專利名稱：抗人肝癌單克隆抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及抗人肝癌的特異性單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌(HCC)是常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，嚴(yán)重危害人類的健康和生命。目前，就世界范圍而言，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，作為一種高死亡率的疾病，肝癌的病因、發(fā)生、演化、診斷、治療都越來(lái)越引起人們的關(guān)注。其中，肝癌的早期診斷對(duì)于患者的轉(zhuǎn)歸以及預(yù)后都具有十分重要的意義。
目前，肝癌診斷的標(biāo)志物首推AFP，用于肝癌的血清學(xué)診斷已沿用多年，最近又用于肝癌血液轉(zhuǎn)移的基因診斷。但此方法在特異性和敏感性上仍存在問題。就特異性而言，對(duì)于HCC患者，干擾診斷準(zhǔn)確性的因素主要是因?yàn)椴糠职橛懈斡不蚵愿窝椎幕颊哐锌蓹z出AFP蛋白以及mRNA。權(quán)威統(tǒng)計(jì)表明，血清AFP陽(yáng)性率在急性黃疸性肝炎為19.8％，慢遷肝為19.9％，慢活肝為34.4％，而肝炎后肝硬化可達(dá)44.6％，上述非癌肝病的血清AFP濃度多在25-200ng/ml之間。對(duì)比肝癌及癌旁肝組織的Northern雜交和免疫組化結(jié)果，常發(fā)現(xiàn)癌旁肝組織有AFP的弱陽(yáng)性表達(dá)，因此常有血清AFP蛋白的假陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)這些病人由于某種原因如炎癥、壞死導(dǎo)致部分肝細(xì)胞脫落入血時(shí)，還可造成血液中AFP mRNA的假陽(yáng)性結(jié)果。Matsmnura等的一組研究顯示在15％的肝硬化患者和12％慢性肝炎患者中可檢出AFP mRNA陽(yáng)性。另一組實(shí)驗(yàn)中，Jiang等則在11例慢性肝炎患者中檢出6例AFP mRNA陽(yáng)性，2例急性肝炎患者中檢出1例AFP mRNA陽(yáng)性。就敏感性而言，大約1/3的HCC患者，其血清AFP陰性(＜20ng/ml)，在分化好(I級(jí))及分化極差(IV級(jí))的HCC內(nèi)AFP的陽(yáng)性率也較低，因此對(duì)這些腫瘤患者不能有效地檢出。這就說(shuō)明AFP在肝癌診斷中存在相當(dāng)?shù)穆┰\率和誤診率，所以，要提高肝癌的早期診斷率需要有敏感性更高和特異性更強(qiáng)的新的標(biāo)志物。
由于目前尚缺特異性強(qiáng)的檢測(cè)和/或治療肝癌的有效方法，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)特異性抗人肝癌單克隆抗體，以及檢測(cè)和治療肝癌的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種特異性抗人肝癌標(biāo)志性抗原的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性檢測(cè)人肝癌的試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性治療人肝癌的治療劑。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種免疫球蛋白，其特征在于，它特異性地結(jié)合于MXR7蛋白。較佳地，所述免疫球蛋白特異性地結(jié)合于去除了N端的MXR7蛋白(例如，缺失了N端50-100個(gè)氨基酸，較佳地50-80個(gè)氨基酸后的MXR7蛋白)更佳地，所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的MXR7蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或是缺失了N端55個(gè)氨基酸的MXR7蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述的免疫球蛋白是單克隆抗體。
在本發(fā)明的另一實(shí)例中，所述的免疫球蛋白由小鼠雜交瘤細(xì)胞系MF4C4，CCTCC No.C200111所產(chǎn)生。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物含有特異性地結(jié)合于MXR7蛋白的免疫球蛋白和選自下組的偶聯(lián)部分藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、酶。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，它是小鼠雜交瘤細(xì)胞系MF4C4，CCTCC No.C200111。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。


圖1用單克隆抗體MF4C4，通過western印跡法檢測(cè)人胚肝細(xì)胞MXR7蛋白的表達(dá)。
圖2用單克隆抗體MF4C4，通過免疫組化方法檢測(cè)肝癌組織中MXR7的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，MXR7基因與肝癌有十分密切的聯(lián)系，可以作為肝癌特異性敏感標(biāo)志基因。在此發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，從胎盤cDNA文庫(kù)分離得到MXR7基因，表達(dá)MXR7蛋白，并研制成功一種雜交瘤單克隆抗體，即抗人肝癌單抗MF4C4。此抗體經(jīng)研究證實(shí)穩(wěn)定性好，和肝癌抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)。
MXR7是1996年Lage等人通過差異雜交方法分離克隆的。同期，本發(fā)明人在研究肝癌特異性敏感標(biāo)志基因時(shí)，從肝癌cDNA文庫(kù)分離得到MXR7基因。該基因全長(zhǎng)cDNA序列為2263bp，定位于人染色體Xq26，由8個(gè)外顯子組成，編碼由580個(gè)氨基酸組成的硫酸類肝素蛋白聚糖，分子量66kDa，通過糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)錨連接于細(xì)胞膜，屬于蛋白聚糖家族。MXR7基因在胚胎時(shí)大量表達(dá)于中胚層組織，合成于胎兒肝臟、肺臟和腎臟，在胎盤組織內(nèi)低水平表達(dá)，其它組織內(nèi)則不表達(dá)，被認(rèn)為參與發(fā)育期形態(tài)發(fā)生和生長(zhǎng)調(diào)控，一旦形態(tài)發(fā)生完成，轉(zhuǎn)錄呈負(fù)調(diào)節(jié)，斷奶后就不能檢測(cè)到。
研究表明，MXR7與肝癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，不僅在肝癌的早期有較高的檢出率，而且隨著肝癌的進(jìn)展，其檢出率也隨之增高。本發(fā)明人檢測(cè)到76.7％(23/30)肝癌組織內(nèi)有MXR7表達(dá)，其中13.3％(4/30)癌旁組織有MXR7弱陽(yáng)性表達(dá)，而另外7例肝癌組織內(nèi)MXR7表達(dá)陰性的病人，其癌旁組織MXR7也表達(dá)陰性。重要的是在血清AFP陽(yáng)性的病人肝癌中88％表達(dá)MXR7 mRNA，而在血清AFP陰性的病人肝癌中仍可發(fā)現(xiàn)有73％呈MXR7 mRNA表達(dá)陽(yáng)性。在直徑＜3cm肝癌中，MXR7 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為77％，顯著高于血清AFP水平升高率43％和肝癌中AFPmRNA表達(dá)率41％。MXR7在肝腺瘤、膽管細(xì)胞癌、肝轉(zhuǎn)移癌和12種常見實(shí)體瘤以及21個(gè)非肝癌細(xì)胞系中均未檢測(cè)到MXR7表達(dá)，表明MXR7是一個(gè)肝癌內(nèi)特異表達(dá)的基因，其特異性明顯高于目前仍用于肝癌診斷標(biāo)志物的AFP，并且比AFP更敏感、檢出率更高，尤其在AFP陰性的肝癌患者中有較高的檢出率。因此MXR7是一新的肝癌標(biāo)志物，能與AFP互補(bǔ)協(xié)同用于肝癌的早期診斷。
另一方面，由于MXR7在肝癌的惡性進(jìn)展中的表達(dá)水平逐漸增高，而可能成為用于判斷肝癌的預(yù)后或抗肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要的靶基因。
MXR7基因是目前在肝癌中發(fā)現(xiàn)的與X染色體相關(guān)的兩個(gè)基因之一。肝癌具有十分明顯的家族聚集性和遺傳易感性，男性發(fā)病率約是女性的10倍，流行病學(xué)調(diào)查已證明母親患肝癌對(duì)子代的遺傳影響遠(yuǎn)大于父親患肝癌對(duì)子代的影響。MXR7基因是否肝癌易感性遺傳的主基因尚需研究。
MXR7與肝癌的關(guān)系十分密切，其作用的分子機(jī)理仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。MXR7基因在胎肝高水平表達(dá)，成人關(guān)閉，肝癌時(shí)復(fù)蘇，與AFP基因表達(dá)的時(shí)空分布很相似，但MXR7 mRNA表達(dá)比AFP更敏感，陽(yáng)性率更高。該基因以GPI錨連接于細(xì)胞表面，是IGF-2的共同受體(co-receptor)。因此與該家族其它成員一樣可以脫落入血，在肝癌患者血液中可檢測(cè)到，以此作為肝癌早期血清學(xué)診斷的特異性標(biāo)志物。
在上述研究基礎(chǔ)上，本發(fā)明人利用雜交瘤技術(shù)制備了抗人MXR7的單克隆抗體MF4C4。
本發(fā)明的MF4C4單抗或其片段可用于肝癌的放射性定位的診斷成像，還可用于免疫治療，例如通過直接或間接地將MF4C4單抗或其片段與化學(xué)治療劑、或放療劑相連從而使其能直接導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明包括具有MF4C4單抗的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體、具有MF4C4單抗可變區(qū)鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括藥物、毒素、細(xì)胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與MF4C4單抗或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與MF4C4單抗或其片段結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物或抗原。
如本文所用，“免疫毒素”指對(duì)靶細(xì)胞有特異性親和力和殺傷力的物質(zhì)，例如免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括藥物、毒素、細(xì)胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治療分子與MF4C4單抗或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。具體的例子有例如131I-MF4C4，MTX-MF4C4偶聯(lián)物等。
對(duì)于本發(fā)明MF4C4單抗重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測(cè)定。MF4C4單抗V鏈的超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region，CDR)特別令人感興趣，因?yàn)樗鼈冎兄辽俨糠稚婕敖Y(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與MF4C4單抗CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab′)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明還提供了編碼肝癌標(biāo)志性抗原的cDNA。本發(fā)明的MF4C4單抗的抗原的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)肝癌標(biāo)志性抗原的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備模板，通過擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以如上用常規(guī)技術(shù)，利用小鼠雜交瘤細(xì)胞系MF4C4(CCTCC No.C200111)獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS7、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。一種人肝癌診斷試劑盒，已完成臨床實(shí)驗(yàn)193例，檢測(cè)陽(yáng)性率高達(dá)74％。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可直接用于肝癌的治療。此外，還可同時(shí)使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α等。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶聯(lián)物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無(wú)菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的MF4C4免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明不僅提供了產(chǎn)生高效價(jià)抗人MXR7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，還提供了單抗檢測(cè)臨床病人血清中MXR7蛋白的含量。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，目前國(guó)際國(guó)內(nèi)均無(wú)相同工作的報(bào)道。本發(fā)明的單克隆抗體可成功地應(yīng)用于原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的血清學(xué)診斷(臨床適用)，特別是對(duì)α-FP陰性肝癌的鑒別診斷和判斷肝癌病人的預(yù)后極有意義。本發(fā)明抗體還能應(yīng)用于肝癌的免疫治療，提高肝癌的綜合治療療效。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人MXR7 cDNA編碼序列的獲得按MXR7基因的序列，合成分別位于閱讀框上游和下游的引物，從胎盤cDNA文庫(kù)擴(kuò)增分離得到如下MXR7基因的編碼序列(SEQ ID NO1)。
1 cagcacgtct cttgctcctc agggccactg ccaggcttgc cgagtcctgg gactgctctc61 gctccggctg ccactctccc gcgctctcct agctccctgc gaagcaggat ggccgggacc121 gtgcgcaccg cgtgcttggt ggtggcgatg ctgctcagct tggacttccc gggacaggcg181 cagcccccgc cgccgccgcc ggacgccacc tgtcaccaag tccgctcctt cttccagaga241 ctgcagcccg gactcaagtg ggtgccagaa actcccgtgc caggatcaga tttgcaagta301 tgtctcccta agggcccaac atgctgctca agaaagatgg aagaaaaata ccaactaaca361 gcacgattga acatggaaca gctgcttcag tctgcaagta tggagctcaa gttcttaatt421 attcagaatg ctgcggtttt ccaagaggcc tttgaaattg ttgttcgcca tgccaagaac481 tacaccaatg ccatgttcaa gaacaactac ccaagcctga ctccacaagc ttttgagttt541 gtgggtgaat ttttcacaga tgtgtctctc tacatcttgg gttctgacat caatgtagat601 gacatggtca atgaattgtt tgacagcctg tttccagtca tctataccca gctaatgaac661 ccaggcctgc ctgattcagc cttggacatc aatgagtgcc tccgaggagc aagacgtgac721 ctgaaagtat ttgggaattt ccccaagctt attatgaccc aggtttccaa gtcactgcaa
781 gtcactagga tcttccttca ggctctgaat cttggaattg aagtgatcaa cacaactgat841 cacctgaagt tcagtaagga ctgtggccga atgctcacca gaatgtggta ctgctcttac901 tgccagggac tggtgatggt taaaccctgt ggcggttact gcaatgtggt catgcaaggc961 tgtatggcag gtgtggtgga gattgacaag tactggagag aatacattct gtcccttgaa1021 gaacttgtga atggcatgta cagaatctat gacatggaga acgtactgct tggtctcttt1081 tcaacaatcc atgattctat ccagtatgtc cagaagaatg caggaaagct gaccaccact1141 attggcaagt tatgtgccca ttctcaacaa cgccaatata gatctgctta ttatcctgaa1201 gatctcttta ttgacaagaa agtattaaaa gttgctcatg tagaacatga agaaacctta1261 tccagccgaa gaagggaact aattcagaag ttgaagtctt tcatcagctt ctatagtgct1321 ttgcctggct acatctgcag ccatagccct gtggcggaaa acgacaccct ttgctggaat1381 ggacaagaac tcgtggagag atacagccaa aaggcagcaa ggaatggaat gaaaaaccag1441 ttcaatctcc atgagctgaa aatgaagggc cctgagccag tggtcagtca aattattgac1501 aaactgaagc acattaacca gctcctgaga accatgtcta tgcccaaagg tagagttctg1561 gataaaaacc tggatgagga agggtttgaa agtggagact gcggtgatga tgaagatgag1621 tgcattggag gctctggtga tggaatgata aaagtgaaga atcagctccg cttccttgca1681 gaactggcct atgatctgga tgtggatgat gcgcctggaa acagtcagca ggcaactccg1741 aaggacaacg agataagcac ctttcacaac ctcgggaacg ttcattcccc gctgaagctt1801 ctcaccagca tggccatctc ggtggtgtgc ttcttcttcc tggtgcactg act(SEQ ID NO1)全長(zhǎng)為1853bp，其中ORF位于第109-1848位，編碼由580個(gè)氨基酸組成的硫酸類肝素蛋白聚糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，分子量66kDa，通過糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)錨連接于細(xì)胞膜，屬于蛋白聚糖家族。
MAGTVRTACL VVAMLLSLDF PGQAQPPPPP PDATCHQVRS FFQRLQPGLK 50WVPETPVPGS DLQVCLPKGP TCCSRKMEEK YQLTARLNME QLLQSASMEL 100KFLIIQNAAV FQEAFEIVVR HAKNYTNAMF KNNYPSLTPQ AFEFVGEFFT 150DVSLYILGSD INVDDMVNEL FDSLFPVIYT QLMNPGLPDS ALDINECLRG 200ARRDLKVFGN FPKLIMTQVS KSLQVTRIFL QALNLGIEVI NTTDHLKFSK 250DCGRMLTRMW YCSYCQGLVM VKPCGGYCNV VMQGCMAGVV EIDKYWREYI 300LSLEELVNGM YRIYDMENVL LGLFSTIHDS IQYVQKNAGK LTTTIGKLCA 350HSQQRQYRSA YYPEDLFIDK KVLKVAHVEH EETLSSRRRE LIQKLKSFIS 400FYSALPGYIC SHSPVAENDT LCWNGQELVE RYSQKAARNG MKNQFNLHEL 450KMKGPEPVVS QIIDKLKHIN QLLRTMSMPK GRVLDKNLDE EGFESGDCGD 500DEDECIGGSG DGMIKVKNQL RFLAELAYDL DVDDAPGNSQ QATPKDNEIS 550TFHNLGNVHS PLKLLTSMAI SVVCFFFLVH580(SEQ ID NO2)
其中，與公布的MXR7基因相比，在913位(請(qǐng)根據(jù)新的序列確定位置)存在a→g的改變(氨基酸由M→V)。
實(shí)施例2人MXR7蛋白片段的表達(dá)本發(fā)明人對(duì)MXR7的表達(dá)進(jìn)行了多次嘗試，發(fā)現(xiàn)去除其N端可有效表達(dá)和純化MXR7蛋白。
在該實(shí)施例中，用下列PCR引物引物15′-cggaattctgccaggatcagat-3′(SEQ ID NO3)引物25′-cgctcgagtcagtgcaccag-3′(SEQ ID NO4)通過PCR法，從人胎盤cDNA庫(kù)(CLONTECH，Human Placenta cDNA)中克隆人MXR7 cDNA(523aa，缺失N端57aa)，將其連接到6×His融合表達(dá)載體pPROEXHT(GIBCO BRL，10711-018)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用Ni-NTA瓊脂糖親和層析法純化MXR7蛋白。
實(shí)施例3MF4C4單抗的制備和純化(1)雜交瘤的制備以實(shí)施例2中純化的MXR7蛋白免疫BALB/c小鼠初次免疫時(shí)將弗氏完全佐劑與抗原100μl(50-100μg)等體積混合，充分乳化，腹腔注射。3周后對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，抗原量減半，并改用弗氏不完全佐劑，注射體積和方法不變。待小鼠血清效價(jià)達(dá)到要求后準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞融合，融合前三天對(duì)小鼠進(jìn)行沖擊免疫(50μg抗原)。
在免疫小鼠的同時(shí)準(zhǔn)備小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3X63Ag8.653(ATCC CRL-1580)。
將致敏的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)(以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞)。
接著，用ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以純化的MXR7蛋白(2μg/ml)包被酶標(biāo)板，每孔100μl，4℃，過夜。室溫封閉后，加待檢上清100μl，37℃孵育1h。洗滌3遍，加酶標(biāo)二抗(抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育45min。甩掉酶標(biāo)二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μl，室溫靜置5分鐘，加終止液50μl。結(jié)果用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm值，OD值高于陰性對(duì)照2倍以上者可視為陽(yáng)性。
然后，將選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)(有限稀釋法，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞)。經(jīng)過2-3輪克隆化培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的能夠產(chǎn)生高效價(jià)單抗的雜交瘤細(xì)胞克隆。將雜交瘤細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存保種。
一種陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞為人肝癌雜交瘤細(xì)胞系MF4C4，該雜交瘤細(xì)胞系于2001年9月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)，武漢市)，保藏號(hào)為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)，武漢市)No.C200111。
(2)MF4C4單抗的制備和純化將上述雜交瘤細(xì)胞MF4C4接種至小鼠腹腔，制備腹水，再?gòu)母顾刑崛慰埂?br> 單抗MF4C4的純化采用protein A親和層析法。首先制備protein A親和層析柱，用PBS平衡柱子后，取含抗MXR7單抗的腹水或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清過柱，然后用PBS洗柱子，至OD值接近于零，以50mmol/L的甘氨酸-HCl溶液(pH2.3)洗脫，收集洗脫液，測(cè)定各收集管的OD值，保留峰值區(qū)的洗脫液，洗脫液經(jīng)透析濃縮后用于制備酶標(biāo)抗體。
實(shí)施例4MF4C4單抗的鑒定用實(shí)施例3中制備的MF4C4單抗，通過常規(guī)蛋白印跡雜交(Western blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人胚肝細(xì)胞中MXR7蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，單抗與66KD位置的一條蛋白帶特異性結(jié)合(圖1)。
用MF4C4單抗，按常規(guī)方法對(duì)肝細(xì)胞癌組織切片進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果如圖4所示，其中圖4A-4D分別為不同放大倍數(shù)，結(jié)果表明在腫瘤包膜區(qū)進(jìn)展性癌巢中胞漿中著色明顯。說(shuō)明抗MXR7單克隆抗體具有較好的特異性和敏感性。
實(shí)施例5用實(shí)施例3中制備的MF4C4單抗，通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)肝癌病人(100例)、非肝癌肝膽疾病患者(43例)和正常人(50例)血清中MXR7蛋白的含量。結(jié)果顯示，74％肝癌病人血清中MXR7蛋白高表達(dá)，非肝癌肝膽疾病患者中僅有18.60％MXR7蛋白為陽(yáng)性，且蛋白表達(dá)水平較肝癌病人低，而正常人血清中MXR7蛋白的含量很低。這說(shuō)明該抗MXR7單克隆抗體具有較好的特異性和敏感性。
此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>王，紅陽(yáng)<120>抗人肝癌單克隆抗體及應(yīng)用<130>014717<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1853<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(109)..(1848)<400>1cagcacgtct cttgctcctc agggccaetg ccaggcttgc cgagtcctgg gactgctctc-60gctccggctg ccactctccc gcgctctcct agctccctgc gaagcagg atg gcc ggg 117Met Ala Gly1acc gtg cgc acc gcg tgc ttg gtg gtg gcg atg ctg ctc agc ttg gac 165Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Asp5 10 15ttc ccg gga cag gcg cag ccc ccg ccg ccg ccg ccg gac gcc acc tgt 213Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys20 25 30 35cac caa gtc cgc tcc ttc ttc cag aga ctg cag ccc gga ctc aag tgg 261His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp40 45 50gtg cca gaa act ccc gtg cca gga tca gat ttg caa gta tgt ctc cct 309Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro55 60 65aag ggc cca aca tgc tgc tca aga aag atg gaa gaa aaa tac caa cta 357Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu70 75 80aca gca cga ttg aac atg gaa cag ctg ctt cag tct gca agt atg gag 405Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu
85 90 95ctc aag ttc tta att att cag aat gct gcg gtt ttc caa gag gcc ttt 453Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe100 105 110 115gaa att gtt gtt cgc cat gcc aag aac tac acc aat gcc atg ttc aag 501Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys120 125 130aac aac tac cca agc ctg act cca caa gct ttt gag ttt gtg ggt gaa 549Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu135 140 145ttt ttc aca gat gtg tct ctc tac atc ttg ggt tct gac atc aat gta 597Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val150 155 160gat gac atg gtc aat gaa ttg ttt gac agc ctg ttt cca gtc atc tat 645Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr165 170 175acc cag cta atg aac cca ggc ctg cct gat tca gcc ttg gac atc aat 693Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn180 185 190 195gag tgc ctc cga gga gca aga cgt gac ctg aaa gta ttt ggg aat ttc 741Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe200 205 210ccc aag ctt att atg acc cag gtt tcc aag tca ctg caa gtc act agg 789Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg215 220 225atc ttc ctt cag gct ctg aat ctt gga att gaa gtg atc aac aca act 837Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr230 235 240gat cac ctg aag ttc agt aag gac tgt ggc cga atg ctc acc aga atg 885Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met245 250 255tgg tac tgc tct tac tgc cag gga ctg gtg atg gtt aaa ccc tgt ggc 933Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Val Met Val Lys Pro Cys Gly260 265 270 275ggt tac tgc aat gtg gtc atg caa ggc tgt atg gca ggt gtg gtg gag 981Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu280 285 290att gac aag tac tgg aga gaa tac att ctg tcc ctt gaa gaa ctt gtg 1029Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val295 300 305aat ggc atg tac aga atc tat gac atg gag aac gta ctg ctt ggt ctc 1077Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu310 315 320ttt tca aca atc cat gat tct atc cag tat gtc cag aag aat gca gga 1125Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly325 330 335aag ctg acc acc act att ggc aag tta tgt gcc cat tct caa caa cgc 1173Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg340 345 350 355caa tat aga tct gct tat tat cct gaa gat ctc ttt att gac aag aaa 1221Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys360 365 370gta tta aaa gtt gct cat gta gaa cat gaa gaa acc tta tcc agc cga 1269Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg375 380 385aga agg gaa cta att cag aag ttg aag tct ttc atc agc ttc tat agt 1317Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser390 395 400gct ttg cct ggc tac atc tgc agc cat agc cct gtg gcg gaa aac gac 1365Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp405 410 415acc ctt tgc tgg aat gga caa gaa ctc gtg gag aga tac agc caa aag 1413Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys420 425 430 435gca gca agg aat gga atg aaa aac cag ttc aat ctc cat gag ctg aaa 1461Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys440 445 450atg aag ggc cct gag cca gtg gtc agt caa att att gac aaa ctg aag 1509Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys455 460 465cac att aac cag ctc ctg aga acc atg tct atg ccc aaa ggt aga gtt 1557His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val470 475 480ctg gat aaa aac ctg gat gag gaa ggg ttt gaa agt gga gac tgc ggt 1605Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly485 490 495gat gat gaa gat gag tgc att gga ggc tct ggt gat gga atg ata aaa 1653Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys500 505 510 515gtg aag aat cag ctc cgc ttc ctt gca gaa ctg gcc tat gat ctg gat 1701Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp520 525 530gtg gat gat gcg cct gga aac agt cag cag gca act ccg aag gac aac 1749Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn535 540 545gag ata agc acc ttt cac aac ctc ggg aac gtt cat tcc ccg ctg aag 1797Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys550 555 560ctt ctc acc agc atg gcc atc tcg gtg gtg tgc ttc ttc ttc ctg gtg 1845Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val565 570 575cac tgact 1853His580<210>2<211>580<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu1 5 10 15Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp20 25 30Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly35 40 45Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val50 55 60Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys65 70 75 80Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala85 90 95Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln
100 105 110Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala115 120 125Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe130 135 140Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp145 150 155 160Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro165 170 175Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu180 185 190Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe195 200 205Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln210 215 220Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile225 230 235 240Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu245 250 255Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Val Met Val Lys260 265 270Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly275 280 285Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu290 295 300Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu305 310 315 320Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys325 330 335Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser340 345 350Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile355 360 365Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu
370 375 380Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser385 390 395 400Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala405 410 415Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr420 425 430Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His435 440 445Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp450 455 460Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys465 470 475 480Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly485 490 495Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly500 505 510Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr515 520 525Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro530 535 540Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser545 550 555 560Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe565 570 575Phe Leu Val His580<210>3<211>22<212>DNA<213>引物<400>3cggaattctg ccaggatcag at 22<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<400>4cgctcgagtc agtgcaccag20
權(quán)利要求
1.一種免疫球蛋白，其特征在于，它特異性地結(jié)合于MXR7蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的MXR7蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者所述的MXR7蛋白缺失N端50-100個(gè)氨基酸。
3.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞系MF4C4，CCTCC No.C200111所產(chǎn)生。
5.一種免疫偶聯(lián)物，其特征在于，該免疫偶聯(lián)物含有特異性地結(jié)合于MXR7蛋白的免疫球蛋白和選自下組的偶聯(lián)部分藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、酶。
6.一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，它是小鼠雜交瘤細(xì)胞系MF4C4，CCTCC No.C200111。
7.一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白或權(quán)利要求5所述的免疫偶聯(lián)物。
8.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白或權(quán)利要求5所述的免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗人肝癌標(biāo)志性抗原的特異性單克隆抗體MF4C4。該單克隆抗體具有與肝癌抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明還提供了MF4C4免疫球蛋白、及其片段和免疫偶聯(lián)物以及含有上述免疫球蛋白、片段或免疫偶聯(lián)物的藥物組合物。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)肝癌的檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1412201SQ01131940
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2001年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月17日
發(fā)明者王紅陽(yáng), 陳正軍, 吳秀菊, 吳孟超 申請(qǐng)人:王紅陽(yáng)