專利名稱：原發(fā)性膽汁性肝硬化癥檢測用抗原的制備和純化技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生物醫(yī)藥體外檢測與診斷技術(shù)背景技術(shù)：
基因克隆與重組技術(shù)、蛋白質(zhì)原核表達(dá)與純化技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容
原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)是一種慢性進(jìn)行性疾病，在女性中多見，是由于肝內(nèi)中小膽管進(jìn)行性破壞并伴有門脈炎癥性改變，進(jìn)一步發(fā)展為纖維化、肝硬化。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性肝功能異常。早期表現(xiàn)為皮膚瘙癢、嗜睡、肝區(qū)隱痛，晚期出現(xiàn)黃疸、肝腹水、肝硬化。PBC的發(fā)病率約為2～24/10萬，有家族傾向，患者的親屬比普通人群發(fā)病風(fēng)險明顯增高。PBC是一種自身免疫性疾病，80％的患者伴有其他的免疫性疾病，如干燥綜合癥、甲狀腺炎、關(guān)節(jié)炎等。PBC患者的血清中可檢測到抗線粒體(AMA)M2抗體、抗核抗體、抗核孔復(fù)合物抗體等多種自身抗體，其中以抗丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDC)抗體為特征性免疫學(xué)異常。
抗PDC抗體是一種抗線粒體抗體(AMA)M2型抗體。PDC由多種酶和蛋白組成，其中與PBC相關(guān)的最重要的抗原成分是PDC-E2成分，即二氫脂乙酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(DPAT)。人DPAT是由細(xì)胞核編碼的蛋白，位于線粒體內(nèi)膜。DPAT含有四個功能結(jié)構(gòu)區(qū)，分別是N-端硫辛酸結(jié)合區(qū)，富含脯氨酸和丙氨酸的鉸鏈連接區(qū)，與PDC E1、E3、亞單位結(jié)合區(qū)，C端為酶催化功能區(qū)。原核表達(dá)及重組實驗證實，內(nèi)側(cè)硫辛酸結(jié)合區(qū)是與自身抗體結(jié)合實際的主要部位，其重組多肽可以檢測出百分之九十以上的PBC M2抗體陽性血清，與純天然的DPAT蛋白的檢出率和靈敏度相同。
本發(fā)明的內(nèi)容涉及到DPAT1-335aa多肽的原核表達(dá)及純化技術(shù)，該多肽包括除C端酶催化區(qū)以外的DPAT三個功能結(jié)構(gòu)區(qū)，對PBC的檢出率可高達(dá)96％。
DPAT1-335aa重組多肽具體的技術(shù)線路是采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法，以正常人肝組織總RNA為模板擴(kuò)增DPATcDNA163-1140bp區(qū)段，插入到原核表達(dá)載體TrcHis(Invitrogen com)多態(tài)隆位點，轉(zhuǎn)化TOPOIO大腸桿菌，IPIG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的DPAT1-335aa多肽是以融合蛋白的形式表達(dá)。融合蛋白采用金屬親合介質(zhì)ProBondTM(Invitrogen com)純化，最后用腸激酶(enterokinase)水解融合蛋白，獲得重組DPAT1-335aa多肽。
權(quán)利要求
丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)E2抗原的表達(dá)與純化技術(shù)及其應(yīng)用屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域體外檢測與診斷技術(shù)。該技術(shù)采用基因工程原核表達(dá)法，在大腸桿菌中表達(dá)與硫氧還蛋白融合的PDC E2抗原-二氫脂乙酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(DPAT)1-335氨基酸殘基的部分多肽，采用金屬親和層析法純化融合蛋白，腸激酶水解獲得重組PDC E2多肽抗原。用此多肽抗原酶聯(lián)免疫法檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者血清中的抗線粒體抗體(AMA)M2抗體，作為PBC的特異性免疫學(xué)診斷試劑。本發(fā)明專利的權(quán)利要求如下1、DPAT1--335氨基酸殘基部分多肽序列的克隆表達(dá)與純化技術(shù)。
2.重組DPAT1-335aa多肽作為抗線粒體抗體(AMA)M2抗體檢測用抗原在原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)診斷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明原發(fā)性膽汁性肝硬化癥檢測用抗原的制備和純化技術(shù),屬于生物醫(yī)藥體外檢測與診斷技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。原發(fā)性膽汁性肝硬化癥(PBC)是一種慢性進(jìn)行性自身免疫疾病。AMA M
文檔編號G01N33/563GK1445369SQ0210726
公開日2003年10月1日 申請日期2002年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月20日
發(fā)明者王虹 申請人:王虹