專利名稱：以酶聯(lián)免疫測(cè)定為基礎(chǔ)的hla補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性抗體檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明以免疫酶學(xué)反應(yīng)為方法學(xué)基礎(chǔ)，通過(guò)測(cè)定CFAbs固定補(bǔ)體量實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中CFAbs測(cè)量的一種CDC效應(yīng)評(píng)估方法。特別涉及器官移植免疫中HLA血清方法學(xué)的基本測(cè)定原理。
二、技術(shù)背景組織器官移植中排斥反應(yīng)是生物機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)移植物(非已)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)移植物細(xì)胞表面的蛋白成分(非已抗原)與受者免疫系統(tǒng)接觸時(shí)，通過(guò)免疫識(shí)別這些非已抗原成分并激發(fā)受者體液免疫系統(tǒng)、細(xì)胞免疫系統(tǒng)對(duì)移植物發(fā)動(dòng)免疫攻擊，破壞、排斥非已移植物，導(dǎo)致組織器官移植失敗。
組織器官移植中，受者免疫系統(tǒng)通過(guò)MHC(組織相溶性復(fù)合物)識(shí)別機(jī)制對(duì)移植物MHC表型及短肽復(fù)合物進(jìn)行雙重免疫識(shí)別。在人類MHC稱為人類白細(xì)胞抗原(HLA)，如果移植供者與受者HLA型別不相符合，則受者免疫系統(tǒng)將移植物識(shí)別為非已并對(duì)其發(fā)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致“免疫排斥反應(yīng)”。
在這種免疫排斥反應(yīng)中，超急性免疫排斥反應(yīng)主要由受者體液免疫成分即受者體內(nèi)在移植前已經(jīng)存在的，針對(duì)供者HLA的抗體分子所介導(dǎo)。這些抗體由受者懷孕、接受輸血、器官移植等使其免疫系統(tǒng)接觸非已HLA分子而產(chǎn)生。這類抗體的特征是能迅速與供者HLA結(jié)合并通過(guò)固定補(bǔ)體，激活補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)CDC效應(yīng)。這種超急性免疫排斥反應(yīng)發(fā)生異常迅速，通常為幾分鐘到數(shù)小時(shí)；而急性、慢性免疫排斥反應(yīng)則由受者的體液免疫及細(xì)胞免疫系統(tǒng)同時(shí)介入。因此，為了預(yù)防器官移植中免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，除盡量選擇HLA型別與受者HLA型別相匹配的供者外，在移植前利用供者淋巴細(xì)胞與受者血清進(jìn)行交叉配型，以鑒別受者體內(nèi)是否存在針對(duì)供者HLA的抗體是預(yù)防超急性排斥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵。同時(shí)，在器官移植后，對(duì)受者體內(nèi)HLA抗體的檢測(cè)，包括PRA(群體反應(yīng)性HLA抗體)動(dòng)態(tài)測(cè)定對(duì)急性、慢性排斥反應(yīng)發(fā)生的監(jiān)測(cè)以及移植后受者生存期限的預(yù)測(cè)具有極其重要價(jià)值。
根據(jù)抗體是否能夠固定激活補(bǔ)體，誘發(fā)CDC效應(yīng)與否，人類HLA抗體主要可分為兩類一類為與相應(yīng)的HLA結(jié)合后可固定補(bǔ)體并激活補(bǔ)體系統(tǒng)誘發(fā)CDC效應(yīng)，該類HLA抗體稱為補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性抗體(Complement-dependent Cytotoxic Antibodies；CDC-Abs)或補(bǔ)體固定性HLA抗體(CFAbsComplement Fixing Antibodies)；其在誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)中的作用已十分明確，是直接導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)尤其是超急性免疫排斥反應(yīng)的體液免疫成分；而另一類HLA抗體，雖能與HLA發(fā)生特異性結(jié)合，但并不固定補(bǔ)體，不激發(fā)CDC效應(yīng)，稱為非補(bǔ)體固定抗體(Non-CFAbs；Non-Complement Fixing Antibodies)。此類抗體甚至在機(jī)體免疫系統(tǒng)沒(méi)有接觸任何非已HLA的情況下，以天然形式存在于人類身體內(nèi)；并可與自身(Autologous)或外來(lái)(Allogeneic)非已HLA分子結(jié)合，但并不激活補(bǔ)體，誘發(fā)免疫CDC攻擊效應(yīng)。迄今，人們對(duì)這類抗體的作用并不十分明了。但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，這些抗體屬于一種天然抗體(Natural Antibody)成分，對(duì)生物體具有保護(hù)作用。美國(guó)、法國(guó)等曾對(duì)此作過(guò)較為深入的研究，體外、體內(nèi)大量實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果都獲得完全一致結(jié)論即正常人體內(nèi)存在天然抗體，由于其具有免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)維持正常生物機(jī)體健康發(fā)揮著某種有益的保護(hù)作用(Protective Effects)并可有效地應(yīng)用于抑制器官移植中的免疫排斥反應(yīng)。
目前，國(guó)際上對(duì)HLA抗體測(cè)定的方法分為兩類一類為Terasaki’s微量淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)，簡(jiǎn)稱為CDC血清學(xué)方法，是一種普遍認(rèn)為經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)CDC測(cè)定方法。該方法以CDC誘發(fā)的淋巴細(xì)胞死亡率作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，其主要特征是直接測(cè)定由CFAbs誘發(fā)的CDC最終效應(yīng)-細(xì)胞死亡，為一種CDC生物效應(yīng)測(cè)定方法。該方法已廣泛應(yīng)用于臨床器官移植的交叉配型以及PRA測(cè)定；但其存在費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、技術(shù)復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件不易控制等很多缺點(diǎn)。另一類方法可同時(shí)測(cè)定CFAbs和Non-CFAbs；包括流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)合于細(xì)胞表面的IgG抗體測(cè)定法，或以純化的HLA包被固相顆粒的抗HLA抗體測(cè)定法；以及使用純化HLA包被96孔微孔板測(cè)定與HLA結(jié)合的IgG抗體ELISA方法等。這些方法最大的缺點(diǎn)是忽略了天然HLA抗體的存在(Non-CFAbs)，它們并不引起CDC效應(yīng)；相反，這些抗體與相應(yīng)的HLA結(jié)合后，可封閉該HLA抗原位點(diǎn)，阻止HLA毒性抗體-CFAbs與相應(yīng)HLA結(jié)合，從而阻斷隨之發(fā)生的CDC效應(yīng)，使受者產(chǎn)生對(duì)移植物的免疫耐受。因此，上述這類方法在檢測(cè)方法學(xué)原理上存在明顯缺陷，不能區(qū)別作用完全不相同的以上兩類抗體。這就是為什么許多實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常得出令人難以解釋或與CDC血清學(xué)相互矛盾的結(jié)果，甚至與受者臨床轉(zhuǎn)歸完全相反結(jié)果如接受正常人免疫丙種球蛋白(Intravenous Immunoglobulin Gamma；IVIG)免疫抑制治療的器官移植受者，上述方法結(jié)果持續(xù)陽(yáng)性，而臨床病人病情正?；蜣D(zhuǎn)好。另外，在臨床器官移植中，該類方法結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)假陽(yáng)性引起對(duì)供者選擇的誤導(dǎo)，致使某些急待器官移植的患者錯(cuò)過(guò)移植機(jī)會(huì)而病情惡化甚至死亡。
目前所有測(cè)定HLA抗體的方法另一明顯不足是所需時(shí)間較長(zhǎng)，這在尸體供者器官移植中是導(dǎo)致移植失敗的首要原因。
綜上所述，組織交叉配型在器官移植前，對(duì)受者體內(nèi)已經(jīng)存在的CFAbs測(cè)定，是決定器官移植成敗的關(guān)鍵因素之一；在器官移植后，是監(jiān)測(cè)受者有無(wú)免疫排斥的重要指標(biāo)；同時(shí)，對(duì)接受移植后受者的病情轉(zhuǎn)歸具有預(yù)測(cè)作用。
目前，國(guó)際上普遍使用的上述測(cè)定HLA抗體的各種方法，均不能充分滿足以上要求。因此，建立一種簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異、穩(wěn)定的CFAbs測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化方法成為器官移植中的迫切需要。
本發(fā)明根據(jù)CDC效應(yīng)的基本原理，在免疫酶學(xué)反應(yīng)方法學(xué)基礎(chǔ)上，建立了一種通過(guò)測(cè)定CFAbs固定補(bǔ)體量實(shí)現(xiàn)對(duì)CDC效應(yīng)評(píng)估的測(cè)量方法。由于CFAbs結(jié)合相應(yīng)細(xì)胞HLA抗原和固定補(bǔ)體為CDC效應(yīng)的最初始階段，而CFAbs固定補(bǔ)體的量與CDC效應(yīng)強(qiáng)度(細(xì)胞死亡)具有直接正相關(guān)關(guān)系；因此，測(cè)定CFAbs的補(bǔ)體固定量可直接用于CDC效應(yīng)的評(píng)估。同時(shí)，本方法在反應(yīng)系統(tǒng)中引入針對(duì)細(xì)胞表面特征性抗原的固相抗體，用于識(shí)別、分離特定的細(xì)胞群，可選擇性地在多種細(xì)胞混合反應(yīng)體系中對(duì)發(fā)生在某種特定細(xì)胞群體的CDC效應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。這種CFAbs測(cè)定方法摒棄了現(xiàn)存各種HLA抗體測(cè)定方法的多種缺陷，具有高靈敏度，高特異性以及經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速等獨(dú)到特點(diǎn)。
*相關(guān)文獻(xiàn)1、Patel R，Terasaki PI.，N Engl J Med 1969；280735-92、Garovoy MR，et al.，Transplant Proc 1983；151939-413、Christiaans MH，et al.，Transplantation 1996；151341-13474、Karuppan ss，et al.，Transplantation 1992；53666-6735、Chia D，et al.，Tissue Antigens 1991；3749-556、(lgA)Koka P.，Transplantation 1993；56207-211*相關(guān)專利


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)CDC效應(yīng)的基本原理，在免疫酶學(xué)反應(yīng)方法學(xué)基礎(chǔ)上，建立了一種通過(guò)測(cè)定CFAbs固定補(bǔ)體量實(shí)現(xiàn)對(duì)CDC效應(yīng)評(píng)估的測(cè)量方法。由于CFAbs結(jié)合相應(yīng)細(xì)胞HLA抗原和固定補(bǔ)體為CDC效應(yīng)的最初始階段，而CFAbs固定補(bǔ)體的量與CDC效應(yīng)強(qiáng)度(細(xì)胞死亡)具有直接正相關(guān)關(guān)系；因此，測(cè)定CFAbs的補(bǔ)體固定量可直接用于CDC效應(yīng)的評(píng)估。同時(shí)，本方法在反應(yīng)系統(tǒng)中引入針對(duì)細(xì)胞表面特征性抗原的固相抗體，用于識(shí)別、分離特定的細(xì)胞群，可選擇性地在多種細(xì)胞混合反應(yīng)體系中對(duì)發(fā)生在某種特定細(xì)胞群體的CDC效應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。這種CFAbs測(cè)定方法摒棄了現(xiàn)存各種HLA抗體測(cè)定方法的多種缺陷，具有高靈敏度，高特異性以及經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速等獨(dú)到特點(diǎn)。本發(fā)明所建立CFAbs免疫測(cè)定方法及試劑盒包括以下主要組成部分(一)固相成分根據(jù)固相方式及成分不同可有如下選擇1、固相抗體可直接將針對(duì)細(xì)胞表面抗原(如CD抗原系列等)受體或結(jié)合在細(xì)胞表面的其它成分(如抗體、補(bǔ)體等)連接在微孔板表面，借以捕獲分離特定細(xì)胞。對(duì)該細(xì)胞表面的CFAbs進(jìn)行測(cè)定。亦可將上述成分連接在磁珠表面，以磁鐵吸附磁珠達(dá)到對(duì)特定細(xì)胞的選擇性分離。
2、固相抗原主要是指經(jīng)純化的HLA抗原；將已知型別(如HLA-A、B、C、D(DR、DQ、DP)及其亞型等)或HLAI型或/和II型的混合HLA抗原連接在微孔板或固相顆粒(如塑料、多聚化合物、磁顆粒等)表面，作為CFAbs結(jié)合的靶物質(zhì)成分。(二)信號(hào)放大檢測(cè)系統(tǒng)1、示蹤標(biāo)記物通常為各種標(biāo)記的配體、抗體或補(bǔ)體成分，尤其是指酶學(xué)標(biāo)記(HRP、AP等氧化酶)。
2、酶學(xué)底物或化學(xué)發(fā)光劑通常為HRP，AP等氧化酶的相應(yīng)底物，如OPD，4-CN，ABTS，PNPP，TMB等；或可利用上述酶作為化學(xué)發(fā)光(魯米諾及其衍生物)、生物發(fā)光的催化劑和其它發(fā)光增強(qiáng)劑共同催化、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，以獲得CFAbs檢測(cè)的高靈敏度。(三)對(duì)照樣品1、陽(yáng)性對(duì)照根據(jù)具體檢測(cè)要求設(shè)定，通常為含已知HLA型別CFAbs的單份血清或混合血清；該血清也可根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)稀釋。陽(yáng)性對(duì)照一般設(shè)3個(gè)劑量點(diǎn)，分別位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的高、中、低三個(gè)劑量區(qū)。
2、陰性對(duì)照通常為正常人男性，AB血型，從未接受過(guò)輸血、器官移植的個(gè)體血清；該血清來(lái)源可為同一個(gè)體或多個(gè)個(gè)體的混合血清。(四)標(biāo)準(zhǔn)品由一系列(一般為5-6個(gè))已知含量的CFAbs血清制成。在完成檢測(cè)后；以該系列的檢測(cè)信號(hào)值(如OD值；發(fā)光單位等)為縱坐標(biāo)對(duì)CFAbs劑量值(橫座標(biāo))制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；作為樣品CFAbs含量定量計(jì)算依據(jù)，給出更為精確的結(jié)果。(五)其它包括洗滌緩沖液、樣品稀釋液、反應(yīng)容器(如試管、微孔板等)、檢測(cè)藥盒說(shuō)明書等其它與檢測(cè)有關(guān)的材料、物品。
本發(fā)明根據(jù)免疫學(xué)CDC的發(fā)生原理，即CDC發(fā)生必須由HLA抗體結(jié)合于相應(yīng)的靶細(xì)胞，繼而固定第一種補(bǔ)體成分激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑或/和旁路途徑，在一系列酶和多種因子的參與下，發(fā)生補(bǔ)體激活的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，直至形成膜攻擊物(MAC)，使生物細(xì)胞膜受損，形成小孔導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓降低，細(xì)胞溶解、死亡。由于CFAbs固定補(bǔ)體的相對(duì)數(shù)量與樣品中CFAbs濃度及CDC效應(yīng)程度成直接正相關(guān)關(guān)系，因此，測(cè)定HLA-CFAbs固定補(bǔ)體的水平或測(cè)量補(bǔ)體活化途徑中任一因子或補(bǔ)體本身及其復(fù)合物，一方面可直接反映HLA-CFAbs的有無(wú)或相對(duì)濃度；另一方面可間接反映CDC效應(yīng)或細(xì)胞損傷、死亡的相對(duì)程度及數(shù)量。
由于本發(fā)明測(cè)定的對(duì)象為CDC發(fā)生最初始階段的HLA-CFAbs-補(bǔ)體復(fù)合物成分，因此該方法需要的反應(yīng)時(shí)間相對(duì)現(xiàn)存的方法為最短。
由于本發(fā)明方法學(xué)中的信號(hào)檢測(cè)可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需要，采用酶學(xué)、熒光、化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨發(fā)光、電致發(fā)光、生物發(fā)光甚至發(fā)射性同位素等作為示蹤信號(hào)放大檢測(cè)手段，因此具有極高的靈敏度。
由于本發(fā)明利用受者自身血清中存在的補(bǔ)體作為反應(yīng)測(cè)量對(duì)象，且反應(yīng)系統(tǒng)主要組成部分為受者血清成分和供者細(xì)胞；因此，最能真實(shí)地模擬受者體內(nèi)的生理內(nèi)環(huán)境。
由于血清中CFAbs及補(bǔ)體成分在低溫狀態(tài)下，活性能得以長(zhǎng)期保存(至少數(shù)年)，因此本方法具有方法學(xué)上的穩(wěn)定性以及很好的可重復(fù)性。
由于本方法采用“雙識(shí)別系統(tǒng)”；即可利用針對(duì)同一靶細(xì)胞上兩種不同抗原成分的特異性抗體；同時(shí)達(dá)到對(duì)特定靶細(xì)胞的鑒別選擇和示蹤作用如利用針對(duì)靶細(xì)胞抗原1(細(xì)胞特征性CD抗原)的固相抗體達(dá)到對(duì)靶細(xì)胞的鑒別、分離；利用針對(duì)靶細(xì)胞抗原2(HLA抗原或補(bǔ)體)的標(biāo)記抗體作為CFAbs的示蹤信號(hào)檢測(cè)手段，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定靶細(xì)胞鑒別、分離和CFAbs信號(hào)檢測(cè)的同步進(jìn)行，從而簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟和縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了方法學(xué)的檢測(cè)特異性。
由于本發(fā)明的CFAbs測(cè)定法可利用最為常見(jiàn)的ELISA方法作為檢測(cè)“技術(shù)平臺(tái)”，不需要其他復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備(如流式細(xì)胞儀等)，方法學(xué)簡(jiǎn)便容易掌握，故具有其成本低廉，實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)且能在短時(shí)間內(nèi)完成大樣本的同時(shí)測(cè)定。
本發(fā)明根據(jù)CDC效應(yīng)的發(fā)生原理，以免疫反應(yīng)方法學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合酶學(xué)顯色或發(fā)光信號(hào)的高靈敏度檢測(cè)特點(diǎn)，建立了通過(guò)測(cè)定靶細(xì)胞表面或固相靶物質(zhì)表面補(bǔ)體固定量的CFAbs測(cè)定法。由于CDC發(fā)生過(guò)程中從CFAbs結(jié)合細(xì)胞表面HLA抗原、補(bǔ)體固定、激活到可被體外測(cè)量的CDC終末效應(yīng)-細(xì)胞死亡出現(xiàn)，需要較長(zhǎng)時(shí)間，而本發(fā)明通過(guò)測(cè)定CDC最早期(初始誘發(fā)效應(yīng))階段所形成的HLA-CFAbs-補(bǔ)體復(fù)合作為評(píng)價(jià)樣品中CFAbs水平以及CDC效應(yīng)程度的指標(biāo)；因此縮短了檢測(cè)周期，顯著提高了方法學(xué)的穩(wěn)定性和靈敏度。由于本方法以最為普通應(yīng)用的酶聯(lián)免疫方法學(xué)作為基礎(chǔ)，具有操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器設(shè)備和專門培訓(xùn)技術(shù)人員的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明的另一顯著特點(diǎn)是能利用樣品本身含有的補(bǔ)體成分，模擬生物體內(nèi)生理微環(huán)境，通過(guò)測(cè)定HLA CFAbs固定補(bǔ)體的早期免疫學(xué)結(jié)合效應(yīng)反映CDC免疫生物學(xué)的終末效應(yīng)，并能同步對(duì)多種細(xì)胞混合樣品中的某一特定細(xì)胞群進(jìn)行選擇性分離，達(dá)到對(duì)發(fā)生在該特定細(xì)胞群體CDC效應(yīng)的測(cè)量。同時(shí)，該方法可在短時(shí)間內(nèi)完成大樣本CFAbs的同時(shí)測(cè)定。發(fā)明中所建立的CFAbs測(cè)定方法或試劑盒具有國(guó)際上現(xiàn)存所有其它方法所不具有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。因此，以上方法及其試劑盒可廣泛應(yīng)用于取代HLA傳統(tǒng)血清學(xué)細(xì)胞毒性反應(yīng)測(cè)定，如血清學(xué)HLA分型(Serology HLA Typing)；HLA交叉配體(HLA Cross Match)，群體反應(yīng)性HLA抗體測(cè)定(Panel Reactive Antibodies，PRA)以及ABO血型配型等多種血清學(xué)方法；同時(shí)，也可直接應(yīng)用于對(duì)樣品中CFAbs的水平測(cè)定，為生物醫(yī)學(xué)中CDC免疫學(xué)效應(yīng)的評(píng)估以及補(bǔ)體生物活性、補(bǔ)體激活機(jī)制研究提供一種經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)便、靈敏的特異性方法。
具體實(shí)施例方式
例一T淋巴細(xì)胞HLA交叉配型細(xì)胞酶聯(lián)免疫學(xué)方法(Cellular ELISA；CELISA)(一)在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量抗CD3抗體包被的免疫磁珠、供者的有核細(xì)胞、受者的血清或血漿混勻。(二)在一定溫度條件下溫育一定時(shí)間(30分鐘-3小時(shí))，此時(shí)如受者血清或血漿中存在CFAbs，可與供者有核細(xì)胞表面的HLA結(jié)合繼而固定受者樣品中自身的補(bǔ)體C1q或C3分子；形成HLA-CFAbs-C1q三聯(lián)復(fù)合物，與此同時(shí)，磁珠固相的抗人CD3抗體特異性地與T淋巴細(xì)胞表面的CD3分子結(jié)合。(三)以磁鐵與反應(yīng)容器外部接觸，形成一有效磁場(chǎng)通過(guò)吸附免疫磁珠對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行吸附分離，吸棄未被吸附的其它細(xì)胞成分和液相成分。(四)以含一定量蛋白的緩沖液如含2％BSA的磷酸緩沖液對(duì)分離的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行洗滌，進(jìn)一步去除殘留的其它細(xì)胞成分和非特異蛋白成分。(五)移去磁鐵，將分離的T淋巴細(xì)胞混懸于含有一定量HRP標(biāo)記的抗C1q或C3抗體(HRP-C1qAb或HRP-C3Ab)的緩沖液中，繼續(xù)溫育(條件同步驟二)；此時(shí)HRP-C1qAb與步驟(二)中“三聯(lián)復(fù)合物”的C1q或C3結(jié)合形成“四聯(lián)復(fù)合物”。(六)重復(fù)步驟(三)(四)，去除游離的HRP-C1qAb或HRP-C3Ab；并將細(xì)胞小心懸浮在小量緩沖液中。(七)在上述細(xì)胞懸液中加入一定量的HRP底物，由四聯(lián)復(fù)合物中的HRP催化顯色反應(yīng)。(八)以酶標(biāo)儀(ELISA Reader)對(duì)上述樣品進(jìn)行光密度吸收值測(cè)量，獲得OD值(OpticalDensity)。(九)將樣品OD值與正常對(duì)照OD值進(jìn)行比較；高出正常對(duì)照樣品上限OD值定義為T淋巴細(xì)胞HLA交叉配型陽(yáng)性；反之定義為陰性。例二、B淋巴細(xì)胞HLA交叉配型CELISA方法(一)將例一步驟(一)中的抗CD3抗體包被的免疫磁珠改為抗人CD19或CD20抗體包被的免疫磁珠。其它成分相同。(二)同例一步驟(二)，但不同的是，磁珠固相的抗CD19或CD20抗體與B淋巴細(xì)胞表面的CD19或CD20分子結(jié)合。(三)同例一步驟(三-九)，但上述步驟中的T淋巴細(xì)胞均改為B淋巴細(xì)胞。說(shuō)明1上述例一和例二以連接有不同CD抗體的免疫磁珠分離相應(yīng)的T或B淋巴細(xì)胞，也可采用以CD抗體直接連接在微孔板上實(shí)現(xiàn)對(duì)T或B淋巴細(xì)胞的識(shí)別分離并對(duì)其細(xì)胞膜表面的CFAbs進(jìn)行測(cè)定。說(shuō)明2上述例一、例二中的HRP-C1qAb或HRP-C3Ab可替換為HRP-hlgGAb，對(duì)結(jié)合在T或B淋巴細(xì)胞表面的總lgG進(jìn)行測(cè)量，達(dá)到對(duì)CFAbs和Non-CFAbs的同時(shí)測(cè)定。例三、HLA Class I/IICFAbs的ELISA測(cè)定方法(一)以一定濃度純化的HLA Class I或/和Class II抗原包被微孔板37℃溫育1-4小時(shí)或4℃過(guò)夜，吸棄包被液。(二)以含有一定量非特異性蛋白(如BSA，脫脂奶粉、小牛血清等)的緩沖液(封閉液)對(duì)微孔板進(jìn)行封閉，時(shí)間、溫度同步驟(一)，然后吸棄剩余封閉液。(三)在相應(yīng)微孔板內(nèi)分別加入陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清、本底緩沖液和受檢血清各50微升(也可為經(jīng)緩沖液稀釋后的血清)。(四)將上述微孔板置37℃或4℃溫育30分鐘-3小時(shí)或4℃過(guò)夜。(五)吸棄反應(yīng)液，以含有一定濃度去垢劑(如吐溫-20；NP-40等)的洗滌液對(duì)微孔板各孔進(jìn)行洗滌，通常洗滌3次，然后吸棄最后一次洗滌液。(六)在各孔里加入含有一定濃度HRP標(biāo)記的抗人C1q抗體，繼續(xù)溫育，條件同步驟(四)。(七)重復(fù)步驟(五)。(八)在各孔內(nèi)加入一定量HRP的底物(如PNPP等)。(九) 以酶標(biāo)儀對(duì)各孔的OD值進(jìn)行測(cè)量，并收集、記錄結(jié)果。(十)結(jié)果判定如OD值大于正常值上限；則結(jié)果表示為HLA-Class I或/和Class II CFAbs檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；反之為檢測(cè)結(jié)果陰性。例四HLA-I或/和HLA-II免疫磁珠ELISA方法(一)在微孔板各孔中加入包被(或連接)有HLA-I或/和HLA-II抗原的磁珠。(二)同例三中步驟(三)、(四)(三)將微孔板置于一磁板上數(shù)分鐘；使免疫磁珠吸附在微孔底部或一側(cè)。然后吸棄液體部分；在各孔中加入洗滌液，然后重復(fù)上述磁板吸附和吸棄步驟2-3次，吸棄最后一次洗滌液。(四)同例三步驟(八)、(九)、(十)。例五群體反應(yīng)性HLA CFAbs測(cè)定方法(CFAbs-PRA)(一)PRA板制備選擇已知多種HLA型別的細(xì)胞，按一定數(shù)目(0.01-3×106/孔)分別加入微孔板各孔；作為CELISA反應(yīng)的靶細(xì)胞；或以純化的HLA各型別抗原分別包被微孔板或免疫磁珠作為固相反應(yīng)材料。(二)在以上PRA板各孔里分別加入一定量的同一受檢樣品血清，與相應(yīng)的靶細(xì)胞或固相靶抗原溫育；溫育條件同例三步驟(四)。(三)對(duì)上述細(xì)胞孔或固相HLA抗原孔進(jìn)行洗滌；如細(xì)胞可采用離心；磁珠采用磁場(chǎng)分離；微孔板可直接洗滌等。(四)在上述各反應(yīng)孔內(nèi)加入HRP-C1qAb或HRP-C3Ab繼續(xù)溫育(條件同上)，然后進(jìn)一步洗滌(條件同上)。(五)在上述各反應(yīng)中加入一定量HRP底物，然后對(duì)各孔進(jìn)行OD值測(cè)定。(六)結(jié)果判定OD值高于正常值上限者判定為CFAbs陽(yáng)性；然后計(jì)算陽(yáng)性反應(yīng)孔占總PRA反應(yīng)孔數(shù)的百分率；計(jì)算公式如下CFAbs陽(yáng)性孔數(shù)÷總PRA孔數(shù)×100＝(PRA％)例CFAbs陽(yáng)性孔數(shù)為25；而總PRA孔數(shù)為50；則PRA％為50％。例六總HLA-I和HLA-II的CFAbs測(cè)定(一)以純化混合的HLA-I或/和HLA-II抗原包被微孔板或磁珠，然后依照上述舉例中的相應(yīng)條件，可實(shí)現(xiàn)對(duì)總HLA-I或/和II的CFAbs測(cè)定。(二)HLA-I的CFAbs測(cè)定也可利用混合的人血小板作為固相HLA-I來(lái)源。(三)以上HLA-I或II抗原應(yīng)包括在統(tǒng)計(jì)學(xué)上＞95％以上的HLA型別。例七HLA-B27的CFAbs測(cè)定(一)以純化的B27抗原包被微孔板或磁珠，然后依照上述舉例中相應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)B27的CFAbs測(cè)定。(二)已知B27型別的細(xì)胞亦可作為B27抗原的靶細(xì)胞來(lái)源，直接用于CFAbs的測(cè)定。
上述舉例僅為部分CFAbs測(cè)定方法的實(shí)際應(yīng)用實(shí)例；因此，根據(jù)本發(fā)明的基本測(cè)定原理衍生出的其它方法應(yīng)包含在發(fā)明所述及范圍之內(nèi)。
五

圖一檢測(cè)固定補(bǔ)體抗體的細(xì)胞ELISA方法，Tc/Bc HLA交叉配型法。圖二檢測(cè)固定補(bǔ)體抗體的免疫磁珠細(xì)胞ELISA方法，Tc/Bc HLA交叉配型法。圖三檢測(cè)固定補(bǔ)體抗體的ELISA方法，群體反應(yīng)性抗體ELISA法。圖四檢測(cè)固定補(bǔ)體抗體的免疫磁珠ELISA方法，群體反應(yīng)性抗體ELISA法。圖五細(xì)胞毒性抗體(CFAbs)和非細(xì)胞毒性抗體(Non-CFAbs)在CDC效應(yīng)發(fā)生中的作用機(jī)制。
權(quán)利要求
權(quán)利要求
1、一種通過(guò)測(cè)定補(bǔ)體結(jié)合率達(dá)到對(duì)樣品CFAbs或CDC效應(yīng)測(cè)定的免疫學(xué)方法及試劑盒。該方法或試劑盒包括以下內(nèi)容
2.在受檢樣品與相應(yīng)的靶細(xì)胞或靶抗原的反應(yīng)系統(tǒng)中，至少加入一種或一種以上與CDC效應(yīng)過(guò)程有關(guān)或/和具有和靶細(xì)胞其它表面特性蛋白分子結(jié)合的標(biāo)記配體或抗體成分。
3.權(quán)利要求1中CFAbs解釋為任何來(lái)源的具有固定或結(jié)合補(bǔ)體能力的抗體成分。
4.權(quán)利要求2中的標(biāo)記配體或標(biāo)記抗體解釋為以下兩類第一類直接或間接參與CDC反應(yīng)的各種成分或/和其相應(yīng)的抗體，其能反映CDC效應(yīng)過(guò)程的任一階段或狀態(tài)。第二類能夠反映或鑒定靶細(xì)胞特征，或具有對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行鑒別分類的各種配體或抗體成分。
5.權(quán)利要求4中的所述及的兩類配體或抗體可同時(shí)或單獨(dú)使用；但在反應(yīng)測(cè)量系統(tǒng)中，必須包括至少一種標(biāo)記配體或抗體，借以反映CDC的發(fā)生過(guò)程。
6.權(quán)利要求2中的CDC效應(yīng)過(guò)程解釋為由具有固定補(bǔ)體作用的抗體和第一個(gè)補(bǔ)體成分結(jié)合于靶細(xì)胞或靶抗原開始到形成最終免疫復(fù)合物，或補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物(MAC；C5b-9)至細(xì)胞死亡的全過(guò)程。
7.權(quán)利要求2中，受檢樣品包括任何一種可能含有CFAbs的生物樣品；包括人、動(dòng)物的所有體液成分；例血清、血漿、腦脊液、脊髓液、羊水、唾液、尿液等。
8.權(quán)利要求2中，靶細(xì)胞解釋為任何一種能與CFAbs結(jié)合的經(jīng)人工處理或天然存在的真核或原核生物細(xì)胞以及血液有形成分例人類細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、各種組織細(xì)胞、各種干細(xì)胞等)、血小板、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、微生物、細(xì)菌等。
9.權(quán)利要求8中的“人工處理”進(jìn)一步解釋為經(jīng)分子生物學(xué)方法改變細(xì)胞遺傳特征或細(xì)胞生物學(xué)方法改造的細(xì)胞(如基因重組、轉(zhuǎn)基因、細(xì)胞融合、體外培養(yǎng)的細(xì)胞系等)。
10.權(quán)利要求4中的“人工處理”進(jìn)一步解釋為包括經(jīng)化學(xué)、生物和物理方法處理的無(wú)生物活性的靶細(xì)胞(如化學(xué)試劑固定、物理冷凍干燥等)。
11.權(quán)利要求2中，靶抗原成份解釋為任何能與CFAbs結(jié)合的生物抗原成份；尤其是指以固相形式存在的抗原。例通過(guò)化學(xué)方法連接或直接通過(guò)物理吸附包被在固相顆粒表面的多種HLA成分或其它抗原成分等。
12.權(quán)利要求2中的靶抗原成分進(jìn)一步解釋為通過(guò)化學(xué)、生物物理方法合成、生物合成、分子生物學(xué)方法重組、修飾或經(jīng)純化天然存在的任何生物抗原成分及其多肽、多肽片段、蛋白分子等。
13.權(quán)利要求2中的標(biāo)記抗體解釋為抗CDC效應(yīng)過(guò)程中所有參與成分(如抗HLA抗體、補(bǔ)體及其復(fù)合物、各種因子、受體等)的抗體；以及特異性抗靶細(xì)胞抗體和抗固相顆粒表面HLA靶抗原的抗體。
14.權(quán)利要求2中標(biāo)記抗體或標(biāo)記配體的標(biāo)記解釋為能被相應(yīng)儀器所測(cè)定的任何酶學(xué)顯色反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、生物發(fā)光反應(yīng)、時(shí)間延遲發(fā)光反應(yīng)、電致發(fā)光反應(yīng)、多種熒光物質(zhì)以及放射性同位素標(biāo)記等。
15.權(quán)利要求2中的細(xì)胞表面特性蛋白解釋為任何能夠反映該類細(xì)胞特性的蛋白成分如細(xì)胞表面的各種受體和抗原成分(如血型抗原ABO系統(tǒng)等)、淋巴細(xì)胞表面抗原、白細(xì)胞表面抗原、各種CD抗原、HLA抗原等。
16.權(quán)利要求2中的靶抗原、配體以及抗體成分進(jìn)一步解釋為以液相形式或固相形式存在于反應(yīng)系統(tǒng)之中如配體或抗體通過(guò)直接(或間接)物理吸附或化學(xué)連接到固相材料上；如微孔板、膜、固相顆粒等任何有形材料。
17.權(quán)利要求2中的標(biāo)記配體進(jìn)一步解釋為C1(C1q、C1r、C1s、)、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9；C1qrs、C1qrs、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a、C4b、C4b2、iC3b、C4b2b、C4b2b3b、C3bBb、C3bnBb、C5a、C5b、C5b67、C5b∽8、C5b∽9；C1-抑制因子、C4-結(jié)合蛋白、D因子、B因子、P因子(備解素)、I-因子、H-因子、S-蛋白；Ba、Bb、MBP、MCP、DAF(CD55)、CR1、CR2、CR3、CR4、CR5、C3aR、C2aR、C4aR、C1qR、CD59等。
18.權(quán)利要求2中的標(biāo)記配體來(lái)源解釋為人源性、動(dòng)物源性以及天然存在的經(jīng)純化或未經(jīng)純化的或通過(guò)化學(xué)合成、分子生物學(xué)方法獲得的各種直接或間接參與CDC反應(yīng)的各種成分。
19.權(quán)利要求2中的標(biāo)記抗體解釋為任何來(lái)源的單克隆和多克隆抗體的完整分子及其片段，包括人源性、動(dòng)物源性、植物源性或通過(guò)基因工程方法獲得的完整抗體分子、嵌合抗體分子(Chimeric Abs)、單鏈抗體分子及其片段如F(ab’)2、Fab、Fv、Facb、F(abc’)2、ScFv等。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)免疫學(xué)中補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(Complement－dependent Cytotoxcity，CDC)反應(yīng)原理，建立了一種測(cè)定HLA補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性抗體(Complement Fixing Antibodies；CFAbs)測(cè)定的體外酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法及試劑盒。該反應(yīng)系統(tǒng)由固相的HLA抗原或具有HLA抗原的靶細(xì)胞以及液相酶標(biāo)配體組成。受檢樣品中的CFAbs與固相HLA抗原或靶細(xì)胞的HLA抗原結(jié)合并同時(shí)固定存在于反應(yīng)系統(tǒng)中的酶標(biāo)記補(bǔ)體或以酶標(biāo)抗補(bǔ)體抗體與固定于HLA抗原－CFAbs復(fù)合物中的補(bǔ)體結(jié)合，然后加入相應(yīng)的酶底物產(chǎn)生酶學(xué)顯色反應(yīng)；由于該顯色信號(hào)的強(qiáng)度與樣品中的CFAbs濃度呈正比關(guān)系，因此通過(guò)測(cè)定這種酶學(xué)顯色的光密度吸光值(Optical Density；OD)即可達(dá)到對(duì)樣品CFAbs有無(wú)及其相對(duì)含量的測(cè)量。在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的反應(yīng)系統(tǒng)中，引入針對(duì)細(xì)胞表面特征性標(biāo)記(如CD等)的抗體，用以識(shí)別分離特定細(xì)胞群體，可實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)生在該細(xì)胞群體CDC效應(yīng)的特異性測(cè)量。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1444044SQ0212407
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2002年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月18日
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