 171.000 VVVV V V V VVVVVVVVVVVV 191.063 VVV V V V VVV VVVVVVV 161.204 VVVV V V V VVVVVVVVVVVV 19檢出數(shù)23 23 23 29 27 25 24 28 25 26 27 24 25 26 23 24 28 25 27
在上述十九個(gè)北柴胡樣品色譜指紋譜分析的基礎(chǔ)上，建立了一系列可供鑒定分析作依據(jù)的指紋譜參數(shù)，其中特征指紋，特征指紋差異率和總差異率為北柴胡的鑒定創(chuàng)立基礎(chǔ)。通過柴胡屬其它26個(gè)品種植物樣品的色譜指紋譜與之比較分析，更進(jìn)一步證明色譜指紋譜用于中藥鑒定是可信的，可行的。
26個(gè)柴胡屬植物樣品的色譜實(shí)驗(yàn)條件，樣品的制備，數(shù)據(jù)的處理等均與北柴胡的完全相同。據(jù)此建立了26個(gè)柴胡屬植物的色譜指紋譜和十強(qiáng)峰等參數(shù)，分別見表11和表12。
表11 不同品種北柴胡的HPLC-FPS
Continued
表12 不同品種北柴胡樣品的十強(qiáng)峰
本研究的目的是北柴胡的鑒別和鑒定，因而以不同產(chǎn)地的北柴胡樣品作為不同批號(hào)的北柴胡樣品，建立了北柴胡的特征指紋，其它柴胡屬植物以其指紋譜與此作對(duì)照，在它們各自的指紋譜中尋找北柴胡的特征指紋，考察特征指紋的檢出率，該項(xiàng)數(shù)據(jù)可為北柴胡的鑒定提供依據(jù)。表13列出了26個(gè)不同品種柴胡屬植物的北柴胡特征指紋檢出表。
表13 不同品種柴胡屬植物的北柴胡特征指紋檢出表.\編號(hào) 2 5 7 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28 48 51 58 59 63 共有數(shù)0.039V VV VV V V V80.055V V V VVV VV VVVVVV VV VVV 190.074VV V V V V VV 40.088V V V V VV VVVVVVVVV VV VV VV210.123V V V V VV VV VVVVVVVVVVVVVVVVV 250.244V V V VVVV V V VVVVVVVVVV 170.248V V VV VVVV V190.309V VVVVVVVV V V V V V 140.326V V V V VV VVVVV VVVVV VVVVV V220.350V V V VV VV V V VVV VV VVV V 190.367V VV V V VVV V VV110.388V V V V VV VV VVVVV V VVV VV 190.400V V V V VV VVVV VVVVVV VVVVVVVV 230.420V VV VVVV VVV VVVV V150.443V V VVVV VV V VVV 120.456V VV V VV V VV VVVVV 140.475V VVV V VVV V VV 40.513V V V VV V V V VV V110.537V V V VVV V V V VVV V V140.556V V V VVVV VVV V VV V 140.572V V V VVV V 70.604V VVVVV VVV V VVVVVVV170.676V V V V VVVV VV VV VVV VVV 180.708V VV V VVV V V VV V 120.761V V VVVVVVV VVVV V140.821V V V V VV VV V VVVV VVV VVVVVV 220.859V V V V VVV V V V VVVV141.000V V V V VV VV VVVVVV VVVVVVVVVV 241.063 V VV V V51.204V V V V VV V VVVVVV VVVVVVVVVV 24檢出數(shù) 18 22 23 21 17 17 19 20 14 21 15 19 18 15 18 12 18 14 12 15 18 26 14 19 24 15檢出率％ 60 73 76 70 56 56 63 66 46 70 50 63 60 50 60 46 40 46 40 50 60 86 46 63 80 50
由表13可知，.值為0.123，0.821，1.000和1.204四個(gè)色譜峰為絕大多數(shù)柴胡屬植物所共有，由此提示，該四個(gè)色譜峰是柴胡屬植物的特征，當(dāng)然，對(duì)北柴胡的鑒定而言，這是必備條件，但并非是完全條件。在與柴胡屬植物色譜指紋譜的比較中將可觀察到兩者的差異，尤其是在特征指紋方面所顯示的差異。雖然在19個(gè)不同產(chǎn)地的北柴胡樣品間也觀察到差異，然而這些個(gè)體差異所產(chǎn)生的特征指紋差異是較小的，它們的特征指紋檢出率均較高，最高的達(dá)96.6％[一個(gè)樣品]，最低的為76.6％，[四個(gè)樣品]，其余均在80％-93.3％之間[十四個(gè)樣品]。而對(duì)26個(gè)不同品種的柴胡屬植物樣品以北柴胡的特征指紋作檢測(cè)時(shí)，檢出率明顯降低，與北柴胡的相比有顯著性差異。柴胡屬植物中檢出率最低者僅為36.6％[一個(gè)樣品]，46.6％-43.3％者有三個(gè)樣品，50％-56.6％者有七個(gè)樣品，60％-66.6％者有七個(gè)樣品，70％-76.6％者有六個(gè)樣品，80％-86.6％者有一個(gè)樣品，達(dá)90％者有一個(gè)樣品.若以75％為界，則有23個(gè)樣品低于此線，僅三個(gè)樣品高于此界限，其中48號(hào)為北柴胡，另二個(gè)分別為7號(hào)樣品黑柴胡和59號(hào)樣品銀州柴胡。說明這二個(gè)不同品種的柴胡在其內(nèi)在特性，化學(xué)成分方面，與北柴胡較相似。以上特征指紋的檢識(shí)只是從各樣品所含化學(xué)成分的角度進(jìn)行了比較，至于有關(guān)各成分的含量情況則尚需通過其它參數(shù)于以說明。
差異率正如前文所述，差異率是一綜合性的參數(shù)，它將每個(gè)特征指紋的檢出及其含量狀況[歸一化面積值]結(jié)合起來，并形成一個(gè)可供比較的數(shù)據(jù)，使北柴胡的鑒定能同時(shí)兼顧質(zhì)和量兩個(gè)方面?，F(xiàn)將其具體運(yùn)作述于下。
首先以19個(gè)北柴胡樣品的色譜指紋譜為基礎(chǔ)，各樣品均以柴胡皂甙A的面積值為基準(zhǔn)，計(jì)算每個(gè)特征指紋的面積歸一化值，列入各自的指紋譜。其次，對(duì)19個(gè)樣品中個(gè)相對(duì)應(yīng)的特征指紋面積歸一化值求其均值，得X均值。見表14。
表14 北柴胡樣品特征指紋面積歸一化值[N值]及其均值
X均值從統(tǒng)計(jì)的角度反映各個(gè)特征指紋在樣品中存在量的平均狀況，由于它在各樣品中均以同一成分作基準(zhǔn)，所得之比值反映了它們?cè)诟髯詷悠分械暮勘壤?，為各樣品相互間的比較奠定基礎(chǔ)，并可據(jù)此求取各樣品的差異率，差異率的計(jì)算見下式。
X均值-Xi 差異率
差異率＝ 總差異率＝
X均值 N
X均值 每個(gè)特征指紋的面積歸一化值的平均值[19個(gè)北柴胡樣
品的均值]
Xi 各樣品中相應(yīng)特征指紋的面積歸一化值
N 北柴胡的特征指紋數(shù)，現(xiàn)為30
按上述操作，也可得到26個(gè)柴胡屬植物樣品中各個(gè)特征指紋的面積歸一化值，及其相應(yīng)的差異率.這些數(shù)據(jù)顯示了各個(gè)特征指紋與均值間的差異，是待鑒樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品間產(chǎn)生差異的根本所在。因而對(duì)所有特征指紋的差異進(jìn)行求和，然后除以特征指紋數(shù)即得待鑒樣品與標(biāo)準(zhǔn)藥材[此處為19個(gè)北柴胡樣品的均值]間的總差異率。為清楚地說明北柴胡和柴胡屬植物間特征指紋的比較情況，將所有45個(gè)樣品的特征指紋檢出率和總差異率列于表15。
表15 北柴胡和柴胡屬植物樣品的特征指紋檢出率％和總差異率％
現(xiàn)對(duì)上表內(nèi)容作下列探討
1.北柴胡與柴胡屬植物間，在總差異率方面有明顯的不同，北柴胡有19個(gè)不同產(chǎn)地的樣品，但它們的總差異率在0.367-0.865之間，其中有兩個(gè)樣品[32號(hào)和45號(hào)]的總差異率大于0.600，占樣品總數(shù)的10.5％。在柴胡屬植物的26個(gè)樣品中有22個(gè)的總差異率超過此值。因此在北柴胡與柴胡屬中其它品種的藥材間的區(qū)分與鑒定時(shí)，特征指紋的總差異率作為考察的首要條件，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建議暫定為小于0.600。
2.對(duì)于北柴胡和柴胡屬植物樣品中所出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象作如下檢討。
北柴胡中的32號(hào)[泉州產(chǎn)]和45[阜陽產(chǎn)]兩個(gè)樣品的總差異率分別為0.664和0.865均已超過0.600的界線，但兩者的特征指紋檢出率卻分別高達(dá)76.6％和80％，是符合北柴胡鑒定所要求的。對(duì)此相互矛盾的情況如何解釋.對(duì)此可仔細(xì)分析兩者特征指紋的面積歸一化值，32號(hào)樣品有九個(gè)特征指紋的面積歸一化值超過1，其中有的高達(dá)3.18，2.04和2.29。45號(hào)樣品則有十一個(gè)特征指紋的面積歸一化值超過1，其中有高達(dá)5.27，4.00，3.13，2.89和2.61者，顯然這是導(dǎo)致它們總差異率較高的基本原因，同時(shí)也反映了這兩個(gè)北柴胡中所含成分是合格的，但在成分的含量比例方面存在較大差異，建議臨床用藥遇到這類北柴胡藥材時(shí)要慎重，尤其對(duì)用藥劑量的大小要多加小心。柴胡屬植物中有四個(gè)樣品9號(hào)[阿爾泰柴胡]，13號(hào)[瀘西柴胡]，48號(hào)[北柴胡]，59號(hào)[銀州柴胡]，它們的總差異率均低于0.600。其中48號(hào)是北柴胡屬正常情況。9號(hào)和13號(hào)兩者的特征指紋檢出率均為70％，該值低于擬定的特征指紋檢出率界線76％，隨即可排除在北柴胡品種之外。59號(hào)的特征指紋鑒出率為80％，高于上述界線，它的十強(qiáng)峰有九個(gè)都被收入特征指紋之列。以上各項(xiàng)參數(shù)均說明59號(hào)樣品與北柴胡極相似，從色譜指紋譜的角度而言，有可能被定為北柴胡，因而被誤作藥用。但從另方面來看，銀州柴胡有可能被納入藥用，擴(kuò)大柴胡屬藥用植物的范圍。當(dāng)然，要達(dá)到此目的尚需做大量的藥理，藥效，毒理等實(shí)驗(yàn)，以保證用藥安全有效。另，值得注意同被藥典收載的柴胡屬植物窄葉柴胡[紅柴胡B.scorzonerifolium]，其特征指紋檢出率50％，總差異率0.668，說明它與北柴胡有明顯的差別，對(duì)此應(yīng)引起注意。
3.現(xiàn)將上述整個(gè)指紋譜鑒定過程歸納為下列幾個(gè)步驟
首先是建立各樣品的色譜指紋譜，對(duì)這項(xiàng)工作應(yīng)特別指出的是作為標(biāo)準(zhǔn)藥材的品種，產(chǎn)地，批號(hào)等各項(xiàng)內(nèi)容都應(yīng)標(biāo)明，且必須有一定 的樣本數(shù)，以減少生物樣品個(gè)體差異所致的影響。當(dāng)然，對(duì)于飲片，制劑，成藥一類樣品，除應(yīng)保證一定數(shù)量的樣本外，更要注意最終產(chǎn)品，中間品和原料藥材間的一致性。
其次是共有峰，重疊率，n強(qiáng)峰，特征指紋，特征指紋檢出率，特征指紋差異率和總差異率等。前三項(xiàng)是產(chǎn)生各項(xiàng)參數(shù)的依據(jù)，應(yīng)予特別注意。至于重疊率，在具有明確的標(biāo)準(zhǔn)藥材時(shí)，或在無法獲得具統(tǒng)計(jì)意義的樣本數(shù)時(shí)，它還是一個(gè)頗具實(shí)用價(jià)值的參數(shù)。因?yàn)樗忍卣髦讣y所反映的化學(xué)成分狀況更全面而充份，在中藥如此復(fù)雜的情況下會(huì)有其特定的意義。例如將樣品的選擇限定在一個(gè)極小的范圍內(nèi)時(shí)，它的作用將比特征指紋更具實(shí)用意義。
當(dāng)獲得上述各項(xiàng)參數(shù)后，首先考察待鑒樣品的特征指紋檢出率和總差異率，針對(duì)該兩項(xiàng)指標(biāo)可能出現(xiàn)的情況作出判斷，一是兩項(xiàng)指標(biāo)全部符合鑒定要求，二是兩項(xiàng)指標(biāo)均不符合鑒定要求，三是只有一項(xiàng)符合鑒定要求。前二種情況給出的結(jié)論是明確的，前者為合格，后者為不合格，對(duì)第三種情況則需作進(jìn)一步探討。若為特征指紋檢出率不合格，表明該樣品在化學(xué)成分方面存在較大差異，其總差異率之所以合格，可能是在各特征指紋求取總差異率的過程中被平均化了..若為一般的平均化且總差異率相差在0.1范圍內(nèi)，可以考慮給出合格鑒定..若為既有嚴(yán)重特征指紋檢出率差異，其特征指紋總差異率雖相差不大，對(duì)此也應(yīng)給出不合格鑒定。若為總差異率不合格，而特征指紋檢出率合格，此時(shí)應(yīng)小心地察看導(dǎo)致總差異率不合格的原因，若為少數(shù)幾個(gè)特征指紋的含量較高所致，則，只要不是特殊的高，且總差異率相差在0.1范圍內(nèi)，可以考慮給出合格鑒定.進(jìn)一步還可考察其n強(qiáng)峰，其中有幾個(gè)被納入特征指紋，若達(dá)90％以上，則應(yīng)考慮給出合格鑒定，若較低，則應(yīng)給出不合格鑒定。
4.在表3和表11中，可清楚地看到，有四個(gè)α值分別為0.123，0.850，1.000和1.204者，幾乎是所有樣品共有的，它們是柴胡屬植物鑒定時(shí)必須檢出的成分.經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，后三個(gè)成分分別是柴胡皂甙D，柴胡皂甙A，柴胡皂甙C，經(jīng)藥效試驗(yàn)證明，它們都是柴胡中的活性成分，且都已有標(biāo)準(zhǔn)品供應(yīng)。實(shí)施例2
淫羊藿屬植物的HPLC指紋譜分析
淫羊藿(Herba Epimedii)是一味常用的補(bǔ)腎壯陽藥，并已成為近年來研究開發(fā)的熱門藥材?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，它不僅對(duì)心腦血管有明顯的藥理作用，而且在抗衰老、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松和免疫調(diào)節(jié)等方面都有明顯的生物活性。
根據(jù)資料所載，我國共有23個(gè)品種的淫羊藿屬植物，另有4個(gè)為其變種。本研究收集得8種淫羊藿，其中5種為我國藥典收載作藥用，包括不同產(chǎn)地和不同部位共23個(gè)樣品，采用HPLC法作其指紋譜研究，以期能為淫羊藿植物的區(qū)分和鑒定提供切實(shí)可行的方法，并為建立藥用淫羊藿植物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。儀器和材料
PE 1022 LCPLDUS色譜工作站，PE 235C DAD DETECTOR紫外檢測(cè)器，PE SERDIES 200 LC PUMP泵(美國PE公司)，MD100-1型電子天平(上海天平儀器廠)，80-1型離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)，一次性有機(jī)溶劑微孔濾膜過濾(0.45μm，上海中惠公司)。
乙腈(色譜純，上海星獅生物工程有限公司)，甲醇(分析純，上海振興化工一廠)，冰乙酸(分析純，上海試劑四廠)。
淫羊藿甙標(biāo)準(zhǔn)品(含量測(cè)定用，中國藥品與生物制品檢定所)。
樣品由上海醫(yī)科大學(xué)施大文教授鑒定并提供樣品號(hào) 名稱 部位 來源1 黔嶺淫羊藿(Epimedium leptorrhizum)葉貴州黔嶺山2 黔嶺淫羊藿(Epimedium leptorrhizum)葉上海市藥材公司3 黔嶺淫羊藿(Epimedium leptorrhizum)莖貴州黔嶺山4 巫山淫羊藿(E.Wushanense) 葉莖 貴州5 巫山淫羊藿(E.wushanense) 根陜西安康6 巫山淫羊藿(E.wushanense) 莖陜西安康7 巫山淫羊藿(E.wushanense) 葉陜西安康8 箭葉淫羊藿(E.sagittatum) 莖陜西安康9 箭葉淫羊藿(E.sagittatum) 葉陜西安康10 箭葉淫羊藿(E.sagittatum) 葉安徽11 箭葉淫羊藿(E.sagittatum) 莖安徽12 箭葉淫羊藿(E.sagittatum) 葉莖 廣西靈山13 寶興淫羊藿(E.davidii) 葉云南14 寶興淫羊藿(E.davidii) 莖云南15 寶興淫羊藿(E.davidii) 葉莖 湖南16 柔毛淫羊藿(E.pubescens) 莖四川灌縣17 柔毛淫羊藿(E.pubescens) 葉四川灌縣18 朝鮮淫羊藿(E.koreanum)葉河南洛陽19 朝鮮淫羊藿(E.koreanum)葉莖 遼寧20 朝鮮淫羊藿(E.koreanum)葉莖 青海藥檢所21 淫羊藿(E.brevicornum) 葉莖 江蘇無錫22 淫羊藿(E.brevicornum) 葉莖 浙江臨安23 淫羊藿(E.brevicornum) 葉莖 陜西實(shí)驗(yàn)方法
色譜條件
色譜柱PERKIN-ELMER-SH/5 C18(5μm，250mm×4.6mmI.D.)，國產(chǎn)C18預(yù)保護(hù)柱(10μm，40mm×4.6mm I.D.)，檢測(cè)波長A為270nm，B為320nm，流動(dòng)相由A、B兩部分以線性梯度在儀器內(nèi)部的比例閥中混合而成，A為乙腈，B為0.7％乙酸溶液，線形梯度為
0min 10min20min20min
A18％ 22％ 24％ 50％
B82％ 78％ 76％ 50％
淫羊藿甙標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置稱取1.0mg淫羊藿甙標(biāo)準(zhǔn)品，置入10ml容量瓶中，加甲醇超聲使溶解，配成0.10mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
樣品供試液制備
精密取淫羊藿葉、根或莖粉0.085克，置入10ml容量瓶中，加10ml甲醇超聲提取30min，冷卻，定容，離心，上清液經(jīng)0.45μm濾膜濾過，即得。
樣品分析
將23個(gè)淫羊藿樣品制成的供試液，按以上色譜條件進(jìn)樣分析，得各樣品的HPLC圖譜，見圖1-圖23，以及相應(yīng)的DAD信息。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，確定淫羊藿甙峰的位置。
指紋譜分析
相對(duì)保留值指紋譜的建立
上述獲得的23個(gè)樣品的色譜圖及其DAD信息，除了貴州產(chǎn)黔嶺淫羊藿葉與購自上海市藥材公司的黔嶺淫羊藿葉外，在約27分鐘處都有一個(gè)最大λmax、比吸收值ratio相同的共有峰。根據(jù)前述計(jì)算21個(gè)樣品的色譜峰的相對(duì)保留值α，以9號(hào)箭葉淫羊藿葉的總峰面積為分母，根據(jù)相對(duì)面積值計(jì)算式計(jì)算各樣品色譜峰與9號(hào)樣品總色譜峰面積間的相對(duì)RA。然后，以9號(hào)箭葉淫羊藿葉的各峰的α值為基準(zhǔn)，其它樣品色譜峰α值按下列各要求與之相比，首先以1％為窗口范圍對(duì)各α值進(jìn)行比照歸納，合條件者再結(jié)合DAD檢測(cè)信息進(jìn)行考核，凡是α值相同或相近(誤差≤±1％)，最大吸收波長λmax、比吸收值ratio都相等的峰，即可認(rèn)定為同一化合物峰。將各個(gè)樣品每個(gè)峰的RA值列在相應(yīng)的α值項(xiàng)下，某α值項(xiàng)下無相應(yīng)峰的樣品，其RA值記為零。由此得到以下21個(gè)樣品的相對(duì)保留值指紋譜，見表16。
表16 21個(gè)淫羊藿樣品的相對(duì)保留值指紋譜
貴州黔嶺淫羊藿葉與購自上海市藥材公司的黔嶺淫羊藿葉的HPLC圖譜中無選定計(jì)算α值的內(nèi)參照峰，沒有建立其相對(duì)保留值指紋譜。
樣品之間的相似性
將21個(gè)淫羊藿樣品按前述重疊率計(jì)算式計(jì)算兩兩之間的峰重疊率并列表，組成反映樣品間相似性的峰重疊率距陣，只需列出一半即可。見表17。
表17 21淫羊藿樣品HPLC峰重疊率3100428.6 100574.1 36.4 100635.4 16.7 22.2 100746.2 28.6 59.2 35.3 100860.9 33.3 7542.8 78.3 100959.1 4162.2 22.8 59.1 48.7 10010 26.7 2012.5 33.3 26.7 16.7 12.1 10011 53.3 16.7 44.4 2535.3 28.6 22.8 33.3 10012 41.7 31.6 5613.3 5054.5 47.6 30.7 13.3 10013 48.5 42.8 64.7 33.3 66.7 66.7 74.5 18.2 16.7 56.3 10014 2518.2 23.5 28.6 2530.8 11.8 4028.6 28.6 17.4 10015 26.7 2012.5 85.7 37.5 30.8 17.6 4028.6 14.3 26.1 13.3 10016 52.2 33.3 41.7 28.6 43.5 5043.9 33.3 28.6 66.7 6046.2 30.8 10017 68.8 3772.7 34.8 5062.1 721926.1 6082.1 27.3 27.3 62.1 10018 53.8 28.6 81.5 23.5 61.5 69.6 54.5 26.7 47.1 5066.7 2512.5 43.5 62.5 10019 3745.5 57.1 33.3 66.7 58.3 57.8 2511.1 6470.6 35.5 23.5 41.7 6059.3 10020 55.2 41.7 46.7 3048.3 46.2 68.1 22.2 2059.3 502123.5 53.8 51.7 34.5 6010021 51.9 36.4 64.3 22.2 74.1 66.7 62.2 2533.3 6470.6 23.5 11.8 5048.5 66.7 64.3 6010022 604864.5 38.1 8066.7 66.7 2128.6 57.1 75.7 303051.8 66.7 6083.9 58.8 7123 55.2 41.7 603062.1 61.5 63.8 22.2 2066.7 72.2 31.6 21.1 69.2 68.6 46.2 73.3 68.8 73.3
3 4 56 7 8 9 101112131415161718192021
12個(gè)樣品的HPLC六強(qiáng)峰
自21個(gè)樣品中挑選出峰數(shù)達(dá)13或13以上的樣品共12個(gè)，每個(gè)樣品均選出其中峰面積最大的6個(gè)峰排列成表，得21個(gè)樣品的六強(qiáng)峰表。見表18。
表18 淫羊藿樣品的六強(qiáng)峰
特征指紋峰
以上述21個(gè)樣品的六強(qiáng)峰為主體，并結(jié)合它們?cè)?1個(gè)樣品中出現(xiàn)的頻率，選出α值為0.0716、0.496、0.549、0.868、0.939、1.000、1.12、1.42、1.51、1.72和1.88等11個(gè)色譜峰為本文所研究淫羊藿植物的特征指紋?，F(xiàn)將21個(gè)樣品的特征指紋峰檢出情況列于表19中，并列出樣品中淫羊藿甙的含量，以觀察兩者之間的相關(guān)性。
表19 21樣品的特征指紋檢出率及淫羊藿甙的含量
α值 檢出特檢出淫羊藿甙樣品號(hào)
0.072 0.496 0.549 0.868 0.939 11.12 1.42 1.5 1.72 1.88征峰數(shù)率％ 含量％ 3√ √ √ √√ √√√ √9 81.8 0.00367 4√ √√ √√ 5 45.4 0.0753 5 √ √ √ √ √√ √√ √9 54.5 0.0526 6√ √ 2 18.2 0.0287 7√ √ √ √ √ √√ √8 72.7 0.443 8√ √ √ √ √ √√ √√9 81.8 0.0358 9√ √ √ √ √ √√ √√√ √11 100 1.5110 √ √2 18.2 0.035511 √ √2 18.2 0.0077812 √ √√√ √√ √7 63.6 0.33413√ √ √ √ √ √√ √√ √10 90.9 0.56214 √ √ 2 18.2 0.039515√ √ 2 18.2 0.037316√ √ √ √ √√ √7 63.6 0.052117√ √ √ √√√ √√√ √10 90.9 1.5318 √√ √ √√ √√ √8 72.7 0.71719 √ √ √ √√ √√√ √9 81.8 0.37920 √ √ √√ √√√ √8 72.7 0.40521 √ √√ √√ √√7 63.6 0.35822√ √ √ √ √ √√ √√√10 90.9 0.71423√ √ √√ √√ √√√ √10 90.9 0.537共有樣品數(shù)11 14 15 10 11 2115 8 9 11 16
表19充分反映了淫羊藿的內(nèi)在特性，這些特征峰可作為其指紋特征用來區(qū)分淫羊藿，以供藥用。特征指紋和特征指紋的檢出率與淫羊藿甙含量的相關(guān)性將構(gòu)成淫羊藿藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容之一。討論
1.樣品指紋譜之間的相似性。
(1)各種莖葉樣品之間的相似性
中華人民共和國藥典規(guī)定，淫羊藿的藥用部位為地上部分的莖葉，現(xiàn)選擇其中淫羊藿甙含量最高的22號(hào)樣品為基準(zhǔn)，通過與一些莖葉樣品的指紋譜重疊率、特征指紋峰檢出率以及淫羊藿甙含量作比較研究(見表20)，發(fā)現(xiàn)重疊率、檢出率以及淫羊藿甙含量之間呈正相關(guān)關(guān)系。
表20 莖葉樣品之間的相似性樣品編號(hào) 4 121519 20 212223重疊率％ 48 574883.9 58.8 71100 72.7特征指紋峰
45.4 63.6 18.2 81.8 72.7 63.6 90.9 90.9檢出率％淫羊藿甙
0.0753 0.334 0.037 0.379 0.405 0.358 0.714 0.537含量％
4號(hào)雖屬被藥典收載品種，但從上述三項(xiàng)指標(biāo)觀之，不具備入藥的基本條件，而15號(hào)樣品為非藥典收載品種，不作藥用是應(yīng)是理所當(dāng)然的。而三項(xiàng)指標(biāo)均高的19號(hào)和23號(hào)樣品(包括22號(hào))均為藥典收載品種，據(jù)此可判為優(yōu)質(zhì)藥材。而三項(xiàng)指標(biāo)表現(xiàn)一般的12號(hào)、20和21號(hào)三個(gè)樣品，其中12號(hào)系非藥典收載品種，除淫羊藿甙含量合格外，另二項(xiàng)均屬偏低，還是應(yīng)列入不能藥用的范圍，20號(hào)和21號(hào)均為藥典收載品種，但各有一項(xiàng)指標(biāo)偏低，只能認(rèn)可其藥用，但不能列入優(yōu)質(zhì)藥材。
(2)各種葉樣品的質(zhì)量分析
以其中淫羊藿甙含量高的9號(hào)樣品為基準(zhǔn)，與其它的葉樣品作重疊率、特征指紋峰檢出率以及淫羊藿甙含量的比較研究，結(jié)果(見表21)表明三者之間也呈正相關(guān)關(guān)系。
表21 葉樣品之間的相似性
樣品編號(hào) 7 9 10 13 1718
重疊率％ 59.1100 12.1 74.57254.5
特征指紋峰
72.7100 18.2 90.990.9 72.7
檢出率％
淫羊藿甙
0.443 1.510.0355 0.562 1.53 0.717
含量％
其中10號(hào)樣品最為突出，它是安徽產(chǎn)的箭葉淫羊藿，雖屬藥典收載品種，但指標(biāo)均十分低，不僅應(yīng)判為劣質(zhì)藥材，且不能入藥，相同品種但產(chǎn)地不同的9號(hào)樣品(陜西安康產(chǎn))，其三項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)最高。17號(hào)樣品，屬藥典收載品種，三項(xiàng)指標(biāo)也均較高。因此，9號(hào)和17號(hào)可判為優(yōu)質(zhì)藥材，7號(hào)也為陜西產(chǎn)，但品種不同，其三項(xiàng)指標(biāo)一般。上述情況說明品種和產(chǎn)地的重要性，它們都會(huì)對(duì)藥材質(zhì)量產(chǎn)生顯著的影響。18號(hào)和7號(hào)，情況類似，也只能判為一般藥材，13號(hào)藥材是云南產(chǎn)的寶興淫羊藿，系非藥典收載品種，但它的三項(xiàng)指標(biāo)均處合格以上，能否可作藥用，尚需進(jìn)一步作特征指紋的差異率和總差異率考察。
(3)各種莖樣品的質(zhì)量分析
縱觀各種莖樣品中淫羊藿甙的含量，十分低下，從入藥角度考慮，莖是不足取的。因此，莖之間比較已無意義，現(xiàn)取9號(hào)葉樣品與之比較，結(jié)果(見表22)，表明莖與葉相比重疊率普遍低下，且重疊率低的特征指紋峰檢出率也低；充分揭示了莖和葉之間在化合物組成以及甙含量方面有著明顯差異。
表22 莖樣品之間的相似性樣品編號(hào) 36 8 9 1114 16重疊率％ 55.2 22.848.7100 22.8 11.843.9特征指紋峰
81.8 18.281.8100 18.2 18.263.6檢出率％淫羊藿甙
0.00363 0.0287 0.0358 1.51 0.00778 0.0395 0.0521含量％
綜合莖葉、葉和莖的淫羊藿甙含量可知，由于莖中甙的含量十分低下，即使葉有較高的含量，莖葉合用的結(jié)果必然使莖葉中甙的含量降低乃至不符和藥典要求。因此，作者認(rèn)為，為保證淫羊藿的臨床療效，淫羊藿以葉入藥為好。
2.在藥典所收載的五個(gè)淫羊藿品種中，巫山、箭葉、柔毛、朝鮮和淫羊藿等的葉或莖葉，它們的特征指紋檢出率均在72.7％之上，淫羊藿甙的含量也均在0.3％以上。若對(duì)品種、產(chǎn)地、藥用部位等三方面予以綜合考慮，則以陜西安康產(chǎn)的箭葉淫羊藿葉和四川灌縣產(chǎn)的柔毛淫羊藿葉為最佳；若以習(xí)慣藥用部位淫羊藿為地上部分時(shí)，則可考慮浙江臨安和陜西產(chǎn)的淫羊藿莖葉以及青海朝鮮淫羊藿、江蘇無錫淫羊藿、廣西靈山箭葉淫羊藿莖葉。但各種莖葉的淫羊藿甙含量均低于0.72％。由于未獲得19、20、21、22、23等淫羊藿品種的葉，不然，對(duì)單獨(dú)以葉入藥的結(jié)論會(huì)更有說服力和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。從當(dāng)前GAP的要求來看，陜西、浙江、四川等省的有關(guān)地區(qū)應(yīng)是首選的產(chǎn)地，品種則以箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿和淫羊藿為宜，另兩個(gè)品種可考慮從藥典收載品種中除名。
3.數(shù)據(jù)化了的色譜指紋譜可產(chǎn)生一系列的參數(shù)，包括重疊率、n強(qiáng)峰、特征峰群以及特征指紋檢出率等，為鑒定和區(qū)分藥材的品質(zhì)提供了科學(xué)的、客觀的、公正的依據(jù)。它可充分利用色譜分離所提供的大量信息，使中藥材的內(nèi)在特性得以較全面地顯示。進(jìn)一步證明色譜指紋譜對(duì)中藥質(zhì)量分析鑒定十分有效的。本實(shí)驗(yàn)中也存在一些問題，例如樣本數(shù)太小，即樣品批號(hào)太少，使結(jié)論的代表性和公正性受到影響，同時(shí)也因數(shù)據(jù)太少，沒能進(jìn)行特征指紋的差異率和總差異率計(jì)算，這些情況將在以后的實(shí)驗(yàn)中加以彌補(bǔ)。實(shí)施例3
半夏及其炮制品的色譜指紋譜
半夏因其有毒而在臨床上常用其炮制品，能治療痰多咳喘，痰飲眩悸，胸脘痞悶，嘔吐反胃，梅核氣，頭痛等病癥。藥理研究充分證明半夏具有鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)吐、抗癌、利膽，調(diào)節(jié)腸胃，降低眼內(nèi)壓和抑制心臟等作用。最近發(fā)現(xiàn)還具有抗炎、抗早孕的作用。
目前常用炮制品有制半夏、宋半夏、仙半夏、青鹽半夏、竹瀝半夏等。由于其有毒，需進(jìn)行炮制，但在半夏炮制時(shí)也沒有一定的質(zhì)控指標(biāo)，僅憑感覺判別，即麻舌程度，無客觀的科學(xué)依據(jù)。由于依賴主觀判斷所得的結(jié)果造成了質(zhì)控的波動(dòng)，極大地影響了半夏炮制品的質(zhì)量。目前尚未見有關(guān)半夏及其炮制品的質(zhì)控研究報(bào)道，雖有涉及麻黃堿、總生物堿、氨基酸、β-谷甾醇等化合物的含量測(cè)定，但缺乏針對(duì)性和系統(tǒng)性的研究，且上述這些成分也是許多中藥普遍含有的成分，無突出的鑒別意義。因此用色譜指紋譜技術(shù)來分析半夏及其炮制品的質(zhì)量問題，也許會(huì)有所進(jìn)展。
藥品、試劑、儀器
藥材編號(hào) 品名 鑒定者 產(chǎn)地或來源 供應(yīng)者1 生半夏Pinellia ternata
(Thunb.)Breit王志偉 四川 上海養(yǎng)和堂飲片廠
天南星科植物半夏2 生半夏(同上) 王志偉 浙江磐安3 生半夏(同上) 王志偉 四川梁平4 生半夏(同上) 王志偉 信德中藥廠5 制半夏 王志偉 1號(hào)樣品的炮制品 上海養(yǎng)和堂飲片廠6 制半夏 王志偉 3號(hào)樣品的炮制品 上海雷允上飲片廠7 宋半夏 王志偉 1號(hào)樣品的炮制品 上海養(yǎng)和堂飲片廠8 仙半夏 王志偉 1號(hào)樣品的炮制品 上海養(yǎng)和堂飲片廠9 青鹽半夏王志偉1號(hào)樣品的炮制品上海養(yǎng)和堂飲片廠10 竹瀝半夏王志偉1號(hào)樣品的炮制品上海養(yǎng)和堂飲片廠11 制半夏 王志偉4號(hào)樣品的炮制品信德中藥廠
試劑
甲醇(HPLC級(jí))購于中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司，水為重蒸去離子水試劑，乙腈(HPLC級(jí))上海星獅生物有限公司。
色譜條件
色譜儀PERKIN-ELMER series200 Ic pump
色譜柱Inertsil ODS-3(4.6*250 mm 5μm)
檢測(cè)器PERKIN-ELMER DAD 235C
檢測(cè)波長215nm
流動(dòng)相乙腈—水
梯度條件時(shí)間(分鐘)0.2133 14
乙腈(％) 5 157575
流速1mL/min
進(jìn)樣量20μl
樣品制備
分別精密稱取過10目篩的1-11號(hào)樣品粉末各5.000克，置于50ml三角燒瓶中，各加甲醇20ml，以超聲提取45min，然后過濾，濾液濃縮定容至5ml，得樣品1-11號(hào)的進(jìn)樣溶液。
HPLC-FPS的建立
將分析所得色譜數(shù)據(jù)，按前述原則建立十一個(gè)樣品的指紋譜，見表23。十一個(gè)樣品的揩紋譜，以1％為窗口范圍，所有各樣品的相對(duì)保留值經(jīng)歸納后，共計(jì)出峰數(shù)為六十二個(gè)。1號(hào)樣品出峰數(shù)高達(dá)四十八個(gè)，見色譜圖-1，最少的為11號(hào)樣品，僅出峰三十六個(gè)。從整體上看，生品的出峰數(shù)較多，炮制品則較少。表24是以1號(hào)樣品為基準(zhǔn)列出了其它十個(gè)樣品的重疊率。生品的重疊率較高，均在81％以上，而炮制品則在67.4％-73.4％之間。表25是它們的八強(qiáng)峰。
表23 11個(gè)樣品的HPLC-FPS
表24 十種樣品的重疊率(％)
表25 樣品的八強(qiáng)峰
由于個(gè)生半夏樣品均為同一品種，僅產(chǎn)地有所不同，現(xiàn)以四個(gè)生品作為基準(zhǔn)，據(jù)建立生半夏的特征指紋。按要求，首先找出它們的共有峰，有二十八個(gè)色譜峰為四個(gè)生品所共有，十一個(gè)為三個(gè)生品共有，合計(jì)三十九個(gè)色譜峰，它們已全部包含了四個(gè)生品的八強(qiáng)峰。以此作為生品半夏的特征指紋，見表26?，F(xiàn)將各生只和炮制品與其進(jìn)行比較，并展開討論。首先可看到四個(gè)生半夏的檢出率在100-87.2％范圍內(nèi)，可見其檢出率較高，七個(gè)炮制品的檢出率均低于85％，說明半夏經(jīng)炮制后確已發(fā)生了變化。由于各炮制品的生藥來源可能有異，因此在討論炮制品的質(zhì)量時(shí)應(yīng)以各飲片廠所采用的生品與其炮制品間比較為主。
表26 半夏的特征指紋
生品和炮制品的指紋譜分析
首先，根據(jù)共有峰和八強(qiáng)峰提供的信息，有些色譜峰可規(guī)定為半夏所必須具有的色譜峰，如α值為0.867，1.000和0.105，這三色譜峰均列入所有樣品的八強(qiáng)峰，是中藥半夏最為特征的標(biāo)示。再如α值為0.129，0.285，0.775，0.796，0.904，0.919，0.965和1.020個(gè)色譜峰，雖然沒有均列入所有樣品的八強(qiáng)峰，但卻是所有樣品共有的，也應(yīng)作鑒定半夏的必要條件。其它如α值為0.308，0.436，0.513，0.714，0.788，0.805，0.835，1.073等八個(gè)色譜峰是十個(gè)樣品所共有，在半夏鑒定時(shí)，對(duì)這些色譜峰應(yīng)有90％以上的檢出率。因此，不論是生半夏抑或是各種半夏炮制品均應(yīng)達(dá)到上述要求。上述十九個(gè)特征指紋峰在對(duì)某些樣品作進(jìn)一步深入研討時(shí)，有助于給出明確的鑒定結(jié)倫。
其次可對(duì)生品和炮制品作質(zhì)量判別，先由重疊率觀之，生品間的重疊率均在81％以上，它們的特征指紋檢出率也高，均在87％以上，說明了生品間較好的相似性，而炮制品中重疊率最高者(8號(hào))為77.4％，特征指紋檢出率最高者(8號(hào))為84.6％。與其它各炮制品相比，這兩項(xiàng)指標(biāo)均顯得較高，說明8號(hào)樣品與生品間的親密關(guān)系，雖然同時(shí)也說明了它們間的差異。因此，對(duì)這批試樣而言，在作品種判定時(shí)，重疊率可以80％為界，特征指紋檢出率可以85％為界。而8號(hào)樣品則存在炮制不足的問題，值得引起注意。
對(duì)制半夏的質(zhì)量控制，除上述的各項(xiàng)要求外，還應(yīng)考慮下列各點(diǎn)。從各制半夏與其對(duì)應(yīng)的生品之間的指紋譜比較來看，1號(hào)與5號(hào)是一組，它們間的重疊率為73.3％，特征指紋檢出率由100％降至76.9％；3號(hào)與6號(hào)是一組，它們間的重疊率為74.1％，特征指紋檢出率由92.3％降至69.2％；4號(hào)與11號(hào)是一組，它們間的重疊率為76.9％，特征指紋檢出率由87.2％降至71.8％。這三組數(shù)據(jù)反映了生品經(jīng)炮制后所發(fā)生的變化，上述兩項(xiàng)參數(shù)客觀地反應(yīng)了這方面的變化，并可據(jù)此作為控制炮制品的依據(jù)。由此可進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到重疊率是反映了生品和炮制品之間相關(guān)性的重要參數(shù)，如若炮制程度不夠，兩者的重疊率必然很高，反之，若炮制過度，則兩者的重疊率必然很低。而檢出率則更精細(xì)地反映了特征指紋的變化情況，為需作進(jìn)一步深入探討時(shí)提供依據(jù)。此外，在根據(jù)炮制經(jīng)驗(yàn)和臨床用藥的反響和決定最佳的炮制工藝時(shí)，色譜指紋譜將可提供最全面的控制指標(biāo)?，F(xiàn)將色譜指紋譜用于制半夏等炮制品的質(zhì)量鑒定時(shí)所涉及的各項(xiàng)參數(shù)簡要?dú)w納如下
1.特征指紋檢出率
高于64％者，再對(duì)其十一個(gè)必須具有的和八個(gè)可部分檢出的色譜峰進(jìn)行核查。
2.八強(qiáng)峰
α值為0.867者必須進(jìn)入八強(qiáng)峰，并列首位。其余α值為1.000，0.775，0.835者必須進(jìn)入八強(qiáng)峰。
3.生品與炮制品的重疊率
從三組生品與炮制品的重疊而言，它們的重疊率在73.3％-76.9％之間。從檢出率的變化情況看，第一和第二兩組均降低了23.1％，第三組僅降低了10.3％，說明生品經(jīng)炮制后特征指紋發(fā)生了明顯的變化，那些在炮制過程中失去的特征指紋峰應(yīng)該引起注意，限于本研究的樣本數(shù)太少，難以得出有規(guī)律性的意見。但無淪如何這是兩個(gè)反映炮制程度的重要參數(shù)，在進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)批號(hào)的基礎(chǔ)上，將會(huì)得到更客觀、公正的數(shù)據(jù)，為最終獲得控制炮制品的數(shù)據(jù)提供依據(jù)。
附1、2、3、4、5、6、11號(hào)樣品的色譜圖，見圖24-圖30。
對(duì)于有些色譜峰經(jīng)炮制后，含量升高或降低，或消失，或出現(xiàn)新的成分，例如由養(yǎng)和堂的生品與炮制品可見，α值為0.160、0.630、0.782、1.170、1.192、1.211、0.134、0.950、0.211、0.244、0.263、0.467、0.652、1.000、0.308、0.345和0.513等均是生品比炮制品含量高；其中α值為0.160、0.308、0.345和0.513者的變化更是顯著，值得注意研究。而α值為0.805、0.824、1.058、0.775和0.904等均是在炮制品中含量有較明顯升高，其中0.805者尤為顯著，而0.226、0.610則是炮制品中所獨(dú)有。當(dāng)然，由雷允上和信德廠的兩組也可得出各自的相應(yīng)數(shù)據(jù)。因目前的數(shù)據(jù)均屬個(gè)別樣品間的比較，若要給出結(jié)論還需通過更多批號(hào)的樣品來證實(shí)。但應(yīng)看到，這些數(shù)據(jù)反映了炮制前后的變化情況和一些值得注意的變化規(guī)律。
權(quán)利要求
1.一種中藥特征指紋譜的建立，其特征在于該指紋譜的建立包括下列步驟
(1)標(biāo)準(zhǔn)藥材的選取，收集業(yè)經(jīng)生藥鑒定的該品種藥材五個(gè)以上的批號(hào)，能有更多的批號(hào)則更佳，因?yàn)榭紤]到生物樣品的個(gè)體差異，只有在相當(dāng)數(shù)量的樣品中，才能清楚地顯現(xiàn)出它的特征，此時(shí)還需注意中藥樣品批號(hào)的含義，除樣品的產(chǎn)地、采收時(shí)間和季節(jié)，以及藥用部位外，氣侯的影響，儲(chǔ)運(yùn)保管條件以及某些人為因素均應(yīng)顧及，因此樣品批號(hào)宜多不宜少；
(2)規(guī)范化的操作條件和步驟應(yīng)從兩方面的工作于以規(guī)范化，一是樣品的預(yù)處理，生物樣品都需經(jīng)預(yù)處理后方能進(jìn)行色譜分析，預(yù)處理的方法有多種，例如超聲萃取，加熱萃取，pH萃取等各種萃取技術(shù)，二是萃取樣品量的大小和樣品粉碎程度，以及萃取液是否再經(jīng)處理等因素，總之所有樣品處理過程都必須保持一致以保證樣品液的分析具有良好的精密度、正確性、重現(xiàn)性和相互間的可比性；
(3)最佳色譜條件的建立色譜條件包括色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)器等的選擇，要建立良好色譜條件使中藥樣品中所含之成分盡可能地獲得分離，也即分得的色譜峰愈多愈好，可以說是多多益善，使中藥的內(nèi)在特性都顯現(xiàn)出來，為鑒定提供足夠的信息，色譜柱的選擇可根據(jù)中藥所含的主要成分而定，例如含生物堿類化合物為主的中藥，可選用離子交換柱；含多糖類化合物為主的中藥可選用凝膠柱，含甾體類化合物為主的中藥可選用c-18反相柱；......等，流動(dòng)相的組成除應(yīng)考慮化合物的性質(zhì)外，因?yàn)橹兴幩煞侄喽s，采用常規(guī)的等梯度洗脫難以使各種性質(zhì)的成分獲得分離，使色譜圖中所出現(xiàn)的峰數(shù)較少，不能給出足夠的鑒定所需的信息，在大多數(shù)的情況下以采用梯度洗脫為宜，在合適的梯度條件下，使性質(zhì)差異較大的各種化合物均被分離，可充分提供鑒定所需的信息，分得的色譜峰越多越有利于鑒定，目前可供選擇的檢測(cè)器，在氣相色譜中有氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)、熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)、電子捕獲檢測(cè)器(ECD)、火焰光度檢測(cè)器(FPD)等，其中以FID最為常用，凡以碳、氫、氧等元素組成的有機(jī)化合物均可被檢出，對(duì)中藥所含之揮發(fā)性成分的分析是十分有效的，在高效液相色譜中有可變紫外-可見光(UV-VIS)檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、示差折射檢測(cè)器(RID)、蒸發(fā)光散射光檢測(cè)器(ELSD)等，其中紫外-可見光檢測(cè)器用得較多，適宜于化合物中有共軛雙鍵的成分分析，而大量的不含共軛雙鍵的化合物不能被檢出，近十年來，ELSD檢測(cè)器的發(fā)展，使中藥中甾體類、皂甙類、多糖類等化合物均可采用ELSD作檢測(cè)；
(4)特征指紋的確立對(duì)上述五個(gè)以上批號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)藥材，在優(yōu)化的提取條件下制備供試液，以及在最佳色譜條件下進(jìn)行分析，每個(gè)樣品同品種的中藥五個(gè)以上的批號(hào)，分別進(jìn)樣三次，由此獲得五個(gè)批號(hào)樣品的十五張色譜圖，并轉(zhuǎn)化為十五張色譜指紋譜，現(xiàn)將這十五張色譜指紋譜中的相對(duì)保留值匯集并列成表，以便選擇特征色譜峰來建立特征指紋。
表I 色譜指紋譜匯集表(面積歸一化值)
總峰數(shù)61
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種中藥特征指紋譜在中藥品種鑒定、中藥區(qū)分和鑒別及中成藥所含藥味的鑒定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種中藥特征指紋譜的建立及其應(yīng)用。用本發(fā)明方法建立的特征指紋譜不僅能用于含有相同有效成分的不同中藥間區(qū)分和鑒別，并能用于品種的鑒定，還能為中成藥所含藥味的鑒定提供依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1403809SQ0112662
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2001年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月4日
發(fā)明者洪筱坤, 王智華 申請(qǐng)人:洪筱坤