專(zhuān)利名稱：用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片屬于生命科學(xué)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)芯片是一種在固態(tài)基底上有序排布的蛋白質(zhì)或多肽陣列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行并行檢測(cè)、識(shí)別、鑒定和診斷的器件?？蓱?yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域。
AML是髓系白細(xì)胞異常增殖，隨血液循環(huán)釋放到外組織和浸潤(rùn)各種組織器官。起病急驟，約66％的病人在一個(gè)月內(nèi)起病，病情急，發(fā)展快。貧血和發(fā)熱時(shí)首發(fā)癥狀，中后期出現(xiàn)出血。其長(zhǎng)期存活率差(20-30％)，最好在緩解后，繼續(xù)接受骨髓移植，以提高治愈機(jī)會(huì)。ALL是由原始淋巴細(xì)胞大量增殖引起的，除發(fā)熱和出血外，還有明顯的肝、脾、淋巴結(jié)腫大等癥狀。其生存率高(60-70％)，若不幸復(fù)發(fā)，方可考慮接受骨髓移植。CML是一種起源于多能干細(xì)胞的腫瘤性增生疾病，臨床特點(diǎn)是粒細(xì)胞顯著增多，脾明顯腫大，絕大多數(shù)CML有較特異的Ph標(biāo)記染色體，病程較緩慢，急性變預(yù)后極差，如不積極治療往往在數(shù)月內(nèi)死亡。CLL是由于一種小淋巴細(xì)胞克隆性擴(kuò)展，逐步積累而浸潤(rùn)骨髓、血液、淋巴結(jié)和其他器官，最終導(dǎo)致造血功能衰竭的一種惡性疾病。這種細(xì)胞形態(tài)上雖類(lèi)似成熟淋巴細(xì)胞，但是一種免疫學(xué)不成熟的、功能不全的細(xì)胞。CLL絕大多數(shù)為B細(xì)胞性，T細(xì)胞性極少。因此，白血病初診時(shí)類(lèi)型的確定，對(duì)評(píng)估預(yù)后、制定治療策略、提高緩解率有重要價(jià)值。
目前臨床上白血病分型的方法主要是根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)來(lái)進(jìn)行的。一般是抽取病人血液和骨髓做細(xì)胞涂片檢查，可辨別是否有異常的細(xì)胞增殖，再進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)白血病細(xì)胞的類(lèi)型和數(shù)量，從而確定白血病的類(lèi)型，但該方法存在靈敏度低、效率差等缺點(diǎn)。近來(lái)由于免疫學(xué)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)有247種表達(dá)于細(xì)胞表面的CD(Cluster of Differentiation)抗原分子與白血病細(xì)胞相關(guān)。不同類(lèi)型的白血病細(xì)胞會(huì)表達(dá)特異的CD分子，利用標(biāo)有熒光標(biāo)記的抗CD的抗體可以檢出表達(dá)相應(yīng)CD分子的細(xì)胞，但此法每次反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)，速度慢，浪費(fèi)大量人力和物力。隨著生物芯片技術(shù)的發(fā)展，Golub等從38位AML或ALL病人的骨髓提取物的基因表達(dá)譜中檢測(cè)到1100個(gè)與AML-ALL分型有關(guān)的基因，并利用其中差異性最顯著的50個(gè)基因制成了精確度很高的DNA芯片。但這種方法實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，適用范圍小，成本昂貴，不太適用于臨床檢測(cè)。此外，還有根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)或分子特征分型的方法，都存在著實(shí)驗(yàn)復(fù)雜、效率低的缺點(diǎn)。并且上述種種方法都是僅僅為分型而設(shè)計(jì)，沒(méi)有考慮到對(duì)不同白血病亞型的分子特性進(jìn)行全面的研究。
本發(fā)明目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)是將與白血病相關(guān)的表達(dá)于白細(xì)胞細(xì)胞膜上的特異性表面標(biāo)志CD系列抗原分子的相應(yīng)抗體以及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照同時(shí)高密度點(diǎn)印于固相載體上，蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)鍵連接固定在固相載體上，以用于對(duì)病人的外周血進(jìn)行白血病的分型和研究。
其中，表面標(biāo)志CD系列抗原，可包括迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的所有CD分子，也可選擇其中的一部分；陽(yáng)性對(duì)照分別采用CD4和CD8；陰性對(duì)照采用人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的目的可通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)采用雙抗體夾心法對(duì)病人的外周血進(jìn)行白血病的分型和研究，即是取病人外周血，稀釋后滴加于芯片表面，表達(dá)分泌不同CD抗原分子的細(xì)胞分別被固定在芯片上的相對(duì)應(yīng)的抗體捕獲，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標(biāo)記的CD4抗體和CD8抗體的混合液，由于CD4和CD8是正常白細(xì)胞和病態(tài)白細(xì)胞普遍表達(dá)的表面標(biāo)志，洗去未結(jié)合的抗體后，進(jìn)行熒光掃描。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，對(duì)熒光掃描的結(jié)果分析如下某點(diǎn)產(chǎn)生熒光信號(hào)，則表明該病人的白細(xì)胞可分泌表達(dá)該點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的CD分子，記為陽(yáng)性，例如CD5+；如果不產(chǎn)生熒光信號(hào)，則記為陰性，例如CD10-；對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行綜合分析，即可對(duì)該病人進(jìn)行白血病分型，或研究不同型白血病的CD表達(dá)特征。
本發(fā)明用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片的制備方法如下第一步，根據(jù)樣品數(shù)目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的檢測(cè)CD分子的腔室，做好標(biāo)記，并確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；第二步，點(diǎn)樣針從多孔板取出蛋白質(zhì)樣品(各種CD抗體以及對(duì)照品)后直接高密度點(diǎn)印于固態(tài)基底上；第三步，室溫過(guò)夜或37℃溫育1小時(shí)，以固定樣品；第四步，利用制作蛋白芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝和保存。
本發(fā)明用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)方法如下第一步，在點(diǎn)樣好的芯片上滴加患者白細(xì)胞樣品，37℃溫育1小時(shí)，使抗原抗體充分反應(yīng)；第二步，用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗凈晾干；第四步，滴加以封阻液稀釋過(guò)的熒光標(biāo)記的CD4和CD8的抗體混合液，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；第五步，反應(yīng)結(jié)束后，利用專(zhuān)業(yè)的芯片掃描分析儀進(jìn)行結(jié)果的判讀和分析。
本發(fā)明具有下述優(yōu)越性第一，可在蛋白質(zhì)分子水平對(duì)各種白血病進(jìn)行精確分型，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，并可盡早確診。而用傳統(tǒng)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)單種CD分子逐一檢測(cè)，速度慢、效率低、實(shí)用性差；細(xì)胞形態(tài)法檢測(cè)往往需要多種方法輔助檢查才能明確診斷，而且一般只適用于急性白血病，對(duì)慢性白血病和一些白細(xì)胞不增多癥缺乏靈活的確診方法。且傳統(tǒng)方法靈敏度低、限制因素多而且重復(fù)性差；而采用本技術(shù)可以通過(guò)一次反應(yīng)即可得到多種指標(biāo)的逐項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果，確定所有與白血病相關(guān)的CD抗原表達(dá)情況，因而大大提高了檢測(cè)的速度和效率。第二，可對(duì)不同型白血病的白細(xì)胞特征和分子特征進(jìn)行研究，并有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的型和亞型。而此前的方法著眼于檢測(cè)，很難進(jìn)行全面的研究。第三，操作系統(tǒng)化，工藝簡(jiǎn)單，分析方便，成本較低，實(shí)用性強(qiáng)。
4——加入熒光標(biāo)記的CD4抗體和CD8抗體5——熒光標(biāo)記物結(jié)合于白細(xì)胞表面，從而可通過(guò)發(fā)熒光的位點(diǎn)判讀該樣品的CD分子表型。
雜交反應(yīng)第一步，在點(diǎn)樣好的芯片上滴加患者白細(xì)胞稀釋液樣品，37℃溫育1小時(shí)，使抗原抗體充分反應(yīng)；第二步，用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗凈晾干；第四步，滴加以封阻液稀釋過(guò)的熒光標(biāo)記的CD4和CD8的抗體混合液，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干。
結(jié)果的檢測(cè)、分析反應(yīng)結(jié)束后，利用專(zhuān)業(yè)的芯片掃描分析儀進(jìn)行結(jié)果的判讀和分析。對(duì)熒光掃描的結(jié)果分析如下某點(diǎn)產(chǎn)生熒光信號(hào)，則表明該病人的白細(xì)胞可分泌該點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的CD分子，記為陽(yáng)性，例如CD5+；如果不產(chǎn)生熒光信號(hào)，則記為陰性，例如CD10-；對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行綜合分析，即可對(duì)該病人進(jìn)行白血病分型，或研究不同型白血病的CD表達(dá)特征。
本實(shí)施例中，A病人的CD特異性表型為CD11c+，CD22+，CD19+，CD25+，CD103+/CD5-，CD10-；B病人的特異表型為CD5+，CD19+，CD20+，CD23+/CD10-，CD22-，表明前者患有毛細(xì)胞白血病，后者患有慢性淋巴細(xì)胞白血病。其它CD分子在這兩種白血病的分型中無(wú)關(guān)，此處不一一列舉。
權(quán)利要求
1，用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，將與白血病相關(guān)的表達(dá)于白細(xì)胞細(xì)胞膜上的特異性表面標(biāo)志CD(Cluster ofDifferentiation)系列抗原分子的相應(yīng)抗體以及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照同時(shí)高密度點(diǎn)印于固相載體上，蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)鍵連接固定在固相載體上。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，所述表面標(biāo)志CD系列抗原，可包括已知的CD分子或其中的一部分；所述陽(yáng)性對(duì)照分別采用CD4和CD8；所述陰性對(duì)照采用人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)。
3，用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片的使用方法，其特征在于，采用雙抗體夾心法，即是取病人外周血，稀釋后滴加于芯片表面，表達(dá)分泌不同CD抗原分子的細(xì)胞分別被固定在芯片上的相對(duì)應(yīng)的抗體捕獲，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標(biāo)記的CD4抗體和CD8抗體的混合液，由于CD4和CD8是正常白細(xì)胞和病態(tài)白細(xì)胞普遍表達(dá)的表面標(biāo)志，洗去未結(jié)合的抗體后，進(jìn)行熒光掃描、分析。
4，根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片的使用方法，其特征在于，對(duì)熒光掃描的結(jié)果分析如下某點(diǎn)產(chǎn)生熒光信號(hào)，則表明該病人的白細(xì)胞可分泌表達(dá)該點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的CD分子，記為陽(yáng)性；如果不產(chǎn)生熒光信號(hào)，則記為陰性。
5，用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片的用途，其特征在于，用于對(duì)病人進(jìn)行白血病分型，或研究不同型白血病的CD表達(dá)特征。
6，用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于，第一步，根據(jù)樣品數(shù)目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的檢測(cè)CD分子的腔室，做好標(biāo)記，并確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；第二步，點(diǎn)樣針從多孔板取出包括各種CD抗體以及對(duì)照品的蛋白質(zhì)樣品后直接高密度點(diǎn)印于固態(tài)基底上；第三步，室溫過(guò)夜或37℃溫育1小時(shí)，以固定樣品；第四步，利用制作蛋白芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝和保存。
7，用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)方法，其特征在于，進(jìn)行雜交反應(yīng)第一步，在點(diǎn)樣好的芯片上滴加患者白細(xì)胞稀釋液樣品，37℃溫育1小時(shí)，使抗原抗體充分反應(yīng)；第二步，用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗凈晾干；第四步，滴加以封阻液稀釋過(guò)的熒光標(biāo)記的CD4和CD8的抗體混合液，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；第五步，反應(yīng)結(jié)束后，利用專(zhuān)業(yè)的芯片掃描分析儀進(jìn)行結(jié)果的判讀和分析。
全文摘要
本發(fā)明用于白血病分型和研究的蛋白質(zhì)芯片涉及一種蛋白質(zhì)芯片,可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行并行檢測(cè)、識(shí)別、鑒定和診斷。本發(fā)明是將與白血病相關(guān)的表達(dá)于白細(xì)胞細(xì)胞膜上的特異性表面標(biāo)志CD系列抗原分子的相應(yīng)抗體以及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照同時(shí)高密度點(diǎn)印于固相載體上,蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)鍵連接固定在固相載體上。本發(fā)明可在蛋白質(zhì)分子水平對(duì)各種白血病進(jìn)行精確分型,通過(guò)一次反應(yīng)即可得到多種指標(biāo)的逐項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果,確定所有與白血病相關(guān)的CD抗原表達(dá)情況,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,檢測(cè)的速度和效率高,并可盡早確診;可對(duì)不同型白血病的白細(xì)胞特征和分子特征進(jìn)行深入研究;操作系統(tǒng)化,工藝簡(jiǎn)單,分析方便,成本較低,實(shí)用性強(qiáng)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1372143SQ02111129
公開(kāi)日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2002年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月21日
發(fā)明者張濤, 李賓, 彭永濟(jì), 徐鋒, 任一萍 申請(qǐng)人:上海晶泰生物技術(shù)有限公司