專利名稱：P－選擇蛋白、p－和e－選擇蛋白復合物的晶體結構及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及P-選擇蛋白的凝集素和EGF樣(LE)域的晶體和三維結構，均與SLeX復合的P-選擇蛋白LE和E-選擇蛋白LE的晶體和三維結構，以及與通過酪氨酸硫酸化和SLeX修飾的功能PSGL-1肽復合的P-選擇蛋白LE的晶體和三維結構。這些結構對于設計和選擇可干擾炎癥過程中白細胞的細胞滾動(cellular rolling)的試劑至關重要。
背景技術：
選擇蛋白是一個細胞表面糖蛋白家族，負責白細胞向炎癥部位募集(recriutment)的早期粘附事件及其向淋巴組織的遷移(Kansas，1996和Vestweber和Blanks，1999綜述)。作為多步過程的一部分(Springer，1994)，選擇蛋白促進白細胞在血管壁上的最初粘附(粘連)及隨后的滾動，由于暴露于局部產(chǎn)生的化學因子，白細胞被激活。整聯(lián)蛋白介導的白細胞的牢固粘附先于白細胞向下面組織的滲出。P-選擇蛋白(CD62P)和E-選擇蛋白(CD62E)受炎癥刺激影響在血管內(nèi)皮表面誘導。P-選擇蛋白也由活化的血小板表達，在被炎癥介質誘導后，在幾分鐘內(nèi)從胞內(nèi)儲藏所移位到細胞表面。E-選擇蛋白被轉錄調節(jié)并在血管內(nèi)皮激活數(shù)小時內(nèi)出現(xiàn)。L-選擇蛋白(CD62L)是選擇蛋白家族的第三個成員，在白細胞上組成型表達。除了在炎癥中的作用外，L-選擇蛋白還介導淋巴細胞在由血管向淋巴組織遷移過程中與特化的高內(nèi)皮微靜脈的附著。
選擇蛋白共有許多結構和功能性質。它們含有高度同源的N端鈣依賴的(C-型，Drickamer，1988)凝集素域、表皮生長因子(EGF)樣域、數(shù)量不等的補體調節(jié)樣單元、跨膜域和胞內(nèi)區(qū)。公認選擇蛋白結合主要通過凝集素域與對面細胞上的聚糖配體之間的弱蛋白質-碳水化合物相互作用介導。已經(jīng)描述了大量不同的聚糖結構能支持和/或抑制選擇蛋白結合。然而，唾液酰LewisX(SLeX，NeuNAc2，3Gal1，4[Fuc1，3] GlcNAc)四糖展示的表位和相關結構似乎是所有3種選擇蛋白共有的生理相關識別成分(Foxall等人，1992)。不同結構的表觀高親和力(或親合力)的特異糖蛋白反受體的分離提示用于識別的其它因子。包括GlyCAM-1(Lasky等人，1992)、MAdCAM-1(Berg等人，1993)、CD34(Baumheuter等人，1993)、ESL-1(Levinovitz等人，1993)和PSGL-1(Moore等人，1992；Sako等人，1993)。然而，只有有限的證據(jù)表明，這些高度糖基化的蛋白質實際上提高細胞或組織特異的糖基化能力(即產(chǎn)生SLeX-樣聚糖的能力)，而不是特異糖蛋白的表達，最終導致選擇蛋白反應性。一個明確的例外是PSGL-1，它是實際上由白細胞的所有亞類表達的一種粘蛋白樣同型二聚體糖蛋白(Yang等人，1999，McEver和Cummings，1997綜述)。預計P-選擇蛋白識別將依賴于PSGL-1粘蛋白樣區(qū)內(nèi)的聚糖的SLeX-樣修飾，它是定位于粘蛋白域之外的多肽骨架的陰離子、N-端部分的一個必需結合表位(Pouyani和Seed，1995；Sako等人，1995；Wilkins等人，1995)。大量研究證實，將該多肽決定簇靶定PSGL-1內(nèi)能大大減弱P-選擇蛋白介導的結合和體內(nèi)炎癥反應(McEver和Cummings，1997；Yang等人，1999)。而且，最近對PSGL-1遺傳缺陷小鼠的研究顯示，P-選擇蛋白介導的白細胞滾動和炎癥募集明顯缺陷(Yang等人，1999)。因此，PSGL-1是選擇蛋白反受體的一個例子，其中多肽和SLeX-修飾聚糖成分是生理相關結合所需的。
根據(jù)它們在脈管系統(tǒng)內(nèi)遇到的剪切應力影響下作為細胞粘附和滾動介質的獨特功能，為表征選擇蛋白相互作用的內(nèi)在的生物物理和分子基礎進行了大量工作。選擇蛋白與其配體結合和解離具有快速的結合動力學(Alon等人，1997；Alon等人，1995)，這一特性似乎部分負責它們介導短暫粘連和細胞滾動現(xiàn)象的能力。似乎也涉及其它因素，包括選擇蛋白相互作用的機械(Alon等人，1995；Puri等人，1998)和獨特結構特性(Chen等人，1997)，但是由于缺乏與生理配體復合的選擇蛋白的高分辨率分子結構，它們?nèi)晕赐耆碚鳌榱丝朔@種限制已經(jīng)進行了大量努力，但迄今為止仍未完成。以前曾經(jīng)描述了含有凝集素和EGF域(lec/EGF)的E-選擇蛋白構建體的X-射線晶體結構(Graves等人，1994)，結合定點誘變研究(Kansas，1996)提示位于凝集素域內(nèi)的推斷的SLeX結合部位。用與寡甘露糖結合的同源大鼠血清甘露糖結合蛋白(MBP-A)的X-射線晶體結構(Weis等人，1992)作為指導，根據(jù)SLeX的游離或結合溶液結構的分子?？?docking)(Poppe等人，1997，和此處的參考文獻)，提出了SLeX與E-選擇蛋白晶體結構結合的模型(Graves等人，1994；Kogan等人，1995；Poppe等人，1997)。然而，還沒有確定與SLeX-樣糖配體復合的E-選擇蛋白或其它選擇蛋白的結構，來證實這些假說。實際上，在本發(fā)明之前，由于用來形成選擇蛋白晶體的高濃度鈣的阻斷作用，不能獲得這種晶體。
迄今為止，突變后含有E-選擇蛋白殘基的MBP-A(K3突變體)與SLeX和有關聚糖共復合的晶體結構(Ng和Weis，1997)是選擇蛋白如何與其配體結合的唯一直接信息?？偠灾?，這些模型和實驗確定的結構支持這樣一種SLeX結合模式Fuc部分的兩個羥基與凝集素域結合鈣連接，其它的結合作用也許由Gal的羥基和NeuNAc的羧酸部分介導。然而，該模型和MBP-A K3突變體/SLeX晶體結構在結合部位內(nèi)SLeX的方向和分子接觸的同一性上不同。
對高親和力P-選擇蛋白/PSGL-1相互作用的結構基礎的了解也是不完全的，識別取決于碳水化合物和多肽成分的發(fā)現(xiàn)使其更加復雜。誘變研究集中于PSGL-1的N端，證實P-選擇蛋白同時識別PSGL-1多肽陰離子區(qū)內(nèi)的一個或多個硫酸酪氨酸殘基和可能位于該區(qū)的含SLeX的O-聚糖(Pouyani和Seed，1995；Ramachandran等人，1999；Sako等人，1995；Wilkins等人，1995)。盡管預計推斷的SLeX結合部位在選擇蛋白之間類似，并且也許參與PSGL-1的SLeX成分與P-選擇蛋白的結合，但是介導與PSGL-1多肽相互作用的P-選擇蛋白域的身份和結構基礎還不清楚。在對于白細胞向炎癥部位補充方面也許十分重要的嗜中性粒細胞-嗜中性粒細胞相互作用中，L-選擇蛋白也識別PSGL-1(Kansas，1996；Vestweber和Blanks，1999)。這種相互作用也受PSGL-1多肽N端突變的影響(Ramachandran等人，1999)，提示P-選擇蛋白和L-選擇蛋白有共同的結合條件。相反，還沒有證實E-選擇蛋白與PSGL-1或其它顯示SLeX的反受體的結合需要多肽成分。
發(fā)明概述本發(fā)明提供P-選擇蛋白的凝集素和EGF樣(LE)域(“P-選擇蛋白LE”)的晶體，以及由P-選擇蛋白LE晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)得出的P-選擇蛋白LE的三維結構。具體而言，P-選擇蛋白LE的三維結構由圖2所示的結構坐標定義，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。P-選擇蛋白LE三維結構的結構坐標可用于大量用途，包括但不限于P-選擇蛋白LE的不同活性部位(包括SLeX結合部位)的顯示、鑒定和表征。這些活性部位結構然后可用于設計可與P-選擇蛋白LE相互作用的試劑，以及與SLeX、PSGL-1或有關分子復合的P-選擇蛋白LE。
本發(fā)明也提供與SLeX復合的P-選擇蛋白LE的晶體，以及由P-選擇蛋白LE∶SLeX晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)得出的P-選擇蛋白LE和SLeX的三維結構。具體而言，P-選擇蛋白LE和SLeX的三維結構由圖3所示的結構坐標定義，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。P-選擇蛋白LE和SLeX的結構坐標可用于大量用途，包括但不限于P-選擇蛋白、SLeX和P-選擇蛋白LE∶SLeX復合物的不同活性部位(包括SLeX結合部位)的顯示、鑒定和表征。這些活性部位結構然后可用于設計可與P-選擇蛋白LE、SLeX相互作用的不同試劑，以及與SLeX、PSGL-1或有關分子復合的P-選擇蛋白LE。
本發(fā)明還提供與SLeX復合的E-選擇蛋白的凝集素和EGF(LE)域(“E-選擇蛋白LE”)的晶體，以及由E-選擇蛋白LE∶SLeX晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)得出的E-選擇蛋白LE和SLeX的三維結構。具體而言，E-選擇蛋白LE和SLeX的三維結構由圖4所示的結構坐標定義，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。E-選擇蛋白LE和SLeX的三維結構坐標可用于大量用途，包括但不限于E-選擇蛋白LE、SLeX和E-選擇蛋白LE∶SLeX復合物的不同活性部位(包括SLeX結合部位)的顯示、鑒定和表征。這些活性部位結構然后可用于設計可與E-選擇蛋白LE、SLeX相互作用的不同試劑，以及與SLeX、PSGL-1或有關分子復合的E-選擇蛋白LE。
另外，本發(fā)明提供了與通過酪氨酸硫酸化和SLeX修飾的功能性PSGL-1肽復合的P-選擇蛋白LE的晶體結構，以及由P-選擇蛋白LE∶PSGL-1肽晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)得出的P-選擇蛋白LE和PSGL-1肽的三維結構。具體而言，P-選擇蛋白LE和PSGL-1肽的三維結構由圖5所示的結構坐標定義，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。P-選擇蛋白LE和PSGL-1肽的結構坐標可用于大量用途，包括但不限于P-選擇蛋白LE、PSGL-1肽和P-選擇蛋白LE∶PSGL-1復合物的不同活性部位(包括SLeX和PSGL-1結合部位)的顯示、鑒定和表征。這些活性部位結構然后可用于設計可與P-選擇蛋白LE、PSGL-1相互作用的不同試劑，以及與SLeX、PSGL-1或有關分子復合的P-選擇蛋白LE。
本發(fā)明也涉及SLeX結合蛋白或肽的活性部位，優(yōu)選地P-選擇蛋白LE的SLeX結合部位，它包括根據(jù)圖3的氨基酸殘基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。此外，除了上述結構坐標外，該活性部位還包括根據(jù)圖3的氨基酸殘基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。SLeX活性部位可對應于P-選擇蛋白LE在與一種試劑(優(yōu)選地SLeX)結合狀態(tài)或未結合狀態(tài)的構型。
本發(fā)明還涉及SLeX結合蛋白或肽的活性部位，優(yōu)選地E-選擇蛋白LE的SLeX結合部位，它包括根據(jù)圖4的氨基酸殘基TYR48、GLU80、ASN82、ASN83、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。此外，除了上述結構坐標外，該活性部位還包括根據(jù)圖4的氨基酸殘基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。SLeX活性部位可對應于E-選擇蛋白LE在與一種試劑(優(yōu)選地SLeX)結合狀態(tài)或未結合狀態(tài)的構型。
另外，本發(fā)明提供了PSGL-1結合蛋白或肽的活性部位，優(yōu)選地P-選擇蛋白LE的PSGL-1結合部位，它包括根據(jù)圖5的氨基酸殘基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和結合鍶的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。此外，除了上述結構坐標外，該活性部位還包括根據(jù)圖5的氨基酸殘基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。PSGL-1活性部位可對應于P-選擇蛋白LE在與一種試劑(優(yōu)選地PSGL-1或PSGL-1肽)結合狀態(tài)或未結合狀態(tài)的構型。
另外，本發(fā)明還提供一種鑒定可與P-選擇蛋白LE相互作用的試劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖2、圖3或圖5的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生P-選擇蛋白LE的三維模型；(b)用該三維結構設計或選擇一種試劑。
另外，本發(fā)明還提供一種鑒定含有SLeX結合部位的分子或分子復合物的激活劑或抑制劑的方法，包括下列步驟(a)利用(i)根據(jù)圖3的殘基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，或(ii)根據(jù)圖4的氨基酸殘基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生含有SLeX結合部位的分子或分子復合物的三維模型；(b)用步驟(a)產(chǎn)生的三維模型進行計算機擬合分析，選擇或設計候選激活劑或抑制劑。在另一個實施方案中，根據(jù)圖3的相對結構坐標還包括氨基酸殘基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。在另一個實施方案中，根據(jù)圖4的相對結構坐標還包括氨基酸殘基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
本發(fā)明還提供一種鑒定含有PSGL-1結合部位的分子或分子復合物的激活劑或抑制劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖5的氨基酸殘基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和結合鍶的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生含有PSGL-1結合部位的分子或分子復合物的三維模型；(b)用步驟(a)產(chǎn)生的三維模型進行計算機擬合分析，選擇或設計候選激活劑或抑制劑。在另一個實施方案中，根據(jù)圖5的相對結構坐標還包括氨基酸殘基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
另外，本發(fā)明還提供一種鑒定可與SLeX相互作用的試劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖3或圖4的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生SLeX的三維模型；(b)用該三維結構設計或選擇可與SLeX相互作用的試劑。
另外，本發(fā)明還提供一種鑒定可與PSGL-1相互作用的試劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖5的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生PSGL-1肽的三維模型；(b)用該三維結構設計或選擇可與PSGL-1相互作用的試劑。
本發(fā)明也提供利用上述方法鑒定的試劑、激活劑或抑制劑。抑制或以其它方式干擾選擇蛋白介導的白細胞在血管組織上滾動的小分子或其它試劑可用于治療與異常炎癥反應有關的疾病，如哮喘和牛皮癬。
最后，本發(fā)明提供一種方法，用于獲得E-選擇蛋白型分子與可配位鈣的化合物的結晶復合物。該方法包括下列步驟(a)在鈣離子和PEG存在下，使結晶的E-選擇蛋白型分子與可配位鈣的化合物接觸，形成E-選擇蛋白型分子與可配位鈣的化合物的結晶復合物；(b)在濃度降低的鈣離子和足夠濃度的PEG和離子鹽存在下，接觸結晶復合物，獲得最終的結晶復合物，它們在冷卻后，適于根據(jù)最終結晶復合物的X-射線衍射闡明E-選擇蛋白型分子和可配位鈣的化合物的三維結構。
通過下列描述，本發(fā)明的其它目的將是顯然的。
附圖簡述

圖1A、1B和1C顯示PSGL-119ek肽的解析和BIAcore親和力分析。
圖1A通過陰離子交換層析解析的PSGL-1 19ek肽譜。參見峰標記的定義文本。插圖主要PSGL-1 19ek肽SGP-3的結構。＜Q表示N端Gln殘基環(huán)化為焦谷氨酸鹽，代表Tyr殘基的硫酸化。編號肽序列中的劃線標出與腸激酶接頭區(qū)結合的非PSGL-1來源的殘基。
圖1B-1和1B-2溶液相P-LE與固定PSGL-1構建體結合的典型BIAcore傳感圖。P-LE(800nM濃度)注射到sPSGL(圖1B-1)和SGP-3(圖1B-2)上。注射P-LE的修飾較少的SGP-3形式的結合信號(未顯示)與結合動力學的結果相同。同時注射溶液相SGP-3可抑制P-LE與sPSGL和SGP-3的結合(點線)，但注射不含酪氨酸硫酸化或糖基化的合成肽不抑制(短劃線)，兩者濃度均為20μM。所有曲線都反映了從總結合中減去非特異結合產(chǎn)生的特異結合。
圖1C-1-圖1C-6通過BIAcore分析對可與固定sPSGL和純化19ek肽反應的溶液相P-LE的結合親和力測定。第一行，從左到右sPSGL(圖1C-1)、SGP-3(圖1C-2)和SGP-2(圖1C-3)。第二行，從左到右SGP-1(圖1C-4)、GP-1(圖1C-5)和SP-1(圖1C-6)。指定濃度的P-LE與固定配體(測定總結合信號)和不含配體的對照細胞(測定非特異結合)反應。顯示了P-LE每一濃度的平衡反應(Req)。在檢測的每一P-LE濃度時，從總結合信號(菱形)中減去非特異反應(三角形)測定特異結合信號(正方形)。KD和標準差(顯示)用BIA評價軟件(BIAcore)通過特異結合曲線的線性擬合確定，是3-10次不同實驗的結果。利用線性擬合測定的KD與斯卡查德圖的線性回歸分析確定的值(未顯示)十分一致。
圖2列出了通過P-選擇蛋白LE晶體的X-射線衍射獲得的P-選擇蛋白LE的原子結構坐標?！霸宇愋汀笔侵笢y量其坐標的原子。“殘基”是指測量的每個原子是它的一部分的類型或殘基，即氨基酸、輔因子、配體或溶劑?！皒，y和z”坐標是指測量的每個原子在單位細胞內(nèi)的位置()的笛卡爾坐標。“Occ”是指占用率?！癇”是指“B值”，它是原子在原子結構中如何運動的量值(2)?！癕OL”是指用于鑒定晶體中每個分子的片段標識?！癕OL”、“MOLA”、“MOLB”、“MOLC”和“MOLD”是指P-選擇蛋白LE的每個分子，“SOLV”是指水分子，“MPDS”是指MPD分子，“CALS”是指鈣離子。由于結構雜亂，P-選擇蛋白的Lys17(MOLA)、Lys17(MOLC)和Asn57(MOLC)顯示為丙氨酸。
圖3列出了通過P-選擇蛋白LESLeX晶體的X-射線衍射獲得的P-選擇蛋白LE和SLeX的原子結構坐標。圖題如圖2所述，不同之處是“MOL”、“A”、“B”、“C”和“D”是指P-選擇蛋白LE的每個分子，和SLeX，MDP分子和鈣離子不標記為“MOL”。然而，SLeX、MDP分子和鈣離子視為“殘基”。由于結構雜亂，P-選擇蛋白的Lys17(MOLA)、Lys17(MOLC)和Asn57(MOLC)顯示為丙氨酸。
圖4列出了通過P-選擇蛋白LESLeX晶體的X-射線衍射獲得的E-選擇蛋白LE和SLeX的原子結構坐標。圖題如圖2所述，不同之處是“MOL”、““SOLV”是指水分子，E-選擇蛋白LE、SLeX和鈣不標記為“MOL”。然而，E-選擇蛋白LE、SLeX和鈣視為“殘基”。
圖5列出了通過P-選擇蛋白LE∶PSGL-1肽晶體的X-射線衍射獲得的P-選擇蛋白LE和PSGL-1肽的原子結構坐標。除了圖5不包括“MOL”圖題之外，圖題如圖2所述。然而，P-選擇蛋白LE的每個分子、PSGL-1肽、水和MPD視為“殘基”。由于結構雜亂，P-選擇蛋白的Asn57(MOLA)、Lys58(MOLA)、Asn71(MOLA)、Arg22(MOLB)、Asn57(MOLB)、Lys58(MOLB)、Glu72(MOLB)、Met125(MOLB)和Arg157(MOLB)顯示為丙氨酸。
圖6A、6B和6C列出了P-選擇蛋白(圖6A)、E-選擇蛋白(圖6B)和PSGL-1(圖6C)的氨基酸序列。用來形成晶體構建體的序列片段以下劃線標出。
發(fā)明詳述在此使用時，下列術語和短語具有以下所述的含義除非另外說明，“選擇蛋白”是一個細胞表面糖蛋白家族，負責白細胞向炎癥部位募集的早期粘附事件及其向淋巴組織的遷移，包括P-選擇蛋白、E-選擇蛋白和L-選擇蛋白，和具有選擇蛋白活性的類似物。P-選擇蛋白優(yōu)選地具有圖6A所示的氨基酸序列，包括保守置換。E-選擇蛋白優(yōu)選地具有圖6B所示的氨基酸序列，包括保守置換?！癊-選擇蛋白型分子”包括完整的E-選擇蛋白分子及其部分，如凝集素和/或表皮生長因子(EGF)樣域，優(yōu)選地是如下定義的“E-選擇蛋白LE”。
“LE域”是選擇蛋白的凝集素和表皮生長因子(EGF)樣域，在此使用時，“P-選擇蛋白LE”是P-選擇蛋白的凝集素和EGF樣域，而“E-選擇蛋白LE”是E-選擇蛋白的凝集素和EGF樣域。P-選擇蛋白LE和E-選擇蛋白LE的氨基酸序列分別示于圖6A和6B中(下劃線)，包括保守置換。
“SLeX”是唾液酰LewisX(SLeX，NeuNAc2，3Gall，4[Fuc1，3]GlcNAc)四糖，包括與SLeX有類似結構和活性的“SLeX類似物”?！癝LeX結合蛋白或肽”是可與SLeX結合并含有SLeX結合部位的蛋白質或肽，包括但不限于P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE和E-選擇蛋白LE?！昂蠸LeX結合部位的分子或分子復合物”包括(i)P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE、E-選擇蛋白LE，(ii)P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE或E-選擇蛋白LE與SLeX的復合物，(iii)P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE或E-選擇蛋白LE與其它分子的復合物，(iv)含有SLeX結合部位的其它分子或分子復合物。
“PSGL-1”是具有PSGL-1活性的分子，包括如下定義的“PSGL-1肽”。PSGL-1的氨基酸序列示于圖6C中，包括其保守置換?！癙SGL-1肽”是通過酪氨酸硫酸化和SLeX修飾的肽，包括圖1A所示的肽結構(表示為SGP-3)，包括其保守置換。“PSGL-1結合蛋白或肽”是可與PSGL-1結合并具有PSGL-1結合部位的蛋白質或肽，包括但不限于P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE和E-選擇蛋白LE?！昂蠵SGL-1結合部位的分子或分子復合物”包括(i)P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE、E-選擇蛋白LE，(ii)P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE或E-選擇蛋白LE與PSGL-1的復合物，(iii)P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE或E-選擇蛋白LE與其它分子的復合物，(iv)含有PSGL-1結合部位的其它分子或分子復合物。
除非另外指出，“蛋白質”或“分子”包括蛋白質、蛋白質域、多肽或肽。
“結構坐標”是對應于分子或分子復合物中一個原子與其它原子的空間關系的笛卡爾坐標。結構坐標可以利用X-射線結晶學技術或NMR技術獲得，或者可以利用分子置換分析或同源性模建獲得。有多種軟件程序可以用圖形表現(xiàn)一組結構坐標，獲得分子或分子復合物的三維圖像。本發(fā)明的結構坐標可以通過數(shù)學操作，如倒置或整數(shù)加減，根據(jù)圖2、圖3、圖4或圖5所示的原始坐標進行修改。因此，可以認為本發(fā)明的結構坐標是相對的，決不只限于圖2、圖3、圖4或圖5的實際x，y，z坐標。
“試劑”包括蛋白質、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或藥物。
“均方根差”是平均值方差的算術平均值的平方根，是表示此處所述結構坐標的偏差或變異的術語。本發(fā)明包括含有所述氨基酸殘基的保守置換，在規(guī)定的均方根差內(nèi)產(chǎn)生相同結構坐標的所有實施方案。
熟練技術人員應當明白，P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE、E-選擇蛋白LE、PSGL-1和PSGL-1肽的氨基酸殘基的編號方式可能不同于此處所述，并且可能含有產(chǎn)生與圖2、圖3、圖4或圖5所示相同的三維結構的某些保守氨基酸置換。通過觀察相關氨基酸序列或利用商品同源性軟件程序(例如，MODELLAR，MSI，San Diego，CA)能容易地確定其它同種型或類似物中相應的氨基酸和保守置換。
“保守置換”是通過具有類似的極性、立體排列或屬于與置換殘基相同的類別(例如疏水、酸性或堿性)等方式，在功能上與置換的氨基酸殘基相當?shù)陌被嶂脫Q，包括對于利用該結構鑒定和設計可與P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白LE、E-選擇蛋白LE、SLeX、PSGL-1、PSGL-1肽、P-選擇蛋白LE∶SLeX復合物、E-選擇蛋白LE∶SLeX復合物、P-選擇蛋白LE∶PSGL-1肽復合物以及含有SLeX或PSGL-1結合部位的其它蛋白質、肽、分子或分子復合物相互作用的試劑、用于分子置換分析和/或同源性模建，對P-選擇蛋白LE、E-選擇蛋白LE、SLeX、PSGL-1肽、P-選擇蛋白LE∶SLeX復合物、E-選擇蛋白LE∶SLeX復合物和P-選擇蛋白LE∶PSGL-1肽復合物的三維結構沒有重要影響的置換。
“活性部位”是指分子或分子復合物中的區(qū)域，由于其形狀和電荷電位，易于通過不同共價和/或非共價結合力與另一種試劑(包括但不限于蛋白質、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或藥物)相互作用或結合。因此，本發(fā)明的活性部位可能包括，例如SLeX或PSGL-1與P-選擇蛋白LE或E-選擇蛋白LE的實際結合部位，以及與SLeX或PSGL-1的實際結合部位相鄰或接近的輔助結合部位，它在與一種特定試劑相互作用或結合后，通過直接干擾SLeX或PSGL-1的實際結合部位或間接影響P-選擇蛋白LE或E-選擇蛋白LE的立體構象或電荷電位，可影響P-選擇蛋白LE或E-選擇蛋白LE的活性，從而阻止或減少SLeX或PSGL-1在SLeX或PSGL-1實際結合部位處與P-選擇蛋白LE或E-選擇蛋白LE的結合。在此使用時，“活性部位”也包括P-選擇蛋白LE和E-選擇蛋白LE的類似物殘基，它們在結合配體(如SLeX或PSGL-1)存在下顯示可見的NMR微擾(perturbation)。盡管這些顯示可見NMR微擾的殘基可能不必直接接觸或立即接近配體結合殘基，但它們可能是對于合理藥物設計方案至關重要的P-選擇蛋白LE和E-選擇蛋白LE殘基。
本發(fā)明第一次提供了結晶的P-選擇蛋白LE。在一個具體實施方案中，P-選擇蛋白LE含有圖6A所示的氨基酸殘基(下劃線標出)，包括保守置換。本發(fā)明的晶體有效衍射X-射線，可用于確定P-選擇蛋白LE的結構坐標，其特征在于是空間群為P21的片狀，晶胞參數(shù)為a＝81.0，b＝60.8，c＝91.4，β＝103.6°。此外，結晶P-選擇蛋白LE的結晶不對稱晶體單元含有4個P-選擇蛋白LE分子。
本發(fā)明也提供含有P-選擇蛋白LE和SLeX的結晶復合物。在一個具體實施方案中，P-選擇蛋白LE的氨基酸殘基如圖6所示(下劃線標出)，包括保守置換。本發(fā)明的結晶復合物有效衍射X-射線，可用于確定P-選擇蛋白LE與SLeX的復合物的結構坐標，其特征在于是空間群為P21的片狀，晶胞參數(shù)為a＝81.1，b＝60.5，c＝91.4，β＝103.3°。此外，本發(fā)明的結晶復合物在不對稱晶體單元中含有1個P-選擇蛋白LE∶SLeX復合物分子。
本發(fā)明還提供含有E-選擇蛋白LE和SLeX的結晶復合物。在一個具體實施方案中，P-選擇蛋白LE的氨基酸殘基如圖6B所示(下劃線標出)，包括保守置換。本發(fā)明的結晶復合物有效衍射X-射線，可用于確定E-選擇蛋白LE與SLeX的復合物的結構坐標，其特征在于是空間群為P212121的桿狀，晶胞參數(shù)為a＝34.5，b＝72.4，c＝77.6。此外，本發(fā)明的結晶復合物在不對稱晶體單元中含有1個E-選擇蛋白LE∶SLeX復合物分子。
本發(fā)明還提供含有P-選擇蛋白LE與PSGL-1肽的結晶復合物。本發(fā)明的結晶復合物有效衍射X-射線，可用于確定P-選擇蛋白LE與PSGL-1肽的復合物的結構坐標，其特征在于是空間群為I222的雙棱錐形，晶胞參數(shù)為a＝63.4，b＝96.8，c＝187.3。此外，本發(fā)明的結晶復合物在不對稱晶體單元中含有1個P-選擇蛋白LE∶PSGL-1肽復合物分子。
在本發(fā)明的晶體或晶體復合物形成后，為了獲得結晶分子或分子復合物的原子坐標，能用多種方法采集X-射線衍射數(shù)據(jù)。借助于特別設計的計算機軟件，能利用這些結晶數(shù)據(jù)產(chǎn)生分子或分子復合物的三維結構。用來產(chǎn)生和精化結晶分子或分子結構的三維結構的不同方法為本領域技術人員周知，包括但不限于多波長反常色散(MAD)、多同晶置換、倒晶格空間溶劑補償(flattening)、分子置換和單同晶置換與反常色散(SIRAS)。
因此，本發(fā)明也提供由P-選擇蛋白LE晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)得出的P-選擇蛋白LE的三維結構。具體而言，P-選擇蛋白LE的三維結構由圖2所示的結構坐標定義，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。P-選擇蛋白LE三維結構的結構坐標可用于大量用途，包括但不限于P-選擇蛋白LE的不同活性部位(包括SLeX結合部位)的顯示、鑒定和表征。這些活性部位結構然后可用于設計可與P-選擇蛋白LE相互作用的試劑，以及與SLeX、PSGL-1或有關分子復合的P-選擇蛋白LE。
另外，本發(fā)明也提供由P-選擇蛋白LE∶SLeX晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)得出的P-選擇蛋白LE和SLeX的三維結構。具體而言，P-選擇蛋白LE和SLeX的三維結構由圖3所示的結構坐標定義，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。P-選擇蛋白LE和SLeX的結構坐標可用于大量用途，包括但不限于P-選擇蛋白LE、SLeX和P-選擇蛋白LE∶SLeX復合物的不同活性部位(包括SLeX結合部位)的顯示、鑒定和表征。這些活性部位結構然后可用于設計可與P-選擇蛋白LE、SLeX相互作用的試劑，以及與SLeX、PSGL-1或有關分子復合的P-選擇蛋白LE。
本發(fā)明還提供由E-選擇蛋白LE∶SLeX晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)得出的E-選擇蛋白LE和SLeX的三維結構。具體而言，E-選擇蛋白LE和SLeX的三維結構由圖4所示的結構坐標定義，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。E-選擇蛋白LE和SLeX的結構坐標可用于大量用途，包括但不限于E-選擇蛋白LE、SLeX和E-選擇蛋白LE∶SLeX復合物的不同活性部位(包括SLeX結合部位)的顯示、鑒定和表征。這些活性部位結構然后可用于設計可與E-選擇蛋白LE、SLeX相互作用的試劑，以及與SLeX、PSGL-1或有關分子復合的E-選擇蛋白LE。
另外，本發(fā)明提供由P-選擇蛋白LE∶PSGL-1肽晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)得出的P-選擇蛋白LE和PSGL-1肽的三維結構。具體而言，P-選擇蛋白LE和PSGL-1肽的三維結構由圖5所示的結構坐標定義，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。P-選擇蛋白LE和PSGL-1肽的結構坐標可用于大量用途，包括但不限于P-選擇蛋白LE、PSGL-1和P-選擇蛋白LE∶PSGL-1肽復合物的不同活性部位(包括PSGL-1和SLeX結合部位)的顯示、鑒定和表征。這些活性部位結構然后可用于設計可與P-選擇蛋白LE、PSGL-1相互作用的試劑，以及與SLeX、PSGL-1或有關分子復合的P-選擇蛋白LE。
本發(fā)明也涉及SLeX結合蛋白或肽的活性部位，優(yōu)選地P-選擇蛋白LE的SLeX結合部位，它包括根據(jù)圖3的氨基酸殘基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。此外，除了上述結構坐標外，該活性部位還包括根據(jù)圖3的氨基酸殘基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。SLeX活性部位可對應于P-選擇蛋白LE在與一種試劑(優(yōu)選地SLeX)結合狀態(tài)或未結合狀態(tài)的構型。
本發(fā)明還涉及SLeX結合蛋白或肽的活性部位，優(yōu)選地E-選擇蛋白LE的SLeX結合部位，它包括根據(jù)圖4的氨基酸殘基TYR48、GLU80、ASN82、ASN83、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。此外，除了上述結構坐標外，該活性部位還包括根據(jù)圖4的氨基酸殘基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。SLeX活性部位可對應于E-選擇蛋白LE在與一種試劑(優(yōu)選地SLeX)結合狀態(tài)或未結合狀態(tài)的構型。
另外，本發(fā)明提供了PSGL-1結合蛋白或肽的活性部位，優(yōu)選地P-選擇蛋白LE的PSGL-1結合部位，它包括根據(jù)圖5的氨基酸殘基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和結合鍶的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。此外，除了上述結構坐標外，該活性部位還包括根據(jù)圖5的氨基酸殘基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。PSGL-1活性部位可對應于P-選擇蛋白LE在與一種試劑(優(yōu)選地PSGL-1或PSGL-1肽)結合狀態(tài)或未結合狀態(tài)的構型。本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括，為了利用結構坐標進行藥物設計，鍶可以替換為鈣。
本發(fā)明的另一方面涉及一種鑒定可與P-選擇蛋白LE的結合或活性部位相互作用的試劑的方法。具體而言，該方法包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖2、圖3或圖5的相對結構坐標，±不超過1.5、優(yōu)選地不超過1.0、最優(yōu)選地不超過0.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生P-選擇蛋白LE的三維模型；(b)用該三維結構設計或選擇一種試劑?？梢岳迷u估推斷的活性部位與鑒定的試劑之間的“擬合”的多種計算機軟件程序，通過計算機擬合分析，鑒定該試劑，方法包括(a)利用同源性模建或活性部位的原子結構坐標，產(chǎn)生分子或分子復合物的推斷的活性部位的三維模型，(b)確定推斷的活性部位與鑒定的試劑之間的結合程度。推斷的活性部位的三維模型可以用本領域周知的大量方法中的任一種產(chǎn)生，包括但不限于同源性模建以及利用結晶或波譜數(shù)據(jù)產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)的計算機分析。用來產(chǎn)生這些三維模型和/或進行必要的擬合分析的計算機程序包括但不限于GRID(牛津大學，牛津，英國)；MCSS(Molecular Simulations，San Diego，CA)；AUTODOCK(Scripps Research Institute，La Jolla，CA)；DOCK(加利福尼亞州立大學，San Francisco，CA)；Flo99(Thistlesoft，MorrisTownship，NJ)；Ludi(Molecular Simulations，San Diego，CA)；QUANTA(Molecular Simulations，San Diego，CA)；Insight(Molecular Simulations，San Diego，CA)；SYBYL(TRIPOS，Inc.，St.Louis.MO)；和LEAPFROG(TRIPOS，Inc.，St.Louis.MO)。
可以進一步評價通過計算機擬合分析鑒定的這種試劑對p-選擇蛋白LE活性的影響，方法包括使鑒定的試劑與P-選擇蛋白LE接觸，并測定該試劑對P-選擇蛋白LE活性的影響。根據(jù)該試劑對P-選擇蛋白LE的活性部位的作用，它可以作為P-選擇蛋白LE活性的抑制劑或激活劑。例如，可以進行酶測定并分析結果，來確定該試劑是P-選擇蛋白LE和SLeX的抑制劑(即可降低或阻止P-選擇蛋白LE與SLeX間結合親和力的試劑)還是P-選擇蛋白LE和SLeX的激活劑(即可提高P-選擇蛋白與SLeX之間結合親和力的試劑)。為了評價鑒定的試劑對選擇蛋白相關疾病(如炎癥)的可能的治療效果，還可以進行其它試驗。
本發(fā)明不限于鑒定可與P-選擇蛋白LE活性部位相互作用的試劑，而且也涉及一種方法，用于鑒定含有SLeX結合部位或PSGL-1結合部位的任何分子或分子復合物的激活劑或抑制劑，包括但不限于P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、E-選擇蛋白LE、P-選擇蛋白LE∶SLeX復合物和E-選擇蛋白LE∶SLeX復合物。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定含有SLeX結合部位的分子或分子復合物的激活劑或抑制劑的方法，包括下列步驟(a)利用(i)根據(jù)圖3的殘基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±不超過1.5、優(yōu)選地不超過1.0、最優(yōu)選地不超過0.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，或(ii)根據(jù)圖4的氨基酸殘基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±不超過1.5、優(yōu)選地不超過1.0、最優(yōu)選地不超過0.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生含有SLeX結合部位的分子或分子復合物的三維模型；(b)用步驟(a)產(chǎn)生的三維模型進行計算機擬合分析，選擇或設計候選激活劑或抑制劑。在另一個實施方案中，根據(jù)圖3的相對結構坐標還包括氨基酸殘基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。在另一個實施方案中，根據(jù)圖4的相對結構坐標還包括氨基酸殘基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。在獲得或合成候選激活劑或抑制劑后，候選激活劑或抑制劑可與分子或分子復合物接觸，并且可以確定候選激活劑或抑制劑對該分子或分子復合物的影響。優(yōu)選地，為了確定候選激活劑或抑制劑對分子或分子復合物結合SLeX的影響，在SLeX(或含有SLeX的分子或分子復合物)的存在下，使候選激活劑或抑制劑與分子或分子復合物接觸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種鑒定含有PSGL-1結合部位的分子或分子復合物的激活劑或抑制劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖5的氨基酸殘基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和結合鍶的相對結構坐標，±不超過1.5、優(yōu)選地不超過1.0、最優(yōu)選地不超過0.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生含有PSGL-1結合部位的分子或分子復合物的三維模型；(b)用步驟(a)產(chǎn)生的三維模型進行計算機擬合分析，選擇或設計候選激活劑或抑制劑。在另一個實施方案中，根據(jù)圖5的相對結構坐標還包括氨基酸殘基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5，優(yōu)選地不超過1.0，最優(yōu)選地不超過0.5。在獲得或合成候選激活劑或抑制劑后，候選激活劑或抑制劑可與分子或分子復合物接觸，并且可以確定候選激活劑或抑制劑對該分子或分子復合物的影響。優(yōu)選地，為了確定候選激活劑或抑制劑對分子或分子復合物結合PSGL-1或PSGL-1肽的影響，在PSGL-1或PSGL-1肽的存在下，使候選激活劑或抑制劑與分子或分子復合物接觸。另外，本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括，為了利用結構坐標進行藥物設計，鍶可以替換為鈣。
另外，圖3或圖4所示的SLeX的結構坐標，圖5所示的PSGL-1肽的結構坐標，能用于鑒定或設計分別可與SLeX和PSGL-1相互作用的試劑。就此而言，本發(fā)明提供一種鑒定可與SLeX相互作用的試劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖3或圖4的相對結構坐標，±不超過1.5、優(yōu)選地不超過1.0、最優(yōu)選地不超過0.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生SLeX的三維模型；(b)用該三維結構設計或選擇可與SLeX相互作用的試劑。然后能合成或獲得鑒定的試劑，然后與SLeX(或含有SLeX的分子或分子復合物)接觸，以確定該試劑對SLeX活性的影響。
另外，本發(fā)明還提供一種鑒定可與PSGL-1相互作用的試劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖5的相對結構坐標，±不超過1.5、優(yōu)選地不超過1.0、最優(yōu)選地不超過0.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生PSGL-1肽的三維模型；(b)用該三維結構設計或選擇可與PSGL-1相互作用的試劑。然后能合成或獲得鑒定的試劑，然后與PSGL-1或PSGL-1肽(或含有PSGL-1或PSGL-1肽的分子或分子復合物)接觸，以確定該試劑對PSGL-1或PSGL-1肽活性的影響。
在美國專利號5,834,228、5,939,528和5,865,116以及PCT申請?zhí)朠CT/US98/16879、公開的WO 99/09148中進一步公開了多種分子分析和合理藥物設計技術，其內(nèi)容在此引用作為參考。
本發(fā)明也涉及利用上述方法鑒定的試劑、激活劑或抑制劑。這些試劑、激活劑或抑制劑可以是蛋白質、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或藥物。抑制或以其它方式干擾選擇蛋白介導的白細胞在血管組織上滾動的小分子或其它試劑可用于治療與異常炎癥反應有關的疾病，如哮喘和牛皮癬。
另外，本發(fā)明也涉及一種確定結構未知的分子或分子復合物的三維結構的方法，包括下列步驟獲得結構未知的分子或分子復合物的晶體，由結晶的分子或分子復合物獲得X-射線衍射數(shù)據(jù)。然后將該分子或分子復合物的X-射線衍射數(shù)據(jù)與本發(fā)明的上述任一種晶體的已知三維結構相比較。然后，利用分子置換分析，使由本發(fā)明的晶體測得的已知三維結構“符合”結晶分子或分子復合物的X-射線衍射數(shù)據(jù)。此外，也可用波譜數(shù)據(jù)或同源性模建產(chǎn)生該分子或分子復合物的推斷的三維結構，并根據(jù)由本發(fā)明的任一種晶體獲得的已知三維結構的構象，精化推斷的結構。
最后，本發(fā)明提供一種方法，用于獲得E-選擇蛋白型分子與可配位鈣的化合物(如SLeX)的結晶復合物。該方法包括下列步驟(a)在鈣離子和PEG存在下，使結晶的E-選擇蛋白型分子與可配位鈣的化合物接觸，形成E-選擇蛋白型分子與可配位鈣的化合物的結晶復合物；(b)在濃度降低的鈣離子和足夠濃度的PEG和離子鹽存在下，接觸結晶復合物，獲得最終的結晶復合物，它們在冷卻后，適于根據(jù)最終結晶復合物的X-射線衍射闡明E-選擇蛋白型分子和可配位鈣的化合物的三維結構。
在該方法中，“E-選擇蛋白型分子”可以是完整的E-選擇蛋白分子及其部分，如凝集素和/或表皮生長因子(EGF)樣域，優(yōu)選地是E-選擇蛋白LE?？膳c鈣配位的化合物優(yōu)選地是SLeX。在步驟(a)中，結晶的E-選擇蛋白型分子可通過本領域周知的方法制備。當結晶的E-選擇蛋白型分子是E-選擇蛋白LE時，結晶的E-選擇蛋白LE優(yōu)選地如以下實施例1所述制備。該方法中鈣離子的來源優(yōu)選地是，而PEG優(yōu)選地是PEG-1000到PEG-2000，最優(yōu)選地是PEG-4000。離子鹽可以是本領域周知的多種離子鹽，優(yōu)選地是。
該方法的一個重要方面是減少步驟(b)中的鈣離子，或者使用有效的鈣濃度，這可阻止或降低鈣在抑制可配位鈣的化合物結合E-選擇蛋白型分子中的作用，從而可形成最終晶體復合物，它適于根據(jù)最終結晶復合物的X-射線衍射闡明E-選擇蛋白型分子和可配位鈣的化合物的三維結構。也就是說，鈣的濃度應當足夠低，使得配位鈣的化合物與E-選擇蛋白型分子上的結合部位結合。例如，如果配位鈣的化合物是SLeX，則設想步驟(a)中的鈣離子濃度可以是20mM-300mM，而步驟(b)中的鈣離子濃度較低(即100μM-20mM)。在步驟(a)和(b)中，鑒于鈣濃度降低或較低，PEG的濃度應當足以保持晶體的完整性，優(yōu)選地約15％-60％(w/v)PEG。步驟(b)中離子鹽的濃度約為10mM-500mM。當配位晶體的化合物是SLeX時，步驟(a)中的接觸可以進行約10-20小時，優(yōu)選地約15小時。步驟(b)中的接觸進行約0.5-3小時，優(yōu)選地約1小時。
步驟(a)和(b)組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在這種情況下，在足夠濃度的鈣離子、PEG和離子鹽存在下，結晶E-選擇蛋白型分子與配位鈣的化合物接觸，形成(E-選擇蛋白型分子與可配位鈣的化合物的)結晶復合物，它適于根據(jù)最終結晶復合物的X-射線衍射闡明E-選擇蛋白型分子與配位鈣的化合物的三維結構。如果步驟(a)和(b)組合，則設想鈣離子、PEG和離子鹽的濃度分別為約100μM-20mM、15％-60％(w/v)和10mM-500mM。
參照下列非限制性實施例，本發(fā)明更易于理解。下列實施例是為了更全面地說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，決不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例11.實驗方法構建體和蛋白質/肽制品的產(chǎn)生。通過間插腸激酶切割序列(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)與IgG1的CH2-CH3區(qū)融合的P-選擇蛋白(P-LE)和E-選擇蛋白(E-LE)的凝集素-EGF(LE)域(153個氨基酸)在CHO細胞中表達，并通過蛋白A sepharose(Pharmacia)層析法從條件培養(yǎng)基中回收。用腸激酶消化二聚體Fc構建體產(chǎn)生單體選擇蛋白LE域(LaVallie等人，1993)，在串聯(lián)的大豆胰蛋白酶抑制劑-瓊脂糖(Sigma)和蛋白A(Perseptive Biosystems)柱上通過層析法除去酶和殘余的Fc域。選擇蛋白LE域在37℃下以25毫單位N-聚糖酶/mg蛋白質的比例去糖基化48小時，通過陰離子交換和疏水作用層析純化。通過真空濃縮使LE域達到10-30mg/ml。P-LE和E-LE經(jīng)質譜法(MS)確定是正確的，通過凝膠過濾HPLC確定為單體，通過表面胞質團共振(BIAcore)確定具有功能(見下文)。
以前(Goetz等人，1997)描述了一種可溶性構建體(19ek.Fc)，其含有PSGL-1的N端19個氨基酸，它們通過含一個有腸激酶切割序列的9氨基酸接頭與IgG1的Fc區(qū)融合。純化并用腸激酶消化19ek.Fc，如上對于LE構建體所述回收單體PSGL-1 19ek肽。通過SuperQ陰離子交換層析使用0-500mM 的梯度將異源19ek肽純化為單個成分。通過蛋白水解和糖苷消化之前和之后的MS、通過NMR、通過組成分析確定其結構(J.Rouse，D.Tsao和R.Camphausen，發(fā)表的數(shù)據(jù))。
P-LE/19ek肽結合研究。在25℃下在BIAcore 2000和3000儀器上進行表面胞質團共振，使用鏈霉親和素包被的傳感芯片(BIAcore)和調節(jié)為1mM 和的HBS-P緩沖液(BIAcore；10mMHEPES(pH7.4)，150mM 和0.005％聚山梨酸酯20(v/v))。19ek肽和sPSGL--PSGL-1的完整二聚胞外域的巖藻糖基轉移酶-VII修飾形式(Croce等人，1998)，用磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)在Lys殘基處生物素化。生物素化后，為了分離功能物質，sPSGL與固定P-選擇蛋白反應(Sako等人，1995)。一種對應于SGP-3多肽部分的合成肽(AnaSpec，Inc.)也類似地生物素化。用HBS-P緩沖液將生物素化的試劑包被于傳感芯片上。糖基化的P-LE和E-LE根據(jù)實驗確定的消光系數(shù)(280nm)定量，以40μL/分鐘注射到19ek肽、sPSGL和對照表面上。在P-選擇蛋白和E-選擇蛋白中和性單克隆抗體、10mMEDTA和可溶性19ek肽存在下進行對照實驗，證實結合特異性(R.Camphausen，未發(fā)表的數(shù)據(jù))。去糖基化的P-LE和E-LE與完整的糖基化形式相似地結合。
結晶與數(shù)據(jù)采集。除非另外指明，所有衍射數(shù)據(jù)均用在5.0KW下運行的Rigaku RU200發(fā)生器室內(nèi)采集，其配備Yale/MolecularStructure Corp.聚焦鏡和RAXIS II或RAXIS IV圖像板面積檢波器。
P-LE的片狀晶體由含有10mg/ml蛋白質、100mM (pH8.5)、150mM 、12mM 、10％(v/v)2，4-甲基戊烷二醇(MPD)和10％(w/v)PEG 6000的溶液在18℃下通過蒸汽擴散形成。這些晶體轉移到100mM (pH8.5)、75mM 、10mM、10％(v/v)MPD和11％(w/v)PEG 6000中，然后轉移到用MPD稀釋5％(v/v)的相同緩沖液中2小時。用MPD第二次5％稀釋后，晶體浸泡13小時，之后在保持于液氮溫度下的液體丙烷中驟凍。利用相同方法，但是向終浸泡溶液中加入8mM SLeX，獲得與SLeX(SLeX-β-O-甲基，Toronto Research Chemicals)復合的P-LE。P-LE晶體的空間群為P21，晶胞參數(shù)為晶胞參數(shù)為a＝81.0，b＝60.8，c＝91.4，β＝103.6°。在SLeX中浸泡的晶體的最大分辨率降為3.4，鑲嵌性(mosaicity)提高到1.5°，得到的晶胞參數(shù)為a＝81.1，b＝60.5，c＝91.4，β＝103.3°。處理衍射數(shù)據(jù)并用DENZO/SCALEPACK(HRLResearch，Inc.)換算，得到表1所示的統(tǒng)計數(shù)字。
由含有30mg/ml蛋白質、100mM HEPES(pH7.5)、10mM、200mM 和15％(w/v)PEG 6000的溶液在18℃下通過蒸汽擴散獲得E-LE的棒形大晶體。晶體生長幾周，利用大引晶法(macroseeding)使其更可再生。對于與SLeX的復合物，將E-LE晶體轉移到含有100mM HEPES(pH7.5)、200mM 、30％(w/v)PEG 4000和15mM SLeX的溶液中，25℃15小時。最初溫育后，將晶體轉移到100mM (pH7.4)、300mM 、2mM 、30％(w/v)PEG 4000和15mM SLeX中，再過1小時，之后如上所述驟凍。E-LE/SLeX晶體屬于空間群P212121，晶胞參數(shù)為a＝34.5，b＝72.4，c＝77.6。衍射數(shù)據(jù)如上所述處理。
通過向蒸汽擴散結晶液滴中重復大引晶獲得P-LE/PSGL-1 19ek肽(SGP-3)復合物的大晶體，測量可達0.5×0.5×0.3mm。由8mg/mlP-LE、2倍摩爾過量的SGP-3、10mM 、100mM HEPES(pH7.0)、150mM 、4mM 、50mM 、5％(w/v)PEG6000和33％(v/v)MPD生長晶體。由含有50％MPD但不含或PEG 6000的相似緩沖液中獲得較早的小種晶。將晶體轉移到100mM HEPES(pH7.0)、10％PEG 6000、30％MPD、100mM 和50mM 中15小時，之后驟凍。通過向最終浸泡緩沖液中加入0.5mM乙酸汞24小時，之后驟凍，獲得汞衍生的晶體。復合物晶體的空間群為I222，晶胞參數(shù)為a＝63.4，b＝96.8，c＝187.3。晶體為雙棱錐形。原始衍射數(shù)據(jù)用Brookhaven National Labs station X4A采集，用RAXIS IV記錄衍射數(shù)據(jù)。汞衍生數(shù)據(jù)在室內(nèi)采集。所有數(shù)據(jù)都如上所述減少，得到表1中的統(tǒng)計數(shù)字。
結構確定和精化。發(fā)現(xiàn)與SLeX復合的E-LE的晶體基本上與以前報道的(Graves等人，1994)同晶形，在結晶不對稱單元中有一個拷貝的E-LE。利用CNS內(nèi)的剛體精化(Brunger等人，1998)獲得最初相位，得到結合SLeX的清楚的電子密度。利用BUSTER(Bricogne，1993)進一步改進這些圖，利用QUANTA(Molecular Simulations，Inc.)使結合SLeX的模型擬合。所有進一步的精化都在CNS中進行，得到一個最終模型，其中86％的殘基在Ramachandran圖的最有利的區(qū)域中，總共含有1510個原子、186個水分子、一個鈣離子和一個拷貝的SLeX。統(tǒng)計數(shù)字示于表1。
應用公開的E-選擇蛋白lec/EGF構建體模型(PDB保藏編號1ESL)以分子置換解析P-LE的結構。用程序AMORE(CCP4，1994)定位所有4個拷貝的P-LE。用上述方法建立并精化該模型。1個拷貝的P-LE具有比其它3個更低的電子密度，但利用非結晶對稱，精化極好地進行，得到表1中的統(tǒng)計數(shù)字。在精化結束時，第4個拷貝的P-LE的平均B因子為63.7，與之相比，其它3個拷貝為44.2。最終模型含有4個拷貝的P-LE，81％的殘基在Ramachandran圖的最有利的區(qū)域中，總共含有5418個原子、134個水分子、2個MPD分子和4個鈣離子。
浸泡于SLeX中的P-LE晶體基本上與上述P-LE結構同晶形。在CNS中剛體精化后，3個結合的SLeX分子有清楚的密度。由于晶體接觸，第4個結合部位部分封閉，從而解釋了在SLeX中浸泡后分辨率的降低。在CNS中有限精化之前，用QUANTA模建結合的SLeX，并重新擬合蛋白質殘基。這產(chǎn)生最終模型，71％的殘基位于最有利的Ramachandran區(qū)中，總共含有5455個原子、3個SLeX分子、4個鈣離子和2個MPD分子。
通過分子置換解析與PSGL-1 19ek肽SGP-3復合的P-LE結構的所有嘗試均告失敗。利用Patterson技術定位重原子位點，并用SHARP精化(de la Fourtelle和Bricogne，1997)。這些相位產(chǎn)生較少但質量足夠的圖，允許P-LE結構的2個凝集素域的定位和2個EGF域的獨立定位。這些圖也表明在與P-LE/SLeX復合物相同的位置處存在結合SLeX分子，和無法解釋的額外密度。重原子相位與BUSTER中的模型相位結合，產(chǎn)生清楚的最大熵圖，它允許以QUANTA擬合SGP-3多肽和SLeX部分。該結構如上所述精化，得到表1中的統(tǒng)計數(shù)字，和Ramachandran圖的最有利的區(qū)域中84％的殘基。最終模型含有2個P-LE/SGP-3復合物、3263個原子、2個鍶離子、224個水分子、2個鈉離子和7個結合MPD分子。
2.結果與討論P-選擇蛋白凝集素/EGF域的X-射線晶體結構。我們得到了含有N端凝集素和EGF域的P-選擇蛋白構建體(稱為P-LE)。盡管E-選擇蛋白lec/EGF晶體結構(Graves等人，1994)表明，凝集素與EGF域之間有最小的相互作用，推斷的SLeX結合部位極好地從凝集素-EGF域連接中去除，但我們選擇保留EGF域，因為研究表明它可能具有功能作用(Gibson等人，1995；Kansas等人，1994)。P-LE通過間插腸激酶切割序列與IgG1的Fc區(qū)融合。該構建體被稱為P-LE.Fc，易于從條件培養(yǎng)基中純化，并在腸激酶消化后產(chǎn)生單體P-LE域。CHO細胞中表達的P-LE含有3個N-連接的聚糖，它們在結晶之前酶促除去。獲得空間群為P21的P-LE晶體，在結晶不對稱單元中含有4個分子，衍射為2.4的分辨率。用E-選擇蛋白lec/EGF晶體結構坐標作為搜索模型，通過分子置換解析該結構。
P-LE晶體結構采取基本上與E-選擇蛋白lec/EGF結構相同的總體構象。這符合選擇蛋白之間這些域62％的序列同一性，使得C主鏈的RMS差異只有0.7。P-LE的凝集素和EGF域通過小界面相互作用，使得與E-選擇蛋白構建體的相似性更加顯著，因為這種關系也得到保持。EGF域中幾個環(huán)的運動與域間角的較小活動一起，導致兩種結構之間的許多次要差異。在晶體中不同P-LE拷貝之間，域間角也略微不同，因此可能是晶體包裝力的作用。
誘變和結構研究(Kansas，1996)提示，推斷的SLeX結合部位在P-LE與E-選擇蛋白lec/EGF結構之間顯著保守。該部位的共同特征，和選擇蛋白功能金屬依賴性的推測的基礎，是Glu-80、Asn-82、Asn-105和Asp-106的側鏈和Asp-106的主鏈羰基配位(coordinate)的一個鈣離子。兩個水分子也連接P-LE內(nèi)的鈣，其中一個被Asn-83的側鏈穩(wěn)定。因為在E-選擇蛋白lec/EGF結構(未顯示)中也存在P-LE該區(qū)域中的8個結合水(0.8)，SLeX結合部位的相似性更加顯著。然而在主要由E-選擇蛋白中的Arg-97改變?yōu)镻-選擇蛋白中的Ser-97所定義的一個區(qū)域中，結合部位不同。在E-選擇蛋白lec/EGF結構中，Arg-97在Tyr-94上堆積，從而顯示該區(qū)域中的帶正電的表面，而在P-LE中，Tyr-94不被較小的Ser-97殘基阻礙，因此能介導疏水作用。E-選擇蛋白lec/EGF構建體中的Arg-97與Asp-100形成氫鍵，它在P-LE中是丙氨酸殘基。與該區(qū)相鄰的是Lys-99，在E-選擇蛋白lec/EGF中，它從結合部位朝向外面。P-LE中的相當殘基是朝向結合部位的絲氨酸殘基。
與SLeX復合的P-和E-選擇蛋白lec/EGF域的晶體結構。我們設法獲得與SLeX復合的P-LE的晶體結構，我們預期能通過將SLeX浸泡于預先形成的P-LE晶體中獲得。我們也希望了解E-選擇蛋白的SLeX結合親和力比P-選擇蛋白約高10倍的結構基礎(Poppe等人，1997)，如果推斷的SLeX結合部位之間有相似性，這是意外的。因此，我們產(chǎn)生了一種E-選擇蛋白凝集素/EGF構建體(E-LE)，如P-LE一樣表達、純化并去糖基化。E-LE在類似于以前對E-選擇蛋白凝集素/EGF(Graves等人，1994)使用的條件下結晶，結晶不對稱單元中含有一個拷貝的E-LE。
P-LE晶體浸泡于含有8mM SLeX的穩(wěn)定溶液中，采集結晶數(shù)據(jù)，擴展到3.4(表1)。P-LE/SLeX晶體結構在不對稱單元中含有4個拷貝的P-LE，一個SLeX結合部位被晶體接觸部分阻礙。這種晶體接觸可能使浸泡后衍射質量顯著降低。盡管這些數(shù)據(jù)分辨率較低，但在3個拷貝的P-LE中，從結合鈣延伸開來能看到清楚的電子密度。這些圖用來構建與P-LE結合的SLeX復合物結構，盡管在獲得高分辨率的SLeX與E-LE的復合物后精化這些結果。最初以可達20mM的SLeX濃度將SLeX浸泡到E-LE晶體中的嘗試未獲成功。我們后來確定，在SLeX結合試驗中，用于結晶的高濃度鈣抑制E-選擇蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，形成一種浸泡方案，其中鈣濃度降低到可促進SLeX結合而仍保持高分辨率衍射的水平。這些條件形成衍射數(shù)據(jù)為1.5分辨率的晶體，和結合SLeX的清楚的電子密度(表1)。P-LE/SLeX復合物的結構揭示，相互作用實際上幾乎完全是靜電作用，與SLeX的大小相比，埋藏的總表面積較小(5492)。由于與P-LE的復合物分辨率較低，以下將更詳細地描述E-LE/SLeX復合物的保守相互作用。Fuc羥基的相互作用肯定提供大量的結合能量。3-和4-羥基不僅配位結合鈣，而且與本身可配位鈣的殘基形成氫鍵。另外，Glu-107僅距Fuc 2-羥基3.4，可形成弱氫鍵。SLeX Gal殘基利用4-羥基(與Tyr-94的羥基)和6-羥基(與Glu-92的羧基)與蛋白質殘基氫鍵鍵合。在兩種選擇蛋白非常不同的區(qū)域內(nèi)(Arg-99(E-選擇蛋白)與Ser-99(P-選擇蛋白))，NeuNAc殘基相互作用。在P-LE中，Tyr-48和Ser-99的羥基分別與NeuNAc的羧酸部分和4-羥基形成氫鍵。最后，似乎是NeuNAc環(huán)的C-4對Pro-98壓緊。NeuNAc的定位使得與E-LE中的Arg-99不利地接觸，因此進一步向回移動(圖2A)允許更好的相互作用。在E-LE與P-LE之間，其余的SLeX基本上都重疊。
與SLeX復合的E-LE的結構證實了在低分辨率P-LE結構中看到的相互作用，由于Ser-97∶Arg-97(P-選擇蛋白∶E-選擇蛋白)不同，與NeuNAc的接觸也不同。Fuc 3-和4-羥基配位結合鈣，與也可配位鈣的殘基形成復雜的氫鍵網(wǎng)絡。Fuc 4-羥基恰好替換無配體結構中可見的鈣-連接的水分子，接受來自Asn-82的氫鍵，為Glu-80貢獻一個氫鍵。Fuc 3-羥基替換另一個鈣配位的水分子，盡管其最終位置與Asn-105更近1。在結合Asn83的SLeX旋轉其2個扭角至59°后，它能為結合的水貢獻一個氫鍵，隨后為Fuc 2-羥基和Glu-107的側鏈貢獻氫鍵(未顯示)。這種旋轉也使Asn-83側鏈能配位鈣。P-LE中的Ser-97替換為E-LE中的Arg-97可與NeuNAc形成不同的相互作用，并使糖離開側鏈，以減輕將要發(fā)生的緊密接觸。Arg-97為糖苷氧和NeuNAc的羧基貢獻氫鍵。在與P-LE類似的排列中，羧基也接受來自Tyr-48的氫鍵。
SLeX結合P-LE和E-LE中觀察到的蛋白質接觸極好地符合集中于對于P-選擇蛋白和E-選擇蛋白識別至關重要的殘基的定點誘變研究(Erbe等人，1993；Erbe等人，1992；Graves等人，1994；Hollenbaugh等人，1993；Ng和Weis，1997)。許多這種突變(例如E-和P-選擇蛋白中的Tyr-48和Tyr-94和E-選擇蛋白中的Arg-97的置換)現(xiàn)在能解釋為直接影響與SLeX的氫鍵作用。其它突變可能通過改變作用殘基的方向間接破壞功能。后一種解釋可能說明了與E-和P-選擇蛋白中發(fā)現(xiàn)的三Lys片段(殘基111-113)突變有關的功能破壞。在與SLeX復合的P-LE和E-LE結構中，Lys-113不直接參與結合。然而，該殘基與Glu-92的羧酸部分氫鍵鍵合(通過側鏈氨基)，后者也與SLeX內(nèi)的Gal殘基的6-羥基氫鍵鍵合。因此，選擇蛋白該區(qū)域中的某些突變可通過間接機制破壞SLeX結合。
E-LE和P-LE/SLeX結構與有關凝集素/聚糖復合物的比較揭示了重要的相似性和差異。對與寡甘露糖結合的MBP-A晶體結構的檢測(Weis等人，1992)表明，鈣結合作用的相似排列也涉及連接的甘露糖殘基的3-和4-羥基。然而相對于MBP-A/寡甘露糖復合物中的甘露糖，E-LE和P-LE/SLeX結構中的Fuc環(huán)“翻轉”。這導致環(huán)位置互換，使得選擇蛋白LE/SLeX復合物的Fuc 3-和4-羥基分別占據(jù)MBP-A/寡甘露糖復合物中甘露糖的4-和3-羥基位置。盡管使用不同的羥基，并且它們與糖環(huán)的關系不同(對于甘露糖3-和4-羥基，分別為赤道-赤道，在Fuc中為赤道-軸)，但保留沿糖環(huán)碳到羥基的載體。羥基的這種精確定位似乎是與鈣離子連接并且同時與蛋白質氫鍵作用所必需的。已導入3個選擇蛋白殘基(Ng和Weis，1997)的MBP-A K3突變體的晶體結構，與選擇蛋白LE/SLeX復合物明顯不同地結合SLeX。這種結構和此處所示的結構顯示與結合鈣有Fuc連接，涉及不同的羥基。在K3突變體/SLeX復合物中，F(xiàn)uc 2-和3-羥基連接鈣，并分別占據(jù)選擇蛋白LE/SLeX復合物中所見的Fuc 4-和3-羥基位置。這使結合袋內(nèi)的SLeX方向相對于選擇蛋白LE/SLeX復合物旋轉90°，并在Gal 4-羥基與Lys-111側鏈之間有氫鍵相互作用，這我們沒有發(fā)現(xiàn)。這突出了Glu-92、Tyr-94和Tyr-48(在E-選擇蛋白中為Arg-97)對于E-和P-LE/SLeX復合物中配體結合的重要性。最后，根據(jù)結合表面上SLeX的一般朝向，將分子?？康紼-選擇蛋白lec/EGF晶體結構內(nèi)的SLeX模型(Graves等人，1994；Kogan等人，1995；Poppe等人，1997)與我們的結果相比較。但是，對于分子接觸的同一性，全都不同程度地不符合此處所示的結構。假定SLeX與結合鈣的連接模擬MBP-A/寡甘露糖復合物和MBP-A K3突變體/SLeX復合物中所見的，所有模型都提示，SLeX的Fuc 2-和3-羥基與結合鈣連接。這與我們在兩種不同的選擇蛋白LE/SLeX復合物中所見截然不同，其中Fuc連接通過3-和4-羥基介導。提出的E-選擇蛋白/SLeX相互作用的其它接觸與我們的結果不同程度地一致或不一致。根據(jù)這些錯誤結構考慮設計用于治療的SLeX模擬物最終可能限制這些工作的成功。
用于X-射線結晶學的功能PSGL-1肽的產(chǎn)生。然后為了闡明識別的結構基礎，我們設法獲得與PSGL-1復合的P-LE的晶體結構，但預期PSGL-1的生理或胞外大形式對于共結晶而言太不均勻。誘變和生物化學研究表明，與E-選擇蛋白不同，P-選擇蛋白識別成熟PSGL-1N端內(nèi)的多肽殘基和SLeX-修飾的O-聚糖。PSGL-1決定簇的候選者包括氨基酸的陰離子片段，這些氨基酸包括(從成熟多肽N端起編號)Tyr-5、Tyr-7和Tyr-10，其中一個或多個是用間接法定位于Thr-16的硫酸化、唾液酸化、巖藻糖基化(假定SLeX樣)的O-聚糖(Pouyani和Seed，1995；Ramachandran等人，1999；Sako等人，1995；Wilkins等人，1995)。3個Tyr殘基中任一個的硫酸化能支持P-選擇蛋白結合，但是，通過滾動研究(Ramachandran等人，1999)而不是通過嚴格親和力測定推斷單個硫酸酪氨酸的相對作用。為了研究這些結構問題并產(chǎn)生適于與P-LE結晶的PSGL-1的均勻修飾形式，我們在事先用巖藻糖基轉移酶-VII和核心2 N-乙酰葡糖胺轉染的CHO細胞系中表達截短形式的PSGL-1，在CHO細胞中表達產(chǎn)生功能PSGL-1必需的修飾酶(Kumar等人，1996；Li等人，1996)。我們使用一種可溶性PSGL-1構建體(19ek.Fc(Goetz等人，1997))，它編碼與IgG1的重鏈域(19.Fc(Sako等人，1995))融合的PSGL-1的19個N端氨基酸，其中導入了腸激酶切割序列，它將在表達和純化后便于單體PSGL-1肽的分離。以前曾證明包被于乳膠微球上的19ek.Fc支持在表達P-和E-選擇蛋白的CHO細胞上的滾動(Goetz等人，1997)。
為了產(chǎn)生單體PSGL-1肽(稱為19ek肽)，用腸激酶消化19ek.Fc。利用MS的初步分析提示，19ek肽在結構上不均勻(未顯示)。因此，通過陰離子交換HPLC實現(xiàn)混合物的解析，它將19ek肽混合物分散為均勻的成分，主要是稍后以鹽梯度洗脫的主要成分(圖1A)。主要19ek肽的結構確定為磺基糖肽(稱為SGP-3)，如圖1A所示。SGP-3的PSGL-1部分在翻譯后廣泛修飾，包括所有3個酪氨酸殘基上的硫酸化，和Thr-16處含SLeX的核心2修飾的O-聚糖(圖1A，插圖)。重要的是，該聚糖與從HL-60骨髓細胞系分離的PSGL-1所表征的2個含SLeX O-聚糖之一相同(Wilkins等人，1996)。19ek肽的次要成分(圖1A)是修飾較少的SGP-3。19ek肽SGP-1和SGP-2的結構(圖1A)確定為分別含有1個和2個硫酸酪氨酸的SGP-3形式。利用MS的初步分析表明，連二硫酸成分內(nèi)存在硫酸酪氨酸的每種前突變，但沒有定量。19ek肽庫內(nèi)也存在不含硫酸酪氨酸(糖肽-1，GP-1)或不含碳水化合物(磺基肽-1，SP-1)的SGP-3形式，并且通過層析法解析(圖1A)。
為了選擇最具功能性的成分進行共結晶，我們使用表面胞質團共振測定P-LE對各19ek肽的結合親和力。為進行比較，我們評價了一種可溶性重組PSGL-1(sPSGL-1)，它包含完整的二聚胞外域。與以前的研究一致，P-LE以快速動力學結合固定的sPSGL和19ek肽(圖1B)。根據(jù)使用EDTA和中和單克隆抗體的對照實驗(未顯示)，并用SGP-3作為可溶性抑制劑(圖1B)，確定結合是特異性的。用完全修飾的SGP-3獲得對于19ek肽的最高親和力作用，KD為778nM。用sPSGL獲得基本相同的親和力(圖1C)，提示19ek肽SGP-3在功能上模擬全長胞外PSGL-1構建體，較短構建體中存在的PSGL-1的N端區(qū)組成了對P-LE的完整識別區(qū)。P-LE對SGP-3的連二硫酸形式的結合親和力略弱(圖1C)，對于二硫酸形式(SGP-2)KD為2.88μM，對于單硫酸形式(SGP-1)為12.3μM。不含碳水化合物(SP-1)或磺基酪氨酸(GP-1)的SGP-3形式的P-LE結合親和力較弱，估計分別為113μM和31.1μM(圖1C)。P-LE對于不含碳水化合物或硫酸化的合成19ek肽的親和力大大低于任何修飾的形式，在此處使用的蛋白質濃度下無法測定。此處測定的P-LE與sPSGL和SGP-3結合的親和力與以前可溶性P-選擇蛋白和類似于P-LE的P-選擇蛋白的凝集素-EGF構建體與全長嗜中性粒細胞PSGL-1結合所測得的值相當(KD分別為322nM和422nM)(Mehta等人，1998)。另外，最近也報道了可溶性P-選擇蛋白與類似于SGP-3修飾的PSGL-1磺基糖肽的結合親和力，KD為～350nM(Leppanen等人，1999)。
與PSGL-1磺基糖肽-3結合的P-LE的X-射線晶體結構。P-LE與兩倍摩爾過量的SGP-3共結晶。為了獲得衍射1.9的大I222空間群晶體，需要重復大引晶和用鍶替換鈣。用室內(nèi)采集的汞數(shù)據(jù)產(chǎn)生相位，顯示在結晶不對稱單元中有2個P-LE/SGP-3復合物。用CNS精化結構為R-因子＝20.4％(R-free，23.5％)(表1)。在SGP-3內(nèi)的29個氨基酸中，可觀察到殘基6-18，包括硫酸化Tyr-7(Tys-7)和硫酸化Tyr-10(Tys-10)。結構中雜亂和缺乏的是多肽殘基1-5，包括大多數(shù)N端硫酸化酪氨酸(Tys-5)和含有腸激酶-接頭區(qū)的殘基19-29。在Thr-16處SLeX修飾的O-聚糖除一個殘基外都可見。未檢測到與Gal(1，3)GalNAc分支(2，3)-連接的NeuNAc的電子密度(圖1A，插圖)，但該殘基似乎不是結合必需的(Leppanen等人，1999)。
P-LE/SGP-3復合物的兩張不同的視圖提供了結合作用的結構概貌，由此可推斷生理P-選擇蛋白/PSGL-1相互作用的情況。SGP-3以1∶1化學計算與含有大表位的P-LE凝集素域結合，將溶劑排除在16412外，包含對于P-LE/SLeX復合物所述的SLeX結合部位。盡管實際上根據(jù)轉移NOE研究(D.Tsao，未發(fā)表的發(fā)現(xiàn))確定，SGP-3在溶液中無序，并且可能延伸，但結合構象通過內(nèi)部折疊壓縮，產(chǎn)生發(fā)夾樣結構。盡管該結果不排除PSGL-1同型二聚體的不同臂(每一個提供結合相互作用的不同成分)可能同時嚙合一個P-選擇蛋白凝集素域的可能性，但是提示，PSGL-1的一個臂能提供完整的一組結合決定簇。而且，這種結合作用提供了PSGL-1同型二聚體的各個單體同時嚙合兩個不同P-選擇蛋白分子的可能性。兩種平行結合作用的共定位可能是P-選擇蛋白功能的生理需要，因為發(fā)現(xiàn)PSGL-1的二聚化突變體在剪切影響下不能支持細胞結合(Snapp等人，1998)。由P-LE/SLeX復合物的檢測也可確定，SGP-3的結合在基本與凝集素域∶EGF域界面相對的P-LE面上發(fā)生。這直接證明P-選擇蛋白的EGF域不參與直接結合PSGL-1，至少是該分子的N端部分，但是在P-選擇蛋白功能中可能具有間接作用(見下文)。
盡管實際上鈣被替換為鍶，但在P-LE與SLeX的復合物中見到的相互作用在P-LE/SLeX結構中再現(xiàn)，這與以前發(fā)現(xiàn)的該金屬能有效替換鈣相一致(Asa等人，1992)。該復合物中有P-LE的大結構重排，導致金屬離子坐標改變。在P-LE/SLeX復合物中，F(xiàn)uc的2-羥基與Glu-107形成氫鍵(距離3.4)。這在P-LE/SGP-3復合物中不存在，但被代替為與Glu-88之間的氫鍵，它本身也可配位結合鍶。在P-LE結構中，Asn-83的側鏈接近但不配位結合鈣，在E-LE與SLeX的結合中，SLeX的結合使其與金屬離子和Fuc羥基相互作用。在P-LE/SGP-3復合物中，該殘基的位點被替換為Glu-88的側鏈。就此而言，金屬連接精確地模擬與寡甘露糖復合的MBP(Weis等人，1992)和與SLeX復合的MBP的K3突變體(Ng和Weis，1997)，其中發(fā)現(xiàn)相應的殘基Glu-193連接鈣。
SGP-3多肽與P-LE之間的相互作用是疏水和靜電接觸的組合。在擴展構象中，與蛋白質接觸的SGP-3肽的大多數(shù)N端殘基是Tys-7，隨后是3個殘基。殘基Tys-10到Leu-13形成一個轉角，這改變了肽的方向，其余的殘基在擴展構象中朝向Pro-18。Tys-7的硫酸化與Ser-46和Ser-47的側鏈羥基、主鏈酰胺氮并通過排列的水分子形成一系列氫鍵。另外，P-LE的His-114為其余的硫酸氧貢獻一個氫鍵，形成氫鍵網(wǎng)絡。Tys-7也與Lys-112的酰胺氮形成主鏈氫鍵，并與Ser-47和Lys-113的側鏈形成疏水作用。SGP-3殘基Leu-8對Leu-13壓緊，它們都對His-108和Lys-111側鏈形成的蛋白質的疏水表面壓緊。這些相互作用有助于穩(wěn)定肽的緊湊四級結構。Tys-10側鏈的芳環(huán)正對兩個亮氨酸殘基，硫酸鹽的位置能與Arg-85和Thr-16的主鏈酰胺氫鍵鍵合。P-LE的大結構排列(見下文)使Arg-85與SGP-3多肽的相互作用成為可能，并且證明了以前關于P-選擇蛋白內(nèi)該殘基的定點誘變研究的發(fā)現(xiàn)(Bajorath等人，1994)。當突變?yōu)锳la時，P-選擇蛋白突變體喪失與PSGL-1表達細胞結合的高親和力，仍保留低親和力(可能只是SLeX介導的)結合。類似地，其表位已經(jīng)對附近殘基76-83作圖的抗體顯示不能與PSGL-1結合，但可與SLeX結合(Hirose等人，1998)。在P-LE/SGP-3復合物中，SGP-3中的Phe-12的側鏈不與蛋白質接觸，但在與非結晶對稱有關的另一拷貝的復合物中對其本身壓緊。在溶液中似乎可能正對Leu-110側鏈形成的疏水表面。只能見到與SGP-3的Pro-14有相互作用，它對His-108壓緊，并接受來自Arg-85的氫鍵。
與無配體的P-LE和P-LE/SLeX復合物相比，與SGP-3結合的P-LE構象有幾處顯著改變。最明顯的構象改變是殘基環(huán)從Asn-83移至Asp-89，使Arg-85與SGP-3的Tys-10接觸，和Glu-88移至連接結合金屬的位置。這種移動隨后似乎影響殘基Arg-54向Glu-74的位置移動，占據(jù)Asn-83到Asp-89環(huán)空出的空間。在未復合的P-LE中，Thr-65對Trp-1的側鏈壓緊，排除溶劑。P-LE/SGP-3復合物中觀察到的環(huán)的移動預期使Trp-1暴露于溶劑，但該殘基重排，在凝集素域的Tyr-118與EGF域的Glu-135之間壓緊。在Trp-1移動的同時，EGF域相對于凝集素域轉動52°，Trp-1側鏈移動產(chǎn)生的空隙被MPD分子填充，它對側鏈的新位置壓緊。這提出了關于EGF域的移動是由用于結晶的高濃度MPD引起的還是由于SGP-3結合引起的這一問題。EGF域在與PSGL-1(至少是分子N端區(qū))的結合中似乎不起直接作用，根據(jù)觀察到EGF域可調節(jié)配體識別，它與凝集素域的關系的改變是一個令人感興趣的發(fā)現(xiàn)(Gibson等人，1995；Kansas等人，1994)。
此外，這些研究也表明，EGF和CR域與此處所述結合部位C端的PSGL-1其它區(qū)之間有第二次結合作用。其它結構研究進一步研究了凝集素與EGF域之間可能的相互作用。SGP-3多肽的內(nèi)部折疊使Tys-10靠近Thr-10處的O-聚糖，提示PSGL-1線性序列內(nèi)SLeX修飾的聚糖與硫酸酪氨酸的關系可能不是絕對位于最少數(shù)量的間插殘基之上。P-選擇蛋白可能支持PSGL-1 N端的多種結合構象，該研究只顯示其中之一。P-LE/SGP-3結構提示PSGL-1的Tys-7和Tys-10(而不是Tys-5)是結合必需的，該結果與誘變研究一致，該誘變研究表明這些特異硫酸酪氨酸殘基在P-選擇蛋白介導的滾動中的優(yōu)先作用。然而，PSGL-1 N端的柔性可能使硫酸酪氨酸有不同的前突變，例如Tys-5和Tys-7或Tys-5和Tys-10，以不同的方式結合P-選擇蛋白內(nèi)的堿性殘基。這一假說可以解釋P-LE對三硫酸SGP-3的親和力為何高于二硫酸SGP-2。P-選擇蛋白內(nèi)可能存在第三個尚未確定的硫酸酪氨酸結合部位，這可解釋這一發(fā)現(xiàn)，PSGL-1多肽的柔性可使3個硫酸酪氨酸殘基中的任一個與此處定義的兩個部位結合。這可解釋含有一個硫酸酪氨酸殘基(包括Tys-5)的PSGL-1的突變?yōu)楹沃С諴-選擇蛋白的結合(Ramachandran等人，1999)。鼠PSGL-1中相應的N端區(qū)也是結合P-選擇蛋白所必需的，并且含有2個可能的硫酸酪氨酸，只有2個和4個殘基從對應于Thr-16的可能的糖基化位點中去除，上述發(fā)現(xiàn)也證明了結合中這種可能的柔性。鼠P-選擇蛋白在位點85和114處也含有堿性殘基，根據(jù)對人P-LE/SGP-3相互作用的觀察，預期與鼠PSGL-1內(nèi)的硫酸酪氨酸有相似的離子作用。這種相互作用的結果是橫跨硫酸酪氨酸和SLeX結合部位有較少的間插殘基。類似地，PSGL-1 N端區(qū)的柔性也允許與Thr-16結合的其它O-聚糖結構的識別。已經(jīng)對骨髓PSGL-1描述了較長聚-N-乙酰乳酸胺O-聚糖內(nèi)的SLeX和LeX表位，P-選擇蛋白可能以類似的方式適合它。
結論。與SLeX復合的P-LE和E-LE和與此處所示PSGL-1磺基糖肽復合的P-LE的晶體結構顯然有助于我們對選擇蛋白識別的分子基礎的理解。與SLeX復合的P-LE和E-LE的結構顯示相同的和不同的結合作用，這解釋了它們對共有配體的不同的親和力。P-LE/SGP-3復合物的結構特別說明了E-和P-選擇蛋白對PSGL-1的不同識別如何實現(xiàn)。E-和P-選擇蛋白凝集素域的主要序列有50％以上相同，而P-LE/SGP-3相互作用必需的殘基是P-選擇蛋白獨有的，這可能是P-選擇蛋白/PSGL-1相互作用的較高親和力的原因。殘基Arg-85和His-114對于與SGP-3內(nèi)酪氨酸硫酸殘基的離子相互作用是重要的，是P-選擇蛋白獨有的(人E-選擇蛋白中的相應殘基分別是不帶電的Gln和Leu)。有趣的是，在小鼠、大鼠、兔和母牛的P-選擇蛋白和E-選擇蛋白中觀察到這些位點處不同電荷的趨勢，提示是P-選擇蛋白與PSGL-1相互作用的保守結合基序。這些結構發(fā)現(xiàn)也可能了解L-選擇蛋白/PSGL-1相互作用的性質。根據(jù)單克隆抗體中和(Kansas，1996)和誘變(Ramachandran等人，1999)研究，L-選擇蛋白似乎也識別PSGL-1的N端區(qū)。這種相互作用的親和力尚未測定，但相對于P-選擇蛋白和E-選擇蛋白與PSGL-1的相互作用，預計為中度親和力。這是根據(jù)以下假設高度同源的L-選擇蛋白凝集素域采取類似于E-選擇蛋白和P-選擇蛋白的構象，PSGL-1 N端的識別與P-選擇蛋白的識別有共同的性質。與P-選擇蛋白一樣，人L-選擇蛋白在位點85處含有堿性殘基(Lys殘基)，預計它可與PSGL-1 N端的內(nèi)硫酸化Tyr形成基本離子作用。然而，L-選擇蛋白在位點114處不含堿性殘基，這能支持與PSGL-1內(nèi)酪氨酸硫酸的第二次離子作用，因此結合親和力也許與P-選擇蛋白相當。
E-和P-選擇蛋白與此處所示SLeX和PSGL-1磺基糖肽的相互作用主要是基于氫鍵網(wǎng)絡和選擇的離子作用，是這類細胞粘附分子的結合親和力和快速結合動力學的基礎。親和力相對較低的選擇蛋白/反受體相互作用的快速可逆性導致白細胞的粘附和滾動，這是隨后的激活、牢固粘附和向組織中滲入所必需的。在炎癥中，PSGL-1似乎在選擇蛋白介導的過程中起中心作用，介導嗜中性粒細胞最初與血管內(nèi)皮的粘附，并且促進對于炎癥反應增強可能十分重要的嗜中性粒細胞-嗜中性粒細胞和嗜中性粒細胞-血小板相互作用。此處所述的結構信息將極大地幫助用于炎癥治療的小分子拮抗劑的合理設計，其中E-和P-選擇蛋白/SLeX和P-選擇蛋白/PSGL-1相互作用得到證實。表1.數(shù)據(jù)采集相位確定及精化統(tǒng)計數(shù)字
表2E-選擇蛋白SLEX 4接觸TYR48，GLU80，ASN82，ASN83，GLU92，TYR94，ARG97，GLU98，ASN105，ASP106，GLU107，結合鈣
E-選擇蛋白SLEX 8接觸TYR44，SER45，PRO46，SER47，TYR48，ALA77，PROP78，GLY79，GLU80，PRO81，ASN82，ASN83，GLU88，CYS90，GLU92，TYR94，ARG97，GLU98，LYS99，ASP100，TRP104，ASN105，ASP106，GLU107，ARG108，LYS111，LYS113，結合鈣P-選擇蛋白SLEX 4接觸TYR48，GLU80，ASN82，GLU92，TYR94，PRO98，SER99，ASN105，ASP106，GLU107，結合鈣P-選擇蛋白SLEX 8接觸TYR44，SER46，SER47，TYR48，ALA77，ASP78，ASN79，GLU80，PRO81，ASN82，ASN83，ARG85，GLU88，CYS90，GLU92，ILE93，TYR94，LYS96，SER97，PRO98，SER99，ALA100，TRP104，ASN105，ASP106，GLU107，HIS108，LYS111，LYS113，結合鈣P-選擇蛋白PSGL-1 4接觸ALA9，TYR45，SER46，SER47，TYR48，GLU80，ASN82，LYS84，ARG85，GLU88，GLU92，TYR94，PRO98，SER99，ASN105，ASP106，GLU107，HIS108，LEU110，LYS111，LYS112，LYS113，HIS114，結合鍶P-選擇蛋白PSGL-18接觸SER6，THR7，LYS8，ALA9，TYR10，SER11，TYR44，TYR45，SER46，SER47，TYR48，TYR49，TRP50，ALA77，ASP78，ASN79，GLU80，PRO81，ASN82，ASN83，LYS84，ARG85，ASN86，ASN87，GLU88，CYS90，GLU92，ILE93，TYR94，ILE95，LYS96，SER97，PRO98，SER99，ALA100，TRP104，ASN105，ASP106，GLU107，HIS108，CYS109，LEU110，LYS111，LYS112，LYS113，HIS114，結合鍶參考文獻(1)Alon，R.，Chen，S.，Puri，K.D.，F(xiàn)inge，E.B.和Springer，T.A.(1997).L-選擇蛋白粘連的動力學和選擇蛋白介導的滾動機制.J.CellBiol.138，1169-1180.
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上述所有公開文本，無論是公開的專利、未決的申請、發(fā)表的文章、蛋白質結構保藏還是其它，均在此完整引用作為參考。盡管為了便于理解已經(jīng)詳細描述了本發(fā)明，但本領域技術人員根據(jù)內(nèi)容所述應當理解，在不背離附加權利要求書中本發(fā)明真正范圍的情況下，能進行形式和細節(jié)的更改。
權利要求
1.一種結晶的P-選擇蛋白LE。
2.權利要求1的結晶P-選擇蛋白LE，其特征在于是空間群為P21的片狀，晶胞參數(shù)為a＝81.0，b＝60.8，c＝91.4，β＝103.6°。
3.P-選擇蛋白LE與SLeX的結晶復合物。
4.權利要求3的結晶復合物，其特征在于是空間群為P21的片狀，晶胞參數(shù)為a＝81.1，b＝60.5，c＝91.4，β＝103.3°。
5.E-選擇蛋白LE與SLeX的結晶復合物。
6.權利要求5的結晶復合物，其特征在于是空間群為P212121的桿狀，晶胞參數(shù)為a＝34.5，b＝72.4，c＝77.6。
7.P-選擇蛋白LE與PSGL-1肽的結晶復合物。
8.權利要求7的結晶復合物，其特征在于是空間群為I222的雙棱錐形，晶胞參數(shù)為a＝63.4，b＝96.8，c＝187.3。
9.SLeX結合蛋白或肽的活性部位，其中該活性部位包括根據(jù)圖3的氨基酸殘基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
10.權利要求9的活性部位，其中該活性部位還包括根據(jù)圖3的氨基酸殘基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
11.SLeX結合蛋白或肽的活性部位，其中該活性部位包括根據(jù)圖4的氨基酸殘基TYR48、GLU80、ASN82、ASN83、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
12.權利要求11的活性部位，其中該活性部位還包括根據(jù)圖4的氨基酸殘基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
13.PSGL-1結合蛋白或肽的活性部位，其中該活性部位包括根據(jù)圖5的氨基酸殘基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和結合鍶的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
14.權利要求13的活性部位，其中該活性部位還包括根據(jù)圖5的氨基酸殘基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109的相對結構坐標，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
15.一種鑒定可與P-選擇蛋白LE相互作用的試劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖2、圖3或圖5的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生P-選擇蛋白LE的三維模型；和(b)用該三維模型設計或選擇可與P-選擇蛋白LE相互作用的試劑。
16.權利要求15的方法，其還包括步驟(c)獲得鑒定的試劑；和(d)使鑒定的試劑與P-選擇蛋白LE接觸，以確定該試劑對P-選擇蛋白LE活性的影響。
17.一種鑒定含有SLeX結合部位的分子或分子復合物的激活劑或抑制劑的方法，包括下列步驟(a)利用(i)根據(jù)圖3的殘基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，或(ii)根據(jù)圖4的氨基酸殘基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和結合鈣的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生含有SLeX結合部位的分子或分子復合物的三維模型；和(b)用步驟(a)產(chǎn)生的三維模型對候選激活劑或抑制劑進行計算機擬合分析，選擇或設計候選激活劑或抑制劑。
18.權利要求17的方法，其中根據(jù)圖3的相對結構坐標還包括氨基酸殘基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
19.權利要求17的方法，其中根據(jù)圖4的相對結構坐標還包括氨基酸殘基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
20.權利要求17的方法，其還包括下列步驟(c)獲得候選激活劑或抑制劑；和(d)使候選激活劑或抑制劑與該分子或分子復合物接觸，確定候選激活劑或抑制劑對該分子或分子復合物的影響。
21.權利要求20的方法，其中為了確定候選激活劑或抑制劑對分子或分子復合物結合SLeX的影響，在SLeX的存在下，使候選激活劑或抑制劑與該分子或分子復合物接觸。
22.一種鑒定含有PSGL-1結合部位的分子或分子復合物的激活劑或抑制劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖5的氨基酸殘基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和結合鍶的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生含有PSGL-1結合部位的分子或分子復合物的三維模型；和(b)用步驟(a)產(chǎn)生的三維模型對候選激活劑或抑制劑進行計算機擬合分析，選擇或設計候選激活劑或抑制劑。
23.權利要求22的方法，其中根據(jù)圖5的相對結構坐標還包括氨基酸殘基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109，±氨基酸主鏈原子的一個均方根差，其不超過1.5。
24.權利要求22的方法，其還包括下列步驟(c)獲得候選激活劑或抑制劑；和(d)使候選激活劑或抑制劑與分子或分子復合物接觸，并確定候選激活劑或抑制劑對分子或分子復合物的影響。
25.權利要求24的方法，其中為了確定候選激活劑或抑制劑對分子或分子復合物結合PSGL-1或PSGL-1肽的影響，在PSGL-1或PSGL-1肽的存在下，使候選激活劑或抑制劑與分子或分子復合物接觸。
26.一種鑒定可與SLeX相互作用的試劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖3或圖4的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生SLeX的三維模型；和(b)用該三維結構設計或選擇可與SLeX相互作用的試劑。
27.權利要求26的方法，其還包括下列步驟(c)獲得鑒定的試劑；和(d)使鑒定的試劑與SLeX接觸，以確定該試劑對SLeX活性的影響。
28.一種鑒定可與PSGL-1相互作用的試劑的方法，包括下列步驟(a)利用根據(jù)圖5的相對結構坐標，±不超過1.5的氨基酸主鏈原子的一個均方根差，產(chǎn)生PSGL-1肽的三維模型；和(b)用該三維結構設計或選擇可與PSGL-1相互作用的試劑。
29.權利要求28的方法，其還包括下列步驟(c)獲得鑒定的試劑；和(d)使鑒定的試劑與PSGL-1或PSGL-1肽接觸，以確定該試劑對PSGL-1或PSGL-1肽活性的影響。
30.利用權利要求15的方法鑒定的一種試劑。
31.利用權利要求17的方法鑒定的一種抑制劑或激活劑。
32.利用權利要求22的方法鑒定的一種抑制劑或激活劑。
33.利用權利要求26的方法鑒定的一種試劑。
34.利用權利要求28的方法鑒定的一種試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及P－選擇蛋白的凝集素和EGF－樣(LE)域的晶體和三維結構，均與SLe
文檔編號G01N23/207GK1430516SQ01809777
公開日2003年7月16日 申請日期2001年5月17日 優(yōu)先權日2000年5月19日
發(fā)明者W·S·索莫斯, 唐進, R·喀姆法森, J·瑟赫拉 申請人:遺傳學研究所有限責任公司