專利名稱：區(qū)分正常妊娠和異位妊娠的診斷裝置及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于區(qū)分正常妊娠和異位妊娠的一步妊娠診斷裝置以及這種裝置的制備方法。更具體地說，本發(fā)明涉及通過免疫檢測分泌到孕婦體液中的人絨毛膜促性腺激素(hCG)及其修飾形式間的形態(tài)差別而可以在早期快速而準(zhǔn)確地測定正常妊娠和異位妊娠的診斷裝置，以及制備這種裝置的方法。
異位妊娠是最常發(fā)生的產(chǎn)科和婦科急癥之一，并且它的發(fā)生率逐年增加。異位妊娠導(dǎo)致的輸卵管破裂的可觀察到的癥狀包括下腹痛、閉經(jīng)或陰道出血、血壓下降引起的頭暈、胃腸道癥狀引起的惡心和嘔吐。未治療的輸卵管破裂可能導(dǎo)致腹膜內(nèi)出血，這是孕婦在妊娠早期死亡的最大原因。因此，如果異位妊娠未在早期發(fā)現(xiàn)，輸卵管破裂和隨后出血休克的發(fā)生可能導(dǎo)致患者死亡。然而，異位妊娠的早期診斷面臨困難，因?yàn)檫€沒有發(fā)現(xiàn)特定的癥狀和可特定地用于異位妊娠的診斷方法。在這些情況下，本發(fā)明的發(fā)明人對異位妊娠的早期檢測可以降低孕婦死亡率并解決正常妊娠的婦女擔(dān)心異位妊娠的焦慮的假設(shè)進(jìn)行了廣泛研究，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)用于異位妊娠的早期診斷的方法和裝置。
人絨毛膜促性腺激素(下文中稱為“hCG”)產(chǎn)生于胎盤的合胞滋養(yǎng)層，它在妊娠早期誘導(dǎo)黃體酮的穩(wěn)定產(chǎn)生以維持胚泡進(jìn)入子宮內(nèi)膜的過程直到妊娠第10周，這時胎盤功能完善。它還刺激胎兒睪丸中睪酮的產(chǎn)生，在男性胚胎內(nèi)生殖器的分化中起重要作用，并且還具有其它各種功能包括刺激母體甲狀腺。在受孕(或受精)后約8天在血液和尿中檢測到hCG水平約為25mIU/ml。接著它的濃度從妊娠第5周開始以穩(wěn)定的速度快速上升，在妊娠第6周達(dá)到約1IU/ml，在妊娠第10周達(dá)到約100～120IU/ml。在妊娠第10到18周期間，濃度由那一水平下降到妊娠第20周時的約20IU/ml，此后濃度維持穩(wěn)定。hCG是糖蛋白，其由α和β兩個亞基組成，含有30％的碳水化合物，分子量約為36700道爾頓。α-亞基由92個氨基酸殘基組成，具有與黃體生成素和甲狀腺刺激激素的α-亞基相同的結(jié)構(gòu)。β-亞基由145個氨基酸殘基組成(hCG的結(jié)構(gòu)特征)(Lapthorn等，Nature.1994.Vol369455～461)。
一般而言，發(fā)現(xiàn)hCG在人體液中以各種形式存在。已知的有完整的hCG(I-hCG)以及修飾的hCGs，后者包括缺口hCG(N-hCG)、高糖基化的hCG、游離的β-hCG和游離的β-核心片段。hCGs的這些各種形式產(chǎn)生于妊娠、腦垂體、滋養(yǎng)層疾病和絨毛膜癌事件中。在正常妊娠婦女的體液中，完整的hCG約占存在的總hCGs的90％，各種修飾的hCGs約占10％或10％以下。
在另一方面，異位妊娠的特征為幾乎所有的hCGs均以完整的hCG的形式存在，與正常妊娠相反，它僅有極少量的修飾的hCGs，其中測得缺口hCG和游離β-hCG的某些比率。另外，與正常妊娠相比，其hCG分泌總量和增加范圍非常小。因此，在妊娠第6周其hCG分泌量約為正常妊娠的1/5，在妊娠第8周則降至正常妊娠的約1/50，也就是約15IU/ml。
美國專利第5,786,220號公開了區(qū)分正常妊娠和異常妊娠的一步診斷試劑體系的制備方法。這一專利公開了正常妊娠、自然流產(chǎn)、異位妊娠、癌癥等可以通過同時測定女性體液中的黃體酮濃度和hCG水平來診斷。具體而言，該專利公開了一種診斷方法，其中血液中黃體酮的濃度為25ng/ml或25ng/ml以下，并且hCG的濃度為25～2500mIU/ml，表示自然流產(chǎn)或異位妊娠；黃體酮濃度超過25ng/ml，并且hCG濃度超過2500mIU/ml，表示正常的子宮內(nèi)妊娠。Denil等(Fertility& Sterility.1999.Vol.721013～1017)公開了在正常妊娠中，游離β-hCG水平為30～170IU/ml，在異常子宮內(nèi)妊娠中，為1～70IU/ml，在異位妊娠中為0.059～29IU/ml，這表明在異位妊娠中分泌的hCG降解產(chǎn)物的濃度比正常妊娠中低得多。
如上所述，hCG是妊娠診斷中最重要的激素，利用妊娠早期的hCG水平，結(jié)合超聲檢查，可以區(qū)分妊娠、流產(chǎn)和異位妊娠。在妊娠診斷中，hCG可以用于確證早期妊娠。低水平的hCG和加倍時間，后者指在受孕第5周到第9周期間每1.4～2天血液中hCG加倍，表明流產(chǎn)或異位妊娠。hCG水平高于正常值解釋為表明多胎妊娠或葡萄胎。除了測定孕婦血漿和尿中的hCG水平外，異位妊娠也通過超聲波檢查法、診斷腹腔鏡檢查及類似方法進(jìn)行診斷。特別地，超聲波檢查法結(jié)合hCG水平測定進(jìn)行診斷，其中超聲發(fā)現(xiàn)存在妊娠囊，并且hCG水平低于1000mIU/ml，表明妊娠生存能力不足。如果每48小時hCG水平不定量增加至少65％，則確定妊娠的預(yù)后很差。
這種用于異位妊娠的診斷方法如測定hCG水平加倍時間的已知方法和測定孕婦體液中游離β-hCG水平的方法具有需要重復(fù)采血樣的缺點(diǎn)。美國專利第5,786,220號中公開的妊娠診斷方法建立在與本發(fā)明不同的診斷原理的基礎(chǔ)上，其不同之處在于黃體酮濃度的測定應(yīng)與hCG水平的測定平行進(jìn)行。即使可以區(qū)分正常妊娠和異常妊娠，也還存在另一個問題，對孕婦來說很危險的常見自然流產(chǎn)和異位妊娠間的有效早期區(qū)分很難獲得。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人對一步同時診斷試劑盒的制備方法進(jìn)行了廣泛的研究，通過所述試劑盒，可以在妊娠早期診斷中同時實(shí)現(xiàn)正常妊娠和異位妊娠的診斷。結(jié)果，現(xiàn)在本發(fā)明的發(fā)明人提供一步同時診斷試劑盒，通過所述試劑盒，通過測定hCG水平為25mIU/ml，可以確定為正常妊娠，通過比較I-hCG和修飾的hCGs的濃度，可以確定異位妊娠。
本發(fā)明的特征在于抗-I-hCG單克隆抗體與抗-α-hCG單克隆抗體的組合使用，抗-修飾的hCG單克隆抗體與抗-β-hCG單克隆抗體的組合使用，以分別檢測孕婦體液(血液、尿、唾液等)中存在的I-hCG和修飾的hCG


圖1b示意性地顯示了圖1a中用于內(nèi)部條帶的抗體固定化膜上的結(jié)果線(NP、EP)和完成線(C)。參考數(shù)字11標(biāo)明了硝化纖維膜。參考數(shù)字8和12標(biāo)明了完成線，在此處固定有兔抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗體。參考數(shù)字9標(biāo)明了測試結(jié)果線，在此處固定有抗-β-hCG單克隆抗體，參考數(shù)字13標(biāo)明了測試結(jié)果線，在此處固定有抗-α-hCG單克隆抗體。參考數(shù)字10標(biāo)明了其上結(jié)合有抗-修飾的hCG單克隆抗體的有色顆粒墊，參考數(shù)字14標(biāo)明了其上結(jié)合有抗-I-hCG單克隆抗體的有色顆粒墊。
圖2a顯示本發(fā)明的用于正常妊娠和異位妊娠的同時診斷裝置的另一示意圖。參考數(shù)字15標(biāo)明了指示測試完成的標(biāo)記(C)。參考數(shù)字16標(biāo)明了異位妊娠線(EP)，參考數(shù)字17標(biāo)明了正常妊娠線(NP)。參考數(shù)字18標(biāo)明了診斷裝置的閱讀窗口，參考數(shù)字19標(biāo)明了樣品接受窗孔，孕婦體液樣品被施加到其中。
圖2b示意性地顯示圖2a中用于內(nèi)部條帶的抗體固定化膜上的結(jié)果線(NP、EP)和完成線(C)。參考數(shù)字20標(biāo)明了硝化纖維膜。參考數(shù)字21標(biāo)明了完成線，在此處固定有兔抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗體。參考數(shù)字22標(biāo)明了異位妊娠(EP)線，在此處固定有抗-α-hCG單克隆抗體，參考數(shù)字23標(biāo)明了正常妊娠(NP)線，在此處固定有抗-β-hCG單克隆抗體。參考數(shù)字24標(biāo)明了其上結(jié)合有抗-修飾的hCG單克隆抗體和抗-I-hCG單克隆抗體的混合有色顆粒墊。
圖3顯示本發(fā)明的用于正常妊娠和異位妊娠的同時診斷裝置中內(nèi)部條帶的結(jié)構(gòu)。參考數(shù)字25標(biāo)明了樣品吸收墊，參考數(shù)字26標(biāo)明了抗體固定化的硝化纖維膜，參考數(shù)字27標(biāo)明了有色顆粒墊，參考數(shù)字28標(biāo)明了樣品接受墊，其中這些墊以部分重疊的方式順序組合。
如上所述，女性正常妊娠或異位妊娠早期階段時尿中的hCG以各種形式存在。特別地，異位妊娠情況下發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)hCG以完整形式(I-hCG)存在，僅有很少量的修飾的hCG存在。在正常妊娠的情況下，I-hCG約占存在的總hCGs的90％，各種修飾的hCGs約占10％。利用以上差別，本發(fā)明可以通過分別檢測和視覺比較I-hCG和修飾的hCGs而確證妊娠并同時區(qū)分正常妊娠和異位妊娠。本發(fā)明的診斷裝置的構(gòu)建通過分別提供具有異位妊娠(EP)區(qū)和正常妊娠(NP)區(qū)的診斷試劑盒來完成，其中當(dāng)樣品中存在I-hCG時，在異位妊娠區(qū)中出現(xiàn)有色線，當(dāng)樣品中存在修飾的hCGs時，在正常妊娠區(qū)中出現(xiàn)有色線。在異位妊娠的情況下，大多數(shù)hCG以I-hCG的形式存在。因此，有色線由于I-hCG的反應(yīng)將僅在EP區(qū)出現(xiàn)，或者即使NP線出現(xiàn)，也將出現(xiàn)強(qiáng)得多的EP線。在正常妊娠中，除了I-hCG外，體液中存在的修飾的hCG約為10％。因此，在本發(fā)明的診斷裝置中，將其上結(jié)合有對修飾的hCGs有反應(yīng)性的抗體的有色顆粒的濃度增加2～10倍，或者使要結(jié)合的抗體的濃度相應(yīng)增加，從而增強(qiáng)修飾的hCGs的反應(yīng)靈敏度。這將致使在兩個區(qū)(EP、NP)中出現(xiàn)的有色線的強(qiáng)度相似，以輔助診斷正常妊娠。
在下文中，本發(fā)明的妊娠診斷裝置的結(jié)構(gòu)將得到更詳細(xì)的描述。
在異位妊娠中過量表達(dá)的抗I-hCG單克隆抗體根據(jù)眾所周知的方法進(jìn)行制備，并接著結(jié)合到有色顆粒上。將由此而得的顆粒摻入玻璃纖維墊中，并進(jìn)行干燥以產(chǎn)生有色顆粒墊。在另一方面，抗修飾的單克隆抗體根據(jù)眾所周知的方法進(jìn)行制備，并接著結(jié)合到有色顆粒上。將由此而得的顆粒摻入玻璃纖維墊中，并進(jìn)行干燥以產(chǎn)生有色顆粒墊。可以用于本發(fā)明的各種有色顆粒包括聚苯乙烯顆粒、膠體金及類似物。在這種顆粒中，優(yōu)選膠體金，粒徑為20到60nm的膠體金更為優(yōu)選。
為了維持診斷裝置的靈敏度，結(jié)合到抗原(hCG)結(jié)合位點(diǎn)上的單克隆抗體用作固相膜，該抗原結(jié)合位點(diǎn)與結(jié)合在有色顆粒上的抗體的結(jié)合位點(diǎn)不同。用于這一目的單克隆抗體為抗-β-hCG單克隆抗體和抗-α-hCG單克隆抗體。通過將抗體分散入膜中分別形成直線而將這兩種抗體固定在分開的硝化纖維膜上(圖1)，或者通過將抗體分散入膜中形成兩條交叉的線或兩條分離的線而將這兩種抗體固定在一個膜上(圖2)。在單克隆抗體結(jié)合區(qū)帶的膜下游末端，將抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗體分散入膜中，從而將出現(xiàn)測試完成線。
如上述制備的抗體固定化膜可被貼在其上施加有粘合劑的聚酯載體上，接著在上面縱向施加單克隆抗體-有色顆粒墊。接著縱向以相互重疊的方式施加要直接滴加孕婦體液的樣品接受墊和吸收過量體液的樣品吸收墊，從而提供用于正常妊娠和異位妊娠的同時診斷試劑盒的內(nèi)部條帶(圖3)。
現(xiàn)在將闡述使用如上述制備的同時診斷裝置來早期診斷正常妊娠和異位妊娠的方法。
當(dāng)將孕婦體液(血液、尿、唾液等)樣品施加到樣品接受墊上時，樣品通過毛細(xì)作用被吸收并遷移，接著和摻入有色顆粒墊中的單克隆抗體結(jié)合的有色顆粒反應(yīng)。在正常妊娠的情況下，存在于樣品中的I-hCG和修飾的hCGs將分別結(jié)合到結(jié)合于有色顆粒上的單克隆抗體上并沿著硝化纖維膜相移動。在固定有兩種單克隆抗體的膜區(qū)域，抗原抗體復(fù)合物將分別以夾心方式結(jié)合，從而由有色顆粒形成的兩條結(jié)果線(NP、EP)以相似的強(qiáng)度在膜上出現(xiàn)。
在異位妊娠中，I-hCG組成了體液中存在的大部分hCGs。因此，I-hCG結(jié)合的單克隆抗體和有色顆粒的復(fù)合物將沿著膜移動，并結(jié)合到抗-α-hCG單克隆抗體上以產(chǎn)生很強(qiáng)的EP帶。相反，其上結(jié)合有抗修飾的hCG單克隆抗體的有色顆粒將不與樣品中的I-hCG反應(yīng)，因此它將繼續(xù)移動而不結(jié)合到固定有抗-β-hCG單克隆抗體的膜上。顆粒還可以與樣品中存在的極少量修飾的hCGs反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)度很弱的NP帶。因此，在異位妊娠的情況下，將出現(xiàn)一條EP帶或強(qiáng)度不同的兩條帶(EP帶強(qiáng)于NP帶)。
如果被測婦女并沒有懷孕，單克隆抗體-有色顆粒復(fù)合物將繼續(xù)移動而不結(jié)合到固定在膜中結(jié)果線(NP、EP)上的抗-hCG單克隆抗體上，因?yàn)闃悠分胁⒉淮嬖趆CG。因此，有色顆粒帶將僅出現(xiàn)在固定有抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗體的測試完成線(C)上。
描述本發(fā)明的用于正常妊娠和異位妊娠的同時診斷裝置的形狀和結(jié)構(gòu)的實(shí)例如圖1a到2b所示。
如果結(jié)合到有色顆粒墊上的抗體和結(jié)合到膜上的抗體交換，可以獲得相同的結(jié)果。如上所述將抗-α-hCG單克隆抗體和抗-β-hCG單克隆抗體分別結(jié)合到有色顆粒上，將抗-I-hCG單克隆抗體、抗-修飾的hCG單克隆抗體和抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗體固定在硝化膜上以提供診斷試劑盒。當(dāng)將來自孕婦的體液施加到樣品接受墊上時，1)在正常妊娠中，樣品中存在的I-hCG和其它修飾的hCGs分別結(jié)合到結(jié)合于有色顆粒上的抗-α-hCG單克隆抗體和抗-β-hCG單克隆抗體上，并沿著硝化纖維膜移動，接著分別以夾心方式結(jié)合到固定在膜上的抗-I-hCG單克隆抗體和抗-修飾的hCG單克隆抗體上，從而導(dǎo)致膜上出現(xiàn)兩條強(qiáng)度相似的結(jié)果線(NP、EP)；2)在異位妊娠中，存在于體液中的I-hCG結(jié)合到結(jié)合于有色顆粒上的抗-α-hCG單克隆抗體上，并沿著膜移動，接著結(jié)合到膜上的抗-I-hCG單克隆抗體上，從而僅給出很強(qiáng)的EP帶，或者樣品中存在的極少量修飾的hCG產(chǎn)生強(qiáng)度很弱的NP帶；3)如果被測婦女并沒有懷孕，單克隆抗體-有色顆粒復(fù)合物將繼續(xù)移動而不結(jié)合到固定在膜中結(jié)果線(NP、EP)上的抗-hCG單克隆抗體上，因?yàn)闃悠分胁⒉淮嬖趆CG。因此，有色顆粒帶將僅出現(xiàn)在固定有抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗體的測試完成線(C)上。
現(xiàn)在，本發(fā)明將通過下列實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅出于闡明本發(fā)明的目的，而不應(yīng)解釋為限制本將反應(yīng)混合物放入50ml離心管(Corning，美國)中，在超速離心機(jī)(Beckman，美國)中在10000rpm下離心15分鐘。離心后，棄去上清液，轉(zhuǎn)移沉淀并在穩(wěn)定化緩沖液(0.5～2％牛血清白蛋白，1～5％蔗糖，50～100mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5～9.0))中再懸浮。將所得的懸浮液調(diào)整到合適濃度，將有色顆粒墊浸入懸浮液中并接著干燥。加入其上結(jié)合有實(shí)施例2中獲得的抗-修飾的hCG單克隆抗體的有色顆粒，直到其濃度為其上結(jié)合有實(shí)施例1中獲得的抗-I-hCG單克隆抗體的有色顆粒濃度的2～10倍?；蛘?，將濃度為2～10倍高的抗-修飾的hCG單克隆抗體被于結(jié)合反應(yīng)，這樣測試樣品中含有的相對少量(10％)的修飾的hCGs可得到清晰檢測。
當(dāng)將實(shí)施例2中獲得的抗-β-hCG單克隆抗體和實(shí)施例1中獲得的抗-α-hCG單克隆抗體制成有色顆粒墊時，將結(jié)合到膜上的抗-修飾的hCG單克隆抗體的濃度調(diào)整到2～10倍高于抗-I-hCG單克隆抗體的濃度，由此修飾的hCG可得到清晰檢測。實(shí)施例5抗體固定化膜(閱讀面板)的制備為了使結(jié)果線在固定有抗體的區(qū)帶內(nèi)響應(yīng)正常妊娠和異位妊娠，將識別并結(jié)合α-hCG的單克隆抗體和識別并結(jié)合β-hCG的單克隆抗體滴加到硝化纖維膜上分別形成直線。濃度為1～4.0mg/ml的抗體得到制備，將該抗體滴加并固定在膜上，其最終濃度為0.1～5μg/cm，其中含有0.1～2％蔗糖的5～50mM磷酸鹽緩沖液用作固定化溶液。在單克隆抗體滴加區(qū)帶下游，用濃度為0.5～2mg/ml的兔抗-鼠免疫球蛋白(IgG)多克隆抗體提供反應(yīng)結(jié)束線(圖1a和2b中的C)，其中含有0.1～2％蔗糖的5～50mM磷酸鹽緩沖液用作固定化溶液。完成抗體固定化的膜在室溫下干燥2小時。要固定的抗體和滴加模式可以根據(jù)要顯示的結(jié)果線的形狀而變化。圖1中顯示的診斷試劑盒通過將抗-α-hCG單克隆抗體和抗-β-hCG單克隆抗體滴加并固定在不同的膜上來制備。在圖2中顯示的診斷試劑盒中，為了使結(jié)果線在一個膜上出現(xiàn)，將兩種抗體以兩條分開的直線的形式滴加并固定在膜上。特別是對于如圖1顯示的診斷試劑盒，要固定在膜上的抗體和要結(jié)合到有色顆粒上的抗體的選擇對于獲得需要的結(jié)果很重要。因此，當(dāng)使用其上固定有抗-α-hCG單克隆抗體的膜時，就需要使用其上結(jié)合有抗-I-hCG單克隆抗體的有色顆粒墊。當(dāng)使用其上固定有抗-β-hCG單克隆抗體的膜時，就需要使用其上結(jié)合有抗-修飾的hCG單克隆抗體的有色顆粒墊，這樣修飾的hCG就可得到檢測。當(dāng)使用其上固定有抗-修飾的hCG單克隆抗體的膜時，就使用其上結(jié)合有抗-β-hCG單克隆抗體的有色顆粒墊。如果使用其上固定有抗-I-hCG單克隆抗體的膜，就需要使用其上結(jié)合有抗-α-hCG單克隆抗體的有色顆粒墊。實(shí)施例6樣品接受墊和樣品吸收墊將玻璃纖維(Millipore，美國)或纖維素紙(Whatman，英國)用于樣品接受墊中，將纖維素紙(Whatman，英國)用于樣品吸收墊中。實(shí)施例7用于妊娠和異位妊娠的同時診斷的條帶的制備如圖3所示，將實(shí)施例5中制備的抗體固定化膜貼到粘性聚酯載體上，將實(shí)施例4中制備的抗體結(jié)合的有色顆粒墊施加在其上，重疊1～3mm。接著施加樣品接受墊，縱向重疊1～10mm，接著施加樣品吸收墊，重疊1～5mm，由此獲得同時診斷條帶。將所得的同時診斷條帶組裝到如圖1a和圖2a中所示的那些塑料套中，從而產(chǎn)生用于正常妊娠和異位妊娠的同時診斷試劑盒。實(shí)驗(yàn)例1用hCG標(biāo)準(zhǔn)溶液評價同時診斷試劑盒為了評價上述實(shí)施例制備的診斷試劑盒的專一性，由來自Zymed(Cat.No.14-1401)的商品I-hCG和通過超聲檢查判斷為正常妊娠的孕婦的妊娠早期的尿制備hCG標(biāo)準(zhǔn)溶液。用于要評價的試劑盒的有色顆粒墊通過將抗I-hCG的單克隆抗體和抗修飾的hCGs的單克隆抗體分別結(jié)合到實(shí)施例4中的有色顆粒上來制備?？贵w結(jié)合的膜通過如實(shí)施例5所述在硝化纖維膜上分別滴加抗-α-hCG單克隆抗體和抗-β-hCG單克隆抗體來制備。將由此而得的兩種抗體固定膜和兩種有色顆粒墊組裝來提供每一種可能的膜和墊的組合。接著將樣品接受墊和樣品吸收墊分別貼到裝置上以產(chǎn)生同時診斷條帶。
制備標(biāo)準(zhǔn)溶液、陰性和陽性標(biāo)準(zhǔn)并用于測試。
陰性標(biāo)準(zhǔn)50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)陽性標(biāo)準(zhǔn)1I-hCG 50mIU/ml磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)陽性標(biāo)準(zhǔn)2來自早期妊娠婦女的尿，其中超聲檢查確證正常子宮內(nèi)妊娠囊，并且檢測到胎兒的心跳。
向樣品接受區(qū)帶施加約500μl上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，并觀察3分鐘。結(jié)果線的出現(xiàn)與否表明結(jié)果的“陽性”和“陰性”。
測試結(jié)果列于下面表1中。表1.用于同時診斷試劑盒(1)的單克隆抗體識別性質(zhì)的比較

注-(沒有反應(yīng))，+(很弱的反應(yīng))，++(顯著反應(yīng))，+++(強(qiáng)烈反應(yīng))由表1可見，在不含有hCG的陰性標(biāo)準(zhǔn)的情況下，測定結(jié)果為“陰性”，因?yàn)樵谀ど瞎潭ㄓ锌贵w1和2的區(qū)帶內(nèi)沒有出現(xiàn)線。對于含有I-hCG的陽性標(biāo)準(zhǔn)1，其上結(jié)合有抗-I-hCG單克隆抗體的有色顆粒和固定有抗-α-hCG單克隆抗體的區(qū)帶顯示出強(qiáng)烈的相互作用，具有其它單克隆抗體的試劑盒顯示出很弱的相互作用。對于利用來自正常妊娠的婦女的尿的陽性標(biāo)準(zhǔn)2，其上結(jié)合有抗-I-hCG單克隆抗體的有色顆粒和固定有抗-α-hCG單克隆抗體的區(qū)帶顯示出強(qiáng)烈的相互作用。其上結(jié)合有抗-修飾的hCG單克隆抗體的有色顆粒和固定有抗-β-hCG單克隆抗體的區(qū)帶也顯示出強(qiáng)烈的相互作用。從這些結(jié)果可以認(rèn)識到，抗-I-hCG單克隆抗體結(jié)合抗-α-hCG單克隆抗體可檢測I-hCG，而用抗-修飾的hCG單克隆抗體和抗-β-hCG單克隆抗體可檢測修飾的hCGs。
當(dāng)結(jié)合到有色顆粒和膜上的抗體互換時獲得相似的結(jié)果，這清楚地表明測定中所用抗體組合的重要性。表2顯示用標(biāo)準(zhǔn)hCG溶液測試的結(jié)果，其中抗-α-hCG單克隆抗體和抗-β-hCG單克隆抗體結(jié)合到有色顆粒上，抗-I-hCG單克隆抗體和抗-修飾的hCG單克隆抗體固定在膜上，以制備同時診斷試劑盒。表2.用于同時診斷試劑盒(2)的單克隆抗體的識別性質(zhì)的比較

注-(沒有反應(yīng))，+(很弱的反應(yīng))，++(顯著反應(yīng))，+++(強(qiáng)烈反應(yīng))由上面實(shí)驗(yàn)例可以看出，正常妊娠和異位妊娠可以用肉眼檢測，因?yàn)槌霈F(xiàn)線的位置和強(qiáng)度取決于樣品中含有的hCG的形式。實(shí)驗(yàn)例2用同時診斷正常妊娠和異位妊娠的試劑盒測試孕婦尿樣表3顯示測試結(jié)果，在該測試中，將來自非妊娠婦女、正常妊娠婦女和異位妊娠婦女的尿樣分別施加到本發(fā)明的同時診斷試劑盒上，以測定正常妊娠和異位妊娠中特異性發(fā)現(xiàn)的修飾的hCGs和I-hCG。正常妊娠的尿樣來自超聲檢查確證子宮內(nèi)妊娠囊和已檢測到胎兒心跳的孕婦。異位妊娠的尿樣來自通過外科手術(shù)確證為異位妊娠的婦女。用于本實(shí)施例的診斷試劑盒為圖1a中所示的形式。表3.同時診斷試劑盒的臨床準(zhǔn)確性的測定

注-(沒有反應(yīng))，+(很弱的反應(yīng))，+++(強(qiáng)烈反應(yīng))
由表3可見，在來自非妊娠婦女的尿樣的情況下，NP和EP結(jié)果線位置并不出現(xiàn)線。在來自正常妊娠婦女的尿樣的情況下，出現(xiàn)相似強(qiáng)度的NP和EP結(jié)果線。特別的是，對于來自異位妊娠婦女的尿樣，出現(xiàn)的EP結(jié)果線比NP結(jié)果線強(qiáng)得多，這意味著信息顯示正常妊娠和異位妊娠間存在顯著差別。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供可同時檢測正常妊娠和異位妊娠的一步妊娠診斷裝置以及這種裝置的制備方法。由于孕婦體液根據(jù)妊娠形式而含有不同形式的hCG，本發(fā)明通過免疫學(xué)檢測體液中存在的hCG的形式而在妊娠早期快速準(zhǔn)確地檢測正常妊娠和異位妊娠。在本發(fā)明中，為了分別檢測孕婦體液中存在的I-hCG和修飾的hCGs，抗-I-hCG單克隆抗體與抗-α-hCG單克隆抗體組合，抗-修飾的hCG單克隆抗體和抗-β-hCG單克隆抗體組合。因此，本發(fā)明通過在早期發(fā)現(xiàn)異位妊娠而將有助于降低孕婦死亡率。
權(quán)利要求
1.基于免疫層析的妊娠診斷裝置，所述裝置包括抗體結(jié)合的膜和抗體結(jié)合的有色顆粒墊，其中抗體由抗-α-hCG單克隆抗體、抗-β-hCG單克隆抗體、抗-I-hCG單克隆抗體和抗-修飾的hCG單克隆抗體的組合組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的妊娠診斷裝置，所述裝置進(jìn)一步包括樣品接受墊和樣品吸收墊。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的妊娠診斷裝置，其中抗體進(jìn)一步包括抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的妊娠診斷裝置，其中抗體結(jié)合的膜包含抗-α-hCG單克隆抗體和抗-β-hCG單克隆抗體，抗體結(jié)合的有色顆粒墊包含抗-I-hCG單克隆抗體、抗-修飾的hCG單克隆抗體和有色顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的妊娠診斷裝置，其中抗體結(jié)合的膜包含抗-I-hCG單克隆抗體和抗-修飾的hCG單克隆抗體，抗體結(jié)合的有色顆粒墊包含抗-α-hCG單克隆抗體、抗-β-hCG單克隆抗體和有色顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的妊娠診斷裝置，其中有色顆粒由選自硒、金和聚苯乙烯的一種或多種形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5的妊娠診斷裝置，其中所用的抗-I-hCG單克隆抗體和抗-修飾的hCG單克隆抗體的濃度比為1∶2～10。
8.妊娠診斷裝置，所述裝置包括異位妊娠線、正常妊娠線和測試完成線，其中當(dāng)測試來自非妊娠婦女的樣品時，只有測試完成線變成視覺可見的；當(dāng)測試來自正常妊娠婦女的樣品時，測試完成線、異位妊娠線和正常妊娠線變成視覺可見的，并且它們強(qiáng)度相同；而當(dāng)測試來自異位妊娠婦女的樣品時，只有測試完成線和異位妊娠線變成視覺可見的，或者，測試完成線、異位妊娠線和正常妊娠線變成視覺可見的，但正常妊娠線強(qiáng)度顯著較弱。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的妊娠診斷裝置，其中異位妊娠線由抗-α-hCG單克隆抗體組成，正常妊娠線由抗-β-hCG單克隆抗體組成，測試完成線由抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗體組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的妊娠診斷裝置，其中異位妊娠線由抗-I-hCG單克隆抗體組成，正常妊娠線由抗-修飾的hCG單克隆抗體組成，測試完成線由抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗體組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的妊娠診斷裝置，其中抗-α-hCG單克隆抗體和抗-β-hCG單克隆抗體已溶解在含有0.1％～2％蔗糖和5～50mM磷酸鹽緩沖液的固定化緩沖液中，接著固定到膜上，至0.1-5μg/cm。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的妊娠診斷裝置，其中樣品選自尿、血液和唾液。
全文摘要
本發(fā)明提供可同時檢測和區(qū)分正常妊娠和異位妊娠的一步妊娠診斷裝置以及制備這種裝置的方法。根據(jù)本發(fā)明，通過免疫檢測分泌到孕婦體液中的人絨毛膜促性腺激素(hCG)及其修飾形式間的形態(tài)差別，可在早期快速而準(zhǔn)確地測定正常妊娠和異位妊娠。
文檔編號G01N33/68GK1446064SQ01814071
公開日2003年10月1日 申請日期2001年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月12日
發(fā)明者張震東, 車政學(xué), 南正鉉 申請人:胡曼塞斯有限公司