專利名稱：用于消除生物樣品渾濁現(xiàn)象的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于消除生物樣品、尤其是血清或血漿樣品渾濁現(xiàn)象的試劑。
當(dāng)血漿或血清樣品(脂血樣品)中富含甘油三酯的脂蛋白顆粒如乳糜微粒的含量增加時(shí)通常會(huì)發(fā)生渾濁。
對于化學(xué)或臨床診斷中脂血樣品的光度分析來說尤其需要能消除渾濁的已知試劑。如果要加以分析的組分在與引起渾濁的甘油三酯的吸收波長一致的波長下吸收光線的話，對于所研究組分的正確的光度分析要么不可能，即使可能也將是困難的。當(dāng)要加以測定的組分的濃度非常低、例如在被分析物為細(xì)胞活性蛋白(CRP)的情況下尤其是如此。
因此，必須要排除渾濁產(chǎn)生的干擾的一個(gè)光度測定操作的典型實(shí)例是CRP的測定。該測定使用與樣品中的CRP特異性反應(yīng)形成不溶性聚集體的抗-人CRP抗體。該測定通過加入抗體開始，并在340nm下用光度計(jì)測量CRP-抗體-聚集體的增值。脂血樣品中的甘油三酯也在這一波長下吸收，于是就有覆蓋消光信號的危險(xiǎn)。
為了解決脂血樣品的這個(gè)問題，在現(xiàn)有技術(shù)中已知可加入若干種試劑來消除渾濁。在與此有關(guān)的美國專利4708939中公開了一種試劑，它在水溶液中包含聚乙氧基化甘油三酯和二級正鏈烷磺酸酯。該已知試劑需要相當(dāng)高的洗滌劑濃度，這會(huì)影響某些測定，尤其是免疫比濁測定。另外，正鏈烷磺酸酯是一種積極的(agressive)洗滌劑，它還可抑制所研究的反應(yīng)。因此該已知試劑不能使樣品完全澄清和得到最佳的抗體-抗原反應(yīng)。
本發(fā)明的目的是提供一種用于消除渾濁的試劑，它尤其適用于CRP測定，但也可用于其他測定。
本發(fā)明的試劑包含0.5-10mM的苯酚、0.5-15％的聚氧乙基化甘油三酯和0.5-15％的至少一種另外的非離子型表面活性劑(tenside)。優(yōu)選包括兩種另外的非離子型表面活性劑的結(jié)合物。
在本發(fā)明的試劑中，聚乙氧基化甘油三酯(Triglyceridethoxylate)是得到完全澄清的樣品所必需的。合適的聚乙氧基化甘油三酯可具有4-16范圍內(nèi)的HLB值，優(yōu)選為6。優(yōu)選的濃度范圍是0.5-2％。優(yōu)選的聚氧乙基化甘油三酯可以商品名Mulsifan RT 163(Zschimmer & Schwarz GmbH & Co.)或TagatCH-40(Goldschmidt AG)購得。
單獨(dú)的聚氧乙基化甘油三酯不能溶于混合物而導(dǎo)致沉淀。溶解作用需要至少一種另外的有助于聚乙氧基化甘油三酯在樣品中的溶解的非離子型表面活性劑。
可以使用的非離子型表面活性劑的典型實(shí)例包括Thesit、Tergitol、Triton、Brij、Nonidet(諾乃清潔劑)P-40、吐溫20(Sigma-Aldrich Ltd.)。
所需的非離子型表面活性劑是10-18個(gè)碳原子的乙氧基化程度低(每分子2-10個(gè)氧化乙烯單元)的直鏈或支鏈聚氧乙烯醚。
優(yōu)選的另外的非離子型表面活性劑是聚氧乙烯(8)異十三烷基醚，它可以商品名Genapol X 080購得。這種非離子型表面活性劑可溶于反應(yīng)混合物，但單獨(dú)的它不具有澄清作用。使聚乙氧基化甘油三酯溶解是必需的(如上所述)?？梢允褂玫姆请x子型表面活性劑的優(yōu)選的濃度范圍是0.5-2％。
另一種優(yōu)選的非離子型表面活性劑是可從Sigma購得的聚氧乙烯-10-十三烷基醚。這種表面活性劑也可溶于反應(yīng)混合物并幫助聚乙氧基化甘油三酯溶解。優(yōu)選的濃度范圍是0.5-2％。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中提供聚氧乙烯(8)異十三烷基醚和聚氧乙烯-10-十三烷基醚的結(jié)合物。這種結(jié)合物可使聚氧乙基化甘油三酯非常有效地溶解并由此提高本發(fā)明試劑的澄清作用。
最后，苯酚沒有溶解脂質(zhì)的作用，但可與表面活性劑協(xié)同起作用來增加它們的澄清作用和消除渾濁。苯酚的存在有助于減少所需表面活性劑的有效濃度。不存在苯酚時(shí)將需要較高濃度的表面活性劑，這會(huì)導(dǎo)致樣品具有太高的粘度。
本發(fā)明試劑中的組分都是已知物質(zhì)，它們已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中用在已知用于消除渾濁的試劑中。
從EP 0004857可知苯酚作為協(xié)同作用組分的用途。從EP0004857還可知使用Genapol作為非離子型表面活性劑。從上文中提及的美國專利4708939可知另外的非離子型表面活性劑的應(yīng)用。不過，現(xiàn)有技術(shù)只公開了單一組分或其亞結(jié)合物的應(yīng)用。這些文獻(xiàn)中沒有一篇顯示象本發(fā)明的試劑那樣將所有這些組分結(jié)合。
結(jié)果令人驚奇地，包括在本發(fā)明試劑中的所有組分都是有效地消除渾濁同時(shí)又對可能的抗體-抗原反應(yīng)作用最小所必需的。理論上，Genapol和聚氧乙烯-10-十三烷基醚在一起可起到澄清作用。但是，澄清作用所需的濃度如此之高，以致任何抗體-抗原反應(yīng)都被完全抑制了。如果按照本發(fā)明加入Mulsifan和苯酚，Genapol和聚氧乙烯-10-十三烷基醚的濃度就可以減小，從而達(dá)到澄清效果而沒有影響免疫反應(yīng)。
原則上，本發(fā)明試劑可以用于由于脂血引起的相互作用可能性的所有免疫測定形式。
下面給出的實(shí)施例采用免疫比濁形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到對其他形式的相關(guān)益處，其他形式包括(但不限于)乳汁增強(qiáng)測定、磁性顆粒化學(xué)發(fā)光免疫測定、免疫熒光測定(偏光和非偏光的)、ELISA測定、免疫色譜測定、或需要減少脂血和/或伴隨的其他非特異性結(jié)合問題的任何測定形式，此時(shí)抗體結(jié)合特性的有益的維持是通過本發(fā)明中反應(yīng)物的結(jié)合介導(dǎo)的。
以下描述了將要用于檢測CRP的測定的本發(fā)明澄清劑的典型配方。另外還給出了一個(gè)顯示本發(fā)明試劑消除脂血樣品中渾濁現(xiàn)象作用的例子。
用于CRP-測定的澄清緩沖液(R1)的配方試劑 范圍 功能凈化水Tris(100mM)/升50-300mM 緩沖劑NaCl(100mM)/升50-150mM 幫助澄清和反應(yīng)PEG6000(2％)(w/w) 1-3％ 反應(yīng)率最佳化需要的苯酚(2mM)(升) 0.5-10mM 脂質(zhì)澄清組分聚氧乙烯10-十三烷基醚(1.0％)(v/v) 0.5-2％ 脂質(zhì)澄清組分Genapol X 80(1.0％)(v/v) 0.5-2％ 脂質(zhì)澄清組分Mulsifan RT 163(1.1％)(v/v) 0.5-2％ 脂質(zhì)澄清組分NaN3抗微生物劑4M HCl 調(diào)pH7.5的pH試劑硫酸慶大霉素溶液穩(wěn)定劑將緩沖液R1調(diào)節(jié)至pH7.5(可能的范圍是pH3-9)并優(yōu)選在37℃(可能的范圍是15-40℃)下使用。
對于CRP-測定，將250μl R1與18μl樣品混合，然后加入30μl抗血清溶液(R2；包括抗CRP抗體)。樣品與R1緩沖液和R2抗血清溶液混合后，樣品中的CRP特異性地與R2中的抗人CRP抗體反應(yīng)得到不溶性聚集體。這些聚集體的吸光度與樣品中的CRP濃度成比例。
R1緩沖液的目的是將脂血樣品中的脂質(zhì)溶解和為免疫反應(yīng)提供最佳條件。
脂血樣品中渾濁現(xiàn)象的消除在該試驗(yàn)中使用具有以下成分的澄清緩沖液(R3)用HCl調(diào)節(jié)至pH7.5的100mM Tris緩沖劑，100mM NaCl，2％聚乙二醇6000，2mM苯酚，1.0％聚氧乙烯10十三烷基醚，1.0％Genapol X 80和1.0％Mulsifan RT 163。
將18μl強(qiáng)脂血血清在37℃下在比色杯中與250μl R3混合。在340nm下測定吸光度相對于時(shí)間的變化。結(jié)果圖解表示在

圖1中。
圖1中顯示的吸光度的變化過程表明，在樣品/試劑比為18μl∶250μl的情況下，與空白試劑比較，約為1.5的濁度在約1.5分鐘內(nèi)降低到吸光度約為0.1的澄清水平。因此，1.5分鐘后已完全消除了渾濁。
權(quán)利要求
1.用于消除生物樣品渾濁現(xiàn)象的試劑，它包含0.5-10mM的苯酚，0.5-15％的聚氧乙基化甘油三酯和至少一種能溶解聚氧乙基化甘油三酯的0.5-15％范圍內(nèi)的非離子型表面活性劑。
2.按照權(quán)利要求1的試劑，其特征在于非離子型表面活性劑選自包括聚氧乙烯-10-十三烷基醚和聚氧乙烯(8)異十三烷基醚的組中。
3.按照權(quán)利要求2的試劑，其特征在于該試劑包含聚氧乙烯-10-十三烷基醚和聚氧乙烯(8)異十三烷基醚的結(jié)合物。
4.按照權(quán)利要求1-3的試劑，其特征在于非離子型表面活性劑的濃度是0.5-2％。
5.按照權(quán)利要求1的試劑，其特征在于聚氧乙基化甘油三酯的濃度是0.5-2％。
6.按照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的試劑，其特征在于將它用于檢測CRP的測定。
全文摘要
用于消除生物樣品渾濁現(xiàn)象的試劑,它包含0.5－10mM的苯酚,0.5－15%的聚氧乙基化甘油三酯和至少一種能溶解聚氧乙基化甘油三酯的0.5－15%范圍內(nèi)的非離子型表面活性劑。
文檔編號G01N33/48GK1372144SQ0210178
公開日2002年10月2日 申請日期2002年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月19日
發(fā)明者G·岡澤, T·拉金, A·普福茨納 申請人:奧林匹斯診斷有限公司