專利名稱：收集和穩(wěn)定生物樣品的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及收集、儲存、運輸和穩(wěn)定生物樣品尤其是一個直接從病人那里得到的全血樣品的方法和裝置。更具體地，本發(fā)明涉及抽真空的液體樣品的容器，其中含有一種起穩(wěn)定作用的添加劑，以在收集生物樣品的過程中立即穩(wěn)定核酸并抑制在儲存過程中發(fā)生體外基因誘導和降解。
背景技術(shù)：
樣品收集容器已被普遍使用多年，用于收集和儲存血樣和其它體液或樣品。典型的收集容器是玻璃或塑料試管并有一個彈性塞。這些玻璃或塑料試管通常被用于收集血樣。
在試管抽真空時可利用血樣收集管吸入一定體積的血樣。試管可含有各種添加劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)，它可制備血樣供特定的測試。一種普通添加劑是抗凝劑。典型的抗凝添加劑是一種檸檬酸鹽或肝素緩沖水溶液。檸檬酸鹽水溶液與血樣以規(guī)定量混合可決定在進行一些試驗時所需的抗凝劑的量。這些裝置僅被用于血清學測試因為添加劑并不能穩(wěn)定樣品中的核酸。在運送過程中，不穩(wěn)定RNA分子被酶降解以致后續(xù)的RNA分離和分析變得困難。而且，機械剌激或是物理環(huán)境的變化如，舉例來講，溫度的影響或采血和運送時細胞的破壞會誘導基因轉(zhuǎn)錄而使某些mRNA種類產(chǎn)生過量或不足。
常用的添加劑包括抗凝劑以使血樣品保持一種抗凝狀態(tài)，使其可被用于進行不同的處理步驟中。例如，抗凝劑典型地用于血樣，然后離心而把血分離成細胞層。含有一種抗凝劑的這種類型樣品管的一個實例公開在Smith等的美國專利5,667,963號。
近年，在生物、醫(yī)學和藥學領(lǐng)域中有越來越多的興趣研究基因活性和生物樣品中所得到的核酸。特別是，核糖核酸能提供廣泛的遺傳起源的信息和細胞功能活性的信息。這些信息可用于臨床診斷傳染病，檢測表達癌基因的細胞是否存在，檢測遺傳疾病，監(jiān)測宿主防御機制的狀態(tài)，研究和診斷代謝疾病，研究藥物在病人體內(nèi)對基因表達的影響，研究藥物的副作用和毒性，以及確定HLA類型或其他特殊的標記。
在把細胞破壞、把RNA釋放入溶液后有很多方法用于分離RNA。另一些方法用于保護RNA以防被內(nèi)源性RNA酶所降解。然后，RNA能從DNA和蛋白中分離出來，后者和RNA一起被增溶。溶解細胞、溶解RNA和抑制RNA酶的過程通常是逐步進行的而不是同時進行的。已知一些溶解細胞和抑制RNA酶活性的方法是使用胍的離液鹽(chaotropic salt)。
一個常用的分離RNA的方法包括在異硫氰酸胍鹽中攪勻細胞，然后依次加入乙酸鈉和酚，以及氯仿/異戊醇。離心之后，在加入乙醇后RNA從上層沉淀下來。另外的方法包括在細胞懸液中加入熱的酚，然后用酒精沉淀。
陰離子和陽離子表面活性劑可用于溶解細胞和釋放細胞質(zhì)RNA。這種溶解細胞并同時把溶液中的DNA和RNA沉淀下來的方法的一個實例在美國Macfarlane的專利5010183中得到揭示。在此過程中，使RNA不能溶解。在細胞懸液中加入2％的表面活性劑氯化芐基二甲基正十六烷基銨溶液和40％的尿素以及其它添加劑。然后，將懸液離心，回收不溶物粒狀沉淀。把沉淀再懸浮在乙醇中并加入鹽使RNA和DNA沉淀下來。
一種分析從血液分離的RNA的方法是使用擴增的方法，包括聚合酶鏈反應(yīng)，以檢測微量RNA的序列。分析RNA的一個困難是在RNA被核酸酶降解之前把RNA從細胞中的蛋白和DNA分離出來。血液中存在足夠量的RNA酶和其他核酸酶以破壞未受保護的RNA。因此，這就需要使用一種能從細胞中分離出RNA而又不讓核酸酶水解RNA的方法。
當今，常規(guī)使用的血液收集方法能夠收集和保留血液在一段時間之后用于分析。這個收集裝置包括一種抗凝劑以防止在儲存過程中發(fā)生凝結(jié)。然而，當有機械剌激或物理環(huán)境的變化如溫度或血液采集時細胞破裂會導致一些RNA的種類被誘導，血液中的核酸酶在儲存和運輸時會水解一些RNA的種類。這些分析樣品之前的操作因素會導致mRNA過低或過量表達以及最終可用分子診斷檢測方法測定的總RNA發(fā)生降解。而且，基因誘導能導致樣品中RNA水平的上升，這就會引起錯誤的結(jié)果。因此，在工業(yè)中就有持續(xù)的要求希望有一種改進的方法和收集血液和其他生物樣品的裝置以便在基于核酸的測試中維持體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄狀況。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及收集生物樣品的方法和裝置。更為特別的是，本發(fā)明涉及一種收集容器和一種收集生物樣品的方法以及立即使樣品與一種穩(wěn)定劑接觸以封閉樣品中基因的體外誘導，因而維持了體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的情況。
因此，本發(fā)明的首要方面是提供一種收集生物樣品特別是在穩(wěn)定劑存在時直接從患者中得到的全血樣品的方法和裝置，以在儲存過程中通過抑制或阻抑樣品中的基因誘導而穩(wěn)定和保存RNA。這種穩(wěn)定劑存在的量能有效的穩(wěn)定核酸，尤其是RNA，并能抑制和封閉基因誘導。
本發(fā)明的一個方面是制備一個能在室溫下長時間保持穩(wěn)定的生物樣品而很少或者是不發(fā)生基因誘導。因此，提供了一種方法可以獲得在儲存過程中在室溫穩(wěn)定而很少發(fā)生或不發(fā)生基因誘導的生物樣品。
本發(fā)明的另一方面是提供一種抑制生物樣品中的核酸基因誘導的方法和裝置，并溶解細胞、細菌、病毒和網(wǎng)織紅細胞。
本發(fā)明的另一方面是提供一種用于接受和收集生物樣品的收集容器，此容器預(yù)先裝有定量的基因誘導封閉劑。
本發(fā)明的又一方面是提供一種穩(wěn)定生物樣品特別是直接從患者身上收集的全血樣品以抑制或防止當樣品在室溫下儲存時引起的基因誘導。
本發(fā)明的再一方面是提供一種穩(wěn)定生物樣品特別是直接從患者身上收集的全血樣品的方法，該法能抑制或防止當樣品在低于室溫，典型的在2℃到約8℃，或在適于將樣品存檔的溫度例如在-20℃到-80℃時發(fā)生的基因誘導或核酸降解。凍結(jié)的樣品可以在室溫融化以分離核酸。
本發(fā)明的還有一方面是提供一種在收集生物樣品時立即封閉體外基因誘導的方法。
本發(fā)明的又一方面是提供一種已預(yù)先加入有效量的基因誘導封閉劑的抽真空的收集容器。
本發(fā)明的又一方面是提供一種血液收集容器，該容器的內(nèi)壓足夠低，而能將預(yù)定體積的生物樣品抽吸入容器。以收集一定量的血液，并在收集時將血樣和基因誘導封閉劑混合而通過防止基因誘導使之在室溫下穩(wěn)定，以便于以后對能樣品進行核酸分析。
本發(fā)明的另一方面是提供一種在含有基因誘導封閉劑和緩沖液的容器中收集血樣從而穩(wěn)定血樣的方法。此種基因誘導劑可以是一種去垢劑、離液鹽、RNA酶抑制劑、螯合劑、或它們的混合物?；旌衔锏膒H調(diào)整后可抑制或封閉核酸降解或基因誘導并便于有效地回收分析物。
本發(fā)明的還有一方面是提供一種在從約pH2到約pH5并至少存在一種基因誘導封閉劑的收集裝置中穩(wěn)定血液樣品的方法。
本發(fā)明的各方面基本是通過提供一種收集生物樣品的裝置而獲得的。這個裝置包括一個容器，它包含有一個側(cè)壁，一個底壁以及一個確定內(nèi)室界限的開口端和一個關(guān)閉開口端的蓋子。這個容器包括至少一種基因誘導封閉劑其量能有效地保護生物樣品和封閉或抑制體外基因誘導。這種容器預(yù)先裝有穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的各方面更進一步是通過提供一種制備一種在室溫下穩(wěn)定存在的生物樣品的方法而達到，它所包括的步驟有提供一個含有一個側(cè)壁，一個底壁和一個確定內(nèi)室界限的開口端的樣品收集容器，容器至少包含一定量和一定濃度的某種基因誘導封閉劑能有效地封閉體外基因誘導以保護生物樣品。生物樣品獲得后立即引入容器中并與基因誘導封閉劑混合而形成穩(wěn)定的生物樣品。
本發(fā)明的各方面也是通過提供一種收集和穩(wěn)定全血樣品或其他生物樣品的方法而達到的。此方法包括提供一個樣品收集容器，此容器包括一個側(cè)壁，一個底壁以及形成內(nèi)室的一個蓋子。此容器預(yù)先放有有效量的核酸穩(wěn)定劑水溶液或分散體以穩(wěn)定和保護核酸和/或全血樣品的轉(zhuǎn)錄狀況。內(nèi)室的壓力比大氣壓要小。收集容器中的全血樣品是直接從患者收集的，并且血樣品中混有穩(wěn)定劑以形成一個穩(wěn)定的全血樣品。
本發(fā)明的這些方面、優(yōu)點和其他突出的特征通過附圖和隨后的發(fā)明的細致描述會更加清楚。
附圖簡述以下簡短的描述一下附圖

圖1是本發(fā)明一個實施方案中容器的剖面?zhèn)纫晥D；圖2是顯示第一個供血者mRNA含量變化的圖；圖3是顯示第二個供血者mRNA含量變化的圖；圖4是顯示第三個供血者mRNA含量變化的圖；圖5是顯示第四個供血者mRNA含量變化的圖；圖6是顯示保存五天且不加穩(wěn)定劑的血樣中某種白細胞介素和其他種類mRNA數(shù)量的圖；圖7是顯示保存五天且不加穩(wěn)定劑的血樣品中的TL-8和TL-10mRNA的含量變化；圖8是顯示在室溫下儲存五天并加有草酸十四烷基三甲基銨和酒石酸的全血樣品中的某些種類的mRNA數(shù)量的圖；圖9是一份顯示圖8樣品中的IL-8和IL-10含量經(jīng)五天的變化。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定和保存生物樣品從而能更精確的測定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物數(shù)量的方法和裝置。更為特別的是，本發(fā)明涉及在收集、運輸和儲存過程中抑制或封閉生物樣品中基因誘導的方法和裝置。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，裝置是一個預(yù)先裝有一定量的基因誘導封閉劑并在收集樣品時立即與生物樣品混合的容器。包含的基因誘導封閉劑的量優(yōu)選能有效混合和穩(wěn)定生物樣品的量。生物樣品優(yōu)選直接從動物特別是人收集。
生物樣品可以是從動物特別是患者身上抽取的體液。在一個具體實施方案中，生物體液是全血樣品。另外一些生物樣品的例子包括含細胞的組分如紅血細胞濃縮物、血小板濃縮物、白細胞濃縮物、癌細胞、骨髓、吸出物、組織、細針吸出物和宮頸樣品。在另一個具體實施方案中，生物樣品是體液，如血漿、血清、尿、腦脊液和痰液。生物樣品也可以是細菌和真核微生物。在一項實施方案中，生物樣品選自體液、組織、機體擦拭物和機體涂片。本發(fā)明的基因誘導封閉劑是一種能抑制、防止或減少在生物樣品儲存時的體外基因誘導的適當試劑。這種試劑能穩(wěn)定生物樣品如血樣，以產(chǎn)生在室溫下穩(wěn)定的能抑制和防止生物樣品的核酸發(fā)生誘導轉(zhuǎn)錄的組合物。
在一種實施方案中，裝置10是一種直接從動物中特別是患者身體中抽取血樣并能在收集時立即穩(wěn)定核酸和封閉基因轉(zhuǎn)錄的裝置。根據(jù)圖示，裝置10包括一個確定小室14界限的容器12。這個實施方案闡明了容器12是一個中空試管，它有一個側(cè)壁16，一個封閉的底端18和一個開口的頂端20。容器12的尺寸適于收集適當體積的生物體液。有彈性的蓋子22位于武器頂端20處用以關(guān)閉容器12。更優(yōu)選的是，蓋22形成的封口能有效的關(guān)閉容器12并保留生物樣品在小室14中。一個起保護作用的護罩23覆蓋了蓋22。
容器12可由玻璃、塑料或其他合適的材料做成。塑料材料可以是不透氧的材料或者是含有一層不透氧的層。另一種選擇是，容器12可以由一種水和空氣可透過的塑料材料做成。更好的是，小室14維持了大氣壓的壓差，壓力低于大氣壓。選擇小室14的壓力能把預(yù)定體積的生物樣品吸入小室14。典型地，生物樣品通過用針24或用此領(lǐng)域中所知的插管刺入蓋22抽入小室14。一個合適的容器12和蓋22的實例公開在Cohen等的美國專利號5,860,937上，在此全文并入，以供參考。
容器12首選是由透明材料做成的。合適的透明熱塑性材料的例子包括聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇對苯二酸酯。根據(jù)所收集的生物樣品的體積要求，選擇容器12的合適尺寸。在一項實施方案中，容器12有一個軸向長度大約100mm和一個直徑大約13mm到16mm的管狀形狀。
蓋22是由一種能維持內(nèi)壓低于大氣壓并能被針頭或其他插管刺入而將生物樣品引入容器12的彈性材料做成的。合適的制作蓋的材料包括，如硅橡膠、天然橡膠、苯乙烯丁二烯橡膠、乙烯丙烯共聚物和聚氯丁二烯。
容器12也包含了一種基因誘導封閉劑26以穩(wěn)定血樣。這種基因誘導封閉劑26優(yōu)選含有一種穩(wěn)定劑的液體，其量能有效地和生物樣品混合并能穩(wěn)定核酸和封閉或抑制細胞或細胞中的核酸發(fā)生基因誘導。在一個實施方案中，選擇容器12的內(nèi)壓和穩(wěn)定添加劑26的體積，使其能對所收集的生物樣品體積提供所必需的穩(wěn)定劑濃度。在優(yōu)選的一個實施方案中，選擇容器12的內(nèi)壓，使之能抽吸大約2.5ml預(yù)定體積的生物樣品進入含有能穩(wěn)定該體積生物樣品的有效體積的基因誘導封閉劑26的容器12。在另一實施方案中，容器12的內(nèi)壓基本上是大氣壓。優(yōu)選的是，容器12預(yù)先由制造商填充基因誘導封閉劑并被包裝成容易使用的形式。典型地，已包裝的容器是無菌的且用無菌包裝材料包裝。
在一個實施方案中，容器12是由對水和氣體具通透性的塑料制成的。穩(wěn)定劑的水丟失是透過容器壁而蒸發(fā)，這樣增加了穩(wěn)定劑的濃度并減少了容器中的壓力。氧氣通過管壁擴散有減少容器中真空度的作用。選擇容器對水和氧氣的通透性以便在容器的所要求的保存期之內(nèi)維持容器中所要求的壓力差。通過平衡氧的通透性和水的丟失來優(yōu)化保存期限。容器的保存期限至少約為一年，最好更長。
基因誘導封閉劑26是至少一種有效的穩(wěn)定劑的固體或水溶液或分散體，它包含在容器中成為預(yù)先填充的容器。固體基因誘導劑可以是一種干粉或微粒如噴霧干燥或凍干的物質(zhì)。此固體基因誘導劑可以是在容器中的松散的微粒物質(zhì)或是在容器內(nèi)表面上的干涂層。
基因誘導阻抑試劑26優(yōu)選包含至少一種穩(wěn)定劑其濃度能穩(wěn)定生物樣品特別是全血樣品中的核酸。典型地，基因誘導封閉劑26是一種穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑的混合物的水溶液。此種穩(wěn)定劑優(yōu)選能有效地穩(wěn)定DNA和RNA包括mRNA、tRNA、snRNA、低分子量的RNA(LMW RNA)、rRNA和cRNA并能封閉或抑制在室溫保存過程中生物樣品中的體外基因誘導。合適的穩(wěn)定和保護核酸及/或防止基因誘導的穩(wěn)定劑的例子包括陽離子化合物、去垢劑、離液鹽、核糖核酸酶抑制劑、螯合劑、季銨以及它們的混合物。一個合適的核糖核酸酶抑制劑是胎盤RNA酶抑制蛋白。離液鹽的例子包括尿素、甲醛、異硫氰酸胍鹽、鹽酸胍鹽、甲酰胺、二甲亞砜、乙二醇和四氟乙酸。在其他的實施方案中，此基因誘導劑是一種有機溶劑或有機還原劑。適當?shù)挠袡C溶劑的例子選自酚、氯仿、丙酮和醇類。醇類一般是低級醇。有機還原劑的例子選自巰基醇類，二硫蘇糖醇(DTT)和它們的混合物。
穩(wěn)定劑也可包括處理生物樣品的另外一種成份。例如，在生物樣品中用于滲透或溶解細胞的化學試劑。優(yōu)選的是，穩(wěn)定劑能溶解網(wǎng)織紅細胞、細菌、紅血細胞和白血細胞。其他成分包括蛋白水解酶、酚、酚/氯仿混合物、醇類、醛類、酮類和有機酸。
去垢劑可以是陰離子去垢劑、陽離子去垢劑或非離子型去垢劑。陰離子去垢劑可以是，例如，十二烷基硫酸鈉。非離子去垢劑可以是，例如，環(huán)氧乙烷縮合產(chǎn)物，如多羥基醇的乙氧基脂肪酸酯。優(yōu)選的非離子型去垢劑是聚氧乙烯山梨聚糖單十二酸酯，它的商品名是TWEEN 20，由Sigma Chemical Co.生產(chǎn)。另一種合適的去垢劑是十二烷基硫酸鈉。包括的去垢劑其量能有效地溶解細胞。去垢劑也可能形成微團以及與核酸的其他復(fù)合物以通過其他機制保護RNA和/或DNA。
在優(yōu)選的實施方案中，穩(wěn)定劑是一種陽離子化合物，其通式為YR1R2R3R4X，其中Y是氮或磷；R1、R2、R3、R4獨立地選自分支或非支鏈烷基、C6-C20芳基或C6-C20芳烷基，且X是有機或無機陰離子。在一實施方案中，R1、R2、R3和R4獨立地為C3-C20支鏈烷基或是C1-C20非支鏈烷基。
陰離子可以是一種無機酸如HX中的陰離子，這里的X是氟、氯、溴、碘，其中氯、溴為優(yōu)選。陰離子也可以是單、二、三羧酸中的陰離子。典型地，陽離子化合物中的陰離子選自磷酸鹽、酸鹽、甲酸鹽、醋酸鹽、丙酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、溴化物和氯化物。
當R1、R2、R3和R4是芳基時，此芳基可獨立地是如苯基、低級烷基取代的芐基，及或是鹵代芐基。在一實施方案中，R1是C12、C14或C16的烷基，R2、R3和R4是甲基。在優(yōu)選的實施方案中，Y是氮并且穩(wěn)定劑是一種季銨。合適的季銨包括烷基三甲基銨，其中的烷基有12、14或16個碳原子。一種優(yōu)選的陽離子化合物是草酸十四烷基三甲基銨。其他合適的季銨包括烷基三甲基銨，其中烷基基團有12、14、16或18個碳原子。一般希望R1、R2、R3和R4有20或更少的碳原子，因為烷基基團有超過20個碳原子的話可能很難溶解和保持在溶液中。適合的季銨表面活性劑的例子公開在Macfarlane的美國專利5,728,822，在此全文并入，以供參考。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，穩(wěn)定劑是一種陽離子化合物且包括一種其量能有效穩(wěn)定核酸的質(zhì)子供體。已發(fā)現(xiàn)把質(zhì)子供體添加進陽離子化合物中會增加生物樣品中陽離子化合物穩(wěn)定核酸的能力。合適的質(zhì)子供體的例子包括單羧酸、二羧酸、三羧酸、脂肪族酮基二羧酸、氨基酸、無機酸和它們的混合物。在一個實施方案中，質(zhì)子供體選自烯基羧酸、C1-C6脂肪族單羧酸、脂肪族C2-C6二羧酸、三羧酸、羥基單羧酸、羥基二羧酸、羥基三羧酸、脂肪族酮基單羧酸、脂肪族酮基二羧酸、氨基酸和它們的混合物。合適的脂肪族羧酸的例子包括C1-C6烷基羧酸如乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、異戊酸、2-甲基丁酸、2，2-二甲基丙酸、正己酸、正辛酸、正癸酸和十二烷酸。烯基羧酸的例子包括丙烯酸、甲基丙烯酸、丁烯酸、異丁烯酸以及它們的混合物。
在一實施方案中質(zhì)子供體的二羧酸是選自草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸以及它們的混合物。含羥基羧酸的例子包括酒石酸和蘋果酸。合適的氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸以及它們的混合物。質(zhì)子供體的三羧酸可以選自檸檬酸和異檸檬酸。
在容器12中基因誘導封閉劑26的量是由容器12的內(nèi)部體積，內(nèi)壓和吸入容器內(nèi)的生物樣品的體積所決定的。在一說明性實施方案中，容器12軸向長度大約100mm、直徑大約16mm，其內(nèi)壓可吸入大約2.5ml的生物樣品。典型的穩(wěn)定添加劑26含有每毫升載液大約50mg到大約90mg。優(yōu)選基因誘導封閉劑26是一種含有大約60mg/ml到大約80mg/ml，更優(yōu)選約70mg/ml的水性介質(zhì)。容器12中的穩(wěn)定添加劑26的體積是大約6到8ml，優(yōu)選約7ml。
在優(yōu)選的實施方案中，基因誘導封閉劑26包括能封閉或抑制體外基因誘導的大約70mg/ml核酸穩(wěn)定劑，并和從患者中直接抽取的全血樣品混合。這個血樣與該液體以大約1∶2到約1∶5的比例，優(yōu)選大約1∶2.5到大約1∶3.1，最優(yōu)選大約1∶2.7到大約1∶2.8的體積比混合。
穩(wěn)定劑的濃度足以穩(wěn)定核酸和封閉或抑制體外基因誘導。在首選實施方案中，生物樣品是全血樣品。與血樣混合后的穩(wěn)定劑的濃度是大約45mg/ml到大約55mg/ml，優(yōu)選大約50mg/ml到大約53mg/ml，更優(yōu)選的是大約51mg/ml到大約52mg/ml。
本發(fā)明的方法是通過獲得生物樣品并把樣品引入含有基因誘導封閉劑的容器中來實現(xiàn)的。在優(yōu)選的實施方案中，制備生物樣品并且立即直接引入收集容器中。在優(yōu)選的實施方案中，生物樣品是直接從患者抽入收集容器而沒有任何中間加工或處理步驟，從而使樣品與基因誘導封閉劑立即混合以防止或抑制核酸分解。已發(fā)現(xiàn)直接從患者收集生物樣品，如收集全血樣品時，把樣品直接引入含有穩(wěn)定劑的容器能防止或減少基因轉(zhuǎn)錄和核酸分解，否則在與穩(wěn)定劑混合之前儲存樣品時就會發(fā)生上述情況。已發(fā)現(xiàn)在收集時或樣品制備時立即把生物樣品與基因誘導封閉劑混合會減少或防止在儲存生物樣品過程中的體外基因誘導。
陽離子化合物是優(yōu)選的穩(wěn)定劑。陽離子化合物能得到在環(huán)境溫度中或低于室溫時運輸樣品至可從樣品分離核酸的實驗室時仍然穩(wěn)定的全血樣品。這個穩(wěn)定的全血樣品在低于室溫時如約2℃到8℃時也可以被儲存和被運輸。此穩(wěn)定的全血樣品也能在使它凍結(jié)的條件下儲存。為了能更長地儲存和存檔，樣品可以在大約-20℃下保存。為了以后的核酸分離，樣品可以融化和更進一步的處理。已發(fā)現(xiàn)為了以后的RNA分離穩(wěn)定劑能使血樣品可靠地冷凍。生物樣品特別是血樣品在不加穩(wěn)定劑時冷凍，在融化過程中會出現(xiàn)核酸特別是RNA降解。在其他的實施方案中，生物樣品可以在大約0℃到大約-80℃之間儲存，優(yōu)選的是在大約0℃到大約-70℃。
已發(fā)現(xiàn)生物樣品中核酸的回收和穩(wěn)定化是依賴于生物樣品的pH值和穩(wěn)定劑的。最終混合物的pH值的范圍可以從約pH2到約pH12之間，優(yōu)選的是約pH2到pH10，更優(yōu)選的是約pH3到約pH8之間。在這個范圍內(nèi)核酸壽命的變化將依賴于生物樣品，生物樣品量和穩(wěn)定劑量的比率和使用的特定的穩(wěn)定劑。在此pH下穩(wěn)定的核酸的保存期限能在室溫下從約24小時到幾天的范圍內(nèi)變化。在此pH范圍內(nèi)穩(wěn)定的核酸的保存期限的范圍在大約2℃到8℃的冰箱內(nèi)可以達到幾個星期。這種穩(wěn)定的核酸能冷凍存檔在-20℃中或更低的溫度，如-70℃到-80℃。
最終混合物的pH值將隨著被穩(wěn)定的生物樣品而發(fā)生變化。本發(fā)明的一個實施方案中，生物樣品是全血樣品，全血樣品和穩(wěn)定劑的混合物被調(diào)節(jié)至約pH2到約pH5。用陽離子化合物穩(wěn)定并調(diào)節(jié)至約pH2到約pH5的核酸放置在室溫下幾天或在約2℃到約8℃的溫度下放置幾星期或冷凍存檔在-20℃或更低的溫度下都是穩(wěn)定的。已發(fā)現(xiàn)大約是在pH3.9到pH4.1之間，全血樣品和穩(wěn)定劑的混合物中核酸可達到最佳的長時間穩(wěn)定化。
在優(yōu)選的實施方案中，收集容器中的穩(wěn)定液在加入生物樣品前的最佳pH值大約在3.6到3.8之間。當把血樣加入收集容器中并與穩(wěn)定液混合后，最終混合物的pH值大約為3.9到4.1。在優(yōu)選的實施方案中，收集容器包括一定量的穩(wěn)定劑以便當與全血樣品以血液與穩(wěn)定劑大約1∶2.5到1∶3.1的體積比混合后，最終混合物的pH值將達到約3.9到4.1。在其他生物樣品中，pH應(yīng)調(diào)節(jié)至恰好能穩(wěn)定混合物。例如，我們發(fā)現(xiàn)真核細胞培養(yǎng)物在約pH4到pH8之間，優(yōu)選在約pH6到pH8之間穩(wěn)定。
生物樣品和穩(wěn)定劑的混合物能通過加入合適的緩沖液來調(diào)節(jié)pH值。有效的調(diào)節(jié)生物樣品的pH值的緩沖液的一個例子是酒石酸。在此領(lǐng)域中所知的其他緩沖液和pH調(diào)節(jié)劑也能使用。緩沖液的pH值可以通過加入氫氧化鈉而調(diào)節(jié)至所需范圍之內(nèi)。
核酸無論是DNA或RNA都可以通過此領(lǐng)域中已知的各種處理方法而從穩(wěn)定的生物樣品中分離出來。我們發(fā)現(xiàn)實驗室中所用的純化操作方案能分離核酸中的穩(wěn)定劑，從而得到純核酸。
陽離子化合物導致樣品中的細胞和病毒溶解并導致核酸以與該化合物的復(fù)合物形式沉淀。沉淀的核酸可以通過此領(lǐng)域中所知的酚提取法或甲酰胺緩沖液從復(fù)合物中抽提出來。在更進一步的實施方案中，可溶解去垢劑而使復(fù)合物解離，并留下不溶性核酸。此化合物可以通過用濃的氯化鋰溶液或其它高鹽溶液如異硫氰酸胍鹽或鹽酸胍鹽處理復(fù)合物而使之溶解。其他分離和純化核酸的方法公開在Colpan等的美國專利5,990,301，在此全文并入，以供參考。
實施例1-穩(wěn)定人血中的RNA這個例子揭示血和穩(wěn)定劑的比率的作用以及穩(wěn)定劑濃度的作用。
本次比較準備了24個樣品。每一個樣品都是從2.5ml血制備的，用含有檸檬酸鈉的血液收集裝置抽吸，并與含有3％(w/v)草酸十四烷基三甲基銨以及分別含125mM和200mM的酒石酸的7.5ml穩(wěn)定緩沖液混合，引入12ml聚乙烯試管。此緩沖液的pH值分別由氫氧化鈉調(diào)節(jié)至3.3、3.5和3.7。樣品在室溫下分別儲藏25小時和72小時。為了分離細胞中的RNA，試管以5000xg離心10分鐘。棄去上清液并用水洗沉淀一次。再用5000xg離心10分鐘后，把沉淀溶于300μl的細胞溶解緩沖液即RLT(QIAGEN GmbH)緩沖液，用360μl的水稀釋再加入40μl蛋白酶K。在55℃下用酶消化10分鐘后，樣品以20，000xg離心3分鐘，把上清液轉(zhuǎn)移入新的試管中再加入350μl的98％乙醇。然后，以8000xg離心1分鐘，使樣品涂布于含有硅膠膜的自旋柱。此自旋柱用含GITC的洗滌緩沖液樣的緩沖液RW1(QIAGENGmbH)洗滌1次并用含乙醇的洗滌緩沖液樣的緩沖液RPE(QIAGEN GmbH)洗滌兩次。然后用2×40μl不含RNA酶的水從硅膠膜洗脫RNA。所有樣品都處理雙份。
已分離的RNA的產(chǎn)量，用分光光度計測量260nm波長的光密度并按1 OD260相當于40μg RNA/ml的濃度計算而確定。已分離的RNA的完整性是變性瓊脂糖/甲醛凝膠中使30μl洗脫液進行電泳，以溴化乙錠染色來證明的。RNA的產(chǎn)量列在表1和表2中。
以上結(jié)果表明2.5ml體積的血樣與含有3％(w/v)草酸十四烷基三甲基銨和分別含有125mM和200mM酒石酸，pH3.7約是使總RNA產(chǎn)量和穩(wěn)定性最佳的選擇。在所有的pH值下，由核糖體RNA的完整性來判斷的RNA穩(wěn)定性是非常好的，但是已分離的RNA的產(chǎn)量當緩沖液的pH值分別調(diào)至3.3和3.5時都比當緩沖液的pH值調(diào)至3.7時要低。然而，即使是在穩(wěn)定緩沖液的pH值是3.3時得到的較低產(chǎn)量也與用對照方法即用QIAamp RNA血樣小試劑盒(QIAGEN目錄號為52303)得到的產(chǎn)量相當或稍好一點，而這種對照方法表明了每2.5ml的血樣得到平均產(chǎn)量為6.8μgRNA。
表1
表2
實施例2-Northern印跡分析這個實例表明對從三個不同供血者身上獲得的、在室溫下分別儲存了1小時，24小時，48小時和72小時的血樣品進行Northern印跡分析的結(jié)果。
2.5ml用含有檸檬酸鈉的血收集裝置抽吸的血樣品與16×100mm聚乙烯試管中含有4％(w/v)草酸十四烷基三甲基銨和200mM酒石酸的6.9ml穩(wěn)定緩沖液混合。樣品在室溫下分別儲存1小時、24小時、48小時和72小時。為了分離細胞RNA，這些試管以5000xg離心10分鐘。棄去上清液并用水洗沉淀一次。再以5000xg離心10分鐘后，把沉淀溶解于300μl溶解緩沖液即RLT緩沖液(QIAGEN GmbH)，加360μl水稀釋并加40μl蛋白酶K。當在55℃時用蛋白酶消化10分鐘后，樣品以20,000xg離心3分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移入一個新試管并加入350μl的98％乙醇。
通過以8000xg離心1分鐘，使樣品涂布于含有硅膠膜的自旋柱。用含GITC的洗滌緩沖液樣的緩沖液RW1(QIAGEN GmbH)洗自旋柱一次，并用含乙醇的洗滌緩沖液樣的緩沖液RPE(QIAGEN GmbH)洗滌兩次。然后RNA用2×40μl的不含RNA酶的水從硅膠膜上洗脫。每一個變數(shù)制備一個樣品。將2.5μg已分離的RNA加樣在變性瓊脂糖/甲醛凝膠上，并在凝膠電泳之后將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。尼龍膜然后與一個放射性標記的RNA探針雜交，此探針包含有一段IFNγ可誘導基因序列(GeneBank登錄號為L07633)，在60℃下過夜，并在60℃下用含有2×SSC/0.1％SDS到0.5×SSC/0.1％SDS的洗滌緩沖液洗滌幾遍。然后，尼龍膜使一張X-線膠片曝光。作為對照，相同供體的RNA是在如上所述抽取血樣并分析后立即用TRIzolTMLS試劑(Life Technologies)提分離。
這些結(jié)果表明用作探針使已分離的RNA雜交的IFNγ可誘導基因的轉(zhuǎn)錄物水平在整個時間中都受到了保護，表達水平?jīng)]有明顯的變化。此轉(zhuǎn)錄物水平等于TRIzolTMLS對照。這些對照代表了在抽取血樣時樣品的體內(nèi)條件，這是因為TRIzol試劑含有酚并混有異硫氰酸胍鹽，該試劑被認為能立即破壞細胞，使蛋白變性以及因此能完全抑制任何生物活性。用TRIzol對照儲存的樣品在Northern-印跡分析中信號強度的比較指出了在把穩(wěn)定緩沖液加入血樣中后，IFNγ可誘導基因的轉(zhuǎn)錄物水平立即被“凍結(jié)”，且在儲存過程中不再變化。
實施例3-血樣收集裝置與常規(guī)的EDTA試管的比較此實例比較了本發(fā)明的收集裝置與常規(guī)的含EDTA試管中RNA的穩(wěn)定性。
從一個供體抽取2.5ml的血樣至血收集裝置中，此裝置在蓋有HEMOGARDTM蓋的一個16×100mm聚乙烯試管(Becton Dickinson and Company)中含有6.9ml的穩(wěn)定緩沖液(4％(w/v)草酸十四烷基三甲基銨，200mM酒石酸，pH3.7)并在與供體靜脈相連接時抽至一定的真空度以抽取2.5ml的血樣。在室溫下分別儲存樣品1小時、1天、3天、7天和10天。
為了分離細胞RNA，試管以5000xg離心10分鐘。棄去上清液并用水洗滌沉淀一次。再以5000xg離心10分鐘后，沉淀溶解于360μl含有乙酸銨的再懸浮緩沖液中，然后加300μl的溶解緩沖液即RLT緩沖液(QIAGEN GmbH)，和40μl的蛋白酶K。在55℃下用蛋白酶消化10分鐘后，樣品以20,000xg離心3分鐘，把上清液轉(zhuǎn)移入新的試管中并加350μl 98％乙醇。然后樣品以8000xg離心1分鐘涂布于含硅膠膜自旋柱。此自旋柱用含GITC的洗滌緩沖液樣的緩沖液RW1(QIAGEN GmbH)的洗滌一次，并用含乙醇的緩沖液樣的緩沖液RPE(QIAGEN GmbH)洗滌兩次。
消化可能和小量RNA一起共純化的殘余基因組DNA是在硅膠膜上并根據(jù)無RNA酶的DNA酶試劑盒(QIAGEN GmbH目錄號為79254)的操作手冊的指導進行的。RNA從硅膠膜上用2*40μl的洗脫緩沖液洗脫。所有的樣品用雙份進行處理。為了分析，洗脫液按1∶125稀釋然后通過實時TaqMan RT-PCR分析1μl已稀釋的洗脫液。由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)發(fā)展起來的分析方法對GAPDH基因的mRNA進行擴增。在TaqMan RT-PCR擴增時每一個樣品都分析雙份。
作為對照，同一個供體的血樣用Becton Dickinson Vacutainer EDTA試管抽吸并如上所述儲存在這種試管中相同時間。1ml的儲存的血樣在每一個時間點用TRIzolTMLS試劑(Life Technologies)分離RNA。隨后根據(jù)專門用于RNA(clean up)的RNeasyTMMini方案(QIAGEN目錄號為74103)對已分離的RNA進行提純。用2×40μl無RNA酶的水洗脫RNA。按1∶50的比例稀釋洗脫液以補償在用TRIzol方法處理時造成的樣品與在樣品管中2.5ml的血樣相比時的體積過低。這些樣品也是用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)的GAPDH TaqMan RT-PCR系統(tǒng)來分析的。
表3說明了人血樣中細胞RNA穩(wěn)定性的結(jié)果。實時RT-PCR的結(jié)果表明在未受保護的EDTA血樣中，轉(zhuǎn)錄物水平隨著時間而下降(由在TaqMan分析中ct值增加說明)在7到10天后降解程度達到不再能檢出mRNA。另一方面，在受保護樣品中GAPDH mRNA不顯示拷貝數(shù)的下降，這考慮了TaqMan的分析存在±1ct值的誤差范圍。在此誤差范圍內(nèi)，ct值的所有變化都被認為是擴增系統(tǒng)正常的波動且沒有明顯的降解。這個結(jié)果清楚地表明了新發(fā)展起來的血樣收集裝置比EDTA血樣收集試管有優(yōu)勢并且還說明RNA的穩(wěn)定性是對樣品材料進行分子分析的先決條件。
表3
實施例4-全血樣品中基因組DNA的穩(wěn)定性也可能從穩(wěn)定的血樣中分離基因組DNA。用含有檸檬酸鈉的血收集裝置抽取2.5ml的血樣并與裝在16×100mm聚乙烯管中的含有4％(w/v)草酸十四烷基三甲基銨和200mM的酒石酸的6.9ml穩(wěn)定緩沖液混合。樣品在室溫下分別儲存24小時和72小時。為了分離基因組DNA，把試管以5000xg離心10分鐘。棄去上清液并用水洗沉淀一次。再以5000xg離心10分鐘后，沉淀溶解于300μl含有EDTA和氯化鈉的緩沖液和400μl的溶解緩沖液，即AL(QIAGEN GmbH)緩沖液，并加入20ul蛋白酶K。當在65℃時用蛋白酶消化10分鐘后，加入420μl的98％乙醇。然后將樣品以8000xg離心1分鐘涂布于含有硅膠膜的自旋柱上。用含鹽酸胍的洗滌緩沖液樣的緩沖液AW1(QIAGEN GmbH)洗滌自旋柱一次，并用含乙醇的緩沖液樣的緩沖液AW2(QIAGEN GmbH)洗滌一次。然后用300μl的tris緩沖液洗脫硅膠膜上的DNA。
用溴化乙錠染色的0.8％瓊脂糖/TBE凝膠來分析5μl的洗脫液。用分光光度計測量260nm波長的光密度并胺1 OD260相當于50μgDNA/ml的濃度來計算已分離的DNA產(chǎn)量。在室溫下儲存24小時和72小時后，分離的基因組DNA是高分子量的。主帶的遷移超過20kb。產(chǎn)量是每2.5ml血樣中有47到80μg，此結(jié)果是在這一數(shù)量的血樣所期望的產(chǎn)量范圍內(nèi)。此DNA也可在酶反應(yīng)如限制性內(nèi)切酶反應(yīng)消化和PCR擴增反應(yīng)中使用。
基因組DNA也可在酶反應(yīng)如限制性內(nèi)切酶反應(yīng)和PCR擴增反應(yīng)中使用。在限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)中，2μgDNA分別用6U EcoRI(E)和HindIII(H)酶在37℃下消化3小時然后用0.8％瓊脂糖TBE凝膠分析。在RCR擴增時，把150和300ng的DNA加入50μl總體積的PCR反應(yīng)混合物中并擴增巨大幼蟲基因的人同系物的1.1kb片斷。用1.2％瓊脂糖/TBE凝膠分析PCR產(chǎn)物。
實施例5此實施例證明了當樣品在沒有穩(wěn)定劑時儲存在室溫下，生物樣品中RNA的內(nèi)在不穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄。全血樣品是從四個供體(被命名為供體1、2、3、4)收集來的。對于每一位供體，第一組的樣品是用EDTA血樣收集管抽取的并在-70℃下存放。第二組的樣品是用同樣的EDTA血樣收集管收集并在室溫下存放。
第二組樣品在室溫下相同的條件中存放并在1、3、5和7天后用定量TaqManRT-PCR分析總γ干擾素的mRNA含量。第一組的樣品是在-70℃相同的條件中存放并用定量TaqManRT-PCR分析總γ干擾素的mRNA含量。供體1-4每一種樣品測定的mRNA含量分別在圖2-5中表示。如圖所示，第一天后儲存在-70℃的血樣中γ干擾素mRNA總含量有很小的減少。存儲在-70℃的三個樣品在第一天到第五天之間mRNA的量有一個微量的增加，這可以用該技術(shù)的誤差范圍內(nèi)的變化來解釋。
三天后在室溫下用EDTA儲存的血樣中總γ干擾素的mRNA含量有顯著的提升，表明存在一個很高的基因誘導率。在第三天后，樣品中總γ干擾素的mRNA含量有了下降，表明存在顯著的分解。此樣品的數(shù)據(jù)表明在室溫下用EDTA處理的全血樣品是不穩(wěn)定的，且基因誘導和分解會導致樣品中總mRNA的持續(xù)變化。樣品中總mRNA的持續(xù)變化妨礙了對血樣品中原始mRNA的精確測定和分析。
實施例6本實施例對混有EDTA并儲存在室溫下的全血對照樣品，以及用草酸十四烷基三甲基銨和酒石酸穩(wěn)定的并保存在室溫下的全血測試樣品中的某些種白細胞介素mRNA和其他種類mRNA隨時間而發(fā)生的變化作了比較。這些血樣是直接從相同的個體得到的并立即與各穩(wěn)定劑混合。最終樣品在室溫下于相同的條件中儲存。
此收集裝置是一個含有4％(w/v)草酸十四烷基三甲基銨和200mM酒石酸的6.9ml穩(wěn)定緩沖液的16×100mm聚乙烯試管。血樣直接從供體抽取放入收集裝置并在那里立即與草酸十四烷基三甲基銨和酒石酸混合。對照樣品是用2.5ml新鮮抽取的血放入一個Becton Dickinson Vacutainer的EDTA試管中來制備的。經(jīng)選定的時間間隔，用定量TaqMan RT-PCR像前面實施例一樣的方法來分析對照樣品和測試樣品。
圖6-9顯示了血樣中特定白細胞介素mRNA和其他mRNA的量隨時間而產(chǎn)生的變化。樣品的分析是用標準方法在收集完血樣后立即對其mRNA量進行測試以確定基線。
樣品在室溫下儲存并在4小時、8小時、24小時、3天、5天后分析。圖6表明檢測儲存了5天的與EDTA混合的血樣中mRNA量離基線的變化。測定的特定mRNA種類標注在圖表沿著橫軸的底部。縱軸是表示各種mRNA的量的變化，變化按數(shù)量級計量。如圖6所示，5天后幾種mRNA只顯示很少或沒有變化，然而另幾種mRNA卻顯示了顯著的增加或減少。這些增加可以理解為是基因誘導的結(jié)果，而減少則是降解的結(jié)果。
圖7的圖表顯示了以EDTA穩(wěn)定的血樣中IL-8和IL-10轉(zhuǎn)錄物的量的變化。在圖中以每一鑒條表示4小時、8小時、24小時、3天和5天后測定的轉(zhuǎn)錄物量。如圖所示，在樣品中存在的IL-8mRNA的量在一開始的三天內(nèi)由于基因誘導以一個穩(wěn)定的速率增加，然后因為分解而開始下降。與此相比，在一開始的三天中，IL-10mRNA的水平出現(xiàn)下降，然后第五天與第三天相比有小幅上升。圖7中的數(shù)據(jù)證明了在室溫下儲存時混有EDTA的血樣的不穩(wěn)定性。
用草酸十四烷基三甲基銨和酒石酸穩(wěn)定的血檢測樣品在收集后立即分析測定各種mRNA的量并確定基線。三天后對儲存在室溫(大約18-22℃)的樣品進行分析。圖8的圖表提供的結(jié)果，表明各種mRNA的變化。這些數(shù)據(jù)證明了血樣品中各種mRNA比用EDTA穩(wěn)定的血樣顯示明顯更小的變化。
圖9顯示了4小時、8小時、24小時、3天和5天后檢測時，五天中IL-8mRNA和IL-10mRNA量的變化。這些數(shù)據(jù)表明了IL-8mRNA水平只有很小的變化，而圖7所描述的加EDTA的全血樣品卻有很顯著的變化。IL-10mRNA的量在五天后呈現(xiàn)出逐漸上升，然而EDTA全血樣品(圖7)卻呈現(xiàn)了很顯著的變化。
已選擇各種不同的實施方案來證明本發(fā)明，本領(lǐng)域中熟練的專業(yè)人員會理解，可以作出各種改進和補充而并不偏離所附權(quán)利要求所確定的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種收集和穩(wěn)定生物樣品的裝置，其特征在于，所述裝置包括內(nèi)室被加工成規(guī)定尺寸以接受所述生物樣品的容器，所述容器有開口和用于關(guān)閉所述開口的蓋子，和含在所述容器內(nèi)的基因誘導封閉劑，其含量可有效封閉所述生物樣品的體外基因誘導并穩(wěn)定所述生物樣品以防止核酸酶解。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述生物樣品是全血，所述容器預(yù)先裝有所述基因誘導封閉劑且其體積可容納血樣。
3.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑選自陽離子化合物、去垢劑、離液鹽、核糖核酸酶抑制劑、螯合劑以及它們的混合物。
4.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑包括含水介質(zhì)，其pH值大約為2到12。
5.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑在所述容器中是固體化合物。
6.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑選自酚、氯仿、丙酮、醇類以及它們的混合物。
7.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述基因誘導劑選自巰基醇類、二硫蘇糖醇(DTT)以及它們的混合物。
8.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑是有機溶劑。
9.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑是有機還原劑。
10.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中，所述水溶液的pH值約為2到10。
11.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中，所述水溶液的pH值約為3到8。
12.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑含有具有以下通式的穩(wěn)定劑YR1R2R3R4X其中Y是氮或磷；R1、R2、R3和R4獨立選自支鏈烷基、非支鏈烷基、C6-C20芳基和C6-C26芳烷基；且X是陰離子。
13.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述支鏈烷基是C3-C20烷基，且所述非支鏈烷基是C1-C20烷基。
14.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，X是選自磷酸鹽、硫酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、草酸鹵、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、溴化物和氯化物的陰離子。
15.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，Y是氮原子，且所述穩(wěn)定劑是季銨。
16.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述R1是有12、14或16個碳原子的烷基，R2、R3和R4是甲基。
17.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述容器的內(nèi)壓低于大氣壓，以將預(yù)定體積的所述生物樣品吸到所述容器中。
18.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑以可溶解所述生物樣品中的細胞的量含有。
19.如權(quán)利要求18所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑溶解網(wǎng)織紅細胞、細菌、紅血細胞和白血細胞。
20.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑以可保護和穩(wěn)定所述生物樣品中的核酸的量含有。
21.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中，所述離液鹽選自異硫氰酸胍鹽和鹽酸胍鹽。
22.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中，所述去垢劑選自十二烷基硫酸鈉和聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯。
23.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中，所述核糖核酸酶抑制劑是胎盤RNA酶抑制蛋白。
24.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述基因誘導封閉劑還以可穩(wěn)定所述樣品中的核酸的有效量含有至少一種質(zhì)子供體。
25.如權(quán)利要求24所述的裝置，其中，所述質(zhì)子供體選自羧酸和無機酸。
26.如權(quán)利要求24所述的裝置，其中，所述質(zhì)子供體選自烯基羧酸、脂肪族單羧酸、脂肪族二羧酸和脂肪族三羧酸。
27.如權(quán)利要求24所述的裝置，其中，所述質(zhì)子供體選自烯基羧酸、C1-C6脂肪族單羧酸、脂肪族C2-C6二羧酸、三羧酸、羥基單羧酸、羥基二羧酸、羥基三羧酸、脂肪族酮基單羧酸、脂肪族酮基二羧酸、氨基酸以及它們的混合物。
28.一種在生物樣品中抑制體外基因誘導的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟提供包括內(nèi)室的樣品收集容器，所述內(nèi)室以足以穩(wěn)定和封閉生物樣品體外基因誘導的量含有至少一種基因誘導封閉劑；將來自動物的生物樣品直接收集進所述樣品收集容器，并立即將所述生物樣品與所述基因誘導封閉劑混合以形成穩(wěn)定的生物樣品。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑選自陽離子化合物、去垢劑、離液鹽、核糖核酸酶抑制劑、螯合劑以及它們的混合物。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑選自固體和含水溶液。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑選自酚、氯仿、丙酮、醇類以及它們的混合物。
32.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑是有機溶劑。
33.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑選自巰基醇類、二硫蘇糖醇(DTT)以及它們的混合物。
34.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑是有機還原劑。
35.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述容器的內(nèi)壓低于大氣壓，所述方法包括通過所述真空把預(yù)定體積的生物樣品直接吸入所述容器并與穩(wěn)定量的所述基因誘導封閉劑混合。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述生物樣品是全血，所述方法包括從動物中提取所述全血樣品，并使所述全血樣品在所述樣品收集容器中直接與所述基因誘導封閉劑接觸，以溶解細胞并穩(wěn)定所述全血樣品中的核酸。
37.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述生物樣品選自紅血細胞濃縮物、血小板濃縮物、白細胞濃縮物、腫瘤細胞、骨髓吸出物、組織、細針吸出物和子宮頸樣品。
38.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述生物樣品是選自血漿、血清、尿液和腦脊液以及痰液的體液。
39.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述生物樣品選自細菌和真核微生物。
40.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述生物樣品選自體液、組織、機體擦拭物和機體涂片。
41.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑包含有以下通式的穩(wěn)定劑YR1R2R3R4X其中Y是氮或磷；R1、R2、R3和R4獨立選自支鏈烷基、非支鏈烷基、C6-C20芳基和C6-C26芳烷基；且X是陰離子。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述支鏈烷基是C3-C20烷基，所述非支鏈烷基是C1-C20烷基。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，X選自磷酸鹽、硫酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、溴化物和氯化物。
44.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述R1是具有12、14或16個碳原子的烷基，R2、R3和R4是甲基。
45.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，Y是氮原子。
46.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑是含水介質(zhì)，其pH值約為3到8。
47.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述離液鹽選自異硫氰酸胍鹽和鹽酸胍鹽。
48.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述去垢劑選自十二烷基硫酸鈉和聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯。
49.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述核糖核酸酶抑制劑是胎盤RNA酶抑制蛋白。
50.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑還以可穩(wěn)定所述樣品中的核酸的有效量含有至少一種質(zhì)子供體，其中所述質(zhì)子供體選自羧酸和無機酸。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述質(zhì)子供體選自脂肪族單羧酸、脂肪族二羧酸和脂肪族三羧酸。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述質(zhì)子供體選自烯基羧酸、C1-C6脂肪族單羧酸、C2-C6脂肪族二羧酸、三羧酸、羥基單羧酸、羥基二羧酸、羥基三羧酸、脂肪族酮基單羧酸、脂肪族酮基二羧酸、氨基酸以及它們的混合物。
53.一種制備穩(wěn)定的全血樣品的方法，其特征在于，所述方法包括提供含有內(nèi)室的樣品收集容器，所述容器預(yù)先裝有其量為可穩(wěn)定并阻抑全血樣品中體外基因誘導的基因誘導封閉劑的水溶液或分散體；將來自患者的全血樣品直接收集到所述收集容器中，并將所述血樣與所述基因誘導封閉劑混合以形成在室溫下穩(wěn)定的全血樣品。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蓋子是隔膜，所述方法包括用套管刺穿所述隔膜并將所述全血樣品通過所述套管引入所述收集容器。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑選自陽離子化合物、去垢劑、離液鹽、核糖核酸酶抑制劑、螯合劑以及它們的混合物，且其中所述水溶液或分散體的pH值約為2到12。
56.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述水溶液或分散體的pH值約為2到5。
57.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述水溶液或分散體在與所述血樣混合之前的pH值約為3.6到3.8。
58.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑的量為可與所述血樣混合產(chǎn)生pH值約為3.9到4.1的混合物。
59.如權(quán)利要求53所述的方法，它包含將所述血樣與所述基因誘導封閉劑以血液封閉劑約1∶2.5到1∶3.1的體積比混合。
60.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑選自異硫氰酸胍鹽、鹽酸胍鹽、十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯、胎盤RNA酶抑制蛋白以及它們的混合物。
61.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑含有具有以下通式的穩(wěn)定劑YR1R2R3R4X其中Y是氮或磷；R1、R2、R3和R4獨立選自支鏈烷基、非支鏈烷基、C6-C20芳基和C6-C26芳烷基；且X是陰離子。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑還包括選自羧酸和無機酸的質(zhì)子供體。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑包括選自脂肪族單羧酸、脂肪族二羧酸、脂肪族三羧酸以及它們的混合物的質(zhì)子供體。
64.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，所述羧酸選自烯基羧酸、C1-C6脂肪族單羧酸、C2-C6脂肪族二羧酸、C3-C6脂肪族三羧酸、脂肪族酮基單羧酸、脂肪族酮基二羧酸、羥基單羧酸、羥基二羧酸、羥基三羧酸、氨基酸以及它們的混合物。
65.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑以可與所述血樣形成在室溫下穩(wěn)定的混合物的量含有。
66.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述基因誘導封閉劑以可與所述血樣形成在約-20到-80℃下穩(wěn)定的混合物的量含有，其中所述混合物可基本上不發(fā)生核酸降解地被解凍。
全文摘要
一種收集容器和一種收集預(yù)定體積的生物樣品特別是全血樣品的方法，包括其量可有效穩(wěn)定和抑制基因誘導的至少一種基因誘導封閉劑。在收集時，這種基因誘導封閉劑能穩(wěn)定生物樣品中的核酸以封閉儲存在室溫時發(fā)生的樣品中體外基因誘導。穩(wěn)定劑包括陽離子化合物、去垢劑、特別是陽離子去垢劑、離液鹽、核糖核酸酶抑制劑、螯合劑、有機溶劑、有機還原劑以及它們的混合物。生物樣品是直接從動物身上收集到的并且立即與基因誘導封閉劑混合，而不經(jīng)任何中間加工或處理。
文檔編號G01N33/48GK1503910SQ01821663
公開日2004年6月9日 申請日期2001年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月8日
發(fā)明者F·奧吉洛, F 奧吉洛, H·巴斯蒂恩, 溝俁, U·厄爾米勒, 桌, L·雷能, 濁鋅, M·瓦倫切克, 鍥, R·懷里奇 申請人:貝克頓迪肯森公司, 恰根有限公司