專利名稱：一種免疫層析一步法檢測β－腎上腺素激動劑類藥物的方法及試紙的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，公開了一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑(簡稱β-興奮劑類藥)的方法及試紙的制備。
目前，測定β-興奮劑類藥的方法有高效液相色譜-質譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和放射免疫測定法(RIA)等。目前免疫測定法ELISA和GC-MS的靈敏度能較好地滿足β-興奮劑類藥殘留分析要求，應用較多，檢測限通常低于0.5ug/kg，前者是主要的篩選方法，后者則是成熟的確證方法。由于以上方法均需借助高檔的儀器和設備，成本高，同時對操作人員需要特殊培訓，實驗結果無法立即顯示。因此不適合于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對懷疑對象的在線檢測和監(jiān)控。
β-興奮劑類藥的免疫測定法和普通的理化檢測法相比有許多優(yōu)勢。(1)免疫反應有很好的特異性。選擇抗β-興奮劑類藥的特異性單克隆抗體，待檢β-興奮劑類藥和其它類型β-興奮劑類藥的交叉反應可以降低到10％以下。(2)β-興奮劑類藥的免疫測定有基團特異性。β-興奮劑類藥有特殊的共有基團，選擇抗β-興奮劑類藥的抗共有基團的多克隆抗體或單克隆抗體，可以同時測定數(shù)種β-興奮劑類藥。如用抗沙丁胺醇抗體RIA對克倫特羅，馬布特羅，特布他林和塞曼特羅的交叉反應分別為118％，78％，29％和11％。
免疫層析是出現(xiàn)于80年代初期的一種獨特的免疫分析方式，它往往以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶)，通過酶反應或直接運用可目測的標記物(如膠體金)而得到直觀的實驗現(xiàn)象(如顯色)。而游離標記物則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。
免疫層析技術運用最成功的標記物為膠體金，膠體金是指分散相粒子直徑在1-150nm的金溶膠，屬于多相不均一體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。膠體金技術是一種新興技術，與傳統(tǒng)的放免技術，熒光免疫技術和酶免疫技術相比有許多獨特的優(yōu)點。①結果直觀，利用肉眼可見的紅色，在不需要任何儀器的情況下對抗原進行檢測，方便基層單位和現(xiàn)場使用。②靈敏度高，達到和ELISA相似的靈敏度，如果加入增敏試劑檢測靈敏度可超過ELISA1-2個數(shù)量級。③速度快，檢測時間一般為3-10分鐘。
由于膠體金免疫層析技術獨特的優(yōu)點，目前已廣泛應用于臨床醫(yī)療檢測中。近年來由于制備技術的改進和試劑原料質量的提高，該技術的應用范圍又得到了進一步拓寬。國內外現(xiàn)有的商品供應及文獻報道的檢測項目主要包括以下方面違禁藥物檢測(苯丙胺、可卡因、大麻、嗎啡、海洛因等)、傳染病病原檢測(梅毒螺旋體、淋球菌、泌尿生殖系沙眼衣原體、幽門螺桿菌等)、激素檢測、寄生蟲、腫瘤標記物、心血管病檢測標志物等。膠體金免疫層析技術用于食品安全領域β-興奮劑類藥的檢測未見報道。
本發(fā)明用膠體金免疫層析技術檢測β-興奮劑類藥。和其它β-興奮劑類藥檢測方法比較，有簡單、快速、單份測定、除商品試劑外不需任何儀器設備的優(yōu)點，特別適合畜禽違禁β-興奮劑類藥的快速篩查。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的采取的方案本發(fā)明實現(xiàn)免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法及試紙的制備包括如下步驟1.待檢樣品的處理；2.硝酸纖維素膜的制備制備β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物。選擇β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物的一種或組合，在硝酸纖維素膜的相應部位線狀點樣作為檢測線。選擇膠體金標記抗體的抗抗體，在硝酸纖維素膜的相應部位線狀點樣作為質控線。
3.膠體金結合物墊的制備選擇和第2項之與β-興奮劑類藥對應的抗β-興奮劑類藥抗體的一種或組合，標記膠體金顆粒，分散在玻璃纖維紙上，作為膠體金結合物墊。
4.試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有抗β-興奮劑類藥抗體的一種或組合的膠體金結合物墊；③在襯墊上加上有β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物的一種或組合線狀點樣作為檢測線，有膠體金標記抗體的抗抗體線狀點樣作為質控線的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
方案可細分為四部分1.待檢樣品的處理；2.硝酸纖維素膜的制備；3.膠體金結合物墊的制備；4.試紙條的組裝。
1.待檢樣品的處理1)尿樣普查無需樣品準備取適量尿樣直接進行試驗(尿樣混濁時建議離心或過濾)。
2)低脂肪含量的肝、肉、組織取絞碎的樣品5g，加入5mM Hcl 25ml搖動作用1.5h使其充分勻漿；取6g勻漿(相當于1.0肝)于離心管中；取上清液置另一離心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分鐘；加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混勻，置4℃中至少1.5小時或過夜處理。4000g離心1分鐘或10-15℃高速離心，取上清液(幾乎清亮)，平衡至室溫。
3)高脂肪肉類組織取絞碎樣品5克加入PH8.5，50mM Tris緩沖液25ml，振蕩作用0.5小時使其充分勻漿；加入15ml正庚烷，振動5分鐘；4000g或10-15℃高速離心5分鐘；用滅菌吸管移去上層庚烷液和中層脂肪液；用15ml正庚烷重復提取一次；于水溶性肉勻漿中加入0.5ml HCl，振蕩1小時；取6克肉勻漿(相當于1.0g肉或組織)上清液置另一離心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分鐘；加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混勻，置4℃中至少1.5小時或過夜處理。4000g離心1分鐘或10-15℃高速離心，取上清液(幾乎清亮)，平衡至室溫。
4)飼料樣品處理方法用乳缽研碎飼料樣品，稱2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉移出上清液并加入2ml1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。2000rpm離心20分鐘，轉移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用進行檢測。
2.硝酸纖維素膜的制備(1)制備β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物。
1)克倫特羅-載體蛋白復合物制備將5mg鹽酸克倫特羅溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應10min，加入20mg牛甲狀腺蛋白(預先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應的克倫特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)塞曼特羅，馬布特羅，馬賁特羅-載體蛋白復合物制備同上。
3)沙丁胺醇-載體蛋白復合物制備取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游離堿溶于10ml甲醇，蒸去溶劑，將殘留物溶于16ml乙醇，攪拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，離心，用乙醇將沉淀物洗滌3次，干燥。將40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六環(huán)-水-三乙胺(25+3+0.3)，攪拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸異丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸餾水中，4℃過夜，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)透析凍存?zhèn)溆谩?br> 4)特布他林-載體蛋白復合物制備同上。
(2)選擇β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物的一種或組合，如下1)克倫特羅-載體蛋白復合物；2)塞曼特羅-載體蛋白復合物；3)馬布特羅-載體蛋白復合物；4)馬賁特羅-載體蛋白復合物；5)沙丁胺醇-載體蛋白復合物；6)特布他林-載體蛋白復合物；7)克倫特羅-載體蛋白復合物與沙丁胺醇-載體蛋白復合物組合；8)克倫特羅-載體蛋白復合物與馬布特羅-載體蛋白復合物組合；9)克倫特羅-載體蛋白復合物，沙丁胺醇-載體蛋白復合物與馬布特羅-載體蛋白復合物組合；10)克倫特羅-載體蛋白復合物，塞曼特羅-載體蛋白復合物，馬布特羅-載體蛋白復合物與馬賁特羅-載體蛋白復合物組合；11)沙丁胺醇-載體蛋白復合物與特布他林-載體蛋白復合物組合；12)克倫特羅-載體蛋白復合物，沙丁胺醇-載體蛋白復合物與特布他林-載體蛋白復合物組合。
(3)檢測線和質控線的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調整為0.01-0.3mg/ml的β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物的一種或組合溶液在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊4-16mm。然后在膜的頂端噴涂一條膠體金標記抗體的抗抗體作為質控線，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
3.膠體金結合物墊的制備(1)選擇和β-興奮劑類藥對應的抗β-興奮劑類藥抗體的一種或組合選擇的抗β-興奮劑類藥抗體組合如下，抗β-興奮劑類藥抗體可以選擇單克隆抗體，也可選擇多克隆抗體1)抗克倫特羅抗體；2)抗塞曼特羅抗體；3)抗馬布特羅抗體；4)抗馬賁特羅抗體；5)抗沙丁胺醇抗體；6)抗特布他林抗體；7)抗克倫特羅抗體與抗沙丁胺醇抗體組合；8)抗克倫特羅抗體與抗馬布特羅抗體組合；9)抗克倫特羅抗體，抗沙丁胺醇抗體與抗馬布特羅抗體組合；10)抗克倫特羅抗體，抗塞曼特羅抗體，抗馬布特羅抗體與抗馬賁特羅抗體組合；11)抗沙丁胺醇抗體與抗特布他林抗體組合；12)抗克倫特羅，抗沙丁胺醇與抗特布他林組合。
(2)抗β-興奮劑類藥抗體標記膠體金顆粒1)膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入1-20ml 1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測定為10-80nm；2)抗β-興奮劑類藥抗體標記膠體金顆粒取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和抗β-興奮劑類藥抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。
(3)膠體金結合物墊制備將標記膠體金顆粒的抗β-興奮劑類藥抗體按比例混合分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
4.試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有抗β-興奮劑類藥抗體的一種或組合的膠體金結合物墊；③在襯墊上加上有β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物的一種或組合線狀點樣作為檢測線，有膠體金標記抗體的抗抗體線狀點樣作為質控線的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
本發(fā)明的優(yōu)點及應用范圍簡單，快速，單份測定，除商品試劑外不需任何儀器設備，成本低，幾分鐘即可用肉眼觀察結果，既可檢測一種β-興奮劑類藥又可同時檢測數(shù)種β-興奮劑類藥的總量。用于β-興奮劑類藥的快速篩查，方便在基層單位的使用推廣。
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，主要用于飼料，奶品，肉品，血漿，尿液中β-興奮劑類藥的快速篩查。本發(fā)明的試紙條的使用單位主要為食品安全檢測的執(zhí)法部門，奶品、肉品生產(chǎn)及消費個人或單位，海關等進出口部門，以及科研部門等。
檢測原理是這樣的在樣品墊2上滴加樣品，如果樣品中有β-興奮劑類藥8，則β-興奮劑類藥8經(jīng)層析作用移動到膠體金結合物墊3，和限量的抗β-興奮劑類藥抗體10結合，當移動到檢測線6時，無多余的膠體金9標記的抗β-興奮劑類藥抗體10和檢測線6上的β-興奮劑類藥8結合，檢測線6不顯色。膠體金9標記的抗β-興奮劑類藥抗體10繼續(xù)向前移動到質控線7，和質控線7上有抗β-興奮劑類藥抗體10的抗抗體11反應，質控線7顯紅色。若樣品中無β-興奮劑類藥8，則膠體金結合物墊3上的膠體金9標記的抗β-興奮劑類藥抗體10和檢測線6上的β-興奮劑類藥8結合，檢測線6顯紅色，質控線7同上顯紅色。
(1)待檢樣品的處理1)畜尿樣本處理取適量尿樣直接進行試驗(尿樣混濁時建議離心或過濾)。
2)飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進行檢測。
(2)硝酸纖維素膜的制備克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復合物制備將5mg鹽酸克倫特羅溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應10min，加入20mg牛甲狀腺蛋白(預先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應的克倫特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 檢測線和質控線的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調整為0.01-0.04mg/ml的克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復合物溶液在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質控線，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)膠體金結合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和鼠源性抗克倫特羅單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。將標記膠體金顆粒的抗克倫特羅抗體分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有膠體金標記抗克倫特羅抗體的膠體金結合物墊；③在襯墊上加上有克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復合物線狀點樣作為檢測線，有抗小鼠IgG抗體線狀點樣作為質控線的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
(5)檢測畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，尿樣克倫特羅濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，飼料提取液克倫特羅濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
實施例二沙丁胺醇免疫層析試紙的制備并用于檢測畜尿和飼料樣本本實施例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測畜尿和飼料樣本。
(1)待檢樣品的處理1)畜尿樣本處理取適量尿樣直接進行試驗(尿樣混濁時建議離心或過濾)。
2)飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進行檢測。
(2)硝酸纖維素膜的制備沙丁胺醇-BSA復合物制備取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游離堿溶于10ml甲醇，蒸去溶劑，將殘留物溶于16ml乙醇，攪拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，離心，用乙醇將沉淀物洗滌3次，干燥。將40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六環(huán)-水-三乙胺(25+3+0.3)，攪拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸異丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸餾水中，4℃過夜，經(jīng)PBS透析凍存?zhèn)溆谩?br> 檢測線和質控線的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調整為0.01-0.04mg/ml的沙丁胺醇-BSA復合物溶液在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質控線，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)膠體金結合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和鼠源性抗沙丁胺醇單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。將標記膠體金顆粒的抗沙丁胺醇抗體分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有膠體金標記抗沙丁胺醇抗體的膠體金結合物墊；③在襯墊上加上有沙丁胺醇-BSA復合物線狀點樣作為檢測線，有抗小鼠IgG抗體線狀點樣作為質控線的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
(5)檢測畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，尿樣沙丁胺醇濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，飼料提取液沙丁胺醇濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
實施例三馬布特羅免疫層析試紙的制備并用于檢測畜尿和飼料樣本本實施例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測畜尿和飼料樣本。
(1)待檢樣品的處理畜尿樣本處理取適量尿樣直接進行試驗(尿樣混濁時建議離心或過濾)。
飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進行檢測。
(2)硝酸纖維素膜的制備馬布特羅-BSA復合物制備將5mg馬布特羅溶于0.5ml0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應10min，加入20mgBSA(預先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應的馬布特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 檢測線和質控線的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調整為0.01-0.04mg/ml的馬布特羅-BSA復合物溶液在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質控線，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)膠體金結合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和鼠源性抗馬布特羅單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。將標記膠體金顆粒的抗馬布特羅抗體分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有膠體金標記抗馬布特羅抗體的膠體金結合物墊；③在襯墊上加上有馬布特羅-BSA復合物線狀點樣作為檢測線，有抗小鼠IgG抗體線狀點樣作為質控線的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
(5)檢測畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，尿樣馬布特羅濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，飼料提取液馬布特羅濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
實施例四克倫特羅和沙丁胺醇免疫層析試紙的制備并用于檢測畜尿和飼料樣本本實施例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測畜尿和飼料樣本。
(1)待檢樣品的處理1)畜尿樣本處理取適量尿樣直接進行試驗(尿樣混濁時建議離心或過濾)。
2)飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進行檢測。
(2)硝酸纖維素膜的制備克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復合物制備將5mg鹽酸克倫特羅溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應10min，加入20mg牛甲狀腺蛋白(預先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應的克倫特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 沙丁胺醇-BSA復合物制備取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游離堿溶于10ml甲醇，蒸去溶劑，將殘留物溶于16ml乙醇，攪拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，離心，用乙醇將沉淀物洗滌3次，干燥。將40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六環(huán)-水-三乙胺(25+3+0.3)，攪拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸異丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸餾水中，4℃過夜，經(jīng)PBS透析凍存?zhèn)溆谩?br> 檢測線和質控線的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調整為0.02-0.08mg/ml的克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復合物和沙丁胺醇-BSA復合物按溶液2∶1混合在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質控線，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)膠體金結合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和抗克倫特羅羊多克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。同上法，用膠體金標記抗沙丁胺醇羊多克隆抗體。按2∶1混合膠體金標記的抗克倫特羅羊多克隆抗體和抗沙丁胺醇羊多克隆抗體。將混合物分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝按附

圖1在襯墊上加上樣品墊，膠體金結合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊部件，組裝為檢測試紙條。
(5)檢測畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，尿樣克倫特羅和沙丁胺醇等β-興奮劑類藥濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，飼料提取液克倫特羅和沙丁胺醇等β-興奮劑類藥濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
實施例五克倫特羅，沙丁胺醇與馬布特羅免疫層析試紙的制備并用于檢測畜尿和飼料樣本本實施例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測畜尿和飼料樣本。
(1)待檢樣品的處理1)畜尿樣本處理取適量尿樣直接進行試驗(尿樣混濁時建議離心或過濾)。
2)飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進行檢測。
(2)硝酸纖維素膜的制備克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復合物制備將5mg鹽酸克倫特羅溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應10min，加入20mg牛甲狀腺蛋白(預先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應的克倫特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 沙丁胺醇-BSA復合物制備取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游離堿溶于10ml甲醇，蒸去溶劑，將殘留物溶于16ml乙醇，攪拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，離心，用乙醇將沉淀物洗滌3次，干燥。將40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六環(huán)-水-三乙胺(25+3+0.3)，攪拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸異丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸餾水中，4℃過夜，經(jīng)PBS透析凍存?zhèn)溆谩?br> 馬布特羅-BSA復合物制備將5mg馬布特羅溶于0.5ml0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應10min，加入20mgBSA(預先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應的馬布特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 檢測線和質控線的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調整為0.03-0.12mg/ml的克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復合物，沙丁胺醇-BSA復合物和馬布特羅-BSA復合物按溶液1∶1∶1混合在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質控線，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)膠體金結合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和抗克倫特羅羊多克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。同上法，用膠體金標記抗沙丁胺醇羊多克隆抗體和抗馬布特羅羊多克隆抗體。按1∶1∶1混合膠體金標記的抗克倫特羅羊多克隆抗體，抗沙丁胺醇羊多克隆抗體和抗馬布特羅羊多克隆抗體。將混合物分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝按附圖1在襯墊上加上樣品墊，膠體金結合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊部件，組裝為檢測試紙條。
(5)檢測畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，尿樣克倫特羅，沙丁胺醇和馬布特羅等β-興奮劑類藥濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質控線顯色說明檢測有效，檢測線不顯色說明結果為陽性，飼料提取液克倫特羅，沙丁胺醇和馬布特羅等β-興奮劑類藥濃度超過5ng/ml，反之為陰性。
權利要求
1.一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法，包括如下步驟(1)待檢樣品的處理，(2)硝酸纖維素膜的制備，(3)膠體金結合物墊的制備，(4)組裝試紙條；其特征是所述的硝酸纖維素膜制備，包括如下步驟(1)制備β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物；(2)選擇β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物的一種或組合；(3)檢測線和質控線的制備。
2.根據(jù)權利要求書1所述的一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法，其特征是所述的選擇β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物的一種或組合，如下1)克倫特羅-載體蛋白復合物；2)塞曼特羅-載體蛋白復合物；3)馬布特羅-載體蛋白復合物；4)馬賁特羅-載體蛋白復合物；5)沙丁胺醇-載體蛋白復合物；6)特布他林-載體蛋白復合物；7)克倫特羅-載體蛋白復合物與沙丁胺醇-載體蛋白復合物組合；8)克倫特羅-載體蛋白復合物與馬布特羅-載體蛋白復合物組合；9)克倫特羅-載體蛋白復合物，沙丁胺醇-載體蛋白復合物與馬布特羅-載體蛋白復合物組合；10)克倫特羅-載體蛋白復合物，塞曼特羅-載體蛋白復合物，馬布特羅-載體蛋白復合物與馬賁特羅-載體蛋白復合物組合；11)沙丁胺醇-載體蛋白復合物與特布他林-載體蛋白復合物組合；12)克倫特羅-載體蛋白復合物，沙丁胺醇-載體蛋白復合物與特布他林-載體蛋白復合物組合。
3.根據(jù)權利要求書1所述的一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法，其特征是所述的檢測線和質控線是這樣制備的將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調整為0.01-0.3mg/ml的β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物的一種或組合溶液在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊4-16mm；然后在膜的頂端噴涂一條膠體金標記抗體的抗抗體條帶作為質控線，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
4.根據(jù)權利要求書1所述的一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法，其特征是所述的膠體金結合物墊的制備，包括如下步驟(1)選擇和β-興奮劑類藥對應的抗β-興奮劑類藥抗體的一種或組合；(2)抗β-興奮劑類藥抗體標記膠體金顆粒；(3)膠體金結合物墊制備。
5.根據(jù)權利要求書4所述的一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法，其特征是所述的選擇和β-興奮劑類藥對應的抗β-興奮劑類藥抗體的一種或組合，組合是這樣的1)抗克倫特羅抗體；2)抗塞曼特羅抗體；3)抗馬布特羅抗體；4)抗馬賁特羅抗體；5)抗沙丁胺醇抗體；6)抗特布他林抗體；7)抗克倫特羅抗體與抗沙丁胺醇抗體組合；8)抗克倫特羅抗體與抗馬布特羅抗體組合；9)抗克倫特羅抗體，抗沙丁胺醇抗體與抗馬布特羅抗體組合；10)抗克倫特羅抗體，抗塞曼特羅抗體，抗馬布特羅抗體與抗馬賁特羅抗體組合；11)抗沙丁胺醇抗體與抗特布他林抗體組合；12)抗克倫特羅，抗沙丁胺醇與抗特布他林組合。
6.根據(jù)權利要求書4所述的一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法，其特征是所述的選擇和β-興奮劑類藥對應的抗β-興奮劑類藥抗體的一種或組合，抗體是指抗克倫特羅抗體，抗塞曼特羅抗體，抗沙丁胺醇抗體，抗馬布特羅抗體，抗馬賁特羅抗體和抗特布他林抗體其中的一種或其組合，抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
7.根據(jù)權利要求書4所述的一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法，其特征是所述的抗β-興奮劑類藥抗體標記膠體金顆粒，步驟如下1)膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入1-20ml 1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測定為10-80nm；2)抗β-興奮劑類藥抗體標記膠體金顆粒取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和抗β-興奮劑類藥抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％；將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。
8.根據(jù)權利要求書1所述的一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法，其特征是所述的組裝試紙條，步驟如下①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有抗β-興奮劑類藥抗體的一種或組合的膠體金結合物墊；③在襯墊上加上有β-興奮劑類藥-載體蛋白復合物的一種或組合線狀點樣作為檢測線，有抗膠體金標記抗體的抗抗體線狀點樣作為質控線的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，是一種免疫層析一步法檢測β－腎上腺素激動劑(簡稱β－興奮劑類藥)的方法及試紙的制備，β－興奮劑類藥為克倫特羅，塞曼特羅，沙丁胺醇，馬布特羅，馬賁特羅和特布他林其中的一種或其組合。試紙制作步驟為(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結合物墊的制備；(4)組裝試紙條；樣品中的β－興奮劑類藥和膠體金結合物墊上的限量的膠體金標記抗β－興奮劑類藥抗體結合，多余的膠體金標記抗β－興奮劑類藥抗體再和硝酸纖維素膜上的β－興奮劑類藥反應，達到簡便、快速、單份篩查β－興奮劑類藥的一種或多種之目的。主要用于飼料、奶品、肉類、血漿、尿液中β－興奮劑類藥的快速篩選。
文檔編號G01N33/531GK1402004SQ0213132
公開日2003年3月12日 申請日期2002年9月27日 優(yōu)先權日2002年9月27日
發(fā)明者陳高明 申請人:江西中德生物工程有限公司