專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠迅速且簡便地對試樣中的測定對象進行高精度定量的生物傳感器。
背景技術(shù)：
以往，作為不用對試樣溶液進行稀釋和攪拌等處理就能夠?qū)υ嚇又械奶囟ǔ煞诌M行定量的方法，揭示了以下所述的生物傳感器(日本專利公開公報平2-062952號)。
該生物傳感器的絕緣性基板上通過絲網(wǎng)印刷等方法形成了由測定電極、工作電極、配極及參考電極組成的電極系，該電極系上則形成了包含親水性高分子、氧化還原酶及導(dǎo)電體的酶反應(yīng)層。根據(jù)需要可在該酶反應(yīng)層中添加緩沖劑。
如果在以上制得的生物傳感器的酶反應(yīng)層上滴加含有底物的試樣溶液，則酶反應(yīng)層溶解，酶與底物反應(yīng)，導(dǎo)電體隨之還原。酶反應(yīng)結(jié)束后，該被還原的導(dǎo)電體又通過電化學(xué)方法氧化，由此時獲得的氧化電流值可求得試樣溶液中的底物濃度。
上述生物傳感器的原理是以測定對象物質(zhì)為底物，通過對酶進行選擇對各種不同的物質(zhì)進行測定。例如，如果使用葡萄糖氧化酶為氧化還原酶，則能夠構(gòu)成可對血液中的葡萄糖濃度進行測定的生物傳感器。該傳感器作為葡萄糖傳感器被廣泛使用。此外，如果使用膽甾醇氧化酶，則能夠構(gòu)成可對血清中的膽甾醇進行測定的生物傳感器。
通常，作為診斷基準(zhǔn)使用的血清膽甾醇值是膽甾醇和膽甾醇酯的濃度合計值。膽甾醇酯不會成為因膽甾醇氧化酶而進行的氧化反應(yīng)的底物。因此，要對作為診斷基準(zhǔn)的血清膽甾醇值進行測定，就必須有使膽甾醇酯轉(zhuǎn)變?yōu)槟戠薮嫉倪^程。該過程中以膽甾醇酯酶作為催化劑。
使用酶反應(yīng)層中包含膽甾醇酯酶和膽甾醇氧化酶的生物傳感器，可測定血清中的總膽甾醇濃度。
但是，在進行膽甾醇的測定時會受到細胞膜中存在的膽甾醇的影響。此外，反應(yīng)試劑中的膽甾醇酯酶最好與可提高反應(yīng)性的表面活性劑共存。在大多數(shù)情況下，由于表面活性劑會破壞細胞膜，所以細胞內(nèi)的物質(zhì)可能會直接或間接地對酶反應(yīng)或電極產(chǎn)生影響?；诖?，膽甾醇傳感器的酶反應(yīng)及其后的電極反應(yīng)都最好在血漿或血清中進行。除了膽甾醇傳感器之外，有時血液中血細胞的存在會對感應(yīng)值產(chǎn)生影響，理想的情況是在不含血細胞的溶液中進行酶反應(yīng)和電極反應(yīng)。
從全血中分離出血漿或血清時一般采用離心分離的方法。但是，進行離心分離需要時間，且操作復(fù)雜。
美國專利第3,607,092號揭示了血液試驗中的膜片。該膜片具有可使溶液透過但無法使血細胞等固體和蛋白質(zhì)等大分子透過的薄膜層，因此，利用該薄膜可除去血細胞。但是，隨著血液的透過薄膜上蓄積了大量固體成分，所以為了獲得上述生物傳感器的反應(yīng)所必須的濾液，需要面積更大的薄膜層。因此，前述薄膜并不一定適用。
美國專利第4,477,575號揭示了利用玻璃纖維濾膜使全血通過以分離出血清的裝置及方法。這種利用纖維和多孔體形成的濾膜從全血中分離出血清的方法可能適用于上述生物傳感器。但是，該方法中的濾膜并不能夠阻擋血細胞，只能夠簡單地減慢其流速，實際上只完成了血細胞和血漿的分離。因此，為了使該方法適用于上述生物傳感器，在血細胞未從濾膜流出的過程中必須獲得生物傳感器的反應(yīng)所必須的量以上的通過濾膜過濾的血漿或血清。這樣就必須使濾膜的血液流動方向的長度的設(shè)定滿足上述條件。
將滿足上述條件的濾膜設(shè)置在生物傳感器的配置了電極系及反應(yīng)試劑系統(tǒng)的部位及供給作為試樣的血液的部位之間，就能夠構(gòu)成具有血細胞過濾能力的生物傳感器。圖9所示即為該傳感器的一個例子，圖9為除去了反應(yīng)試劑層的分解立體圖。
圖9中，在由聚對苯二甲酸乙二醇酯形成的絕緣性基板101上通過絲網(wǎng)印刷法涂布銀糊，形成導(dǎo)電片102和103及電極系的底層。然后，在基板101上涂布含有樹脂粘合劑的導(dǎo)電性碳糊形成包括工作電極104和配極105的電極系。此外，通過涂布絕緣糊形成絕緣層106。工作電極104和配極105分別與導(dǎo)電片102和導(dǎo)電片103相連。工作電極104及配極105的露出部分面積一定，且絕緣層106覆蓋部分導(dǎo)電片。
以上形成了電極系的絕緣性基板101、具有氣孔109的罩子108、隔板107及具有血細胞過濾功能的濾膜111按照圖中點劃線所示的位置關(guān)系相連形成生物傳感器。濾膜111嵌合在罩子108和絕緣性基板101間由隔板107的狹縫110形成的試樣溶液供給通道中。113a表示濾膜111的與絕緣性基板接觸的部分。濾膜111不覆蓋前述試樣溶液通道中的由工作電極104和配極105形成的電極系，而是被設(shè)置在電極系和基板上的試樣供給部位112間。
在以上構(gòu)成的生物傳感器的試樣供給部位112滴下血液，血液從濾膜111的試樣供給部位的端部滲入其內(nèi)部。由于濾膜內(nèi)血細胞的滲透速度比作為液體成分的血漿慢，所以血漿從濾膜的電極系端部滲出。滲出的血漿一邊使位于覆蓋電極的位置或其上的罩子內(nèi)面的由酶等組成的反應(yīng)試劑溶解，一邊填滿到氣孔109為止的整個試樣溶液供給通道。當(dāng)整個試樣溶液供給通道被液體填滿后，濾膜111內(nèi)的液體也停止流動，此時血細胞未到達濾膜的電極系端部，而是停留在原來的位置。
這樣經(jīng)過血細胞的過濾，血漿溶解的反應(yīng)試劑層與血漿中的測定成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，如果是膽甾醇傳感器就與膽甾醇發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)過一定時間后，利用電極反應(yīng)測定電流值，再由此測定血漿中的成分。
但是，在該生物傳感器的試樣供給部位112滴下的血液的一部分未被濾膜111的試樣供給部位端部吸收，而是被轉(zhuǎn)移到試樣溶液供給通道和濾膜111的接觸部位，這樣包含血細胞成分的血液直接到達反應(yīng)試劑層，其結(jié)果是，血細胞或血細胞內(nèi)的成分與反應(yīng)試劑發(fā)生反應(yīng)，使測定值出現(xiàn)誤差。
用粘合劑粘合濾膜111和試樣溶液供給通道的接觸部分可防止以上血液被轉(zhuǎn)移到濾膜111和試樣溶液供給通道的間隙的現(xiàn)象。
但是，所用粘合劑可能會改變血液成分。此外，濾膜111表面或試樣溶液供給通道的接觸部位需要涂布粘合劑，這樣制作工序就會變得復(fù)雜。
本發(fā)明的目的是對具備可使血細胞等固形成分過濾的濾膜的生物傳感器進行改進，解決以往技術(shù)中存在的上述問題。
本發(fā)明的目的是使傳感器中添加的試樣滲透入濾膜內(nèi)，但僅使透過濾膜的試樣溶液到達反應(yīng)試劑層及電極系，以此提供能夠顯現(xiàn)穩(wěn)定的感應(yīng)性的生物傳感器。
發(fā)明的揭示本發(fā)明的生物傳感器具備絕緣性基板、設(shè)置在前述基板上的至少具有工作電極和配極的電極系、與前述基板組合形成將試樣溶液從試樣供給部位導(dǎo)向前述電極系的試樣溶液供給通道的覆蓋部件、至少包含氧化還原酶和導(dǎo)電體的反應(yīng)試劑系統(tǒng)、設(shè)置在前述試樣溶液供給通道的電極系和試樣供給部位間的濾膜，該生物傳感器的特征是，從前述濾膜的試樣供給部位的端部到電極系的端部的區(qū)域內(nèi)具有包圍濾膜表面的空隙部分。
較好的實施方式中，前述試樣供給部位被設(shè)置在前述基板上，前述試樣溶液供給通道沿基板及覆蓋部件配置。
該實施方式中，包圍前述濾膜表面的空隙部分寬度最好在0.5mm以上。前述空隙部分寬度如果小于0.5mm，則轉(zhuǎn)移到形成試樣溶液供給通道的基板及/或覆蓋部件和濾膜的間隙的血液可能會因毛細管作用進入空隙部分。更好的是空隙部分寬度在0.5mm～5.0mm的范圍內(nèi)。如果超過5.0mm，則使傳感器振動的情況下濾膜可能會變形。前述空隙部分寬度最好在1.0mm～3.0mm的范圍內(nèi)。
其他較好的實施方式中，前述試樣供給部位被設(shè)置于前述覆蓋部件，前述試樣溶液供給通道從試樣供給部位開始沿重力方向配置。該實施方式中，包圍濾膜表面的空隙部分的寬度最好在100μm以上，小于前述濾膜的厚度。
所用濾膜由具備三維相連的空隙部分的多孔體形成，該多孔體通過毛細管作用將血液從前述試樣供給部位轉(zhuǎn)移到試樣溶液供給通道，并具備利用血漿和血細胞的流動阻力差對血細胞進行過濾的作用。該濾膜可采用玻璃纖維、纖維素、紙漿等親水性纖維形成的非織造布、濾紙及其他多孔體。
本發(fā)明適用于以膽甾醇氧化酶為氧化還原酶的膽甾醇傳感器。
膽甾醇傳感器的前述反應(yīng)試劑系統(tǒng)中最好包含能夠?qū)δ戠薮减ミM行分解的酶。這種能夠?qū)δ戠薮减ミM行水解的酶最好為膽甾醇酯酶，前述反應(yīng)試劑系統(tǒng)中最好還包含表面活性劑。
前述覆蓋部件及前述絕緣性基板的部分或全部最好是透明的。
對附圖的簡單說明

圖1為本發(fā)明實施方式之一的生物傳感器的除去了反應(yīng)試劑的分解立體圖。
圖2為同一生物傳感器的縱截面圖。
圖3為本發(fā)明另一實施方式中的生物傳感器的主要部分的平面圖。
圖4為本發(fā)明另一實施方式中的生物傳感器的縱截面圖。
圖5為本發(fā)明又一實施方式中的生物傳感器的縱截面圖。
圖6為同一傳感器的分解立體圖。
圖7為本發(fā)明另一實施方式中的生物傳感器的縱截面圖。
圖8為同一生物傳感器的分解立體圖。
圖9為已有技術(shù)中的生物傳感器除去了反應(yīng)試劑層的分解立體圖。
實施發(fā)明的最佳方式如上所述，本發(fā)明的生物傳感器的基板和覆蓋部件間形成的試樣溶液供給通道中具備設(shè)置在基板或覆蓋部件側(cè)的試樣供給部位和基板上的電極系間的濾膜。從前述濾膜的試樣供給部位的端部到電極系的端部的區(qū)域內(nèi)具有包圍濾膜表面的空隙部分。即，濾膜表面的周圍設(shè)置了不與形成試樣溶液供給通道的基板及覆蓋部件接觸的區(qū)域。
從某種角度看，本發(fā)明的生物傳感器具備絕緣性基板、設(shè)置在前述基板上的至少具有工作電極和配極的電極系、與前述基板組合形成將試樣溶液從基板上的試樣供給部位導(dǎo)向前述電極系的試樣溶液供給通道的覆蓋部件、至少包含氧化還原酶和導(dǎo)電體的設(shè)置在前述電極系上或其附近的反應(yīng)試劑系統(tǒng)、設(shè)置在前述試樣溶液供給通道的電極系和試樣供給部位間的濾膜，從前述濾膜的試樣供給部位的端部到電極系的端部的區(qū)域內(nèi)具有包圍濾膜表面的空隙部分。
從另一角度看，本發(fā)明的生物傳感器具備絕緣性基板、設(shè)置在前述基板上的至少具有工作電極和配極的電極系、與前述基板組合的覆蓋部件、形成于前述覆蓋部件和基板間的將試樣溶液從前述覆蓋部件的試樣供給部位導(dǎo)向基板上的電極系的試樣溶液供給通道、至少包含氧化還原酶和導(dǎo)電體的設(shè)置在前述電極系上或其附近的反應(yīng)試劑系統(tǒng)、設(shè)置在前述試樣溶液供給通道的電極系和試樣供給部位間的濾膜，從前述濾膜的試樣供給部位的端部到電極系的端部的區(qū)域內(nèi)具有包圍濾膜表面的空隙部分。
上述構(gòu)造使滴在試樣供給部位的血液等試樣溶液被前述濾膜吸收，血細胞等固形成分則被前述濾膜過濾，將試樣溶液沿試樣溶液供給通道導(dǎo)向電極系及反應(yīng)試劑層。其結(jié)果是，僅血細胞等固形成分被過濾了的試樣溶液到達了電極系。在試樣溶液供給通道的試樣供給部位附近，有時部分試樣溶液不是被濾膜吸收，而是從濾膜和試樣溶液供給通道的接觸部分的細小縫隙直接流入試樣溶液供給通道內(nèi)。但是，這部分試樣溶液在包圍前述濾膜表面的空隙部分被阻擋，不能夠進入其上的電極系。因此，含有血細胞等固形成分的試樣溶液不會從設(shè)有空隙部分的區(qū)域流向電極系。在試樣溶液供給通道中，反應(yīng)試劑層最好設(shè)置在電極系上或其附近。
構(gòu)成反應(yīng)試劑系統(tǒng)的氧化還原酶可采用各種不同的酶，例如，葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、膽甾醇氧化酶等。
測定血清膽甾醇值時，采用膽甾醇氧化酶和能夠使膽甾醇酯水解的酶?？墒鼓戠薮减ニ獾拿赴戠薮减ッ负椭鞍字久傅?。特別是膽甾醇酯酶，在使用了適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┑那闆r下，可迅速將膽甾醇酯轉(zhuǎn)變?yōu)槟戠薮肌?br> 使用可使膽甾醇酯水解的酶時，如果使反應(yīng)試劑中包含可提高酶活性的表面活性劑，則可大大縮短酶反應(yīng)所需時間。
例如，可使膽甾醇酯酶的活性得到提高的表面活性劑包括正辛基-β-D-硫葡糖苷、聚乙二醇一月桂醚、膽酸鈉、月桂基-β-麥芽糖苷、蔗糖-一月桂酸酯、脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、N，N-二(3-D-葡萄糖酰胺丙基)乙醇酰胺、N，N-二(3-D-葡萄糖酰胺丙基)脫氧乙醇酰胺、聚氧化乙烯-對叔辛基苯基乙醚(TritonX-100)等。
如果用鉑等電化學(xué)特性穩(wěn)定的金屬形成生物傳感器的電極系，則所得氧化電流值不會出現(xiàn)誤差。但是，這類金屬的價格較高，所以制作一次性傳感器時，用銀糊等形成銀電極，再用碳糊覆蓋該銀電極而形成碳電極，由該銀·碳電極形成電極系。如果試樣溶液中包含表面活性劑，則試樣溶液因表面活性劑的作用而浸入碳粒間。其結(jié)果是，碳電極的活性下降。此外，試樣溶液處于與銀電極接觸的狀態(tài)。因此，在這種狀態(tài)下如果對工作電極施加電壓，則銀電極會發(fā)生銀糊反應(yīng)產(chǎn)生電流，使測定電流值出現(xiàn)正誤差。
為了抑制上述現(xiàn)象，采取用親水性高分子覆蓋電極系表面的方法。該親水性高分子可抑制因試樣溶液的導(dǎo)入而形成粘稠的層導(dǎo)致試樣溶液與電極接觸的現(xiàn)象。
該親水性高分子包括羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、乙基纖維素、羥丙基纖維素、明膠、聚丙烯酸及其鹽、淀粉及其衍生物、馬來酸酐或其鹽的聚合物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯樹脂、聚-2-羥乙基甲基丙烯酸酯等。
為了抑制上述表面活性劑產(chǎn)生的影響，除了使用親水性高分子的方法之外，還可采用以下方法。即，僅用碳糊形成電極系的與試樣溶液接觸的部分，為確保導(dǎo)電性而使用的銀糊僅用在被絕緣層覆蓋的部分。使用該印刷電極時，可以不使用上述親水性高分子層，但上述親水性高分子還具有防止因試樣溶液或試樣溶液與反應(yīng)試劑的混合液中的蛋白質(zhì)等吸附在電極表面而使電極反應(yīng)活性下降的效果。因此，即使在使用了上述印刷電極的情況下，也最好同時使用親水性高分子。
由銀及碳形成生物傳感器的電極系的情況下，反應(yīng)試劑中含有導(dǎo)電體。
該導(dǎo)電體可選自鐵氰化鉀、對苯醌、吩嗪、二茂鐵衍生物(氧化型)等水溶性、且能夠在酶-電極間使電子轉(zhuǎn)移的化合物。
氧化電流的測定方法包括僅由工作電極和配極組成的二電極方式及工作電極、配極和參考電極組成的三電極方式。其中，三電極方式更能夠進行精確的測定。
以下，例舉具體實施方式
對本發(fā)明進行詳細說明。此外，附圖都只是簡圖，其中各要素的相對尺寸不一定準(zhǔn)確。
圖1為本發(fā)明實施方式之一的生物傳感器的分解立體圖。圖2為其縱截面圖。
利用絲網(wǎng)印刷法在由聚對苯二甲酸乙二醇酯形成的絕緣性基板1上涂布銀糊，形成導(dǎo)電片2、3及電極系的底層。然后，在該基板1上涂布含有樹脂粘合劑的導(dǎo)電性碳糊形成包含工作電極4和配極5的電極系。此外，涂布絕緣性糊狀物形成絕緣層6。工作電極4和配極5分別與導(dǎo)電片2和導(dǎo)電片3相連。絕緣層6覆蓋部分導(dǎo)電片，工作電極4和配極5的露出部分面積一定。
以上形成了電極系的絕緣性基板1、具有氣孔9的罩子8、隔板7及具有血細胞過濾功能的濾膜11按照圖中點劃線所示的位置關(guān)系相連，形成生物傳感器?；?和罩子8間通過隔板7的縫隙10沿基板1及罩子8形成了試樣溶液供給通道。濾膜11按嵌入該試樣溶液供給通道的大小截斷，被設(shè)置于電極系和試樣供給部位，但不覆蓋電極系。13a和13b分別表示濾膜11與絕緣性基板1及罩子8接觸的部分。
濾膜11的試樣供給部位12的端部到電極系的端部的區(qū)域中，為了在濾膜表面設(shè)置與形成試樣溶液供給通道的基板1、隔板7及罩子8不接觸的區(qū)域，在與基板1及隔板7分別對應(yīng)的位置設(shè)置了透孔14及15，并在罩子8上設(shè)置了與縫隙10相連的2個凹陷部分16。為了覆蓋基板1及罩子8上的透孔14及15，在它們的外面蓋上了蓋子17及18。由上述透孔14及15和凹陷部分16、16就形成了包圍濾膜11表面的空隙部分。
透孔14及15分別由蓋子17及18蓋著，但即使不蓋蓋子其功能也不會受損。但是，如果不蓋上蓋子，則濾膜11露出在外面，所以試樣溶液會從該部位蒸發(fā)，一旦液體通過濾膜到達電極系，就有可能出現(xiàn)液體逆流現(xiàn)象。因此，設(shè)置了覆蓋基板及罩子上的透孔的蓋子17及18。如果基板及蓋子具有一定的厚度，則設(shè)置凹陷部分代替透孔，就不需要蓋子17及18了。
在基板上的試樣供給部位12滴下試樣溶液，使該溶液與濾膜11的試樣供給部位端部接觸，則試樣溶液被濾膜11吸收，通過濾膜11除去其中的血細胞等固形成分，將血漿導(dǎo)入試樣溶液供給通道，再導(dǎo)入傳感器內(nèi)部。然后，血漿一邊溶解位于覆蓋電極的位置或其上的罩子內(nèi)面的反應(yīng)試劑，一邊從電極系附近開始直至填滿到氣孔9為止的整個試樣溶液供給通道。當(dāng)整個試樣溶液供給通道被液體填滿后，濾膜11內(nèi)的液體也停止流動，此時血細胞未到達濾膜的電極系端部，而是停留在原來的位置。因此，設(shè)計成從濾膜11僅通過可填滿整個試樣溶液供給通道的溶液量，血細胞未到達濾膜前端，血漿和血細胞間存在流通阻力差的樣式。
本實施例中，通過縫隙10形成的試樣溶液供給通道的試樣供給部位端部到氣孔9的外周的長度為12.5mm，縫隙10的寬度為2.0mm，縫隙10的深度為0.1mm。
透孔14及15的尺寸用(與基板長度方向垂直相交的方向的長度)×(基板的長度方向尺寸)表示為4.0×3.0mm，凹陷部分16的尺寸也同樣為4.0×3.0mm?；寮罢肿拥暮穸确謩e為0.35mm，隔板厚度為0.1mm。因此，具有上下為0.35mm、左右為2.0mm的厚度。通過試樣溶液前進方向的(以下簡稱為空隙部分的寬度)3.0mm的空隙部分包圍濾膜11。該空隙部分位于從試樣供給部位12的端部開始1mm到電極系端部3.0mm的位置。前述尺寸是較理想的實施方式的一個例子，但并不限于該尺寸。
圖2是生物傳感器的縱截面圖。基板1的電極系上形成了親水性高分子層21及覆蓋該高分子層的導(dǎo)電體層22。形成于隔板7的縫隙10的試樣溶液供給通道中配置了濾膜11。該濾膜11的端部可以與電極系接觸也可不接觸，但不與電極系中的工作電極4接觸。試樣溶液供給通道中，在罩子8的內(nèi)面由濾膜11的電極系端部和氣孔9形成的區(qū)域內(nèi)是酶及表面活性劑形成的層23。在層23與濾膜11的端部接觸的情況下，試樣溶液能夠很容易地流入層23，但這種接觸并不是必須的。
圖3是表示本發(fā)明另一實施方式的生物傳感器中的隔板和濾膜的位置關(guān)系的平面圖。形成試樣溶液供給通道的縫隙10中，嵌合了濾膜的部分10a和存在電極系、并有濾膜過濾的試樣溶液流過的部分10b的寬度是不同的。圖3中，嵌合了濾膜的部分10a比具有電極系的部分10b窄。
圖4是本發(fā)明另一實施方式的生物傳感器的縱截面圖。雖然該傳感器的結(jié)構(gòu)與圖2相同，但其中配置的反應(yīng)試劑不同。該例子中，在電極系上僅形成了親水性高分子層21，在罩子8一側(cè)設(shè)置了含浸及負載了酶、表面活性劑及導(dǎo)電體的多孔質(zhì)載體24，該載體與濾膜11的端部接觸。
圖5是本發(fā)明又一實施方式的生物傳感器的縱截面圖。圖6是該傳感器的除去了試劑層的分解立體圖。
與圖1相同，在絕緣性基板31上形成了導(dǎo)電片32和33，以及分別與導(dǎo)電片相連的工作電極34及配極35、絕緣層36。該基板31上組合了多個隔板41、43、45、47、49及罩子52，在隔板43和罩子52間設(shè)置了濾膜51。罩子52的透孔53構(gòu)成了試樣供給部位。設(shè)置于隔板41、43、45、47、49的透孔42、44、46、48及50使試樣溶液供給通道沿重力方向配置。隔板45及49的透孔46及50的孔徑比濾膜51的直徑大，所以在濾膜51周圍形成了包圍該濾膜51的空隙部分，該空隙部分用55及56表示。隔板47與濾膜51的部分外周相連，起到確定濾膜位置的作用。隔板41具有使前述試樣溶液供給通道的終端朝向大氣開放的氣孔54。因此，從形成位于電極系上方的試樣供給部位的透孔53到電極系的試樣溶液供給通道通過毛細管作用使試樣溶液沿重力方向?qū)?，如果通過濾膜51過濾的血漿到達電極系，則試樣溶液的流動停止。
決定包圍濾膜51的空隙部分55及56的高度的隔板49及45的厚度最好在100μm以上。隔板41的透孔42為試樣溶液與試劑的反應(yīng)提供了場所。隔板41的厚度最好為100～200μm。試樣溶液供給通道沿重力方向配置，可使試樣利用重力作用通過濾膜，然后迅速到達反應(yīng)試劑層。
該例子中，在電極系上形成了CMC層61及導(dǎo)電體層62，在隔板43的內(nèi)面形成了包含酶和表面活性劑的層63。
圖7是本發(fā)明另一實施方式的生物傳感器的縱截面圖。圖8是該傳感器除去了試劑層的分解立體圖。所示傳感器中除了用非織造布形成的試樣溶液誘導(dǎo)層57代替隔板43之外，其他都與圖5及6所示的傳感器大致相同。該例子中，在電極系上設(shè)置了CMC層61及包含酶、表面活性劑和導(dǎo)電體的層64。
以下，對本發(fā)明的實施例進行說明。
實施例1為了制作膽甾醇傳感器，首先，在圖1的絕緣性基板1上的電極系上滴下親水性高分子羧甲基纖維素的鈉鹽(以下稱為CMC)的0.5wt％水溶液，于50℃的溫風(fēng)干燥器中干燥10分鐘，形成CMC層21。然后，在CMC層上滴下導(dǎo)電體鐵氰化鉀的水溶液4μl(相當(dāng)于鐵氰化鉀70mM)覆蓋CMC層21，于50℃的溫風(fēng)干燥器中干燥10分鐘后，形成鐵氰化鉀層22。
此外，在罩子8和隔板7的縫隙10形成的凹部滴下作為表面活性劑的TritonX-100的2wt％乙醇溶液2μl，室溫干燥3分鐘后，形成表面活性劑層。然后，在溶解了來自奴卡氏菌的膽甾醇氧化酶(EC1.1.3.6，以下簡稱為ChOD)和來自假單胞菌的膽甾醇酯酶(EC.3.1.1.13，以下簡稱為ChE)的水溶液中添加TritonX-100。在表面活性劑層上滴下1.5μl該混合水溶液，通過液氮冷凍后，將其裝入梨形燒瓶內(nèi)，在冷凍干燥器中干燥一晚，形成含有1單位(U)/傳感器的膽甾醇氧化酶、2.5U/傳感器的膽甾醇酯酶及2wt％的表面活性劑的酶/表面活性劑層23。然后，將裁剪成2mm×8mm的長方形的玻璃薄膜(ADVANTEC公司制GC50，厚度為0.19mm)設(shè)置在圖1所示位置，使其不與工作電極接觸。
如圖1所示，為了在濾膜薄膜設(shè)置不與形成試樣溶液供給通道的絕緣性基板、隔板及罩子接觸的區(qū)域，在試樣溶液供給通道的設(shè)置了濾膜的位置上設(shè)置了透孔14及15和凹陷部分16、16。它們的尺寸如前所述。
在基板1的試樣供給部位12滴下作為試樣溶液的全血試樣20μl。然后，通過透明材料制成的罩子8目視觀察，確認(rèn)從濾膜過濾的液體到達試樣溶液供給通道的氣孔9的外周部分開始的3分鐘后，以配極為基準(zhǔn)從正極方向?qū)ぷ麟姌O施加+0.5V的脈沖電壓，測定5秒鐘后的電流值。其結(jié)果是，能夠獲得來源于血清中的膽甾醇濃度的感應(yīng)值。
本實施例中，通過冷凍干燥形成了酶/表面活性劑層，也可通過風(fēng)干形成該層。但是，這種情況下，由于反應(yīng)試劑層的溶解性大幅度惡化，所以過濾的液體從到達試樣溶液供給通道的氣孔9的外周部分到反應(yīng)結(jié)束需要很長時間。
實施例2實施例1中，在試樣溶液供給通道的罩子內(nèi)面通過冷凍干燥形成的酶/表面活性劑層23與覆蓋基板的電極系、通過風(fēng)干形成的CMC層21及鐵氰化鉀層22一起構(gòu)成了反應(yīng)試劑系統(tǒng)。本實施例中，如圖4所示，設(shè)置了含浸負載了酶、表面活性劑及導(dǎo)電體的多孔質(zhì)載體24，該載體與濾膜11的端部接觸，該載體和在覆蓋基板的電極系位置通過風(fēng)干的CMC層21形成反應(yīng)試劑系統(tǒng)。
多孔質(zhì)載體上負載的構(gòu)成反應(yīng)試劑系統(tǒng)的部分試劑與通過冷凍干燥負載的情況相同，都能夠提高反應(yīng)試劑對試樣溶液的溶解性。
首先，與實施例1同樣在電極系上滴下親水性高分子CMC的0.5wt％水溶液，于50℃的溫風(fēng)干燥器中干燥10分鐘，形成CMC層21。
然后，用纖維系粘合劑(塞梅代恩公司制塞梅代恩C)使裁剪成2×4.5mm的以玻璃纖維為主成分的毛氈形成的多孔質(zhì)載體24與濾膜11的端部接觸，將其粘合固定在圖4所示的試樣溶液供給通道的罩子側(cè)的位置。
與實施例1相同，在該多孔質(zhì)載體24上滴下溶解了膽甾醇氧化酶、膽甾醇酯酶、鐵氰化鉀及TritonX-100的水5μl，均勻滲透后，于50℃的溫風(fēng)干燥器干燥15分鐘。
然后，與實施例1同樣，配置濾膜11，粘合前述罩子部件和基板1，制成生物傳感器。但是，由于多孔質(zhì)載體24的厚度約為0.1～0.2mm，所以，與試樣溶液供給通道的濾膜11相比，電極系中的基板1和罩子8間的距離比實施例1的0.1mm大，為0.3mm。因此，實施例2所用的濾膜11為GB100R。
在試樣供給部位滴下全血試樣3分鐘后，上述生物傳感器可顯示出來源于膽甾醇濃度的感應(yīng)值。
以上實施例中，基板1及罩子8都是用透明材料制成的，這樣能夠通過目視確認(rèn)試樣的流動情況。
以上實施例中，形成試樣溶液供給通道的縫隙10的有濾膜嵌合的部分和存在電極系、有從濾膜過濾的試樣流入的部分的寬度是相同的，但任何一部分都可以采用較狹小的形狀。如此的例子中的隔板及濾膜的位置關(guān)系及形狀如圖5所示。
只要構(gòu)成反應(yīng)試劑系統(tǒng)的試劑的配置及負載方法能夠使構(gòu)成反應(yīng)試劑系統(tǒng)的試劑能夠迅速溶入試樣溶液，使酶反應(yīng)順利進行即可，并不僅限于本實施例的條件。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性如上所述，本發(fā)明通過防止含有血細胞等固形成分的試樣溶液中的固形成分與電極系或反應(yīng)試劑系統(tǒng)接觸，提供了測定精度和感應(yīng)值的穩(wěn)定性都有所提高的生物傳感器。
權(quán)利要求
1.生物傳感器，具備絕緣性基板、設(shè)置在前述基板上的至少具有工作電極和配極的電極系、與前述基板組合形成將試樣溶液從試樣供給部位導(dǎo)向前述電極系的試樣溶液供給通道的覆蓋部件、至少包含氧化還原酶和導(dǎo)電體的反應(yīng)試劑系統(tǒng)、設(shè)置在前述試樣溶液供給通道的電極系和試樣供給部位間的濾膜，其特征在于，從前述濾膜的試樣供給部位的端部到電極系的端部的區(qū)域內(nèi)具有包圍濾膜表面的空隙部分。
2.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中，前述覆蓋部件被設(shè)置在前述基板的上方，前述試樣溶液供給通道從設(shè)置在前述基板上的試樣供給部位開始沿前述覆蓋部件及基板配置。
3.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中，前述試樣供給部位位于前述電極系的一側(cè)。
4.如權(quán)利要求2或3所述的生物傳感器，其中，前述空隙部分的寬度為0.5mm～5.0mm。
5.如權(quán)利要求4所述的生物傳感器，其中，前述空隙部分的寬度為1.0mm～3.0mm。
6.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中，前述試樣溶液供給通道從設(shè)置于前述覆蓋部件的試樣供給部位開始沿重力方向配置。
7.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中，前述試樣供給部位位于前述電極系的上方。
8.如權(quán)利要求6或7所述的生物傳感器，其中，前述空隙部分的寬度在100μm以上，但小于前述濾膜的厚度。
9.如權(quán)利要求5或8所述的生物傳感器，其中，前述濾膜由具備三維相連的空隙部分的多孔體形成，所述多孔體利用毛細管作用將血液從前述試樣供給部位導(dǎo)向試樣溶液供給通道，具有利用血漿與血細胞的流動阻力差來過濾血細胞的作用。
10.如權(quán)利要求9所述的生物傳感器，其中，前述氧化還原酶為膽甾醇氧化酶。
11.如權(quán)利要求10所述的生物傳感器，其中，前述反應(yīng)試劑系統(tǒng)中包含可使膽甾醇酯水解的酶。
12.如權(quán)利要求11所述的生物傳感器，其中，前述可使膽甾醇酯水解的酶為膽甾醇酯酶。
13.如權(quán)利要求11或12所述的生物傳感器，其中，前述反應(yīng)試劑系統(tǒng)中包含表面活性劑。
14.如權(quán)利要求13所述的生物傳感器，其中，前述覆蓋部件及前述絕緣性基板的一部分或全部是透明的。
全文摘要
本發(fā)明提供了即使對含有血細胞等固形成分的試樣溶液也能夠進行高精度測定、且感應(yīng)值的穩(wěn)定性良好的生物傳感器。該生物傳感器具備絕緣性基板、設(shè)置在前述基板上的至少具有工作電極和配極的電極系、與前述基板組合形成將試樣溶液從試樣供給部位導(dǎo)向前述電極系的試樣溶液供給通道的覆蓋部件、至少包含氧化還原酶和導(dǎo)電體的反應(yīng)試劑系統(tǒng)、設(shè)置在前述試樣溶液供給通道的電極系和試樣供給部位間的濾膜,從前述濾膜的試樣供給部位的端部到電極系的端部的區(qū)域內(nèi)具有包圍濾膜表面的空隙部分。利用上述構(gòu)造使血細胞等固形成分被濾膜過濾而不流入電極系。
文檔編號G01N33/487GK1386194SQ01802234
公開日2002年12月18日 申請日期2001年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月31日
發(fā)明者山本智浩, 長谷川美和, 渡邊基一, 池田信, 南海史朗 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社