專利名稱：用于分析電泳和制備電泳的介質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于分析電泳和制備電泳的介質(zhì)。
在高壓電泳下形成pH梯度的這類水溶液廣泛用于蛋白質(zhì)和肽的分析中。這類已知的溶液包含具有兩性性能的聚合電解質(zhì)，并且通常通過羧酸與聚胺的縮合或聚合來合成制備。在合成時，產(chǎn)生許多分子量不同和酸性基團(tuán)(羧基)和堿性基團(tuán)(氨基或亞氨基)數(shù)目不同的化合物。在高壓電泳條件下，這些聚合電解質(zhì)由于其酸性和堿性基團(tuán)的比例不同而這樣排序，即具有特別的酸性性能的聚合電解質(zhì)濃集在陽極附近，而所有其它的聚合電解質(zhì)根據(jù)其酸性或堿性性能的“等級”排列在電極之間，并因此而濃集。通過聚合電解質(zhì)按其各個物質(zhì)的酸性或堿性性能的選擇性濃集在整個水溶液內(nèi)部形成pH梯度。
借助于該pH梯度，兩性化合物，例如蛋白質(zhì)和肽可以根據(jù)該不同的酸性或堿性性能達(dá)到分離。這種分析性分離方法在文獻(xiàn)中被稱作“等電點聚焦”。如果該方法在特定的凝膠(聚丙烯酰胺)中進(jìn)行，那么該方法被稱作PAGIEF(在聚丙烯酰胺凝膠上的IEF)，并被視作標(biāo)準(zhǔn)方法。
在市售的兩性物合成時使用的不飽和酸例如取代的丙烯酸是有劇毒的，其殘余量被認(rèn)為是有危害的。
出于該理由，禁止使用市售的兩性物來純化隨后用于人類的蛋白質(zhì)。
在合成該兩性物時，產(chǎn)生許多未知結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)，其相對濃度按批號差異很大。因此對分析結(jié)果的再現(xiàn)有不利影響。
在某些應(yīng)用中，報導(dǎo)過在兩性物和分析物之間所不希望的配合物導(dǎo)致的“人造條帶”。
也報導(dǎo)過具有高分子量的兩性物對蛋白質(zhì)的分析顯色反應(yīng)的部分干擾。多次報導(dǎo)過在某些制造商的產(chǎn)品中有異常高含量的MG(分子量)＞10KD的兩性物。
在蛋白質(zhì)的制備性純化情況下，隨后的兩性物的分離是困難的，并且有時是不完全的；據(jù)推測可能的原因是這里形成了配合物。
已經(jīng)證明市售的兩性物不適合于作為用于生物顆粒的分離介質(zhì)，因為該生物顆粒聚集在介質(zhì)中。
本發(fā)明的目的是提供一種用于等電點聚焦(IF)的含有不同pKs值的酸和堿的水溶液，其不具有上述缺陷，并因此明顯拓寬了其應(yīng)用范圍。
本發(fā)明的目的是通過權(quán)利要求1的水溶液達(dá)到的。其它有利的實施方案由隨后的權(quán)利要求2至7給出。
本發(fā)明的水溶液包括具有成梯度的酸度和/或堿度的酸和堿的混合物。各個酸的pKs值在pKs3.5至pKs12之間變化，并且“相鄰”酸的pKs-值的差值(ΔpKs)應(yīng)該不大于ΔpKs＝1。理想的值是ΔpKs＜0.8。
所用堿的pKs值在pKs＝1.5至pKs＝11之間變化。當(dāng)各個堿的差值ΔpKs＜0.8時是理想的。
所使用的酸和/或堿的數(shù)目和其相關(guān)濃度決定pH-梯度的范圍和分布(Profil)。最低數(shù)目是各2種酸和/或2種堿，優(yōu)選是3種酸和/或3種堿。在pH值范圍寬(pH2.5至10)的情況下，使用具有成梯度的pKs的11種酸和13種堿。
在所附的附

圖1至3中，描述了各為三種常規(guī)酸和堿的模型中的電泳遷移和因此產(chǎn)生的pH梯度的形成。下面的酸∶羥基丁酸(HIBA(pKs＝3.8))，HEPES(pKs＝7.5)和2-羥基吡啶(pKs＝11.6)和下面的堿∶牛磺酸(pKs＝1.5)、蜜胺(pKs＝5)和ammediol(pKs＝9)以不同的濃度存在于起始溶液中(參見附圖1)。一般規(guī)則是，與較強的酸和堿的濃度相比，不但非常弱的酸而且非常弱的堿的相對濃度明顯升高(約5倍)?！爸械葟姸取钡乃岷蛪A的濃度升高至約1.5倍至最大3倍。
在附圖2和3中，描述了電泳移動之后上述酸和堿的相對濃度。在所述的“平衡狀態(tài)”中，形成酸和堿“對”，它們僅以非常低的程度相互電離(強酸-HIBA+非常弱的堿-牛磺酸，弱酸-HEPES+弱堿-蜜胺和強堿-Ammediol+非常弱的酸-2OH-吡啶)，并且因此介質(zhì)本身的物質(zhì)的電泳遷移停頓。在這些對的區(qū)域中，在每種情況下產(chǎn)生一相應(yīng)于酸和堿的pKs值的算術(shù)平均值的pH值。因此，這些對的pH值是HIBA/?；撬崛芤簆H＝2.6，HEPES/蜜胺pH＝6.25，2-OH-吡啶/AmmediolpH＝10.3。其中對可以確保穩(wěn)定的pH值的pH范圍是約1pH單元。只要各個酸和堿的絕對濃度在平衡狀態(tài)下確保足夠的緩沖能力，則所有其它的具有不同pKs值的酸和堿就構(gòu)成同樣在一個pH單元內(nèi)確保穩(wěn)定的pH值的對。
本發(fā)明的溶液由詳知其性能的確定的化學(xué)物質(zhì)組成。通過制備時所使用的天平的精密性和準(zhǔn)確性來保證整個混合物的再現(xiàn)性。所使用的物質(zhì)是無毒的。所使用的每一種物質(zhì)是“單官能”的，也就是說根本不存在如形成配合物或生物高分子聚集的結(jié)果，或者與具有多官能基團(tuán)的聚合電解質(zhì)相比這種作用至少明顯降低。該混合物中所有各個組分的分子量總計＜300道爾頓。
已經(jīng)成功地證明本發(fā)明的水溶液可以作為用于生物聚合物和生物顆粒的分離介質(zhì)，并且認(rèn)為具有生物相容性。因為大部分各個組分可以通過具有類似pKs值的化學(xué)物質(zhì)替代，所以通過改變該組合物的組成可以顧及生物顆粒對該分離介質(zhì)的特定要求。出于該理由，官方可能許可該溶液用于隨后在人體中用的生物顆粒和生物聚合物(肽和蛋白質(zhì))的純化。
下面舉例說明本發(fā)明的具有不同pH-間隔的水溶液。這里要注意，在制備用于窄的pH間隔的介質(zhì)時，酸和堿的絕對濃度升高；一般也可以通過使用新組分來降低pKs值的差。
實施例1(pH-間隔3-10)
實施例2(pH-間隔4-6)
實施例3(pH-間隔5.5-7.5)
實施例4(pH-間隔8-11.5)
實施例5(pH-間隔2.5-5)
在所述的介質(zhì)中產(chǎn)生大部分呈線性的pH梯度。在一定的pH范圍中，通過改變酸和堿的相對濃度可以使pH分布逐漸平緩。在制備本發(fā)明的溶液時，各個化合物的加入順序一般是不重要的。
權(quán)利要求
1.用于分析電泳和制備電泳的介質(zhì)，其包含具有不同pKs值的酸和堿，其特征在于，包含至少二種其pKs值在約3.0至12之間的酸和至少二種其pKs值在約1.5至11之間的堿，其中相鄰酸的pKs-值的差值(ΔpKs)不大于1，優(yōu)選是0.8至0.5，相鄰堿的pKs-值的差值(ΔpKs)不大于1，優(yōu)選是0.8至0.5。
2.權(quán)利要求1的介質(zhì)，其特征在于，其包含至少3種酸和3種堿。
3.權(quán)利要求1或2的介質(zhì)，其特征在于，所述酸的相對和絕對濃度隨pKs-值的升高而連續(xù)升高，所述堿的相對和絕對濃度隨pKs-值的升高而下降，其中在每種情況下，與最強酸和堿的濃度相比，較弱酸和/或較弱堿的濃度在pKs值有小差異即pKs＝1-3時升高1.5至3倍，而在pKs值的差異大即pKs＝3-8時，較弱酸和堿的相對濃度升高至達(dá)4至8倍。
4.上述權(quán)利要求之一項的介質(zhì)，其特征在于，在電泳遷移之后每個相鄰pH值單元形成酸/堿對，產(chǎn)生相應(yīng)于相應(yīng)酸和相應(yīng)堿的pKs值的算術(shù)平均值的pH值。
5.上述權(quán)利要求之一項的介質(zhì)，其特征在于，選擇各個酸和堿的濃度以便在電泳遷移之后在平衡狀態(tài)下確定和保持足夠的緩沖能力。
6.上述權(quán)利要求之一項的介質(zhì)，其特征在于，為了調(diào)節(jié)窄的pH-間隔，提高酸和堿的絕對濃度，并且如果需要通過其相應(yīng)的選擇降低該酸和堿的ΔpKs。
7.上述權(quán)利要求之一項的介質(zhì)，其特征在于，每種情況下使用的酸和堿的分子量低于300道爾頓。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于分析電泳和制備電泳的介質(zhì)，其包含具有不同pK
文檔編號G01N27/447GK1462368SQ01816132
公開日2003年12月17日 申請日期2001年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月21日
發(fā)明者格哈德·韋伯 申請人:格哈德·韋伯