專利名稱：定量pcr和免疫pcr通用檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領(lǐng)域，特別是涉及一種定量PCR和免疫PCR通用檢測方法和試劑盒。
現(xiàn)有定量PCR檢測方法是首先將待檢樣品和PCR擴增試劑加入Eppendorf管中進行PCR擴增，然后取生物素化的PCR產(chǎn)物加入到預(yù)先包被有親和素或鏈霉親和素的酶標微孔板中，隨后生物素化的PCR產(chǎn)物被包被于酶標孔中的親和素或鏈霉親合素所捕獲，用NaOH將雙鏈DNA變性，使之成為單鏈后加入特異性的熒光素或地高辛標記探針進行雜交反應(yīng)，然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗-熒光素標記抗體或抗-地高辛標記抗體，洗板去除未結(jié)合的酶標記的抗體后，用3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB)顯色，通過顯色反應(yīng)顏色的深淺，反映待測樣品中DNA或RNA模板的定量情況(全文斌，高巍，費然等。核酸擴增產(chǎn)物的量化酶免疫通用型檢測方法。中華醫(yī)學檢驗雜志，1999，2283-86)。該方法操作簡便、重復(fù)性好、特異性強、敏感度高、結(jié)果判斷客觀準確，不足之處是需將PCR產(chǎn)物從Eppendorf管中取出并轉(zhuǎn)移到酶標微孔板中，這樣不但增加了操作步驟，使PCR擴增、探針雜交、酶顯色和檢測不能在同一管中進行，明顯增加了污染的機會，從而降低了本方法的準確性。
免疫-PCR(Immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統(tǒng)，它利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴增反應(yīng)的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測。
現(xiàn)有免疫PCR檢測方法是通過應(yīng)用一個對DNA和抗體具有雙重結(jié)合活性的連接分子，使作為標記物的DNA(一般為質(zhì)粒DNA)分子特異性地結(jié)合到抗原-抗體復(fù)合物上，從而形成一種特異性的抗原-抗體-DNA復(fù)合物，附著的質(zhì)粒DNA分子可用適宜的引物進行PCR擴增，特異性PCR產(chǎn)物的存在證明DNA標記物分子特異性地附著于抗原-抗體復(fù)合物上，進而證明有抗原的存在，通過PCR擴增標記DNA分子，使抗原抗體反應(yīng)放大，從而判斷是否存在特異性抗原。該方法可檢測到1fg抗原，其敏感度是現(xiàn)有ELISA方法的1-10萬倍。
目前用作免疫PCR中連接分子的通常有兩種鏈霉抗生物素蛋白-蛋白A融合蛋白和抗生物素蛋白(又稱親和素)。
現(xiàn)有技術(shù)中根據(jù)SPA可與不同來源的IgG的Fc端發(fā)生特異性結(jié)合而不影響IgG分子與抗原結(jié)合能力的原理，構(gòu)建了通用性SPA-DNA探針，組成Ab-(SPA-DNA)→PCR通用性模式，為通用一套系統(tǒng)檢測各種抗原提供了條件；根據(jù)生物素和親和素可以進行特異性結(jié)合的原理，構(gòu)建了通用性Bio-DNA探針，組成Ag-Ab1-(Ab2-Bio)-Av-(Bio-DNA)→PCR通用性模式，為通用一套系統(tǒng)檢測各種抗體提供了條件。(吳自榮，陳阜東，戚蓓靜等。通用型免疫-聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)的建立及應(yīng)用。中華醫(yī)學檢驗雜志，1997，20147-149)。
現(xiàn)有技術(shù)中用單克隆抗體包被Eppendorf管，生物素化多抗和游離的親和素作為連接分子，生物素化重組質(zhì)粒作為指示分子，用特異引物擴增指示分子，組成了雙抗體夾心免疫-PCR系統(tǒng)，用于人促甲狀腺激素(TSH)的測定，其檢測靈敏度比ELISA方法提高了105倍(楊葵，周棱，王衍真.雙抗夾心免疫PCR法檢測人促甲狀腺激素TSH.免疫學雜志，2000，16142-145)。
現(xiàn)有免疫PCR技術(shù)中抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)操作與ELISA相同，通常在塑料ELISA平板上進行；而后半程的PCR操作則有兩種途徑其一是將平板孔內(nèi)結(jié)合的報告DNA模板精確地轉(zhuǎn)移至PCR管反應(yīng)體系中，再插入普通PCR儀中進行擴增反應(yīng)(Sanna PP，Weiss F，Samson ME，et al.Rapid induction of tumor necrosis factor alpha in the cerebrospinalfluid after intracerebroventricular injection of lipopolysaccharide revealedby a sensitive capture immuno-PCR assay.Proc Nalt Acad Sci USA，1995，92272-275)；其二是將平板直接置于PCR儀中進行擴增反應(yīng)，但這需要專用平板PCR儀器(Niemeyer CM，Adler M，Blohm D.Fluorometricpolymerase chain reaction(PCR)enzyme-Linked immunosorbent assay forquantification of immuno-PCR products in microplates.Anal Biochem，1997，246140-145)。顯然前者繁瑣，后者昂貴。采用戊二醛作連接劑，將蛋白質(zhì)高效率包被在普通PCR管內(nèi)壁，使免疫及PCR反應(yīng)用普通PCR儀得以在管中連貫地進行，以普通PCR儀進行擴增反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，標準曲線的線性關(guān)系好，與ELISA方法比較敏感度高出約105(徐平西，肖華勝，鞠躬.一種簡易的免疫PCR方法的建立.生物化學與生物物理進展，1999，26396-398)。該方法仍需將PCR擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至酶標微孔板中進行下一步的定量測定。
以上技術(shù)方案雖然較好的解決了通過定量PCR測定靶核酸序列和通過免疫PCR測定微量靶抗原的問題，但存在需要向微孔板轉(zhuǎn)移擴增產(chǎn)物從而增加操作步驟就不可避免地造成污染的問題。再者上述定量PCR只能單獨測定相應(yīng)的靶序列而不能同時測定相應(yīng)的靶抗原；上述免疫PCR只能單獨測定相應(yīng)的靶抗原而不能同時測定相應(yīng)的靶序列，也不能同時進行定量PCR和免疫PCR從而實現(xiàn)既測定靶序列又能測定靶抗原的目的。
本發(fā)明的任務(wù)就是提供一種定量PCR和免疫PCR通用檢測方法和試劑盒。
本發(fā)明的任務(wù)是這樣完成的一種定量PCR和免疫PCR通用檢測方法，其特征在于用同一改良Eppendorf管和相應(yīng)PCR擴增試劑，同時連續(xù)進行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)、靶抗原和病原體靶序列捕獲、PCR擴增靶序列和質(zhì)粒DNA、洗滌、特異性標記探針雜交、顯色或發(fā)光反應(yīng)步驟，同時連續(xù)進行定量PCR測定靶序列和免疫PCR測定靶抗原，該方法包括a)預(yù)包被特異性抗體在改良Eppendorf管底部包被穩(wěn)定化的特異性多克隆或單克隆抗體或蛋黃抗體IgY。
b)捕獲靶抗原和靶序列向已包被有特異性抗體的改良Eppendorf管中加入待檢樣品10-50μl，置37℃作用10-60分鐘后洗滌。
c)PCR擴增靶序列和質(zhì)粒DNA加入裂解液10-50μl 63℃保溫30分鐘，再加入相應(yīng)PCR擴增試劑20-50μl，進行PCR擴增，擴增參數(shù)為起始變性94℃2min；20-30個PCR循環(huán)變性94℃30s，退火56℃40s，延長70℃40s；后置延長72℃5分鐘。待PCR擴增完畢后，洗滌除去多余反應(yīng)物質(zhì)。
d)特異性標記探針雜交向改良Eppendorf管中加入熒光素(或地高辛)標記的靶序列特異性探針和地高辛(或熒光素或另一種熒光素)標記的質(zhì)粒DNA特異性探針，液相雜交90℃2-5min、55℃1-10分鐘后，洗滌除去多余的標記探針。
e)顯色或熒光或發(fā)光定量向上述改良Eppendorf管中加入堿性磷酸酶標記的抗熒光素抗體或抗地高辛抗體和辣根過氧化物酶或另一種酶標記的抗地高辛抗體或抗熒光素抗體或抗另一種熒光素抗體，37℃結(jié)合30分鐘，洗滌后先加入堿性磷酸酶顯色劑顯色，其顏色深淺與靶序列含量成正比，用酶標儀定量測定之。上述測定完成后，洗滌改良Eppendorf管，加入辣根過氧化物酶顯色劑顯色，其顏色深淺與靶抗原含量成正比，用酶標儀定量測定之；或向上述改良Eppendorf管中加入兩種不同熒光素的顯色劑，用熒光測定儀測定所顯示的兩種不同波長或不同顏色的熒光強度；或用發(fā)光儀測量發(fā)光強度，分別與相應(yīng)靶序列和靶抗原的含量成正比。
一種定量PCR和免疫PCR通用檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括a)改良Eppendorf管；b)裂解液10mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有0.4％NP-40或Triton X-100或100mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有0.01％Triton X-100和0.05％Tween-20和1mg/L蛋白酶K，50mmol/L KCL中的任一種。
c)進行定量PCR和免疫PCR所需的擴增試劑；d)檢測定量PCR和免疫PCR擴增產(chǎn)物所需的試劑；上述改良Eppendorf管是一個高10-13mm，上口口徑為6-10mm，底部2-5mm呈U型或V型的改良Eppendorf管，其上有一直徑5-11mm的圓形小蓋，小蓋上有卡槽或螺紋與該改良Eppendorf管的上口相吻合。在該改良Eppendorf管的底部包被有穩(wěn)定化的特異性抗體，該特異性抗體是通過共價鍵或非共價鍵的方式與上述改良Eppendorf管相結(jié)合。該改良Eppendorf管是由聚乙烯、聚丙烯塑料或其他耐高溫材料制作而成，其內(nèi)壁可以用公知共用的活化試劑修飾而含有相應(yīng)的活性基團，以利于特異性抗體的共價或非共價結(jié)合。
本發(fā)明采用以上結(jié)構(gòu)和方法后，由于改良Eppendorf管設(shè)置了特殊尺寸和采用相應(yīng)定量PCR和免疫PCR擴增試劑，可以使改良Eppendorf管既能在PCR儀上進行擴增反應(yīng)又能將其放入微孔板的板孔中進行洗滌處理和標記酶或熒光素的顯色反應(yīng)或熒光或發(fā)光檢測，能夠在改良Eppendorf管中進行上述定量PCR和免疫PCR的全程反應(yīng)過程；再者由于在改良Eppendorf管的底部預(yù)包被有特異性抗體，通過抗原抗體反應(yīng)，可有效捕獲和富集待檢樣品中的游離抗原、病原體和相應(yīng)病原體所攜帶的核酸物質(zhì)，從而免去靶核酸的預(yù)提取和純化等操作步驟，同時也避免了其他非檢測組分的干擾，而后通過加入生物素化特異性抗體、連接分子(通常是親和素或鏈霉親和素)、相應(yīng)生物素化靶序列和質(zhì)粒DNA引物及其他相應(yīng)試劑，繼而進行定量PCR和免疫PCR的擴增反應(yīng)，同時對靶序列和質(zhì)粒DNA(即標記DNA)進行雙重擴增，再通過洗滌除去多余反應(yīng)物后，如有待檢病原體的存在則相應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物就能通過連接分子和生物素化特異性抗體以三明治夾心的方式結(jié)合于改良Eppendorf管的底部，然后加入不同標記的靶序列和質(zhì)粒DNA特異性雜交探針進行雜交反應(yīng)，相應(yīng)雜交產(chǎn)物通過包被特異性抗體-待檢抗原-生物素化特異性抗體-連接分子-生物素化的熒光素或地高辛標記的雜交產(chǎn)物的方式被改良Eppendorf管捕獲，繼而通過相應(yīng)標記酶或熒光素的顯色反應(yīng)或熒光或發(fā)光強度而達到同時定量測定靶序列和靶抗原的目的，具有簡便的操作方法和靈敏、準確的優(yōu)點，適用于與疾病相關(guān)的靶序列和靶抗原的同時定量測定，尤其適用于極微量病原體和標志蛋白的檢測。
附圖是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)和捕獲方式示意圖。
下就結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
附

圖1中，1為改良Eppendorf管、2為特異性抗體、3為小蓋、4為卡槽或螺紋、5為上口、6為活性基團。
附圖2為靶序列雜交產(chǎn)物捕獲方式示意圖，其中Ab為特異性抗體、Ag為待檢抗原、Bio為生物素、Ab-Bio為生物素化特異性抗體、Av為親和素、Bio-DNA1為靶序列擴增產(chǎn)物、FITC為熒光素、Bio-DNA1-FITC為靶序列雜交產(chǎn)物。
附圖3為質(zhì)粒DNA雜交產(chǎn)物捕獲方式示意圖，其中Ab為特異性抗體、Ag為待檢抗原、Bio為生物素、Ab-Bio為生物素化特異性抗體、Av為親和素、Bio-DNA2為質(zhì)粒DNA擴增產(chǎn)物、Dig為地高辛、Bio-DNA2-Dig為質(zhì)粒DNA雜交產(chǎn)物。
如附圖所示，本發(fā)明定量PCR和免疫PCR通用檢測方法和試劑盒中的改良Eppendorf管是一個高10-13mm，上口5口徑為6-10mm，底部2-5mm呈U型或V型的改良Eppendorf管1，其上有一直徑5-11mm的圓形小蓋3，小蓋3上有卡槽或螺紋4與該改良Eppendorf管1的上口5相吻合。在該改良Eppendorf管1的底部包被有穩(wěn)定化的特異性抗體2，該特異性抗體2是通過共價鍵或非共價鍵的方式與上述改良Eppendorf管1相結(jié)合。該改良Eppendorf管1是由聚乙烯、聚丙烯塑料或其他耐高溫材料制作而成，其內(nèi)壁可以用公知共用的活化試劑修飾而含有相應(yīng)的活性基團6，以利于特異性抗體2與改良Eppendorf管1的內(nèi)壁共價或非共價結(jié)合。
一種定量PCR和免疫PCR通用檢測方法，其特征在于用同一改良Eppendorf管和相應(yīng)PCR擴增試劑，同時連續(xù)進行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)、靶抗原和病原體靶序列捕獲、PCR擴增靶序列和質(zhì)粒DNA、洗滌、特異性標記探針雜交、顯色或發(fā)光反應(yīng)步驟，同時連續(xù)進行定量PCR測定靶序列和免疫PCR測定靶抗原，該方法包括a)預(yù)包被特異性抗體在改良Eppendorf管底部包被穩(wěn)定化的特異性多克隆或單克隆抗體或蛋黃抗體IgY。所述特異性抗體是多克隆、單克隆抗體、蛋黃抗體IgY中的任一種或任意組合，尤其是蛋黃抗體IgY，因其耐熱性好，具有更好的穩(wěn)定性。所述特異性抗體是通過改良Eppendorf管1上的活性基團以共價鍵或非共價鍵的方式與上述改良Eppendorf管1相結(jié)合。上述特異性抗體采用海藻糖或其他穩(wěn)定化技術(shù)進行穩(wěn)定化處理，以使其具有更好的穩(wěn)定性，其穩(wěn)定方法是取1-10mg干重的特異性抗體和30-100mg海藻糖加1ml的蒸餾水溶解即為穩(wěn)定化液，也可以向含有1-10mg/ml特異性抗體的溶液1ml中加入30-100mg的海藻糖，使上述特異性抗體成為含有海藻糖穩(wěn)定化的混合物，其與海藻糖的重量比為1∶10-30。其穩(wěn)定機理是基于海藻糖類似于水化膜的性質(zhì)，可使上述特異性抗體的局部區(qū)域處于水化狀態(tài)，從而使上述特異性抗體的生物分子的活性保持穩(wěn)定，更重要的是可使改良Eppendorf管上的特異性抗體的活性在干燥狀態(tài)保持穩(wěn)定。
b)捕獲靶抗原和靶序列向已包被有特異性抗體的改良Eppendorf管中加入待檢樣品10-50μl，置37℃作用10-60分鐘后洗滌。如待檢樣品中有待檢病原體存在，則待檢病原體就通過所含的靶抗原與改良Eppendorf管中的特異性抗體發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被捕獲，同時病原體所含的靶序列也跟隨病原體一同被捕獲。
c)PCR擴增靶序列和質(zhì)粒DNA向改良Eppendorf管中加入裂解液10-50μl，裂解液是100mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有0.01％Triton X-100和0.05％Tween-20和1mg/L蛋白酶K，50mmol/LKCL。然后63℃保溫30-60分鐘，再加入相應(yīng)PCR擴增試劑20-50μl，PCR擴增試劑含生物素化特異性抗體10-20mg/L、游離親和素或鏈霉親和素5mg/L、生物素化靶序列引物1和2各50pmol/L、質(zhì)粒DNA10-50μg/L、生物素化質(zhì)粒DNA引物1和2各50pmol/L及其他所需試劑。然后進行PCR擴增，擴增參數(shù)為起始變性94℃2min；25-35個PCR循環(huán)變性94℃30s，退火56℃40s，延長70℃40s；后置延長72℃5分鐘。待PCR擴增完畢后，洗滌除去多余反應(yīng)物質(zhì)。選擇合適的擴增循環(huán)數(shù)使PCR反應(yīng)在“平臺期效應(yīng)”出現(xiàn)前即終止，由于PCR所用的靶序列和質(zhì)粒DNA引物用生物素標記，這樣在擴增反應(yīng)結(jié)束后PCR擴增產(chǎn)物帶有生物素成分，隨后PCR擴增產(chǎn)物與游離親和素或鏈霉親和素和生物素化特異性抗體形成復(fù)合物(Ab-Bio)-Av-(Bio-PCR擴增產(chǎn)物)。上述復(fù)合物再通過待檢抗原與改良Eppendorf管中的特異性抗體發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被結(jié)合于改良Eppendorf管上，其結(jié)合形式為改良Eppendorf管-Ab-Ag-(Ab-Bio)-Av-(Bio-PCR擴增產(chǎn)物)。上述Bio-PCR擴增產(chǎn)物包括Bio-靶序列擴增產(chǎn)物和Bio-質(zhì)粒DNA擴增產(chǎn)物。
d)特異性標記探針雜交向改良Eppendorf管中加入50-100μl變性液0.4mol/L NaOH和25mmol/L EDTA-Na2混勻，室溫作用5min，然后加入雜交液20-50μl，雜交液為10mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有50mmol/L KCL、1.5μmol/L的熒光素或地高辛標記的靶序列特異性探針和1.5μmol/L的地高辛或熒光素或另一種熒光素標記的質(zhì)粒DNA特異性探針。然后進行液相雜交反應(yīng)90℃2-5min、55℃1-10min，然后洗滌除去多余的標記探針。在上述反應(yīng)中熒光素或地高辛標記的靶序列特異性探針與上述Bio-靶序列擴增產(chǎn)物進行特異性雜交，其雜交產(chǎn)物以下列形式結(jié)合于改良Eppendorf管上改良Eppendorf管-Ab-Ag-(Ab-Bio)-Av-(Bio-靶序列雜交產(chǎn)物—熒光素或地高辛)；在上述反應(yīng)中地高辛或熒光素或另一種熒光素標記的質(zhì)粒DNA特異性探針與上述Bio-質(zhì)粒DNA擴增產(chǎn)物進行特異性雜交，其雜交產(chǎn)物以下列形式結(jié)合于改良Eppendorf管上改良Eppendorf管-Ab-Ag-(Ab-Bio)-Av-(Bio-質(zhì)粒DNA雜交產(chǎn)物—地高辛或熒光素或另一種熒光素)。
e)顯色或熒光或發(fā)光定量向上述改良Eppendorf管中加入堿性磷酸酶標記的抗熒光素抗體或抗地高辛抗體和辣根過氧化物酶或另一種酶標記的抗地高辛抗體或抗熒光素抗體或抗另一種熒光素抗體，37℃結(jié)合30分鐘，洗滌后先加入堿性磷酸酶顯色劑顯色，其顏色深淺與靶序列含量成正比，用酶標儀定量測定之。上述測定完成后，洗滌改良Eppendorf管，加入辣根過氧化物酶顯色劑顯色，其顏色深淺與靶抗原含量成正比，用酶標儀定量測定之；或向上述改良Eppendorf管中加入兩種不同熒光素的顯色劑，用熒光測定儀測定所顯示的兩種不同波長或不同顏色的熒光強度；或用發(fā)光儀測量發(fā)光強度，分別與相應(yīng)靶序列和靶抗原的含量成正比。
一種定量PCR和免疫PCR通用檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括a)改良Eppendorf管；b)裂解液10mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有0.4％NP-40或Triton X-100或100mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有0.01％Triton X-100和0.05％Tween-20和1mg/L蛋白酶K，50mmol/L KCL中的任一種。
c)進行定量PCR和免疫PCR所需的擴增試劑；d)檢測定量PCR和免疫PCR擴增產(chǎn)物所需的試劑；上述改良Eppendorf管是一個高10-13mm，上口口徑為6-10mm，底部2-5mm呈U型或V型的改良Eppendorf管，其上有一直徑5-11mm的圓形小蓋，小蓋上有卡槽或螺紋與該改良Eppendorf管的上口相吻合。在該改良Eppendorf管的底部包被有穩(wěn)定化的特異性抗體，該特異性抗體是通過共價鍵或非共價鍵的方式與上述改良Eppendorf管相結(jié)合。該改良Eppendorf管是由聚乙烯、聚丙烯塑料或其他耐高溫材料制作而成，其內(nèi)壁可以用公知共用的活化試劑修飾而含有相應(yīng)的活性基團，以利于特異性抗體的共價或非共價結(jié)合。
上述裂解液包括1)10mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有0.4％NP-40或Triton X-100；或2)100mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有0.01％Triton X-100和0.05％Tween-20和1mg/L蛋白酶K，50mmol/L KCL中的任一種配方。
上述定量PCR和免疫PCR所需的擴增試劑包括生物素化特異性抗體10-20mg/L、游離親和素或鏈霉親和素5mg/L、生物素化靶序列引物1和2各50pmol/L、質(zhì)粒DNA10-50μg/L、生物素化質(zhì)粒DNA引物1和2各50pmol/L、1.5mmol/L MgCL2、0.2-0.4mmol/L 4種脫氧核糖核苷酸、Taq-DNA聚合酶2U、50mmol/L KCL、10mmol/L PH8.3Tris-HCL緩沖液。所述定量PCR和免疫PCR擴增試劑是上述各組分的混合液。
上述檢測定量PCR和免疫PCR擴增產(chǎn)物所需的試劑包括1)變性液0.4mol/L NaOH和25mmol/L EDTA-Na2；2)雜交液10mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有50mmol/LKCL、1.5μmol/L的熒光素或地高辛標記的靶序列特異性探針和1.5μmol/L的地高辛或熒光素或另一種熒光素標記的質(zhì)粒DNA特異性探針；3)酶或熒光標記抗體包括堿性磷酸酶標記的抗熒光素抗體或抗地高辛抗體和辣根過氧化物酶或另一種酶標記的抗地高辛抗體或抗熒光素抗體或抗另一種熒光素抗體中的任一種組合；4)顯色液或發(fā)光試劑其中堿性磷酸酶顯色劑是以對硝基苯磷酸酯(p-NPP)為底物或利用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和氯化硝基四氮唑藍(NBT)顯色系統(tǒng)；其中辣根過氧化物酶顯色劑是以鄰苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB)為底物；其中熒光試劑是異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅丹明(RB200)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)中的任一種或任一組合；其中發(fā)光試劑是魯米諾及其衍生物、吖啶酯及其衍生物中的任一種或任一組合。
上述顯色或熒光或發(fā)光的定量檢測是利用酶標儀、熒光測定儀、發(fā)光測定儀定量測定之。
操作時，取適量的待檢樣品加入改良Eppendorf管中，37℃保溫30-60分鐘，使待檢抗原或病原體與改良Eppendorf管底部預(yù)包被的單克隆或多克隆抗體發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)而被捕獲和富集，然后加入所需擴增試劑包括生物素化特異性抗體、游離親和素或鏈霉親和素、生物素化靶序列引物1和2、質(zhì)粒DNA、生物素化質(zhì)粒DNA引物1和2及其它反應(yīng)試劑進行PCR擴增，此時靶序列和標記質(zhì)粒DNA同時被擴增，擴增完畢后洗滌除去多余物質(zhì)，再加入特異性標記寡核苷酸探針與上述生物素化擴增產(chǎn)物進行核酸雜交，雜交產(chǎn)物通過加入的生物素化單克隆或多克隆抗體、連接分子(通常是親和素或鏈霉親和素)與結(jié)合到改良Eppendorf管1底部的待檢抗原發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)而被結(jié)合到改良Eppendorf管1底部，洗滌除去多余物質(zhì)，加入相應(yīng)酶或熒光標記物與上述復(fù)合物結(jié)合，洗滌除去多余酶或熒光標記物后加入相應(yīng)顯色劑顯色或發(fā)光，將該改良Eppendorf管1放入微孔板的板孔中，用酶標儀或熒光儀或發(fā)光儀測量顯色的深淺或熒光或發(fā)光的強度，其顯色深淺或熒光或發(fā)光強度與待檢抗原的含量及待檢核酸物質(zhì)的含量呈正比，從而實現(xiàn)定量PCR測靶核酸(靶序列)和免疫PCR測靶抗原的目的(上述洗滌步驟均可將該改良Eppendorf管放入微孔板的板孔中，然后在洗板機上完成)。
權(quán)利要求
1.一種定量PCR和免疫PCR通用檢測方法，其特征在于用同一改良Eppendorf管和相應(yīng)PCR擴增試劑，同時連續(xù)進行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)、靶抗原和病原體靶序列捕獲、PCR擴增靶序列和質(zhì)粒DNA、洗滌、特異性標記探針雜交、顯色或發(fā)光反應(yīng)步驟，同時連續(xù)進行定量PCR測定靶序列和免疫PCR測定靶抗原，該方法包括a)預(yù)包被特異性抗體在改良Eppendorf管底部包被穩(wěn)定化的特異性多克隆或單克隆抗體或蛋黃抗體IgY。b)捕獲靶抗原和靶序列向已包被有特異性抗體的改良Eppendorf管中加入待檢樣品10-50μl，置37℃作用10-60分鐘后洗滌。c)PCR擴增靶序列和質(zhì)粒DNA向上述改良Eppendorf管中加入裂解液10-50μl 63℃保溫30分鐘，再加入相應(yīng)PCR擴增試劑20-50μl，進行PCR擴增，擴增參數(shù)為起始變性94℃2min；25-35個PCR循環(huán)變性94℃30s，退火56℃40s，延長70℃40s；后置延長72℃5分鐘。待PCR擴增完畢后，洗滌除去多余反應(yīng)物質(zhì)。d)特異性標記探針雜交向改良Eppendorf管中加入熒光素或地高辛標記的靶序列特異性探針和地高辛或熒光素或另一種熒光素標記的質(zhì)粒DNA特異性探針，液相雜交90℃2-5min、55℃1-10分鐘后，洗滌除去多余的標記探針。e)顯色或熒光或發(fā)光定量向上述改良Eppendorf管中加入堿性磷酸酶標記的抗熒光素抗體或抗地高辛抗體和辣根過氧化物酶或另一種酶標記的抗地高辛抗體或抗熒光素抗體或抗另一種熒光素抗體，37℃結(jié)合30分鐘，洗滌后先加入堿性磷酸酶顯色劑顯色，其顏色深淺與靶序列含量成正比，用酶標儀定量測定之。上述測定完成后，洗滌改良Eppendorf管，加入辣根過氧化物酶顯色劑顯色，其顏色深淺與靶抗原含量成正比，用酶標儀定量測定之?；蛳蛏鲜龈牧糆ppendorf管中加入兩種不同熒光素的顯色劑，用熒光測定儀測定所顯示的兩種不同波長或不同顏色的熒光強度，或用發(fā)光儀測量發(fā)光強度，分別與相應(yīng)靶序列和靶抗原的含量成正比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量PCR和免疫PCR通用檢測方法，其特征在于上述改良Eppendorf管是一個高10-13mm，上口[5]口徑為6-10mm，底部2-5mm呈U型或V型的改良Eppendoff管[1]，其上有一直徑5-11mm的圓形小蓋[3]，小蓋[3]上有卡槽或螺紋[4]與該改良Eppendorf管[1]的上口[5]相吻合；在該改良Eppendorf管[1]的底部包被有穩(wěn)定化的特異性抗體[2]，該特異性抗體[2]是多克隆、單克隆抗體和蛋黃抗體IgY中的任一種或任意組合；該特異性抗體[2]是通過共價鍵或非共價鍵的方式與上述改良Eppendorf管[1]相結(jié)合；該改良Eppendorf管[1]是由聚乙烯、聚丙烯塑料或其他耐高溫材料制作而成，改良Eppendorf管[1]內(nèi)壁可以用公知共用的活化試劑修飾而含有相應(yīng)的活性基團[6]，以利于特異性抗體[2]的共價或非共價結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的定量PCR和免疫PCR通用檢測方法，其特征在于上述特異性抗體采用海藻糖或其他穩(wěn)定化技術(shù)進行穩(wěn)定化處理；上述特異性抗體為含有海藻糖穩(wěn)定化的混合物，其與海藻糖的重量比為1∶10-30。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量PCR和免疫PCR通用檢測方法，其特征在于上述PCR擴增試劑是生物素化特異性抗體、游離親和素或鏈霉親和素、生物素化靶序列引物、質(zhì)粒DNA、生物素化質(zhì)粒DNA引物及其他所需試劑的混合液；上述PCR擴增是對靶序列和質(zhì)粒DNA進行同時雙重擴增；上述標記特異性探針同時分別與靶序列和質(zhì)粒DNA進行雜交，同時生成生物素化的熒光素或地高辛標記的靶序列和質(zhì)粒DNA雜交產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量PCR和免疫PCR通用檢測方法，其特征在于生物素化的熒光素或地高辛標記的靶序列雜交產(chǎn)物是通過包被特異性抗體—待檢抗原—生物素化特異性抗體—親和素或鏈霉親和素—生物素化的熒光素或地高辛標記的靶序列雜交產(chǎn)物的復(fù)合物形式被改良Eppendorf管捕獲；生物素化的地高辛或熒光素標記的質(zhì)粒DNA雜交產(chǎn)物是通過包被特異性抗體—待檢抗原—生物素化特異性抗體—親和素或鏈霉親和素—生物素化的地高辛或熒光素標記的質(zhì)粒DNA雜交產(chǎn)物的復(fù)合物形式被改良Eppendorf管捕獲。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量PCR和免疫PCR通用檢測方法，其特征在于用兩種不同的酶或熒光素顯色或熒光或發(fā)光定量測定靶序列和靶抗原。
7.一種定量PCR和免疫PCR通用檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括a)改良Eppendorf管；b)裂解液；c)進行定量PCR和免疫PCR所需的擴增試劑；d)檢測定量PCR和免疫PCR擴增產(chǎn)物所需的試劑；
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的定量PCR和免疫PCR通用檢測試劑盒，其特征在于上述改良Eppendorf管是一個高10-13mm，上口[5]口徑為6-10mm，底部2-5mm呈U型或V型的改良Eppendorf管[1]，其上有一直徑5-11mm的圓形小蓋[3]，小蓋[3]上有卡槽或螺紋[4]與該改良Eppendorf管[1]的上口[5]相吻合；在該改良Eppendorf管[1]的底部包被有穩(wěn)定化的特異性抗體[2]，該特異性抗體[2]是多克隆、單克隆抗體和蛋黃抗體IgY中的任一種或任意組合；該特異性抗體[2]是通過共價鍵或非共價鍵的方式與上述改良Eppendorf管[1]相結(jié)合；該改良Eppendorf管[1]是由聚乙烯、聚丙烯塑料或其他耐高溫材料制作而成，改良Eppendorf管[1]內(nèi)壁可以用公知共用的活化試劑修飾而含有相應(yīng)的活性基團[6]，以利于特異性抗體[2]的共價或非共價結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的定量PCR和免疫PCR通用檢測試劑盒，其特征在于上述裂解液是1)10mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有0.4％NP-40或Triton X-100；或2)100mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有0.01％Triton X-100和0.05％Tween-20和1mg/L蛋白酶K，50mmol/L KCL中的任一種。上述進行定量PCR和免疫PCR所需的擴增試劑包括生物素化特異性抗體10-20mg/L、游離親和素或鏈霉親和素5mg/L、生物素化靶序列引物1和2各50pmol/L、質(zhì)粒DNA 10-50μg/L、生物素化質(zhì)粒DNA引物1和2各50pmol/L、1.5mmol/L MgCL2、0.2-0.4mmol/L4種脫氧核糖核苷酸、Taq-DNA聚合酶2U、50mmol/L KCL、10mmol/LPH8.3 Tris-HCL緩沖液。所述定量PCR和免疫PCR擴增試劑是上述各組分的混合液。上述檢測定量PCR和免疫PCR擴增產(chǎn)物所需的試劑包括1)變性液0.4mol/L NaOH和25mmol/L EDTA-Na2；2)雜交液10mmol/L PH8.8 Tris-HCL緩沖液中含有50mmol/LKCL、1.5μmol/L的熒光素或地高辛標記的靶序列特異性探針和1.5μmol/L的地高辛或熒光素或另一種熒光素標記的質(zhì)粒DNA特異性探針；3)酶或熒光標記抗體包括堿性磷酸酶標記的抗熒光素抗體或抗地高辛抗體和辣根過氧化物酶或另一種酶標記的抗地高辛抗體或抗熒光素抗體或抗另一種熒光素抗體中的任一種組合；4)顯色液或發(fā)光試劑其中堿性磷酸酶顯色劑是以對硝基苯磷酸酯(p-NPP)為底物或利用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和氯化硝基四氮唑藍(NBT)顯色系統(tǒng)；其中辣根過氧化物酶顯色劑是以鄰苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB)為底物；其中熒光試劑是異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅丹明(RB200)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)中的任一種或任一組合；其中發(fā)光試劑是魯米諾及其衍生物、吖啶酯及其衍生物中的任一種或任一組合。上述顯色或發(fā)光的定量檢測是利用酶標儀、熒光測定儀、發(fā)光測定儀定量測定之。
10.一種定量PCR和免疫PCR通用檢測方法和試劑盒適用于與疾病相關(guān)的靶序列和靶抗原的同時定量測定，尤其適用于極微量病原體和標志蛋白的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量PCR和免疫PCR通用檢測方法和試劑盒,其特征是用同一改良Eppendorf管和相應(yīng)PCR擴增試劑,同時連續(xù)進行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)、靶抗原和病原體靶序列捕獲、PCR擴增靶序列和質(zhì)粒DNA、洗滌、特異性標記探針雜交、顯色或發(fā)光反應(yīng)步驟,同時連續(xù)進行定量PCR測定靶序列和免疫PCR測定靶抗原,具有簡便的操作方法和靈敏、準確的優(yōu)點。適用于與疾病相關(guān)的靶序列和靶抗原的同時定量測定,尤其適用于極微量病原體和標志蛋白的檢測。
文檔編號G01N33/68GK1356551SQ0113022
公開日2002年7月3日 申請日期2001年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月8日
發(fā)明者郭占軍, 趙華, 郭愛芹 申請人:郭占軍