專利名稱：二十二碳六烯酸作為維甲酸x受體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及維甲酸X受體，下文稱作“RXR”。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及維甲酸X(retinoid x)受體的配體的識(shí)別以及與該識(shí)別相關(guān)的內(nèi)容。
背景和現(xiàn)有技術(shù)核受體(NR)超家族含有150種以上不同的蛋白質(zhì)，確信它們之中大部分具有配體激活的轉(zhuǎn)錄因子功能，這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)而產(chǎn)生廣泛的不同的生物學(xué)效應(yīng)(參見Di Croce等EMBO J 186201-6210(1999)；Mangelsdorf等Cell 83825-839(1995)；Perlmann等，Cell 90391-397(1997))。該家族的成員包括針對(duì)內(nèi)源性親脂小分子的受體，比如類固醇激素受體、維甲酸受體、維生素D受體、甲狀腺激素受體。此外，該家族的許多成員缺少已知配體，因而被稱作“孤兒受體”(參見Gigère等，Endocrine Rev 20689-725(1999)；Kastner，Cell 83859-869(1995))。
最近幾年，已經(jīng)識(shí)別了針對(duì)一些孤兒受體的小分子親脂性配體和激活劑，從而導(dǎo)致對(duì)這一領(lǐng)域更新的認(rèn)識(shí)，而這一認(rèn)識(shí)將帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。這些研究成果大大增強(qiáng)了人們對(duì)內(nèi)分泌學(xué)以及相關(guān)疾病的了解(Forman等Cell81687-693(1997)；Xu等，Mlo.Cell 3397-403(1999)；Makashima等，Science2841362-1365(1999)；Parks等，Science 2841365-1368(1999)；Wang等，MolCell 3543-553(1999)；Janowski等，Nature 383728-731(1996)；Kliewer等，Cell9273-82(1998)；Blumberg等，Genes Dev.123195-3205(1998))。然而，大部分孤兒受體的配體及其生物學(xué)功能仍有待闡明，使得通過(guò)鑒定新的核受體內(nèi)源性配體來(lái)弄清此前尚未鑒定的信號(hào)傳導(dǎo)途徑之重要性變得很重要(參見Mangelsdorf等Cell 83841-850(1995)；Giguère等，如上)。
維甲酸X受體(RXR)由維生素A代謝物9-順式視黃酸激活，該代謝物以高親和力結(jié)合RXR配體結(jié)合域。此外，RXR與包括視黃酸受體(RAR)及一些孤兒受體在內(nèi)的很多種核受體形成異源二聚體。正如基因敲除(geneabalation)實(shí)驗(yàn)所顯示的，RXR對(duì)于胚胎發(fā)育是必要的。此外，突變小鼠的遺傳分析顯示出RXR在成人，比如在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面具有重要功能。
長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為，膳食脂肪酸對(duì)于正常生長(zhǎng)、發(fā)育是必不可少的，可作為能量源、膜成分、以及作為必需的脂代謝物的前體(Salem等，In HealthEffects of Polyunsaturated Fatty Acids in Seafoods(1986)；Neuringer等，AnnRev Nutr 8517-541(1998)；Horrocks等，Pharmacological Res 40211-225(1999)；Xiang and Zetterstrm，Acta Paediatr 8878-82(1999))。脂肪酸被分為“非必需”脂肪酸和“必需”脂肪酸。必需脂肪酸不能在人體內(nèi)合成，必須通過(guò)膳食攝取。這些包括亞油酸(182n-6)，α-亞麻酸(183n-3)以及它們的延長(zhǎng)和非飽和產(chǎn)物花生四烯酸(204n-6)，二十二碳六烯酸(DHA；226n-3)。(脂肪酸命名參見Neuringer等的描述，文獻(xiàn)同上)?；ㄉ南┧崾嵌妓峄衔锏闹饕绑w，這是一個(gè)包括前列腺素、前列環(huán)素、白三烯、羥基脂肪酸等生物活性因子的大家族。這些代謝物作為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的化學(xué)遞質(zhì)而發(fā)揮作用，并且還顯示出調(diào)節(jié)離子運(yùn)輸、激素分泌和免疫應(yīng)答的功能。令人感興趣的是，體內(nèi)一些花生四稀酸代謝物及其它一些脂肪酸顯示出能作為過(guò)氧化物酶體增生劑激活的受體的配體，這表明它們?cè)隗w內(nèi)核受體信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中具有遞質(zhì)的作用。
與花生四稀酸代謝物相比，DHA的作用機(jī)制尚不清楚。令人感興趣的是，DHA在出生后的哺乳動(dòng)物CNS中高水平的積累表明DHA參與了CNS的成熟過(guò)程和/或神經(jīng)學(xué)過(guò)程。值得注意的是，DNA缺陷將導(dǎo)致人的神經(jīng)異常和學(xué)習(xí)能力的喪失(參見Gamoh等Neurosci93237-241(1999)；Femstrom，Lipids 34161-169(1999)；Sheaff Greiner等Lipids Suppl 34239-243(1999))。并且，膳食DHA對(duì)于治療動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥和癌癥都是有益的(Horrocks等Pharmacol Res 40211-225(1999)；Rose等，Pharmacol Theraput 83217-244(1999))。
目前可以肯定的是DHA具有作為RXR配體的功能，正如這里所闡明的，DHA可以以完整或部分的形式通過(guò)激活RXR而表現(xiàn)其生物學(xué)活性。這種途徑在現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有提及，它是本發(fā)明的特征，在此詳細(xì)闡述。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B顯示經(jīng)鼠外植體生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基對(duì)GAL 4-RAR和GAL4-RXR構(gòu)建體的激活具有發(fā)育階段特異性。
圖2提供了經(jīng)不同組織生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基激活效果的比較數(shù)據(jù)。
圖3A和3B分別顯示不同多不飽和脂肪酸以及它們對(duì)RXR激活效果的比較結(jié)果(3A)、不同濃度和它們的效果的比較結(jié)果(3B)。
圖4顯示使用二十二碳六烯酸進(jìn)行蛋白結(jié)合研究的結(jié)果。
優(yōu)選實(shí)施例的詳述實(shí)施例1本實(shí)施例所述實(shí)驗(yàn)旨在確定體內(nèi)內(nèi)源維甲酸受體配體的存在。為達(dá)到這一目的，使用UAS螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體和表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染來(lái)源于人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3的細(xì)胞。表達(dá)載體可以是pCMX-GAL4-RAR或pCMX-GAL4-RXR。表達(dá)載體包含一種編碼酵母GAL4結(jié)合域(氨基酸l-147)的構(gòu)建體，并與人RAR或人RXR的配體結(jié)合域共處一個(gè)閱讀框內(nèi)。按照引入本文作參考的Perlmann等，Genes Dev 9769-782(1995)所描述的磷酸鈣法在24孔板上進(jìn)行三份平行轉(zhuǎn)染。每孔使用100ng UAS螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體，100ng表達(dá)質(zhì)粒，200ng參考質(zhì)粒，即含有細(xì)菌β-半乳糖苷酸酶基因的pCMX-βGal進(jìn)行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染之后6-8小時(shí)，加入含10％活性炭剝離的胎牛血清，1％青霉素/鏈霉素以及1％L-谷氨酰胺的新鮮培養(yǎng)基以及小鼠組織外植體，其解釋如下小鼠組織外植體為本研究提供了潛在的內(nèi)源配體源。為達(dá)到此目的，對(duì)成年野生型NMRI小鼠經(jīng)其升主動(dòng)脈灌注冷磷酸鹽緩沖液以移走血管中的血液。解剖器官，并用剪刀剪成小塊，放入極限必需培養(yǎng)基中，采用同樣的方式從野生型胚胎(E13.5)中收集胚胎組織。然后或?qū)⒔M織直接放到轉(zhuǎn)染細(xì)胞上或在培養(yǎng)基中溫育37℃過(guò)夜。然后將條件培養(yǎng)基同組織分開，等份后冷凍，直至對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示。
研究發(fā)現(xiàn)胚胎CNS包含能激活RAR的配體，即E13.5。如圖1A所示，經(jīng)胚胎脊索和腦生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基都能激活GAL4-RAR但是不激活GAL4-RXR。值得注意的是，使用成人CNS組織獲得如圖1B所示的相反結(jié)果。比如，由8周齡鼠腦組織生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基激活了GAL4-RXR，而僅適度增加了GAL4-RAR的活性。
實(shí)施例2RXR是許多核受體共同的異源二聚體配偶體，以下實(shí)驗(yàn)旨在確定經(jīng)成人腦生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基是直接激活RXR配體結(jié)合域，還是激活在被轉(zhuǎn)染的JEG-3細(xì)胞中表達(dá)的RXR異源二聚化配偶體。
實(shí)驗(yàn)使用編碼受體Nurr-1的配體結(jié)合域的構(gòu)建體，該受體是與RXR異源二聚化的孤兒核受體。RXR是RXR-Nurr-1異源二聚體可以接受的異源二聚化配偶體，在這類復(fù)合體中可以被配體有效地激活。
與上述平行的構(gòu)建體即pCMX-GAL4-NURR1用于作餌，與存在于構(gòu)建體pCMX-RXR中的野生型RXR在細(xì)胞JEG-3中共同表達(dá)。如上所述的分析方法同樣用于本次分析。GAL4-NURR1或RXR表達(dá)載體同UAS螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，在腦組織生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基作用下被有效激活。相比之下，當(dāng)野生型RXR沒(méi)有同GAL4-NURR載體共轉(zhuǎn)染時(shí)，只能觀察到適度的激活作用，推測(cè)這是在過(guò)表達(dá)的GAL4-NURR1和外源RXR之間的異源二聚化所導(dǎo)致的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明RXR是成人腦所產(chǎn)生的激活作用的直接激活目標(biāo)。
進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)經(jīng)源自外周組織的外植體生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基激活GAL4-NURR1/RXR的效果。結(jié)果如圖2所示。經(jīng)睪丸和心臟生長(zhǎng)過(guò)的培養(yǎng)基激活了報(bào)告基因250-300倍，在源自脾、腎和肺的CM中表現(xiàn)出中度激活。經(jīng)腦生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基對(duì)報(bào)告基因的激活程度最高。這些結(jié)果提示使用經(jīng)成人腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)對(duì)成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織進(jìn)行研究時(shí)，經(jīng)海馬回生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基同經(jīng)其它組織如紋狀體、運(yùn)動(dòng)皮層、小腦以及脊索組織生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基相比較表現(xiàn)出最強(qiáng)的信號(hào)。不過(guò)，如圖2所示，上述所有組織中都觀察到活性，表明RXR激活因子在腦內(nèi)廣泛分布。
實(shí)施例3本實(shí)驗(yàn)描述了在分離配體方面的其它工作。經(jīng)腦生長(zhǎng)過(guò)的條件培養(yǎng)基與等體積的己烷混合，強(qiáng)烈震蕩5分鐘?；旌衔镆?2000rpm離心10分鐘以分相。分相之后，將上層相移至一干凈管中。重復(fù)抽提水相，集中兩次所得有機(jī)相。隨后，己烷抽提物在氮?dú)庀抡舭l(fā)。殘余物在小量純乙醇中重新溶解并如上所述進(jìn)行檢測(cè)。
在平行試驗(yàn)中，使用鹽酸預(yù)處理培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，使用鹽酸預(yù)處理提高了產(chǎn)量，表明活性物質(zhì)是親脂性的帶負(fù)電荷的分子。
實(shí)施例4
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)用于純化活性成分至均一。具體地說(shuō)，蒸發(fā)除去條件培養(yǎng)基中的己烷抽體物，殘余物重新溶解在200ml己烷中。樣品(150ml)注射至標(biāo)準(zhǔn)相HPLC柱上，使用從己烷到己烷/二氯甲烷/異丙醇(85∶10∶5v/v)的線性梯度(這兩種洗脫液都含有1％的乙酸)，以0.5ml/min的流率洗脫30分鐘。注入樣品17分鐘后收集30個(gè)級(jí)份，每一級(jí)份包含樣品0.25ml。這些級(jí)份通過(guò)如上所述方法進(jìn)行分析。集中活性級(jí)份、蒸發(fā)至干燥，重新溶解在50μl、80％甲烷中，將其中30μl的樣品注入到反相HPLC柱上。流動(dòng)相甲烷/異丙醇/水(80∶10∶10v/v)含有1％乙酸，以0.3ml/min的速率流動(dòng)。使用如上所述方法在被轉(zhuǎn)染的JEG-3細(xì)胞中對(duì)等樣式份進(jìn)行檢測(cè)。
使用電噴射質(zhì)譜學(xué)分析活性級(jí)份，結(jié)果顯示活性分子具有化學(xué)結(jié)構(gòu)式C22H31O2。假設(shè)該分子是去質(zhì)子化離子，因此活性化合物的結(jié)構(gòu)式為C22H32O2。這正是二十二碳六烯酸的結(jié)構(gòu)式。順4，7，10，13，16，19-DHA的[M-H]-離子碰撞誘導(dǎo)解離光譜與上述活性級(jí)份有相當(dāng)大的相似性，就此得出結(jié)論上述活性分子是順4，7，10，13，16，19-DHA。
實(shí)施例5鑒于如上所示結(jié)果，對(duì)各種多不飽和脂肪酸進(jìn)行了檢測(cè)，以確定在用GAL4-Nurr1和RXR表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，它們是否激活了報(bào)告基因。具體的，取每種多不飽和脂肪酸各20μM加入到細(xì)胞中，如上所述方法檢測(cè)活性。受到檢測(cè)的多不飽和脂肪酸為亞油酸(18∶2)，亞麻酸(18∶3)，花生四烯酸(20∶4)，二十一碳二烯酸(21∶2)，山崳酸(22∶0)，二十二碳二烯酸(22∶2)，二十二碳三烯酸(22∶3)，二十二碳四烯酸(22∶4)，二十二碳五烯酸(22∶5)，二十二碳六烯酸(22∶6)，甲基化二十二碳六烯酸(22∶6met)。
結(jié)果如圖3A所示，并顯示出當(dāng)其它被檢測(cè)的分子表現(xiàn)為中度活性時(shí)，二十二碳六烯酸顯示出強(qiáng)烈的激活活性。
在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，改變用于檢測(cè)的DHA、亞油酸、亞麻酸、油酸的濃度(1μM到250μM)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3B中顯示，表示為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的倍數(shù)誘導(dǎo)并與β-半乳糖苷酸酶對(duì)照進(jìn)行比較，這些后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明DHA是最有效的激活劑，它的EC50為約30μM。
實(shí)施例6本實(shí)驗(yàn)旨在確定DHA是否借助配體與RXR的配體結(jié)合域的直接結(jié)合而發(fā)揮其作用。已知配體激活的核受體與輔激活物結(jié)合，輔激活物包括稱之為SRC-1的分子。要實(shí)現(xiàn)該目的，人RXR和鼠ER的配體結(jié)合域作為GST融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，按照Cavailles等Proc.Nat.Acad.Sci USA91(21)10009-13(1994)結(jié)合到谷胱苷肽-Sepharose珠上，而基于含SRC-lecDNA的Psa5的構(gòu)建體被用于通過(guò)市售系統(tǒng)產(chǎn)生[35S]甲硫氨酸標(biāo)記蛋白。標(biāo)記的SRC-1蛋白與被GST或GST融合蛋白標(biāo)記的珠，在DMSO、1μM雌二醇或DHA存在下，以不同的濃度，在NETN緩沖液(0.5％NP-40，20mM Tris-HCL，pH8.0，100mM Nacl，1mM EDTA)以及蛋白酶抑制劑中共同溫育?；旌衔餃赜^(guò)夜，用NETN緩沖液將游離蛋白從珠上洗下來(lái)。結(jié)合的蛋白用加樣緩沖液洗脫，SDS-PAGE分離，并用熒光顯影觀察。
結(jié)果如圖4所示。當(dāng)DHA存在時(shí)，不能有效結(jié)合RXR配體結(jié)合域與[35S]甲硫氨酸標(biāo)記的SRC-1片段有效的結(jié)合；當(dāng)DHA不存在時(shí)，不能有效結(jié)合。這表明DHA直接結(jié)合RXR配體結(jié)合域，導(dǎo)致與SRC-1有效的相互作用。
上述實(shí)施例表明，二十二碳六烯酸或“DHA”已經(jīng)被鑒定為維甲酸X受體或“RXR”的天然配體。這使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能確定特定物質(zhì)是否是RXR的拮抗物或激動(dòng)劑。簡(jiǎn)而言之，可以通過(guò)感興趣的物質(zhì)與受體或其中包含了受體的配體結(jié)合域的分子，以及DHA相結(jié)合來(lái)確定。由于DHA是RXR的配體，人們可以在所感興趣的分子存在或不存在的條件下，比較DHA與靶分子的結(jié)合。通過(guò)這種方式，人們可以確定這種感興趣的分子是否真的與RXR結(jié)合。進(jìn)一步的，通過(guò)比較所述分子對(duì)RXR分子的效應(yīng)，可以確定它是激活劑還是拮抗劑。
本文描述的系統(tǒng)可以在細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞環(huán)境中使用。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)是已知的，這里無(wú)需描述。這些都可以使用與實(shí)施例描述相近的方法，用轉(zhuǎn)染細(xì)胞確定感興趣分子的活性。
類似的，認(rèn)識(shí)到DHA是RXR的結(jié)合配體，提示出一種確定分子在治療和/或控制需要調(diào)節(jié)RXR的狀態(tài)下的治療價(jià)值的方法。通過(guò)使用與識(shí)別激活劑或拮抗劑同樣的技術(shù)，可以鑒別具有治療用途的可以被用于抑制或激活RXR的物質(zhì)，也可以確定受體的效應(yīng)。使用DHA增強(qiáng)信號(hào)傳遞的典型病癥是糖尿病和乳腺癌。參見Mukeherjee等，Nature 386407-410(1997)；Gottardis等，Canc.Rec.565566-70(1996)，其顯示增強(qiáng)的RXR信號(hào)在這些病癥中是有益的。天然DHA或合成DHA都可以使用，前者是優(yōu)選。RXR和許多核受體的異源二聚化配偶體，這一事實(shí)顯示RXR配體比如DHA的給藥，將有益于治療一些依賴異源二聚化而上調(diào)基因的疾病。
應(yīng)注意到這里使用“RXR”時(shí)，包含配體結(jié)合域或“LBD”的任何形式的分子也是本發(fā)明所期望的，包括LBD本身，完整的RXR分子以及中等大小的分子，即至少包含LBD但并非全部的分子。本文中“LBD”指，與DHA結(jié)合所需的分子的最小部分。
本文中“RXR”指任何形式的RXR分子。哺乳動(dòng)物形式，尤其人的RXR形式都是優(yōu)選的，但是其它形式如鼠的以及其它嚙齒類動(dòng)物的形式也可使用?！癉HA”也指任何形式的分子，如標(biāo)記形式的等等。
本發(fā)明的其它方面對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是清楚的，這里無(wú)需贅述。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)和解釋作為一種描述用語(yǔ)而并非一種限制，在使用這些術(shù)語(yǔ)和解釋時(shí)，申請(qǐng)人不想排除對(duì)其它特征或部分的任何等價(jià)形式的描述?？梢哉J(rèn)識(shí)到，各種修改都有可能在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種確定物質(zhì)是否結(jié)合維甲酸X受體(RXR)的方法，包括在二十二碳六烯酸(DHA)存在的情況下將所述物質(zhì)與維甲酸X受體(RXR)接觸，并且確定所述物質(zhì)是否抑制DHA與RXR的結(jié)合，抑制則表明所述物質(zhì)與RXR結(jié)合。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的RXR包括RXR的配體結(jié)合域。
3.權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的RXR是哺乳動(dòng)物RXR。
4.權(quán)利要求3所述方法，其中所說(shuō)的哺乳動(dòng)物RXR是人RXR。
5.權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的RXR存在于細(xì)胞表面。
6.權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的RXR存在于用編碼RXR的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的表面。
7.權(quán)利要求1所述方法，包括確定報(bào)告分子的表達(dá)，從而確定所述物質(zhì)的結(jié)合。
8.權(quán)利要求7所述方法，其中所說(shuō)的報(bào)告分子是熒光分子，化學(xué)發(fā)光分子或發(fā)光分子。
9.權(quán)利要求8所述方法，其中所說(shuō)的報(bào)告分子是螢光素酶。
10.權(quán)利要求7所述方法，其中所說(shuō)的報(bào)告分子由轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)。
11.一種增加維甲酸X受體(RXR)活性的方法，包括將所說(shuō)的RXR與所說(shuō)的RXR結(jié)合配體接觸。
12.權(quán)利要求11所述方法，其中所說(shuō)的配體是二十二碳六烯酸。
13.權(quán)利要求11所述方法，其中所說(shuō)的配體是同所說(shuō)的RXR相結(jié)合的分子，該配體與RXR的結(jié)合比二十二碳六烯酸與RXR的結(jié)合有更大親和力。
14.一種抑制維甲酸X受體(RXR)活性的方法，包括將所說(shuō)的RXR與結(jié)合所說(shuō)的RXR的分子相接觸，該分子抑制二十二碳六烯酸與RXR的結(jié)合。
15.權(quán)利要求11所述方法，包括向有需要的受試者給藥所說(shuō)的DHA。
16.權(quán)利要求15所述方法，其中所說(shuō)的受試者患有糖尿病或乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)維甲酸X受體的配體的鑒別。具體地，將二十二碳六烯酸鑒定為一種RXR配體。并提供了基于這一研究所建立的各種檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1427952SQ01809212
公開日2003年7月2日 申請(qǐng)日期2001年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月24日
發(fā)明者托馬斯·珀?duì)柭? 亞歷山大·馬塔德厄奎扎, 瑪麗亞·肖柏格, 利厄·蘇亞, 簡(jiǎn)·肖瓦爾, 威廉·格里菲思, 羅爾夫·澤特斯特羅姆 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究院