專利名稱：一種快速檢測生物樣品中β的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物樣品中β2-受體興奮劑的快速檢測方法，特別是克侖特羅的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
β2-腎上腺素受體興奮劑(以下簡稱β2-受體興奮劑)是一類人工合成的藥物，可選擇性地作用于β2-腎上腺素受體，在治療劑量下有強(qiáng)而持久地松弛支氣管平滑肌的作用，臨床上用于防治支氣管哮喘型慢性支氣管炎、肺氣腫等呼吸系統(tǒng)疾病所致的支氣管痙攣。當(dāng)作為飼料添加劑的一種成份大劑量用于家畜飼養(yǎng)時，可使家畜體內(nèi)能量從脂肪組織向肌肉組織轉(zhuǎn)移，促進(jìn)家畜肌肉組織蛋白質(zhì)的合成，加速脂肪的轉(zhuǎn)化和分解，使家畜生長速度加快，瘦肉相對增加，但其在家畜內(nèi)臟及肌肉組織中的殘留可嚴(yán)重危害人類健康，過量攝入人體可引起交感神經(jīng)興奮，出現(xiàn)肌肉震顫，心慌，頭昏，頭痛，嘔吐等中毒癥狀，對高血壓、心臟病等疾病患者甚至可導(dǎo)致死亡(Gas chromatography-mass spectrometry analysis of β2-agoinst in bovine retina，Anal.Chim.Acta.，2000，408285-290)。
克侖特羅(化學(xué)名為羥甲叔丁基腎上腺素)是最常使用的β2-受體興奮劑之一。一般來說，飼料中添加適量克倫特羅后，可使畜禽生長速率、飼料轉(zhuǎn)化率、胴體瘦肉率提高10％以上，所以又將其稱為″瘦肉精″?？藖鎏亓_進(jìn)入人體后分布快、代謝緩慢，易引起中毒。
1990年西班牙發(fā)生了第1例克侖特羅中毒的報道，患者是在食用含有克侖特羅的動物肝臟后出現(xiàn)肌肉震顫、心動過速、心悸、眩暈等癥狀，持續(xù)時間平均為40小時。于是國際上頒布法規(guī)禁止將β2-受體興奮劑作為生長促進(jìn)劑使用，世界衛(wèi)生組織也規(guī)定了農(nóng)畜產(chǎn)品中克侖特羅的最高殘留限量為1μg/l(maximum residual level，MRL)。1998年5月，香港居民因食用內(nèi)地供應(yīng)的豬內(nèi)臟，造成17人中毒的“瘦肉精”中毒事件。我國農(nóng)業(yè)部發(fā)文“嚴(yán)禁生產(chǎn)和使用β-興奮劑類產(chǎn)品和未經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的獸藥及飼料藥物添加劑”，并于1999年發(fā)布《中華人民共和國動物及動物源食品中殘留物質(zhì)監(jiān)控計(jì)劃》明令禁止在家畜飼養(yǎng)中使用β2-受體興奮劑。但由于缺乏快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測畜產(chǎn)品中β2-受體興奮劑殘留量的方法和標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上給查禁工作帶來困難，中毒事件仍時有發(fā)生。最近，廣東、浙江發(fā)生的數(shù)起“毒豬肉”中毒事件就是因?yàn)槭秤昧撕笆萑饩钡呢i肉或豬內(nèi)臟所致。因此如何快速、準(zhǔn)確地測定克侖特羅在食品中殘留水平成為我國食品衛(wèi)生部門、檢驗(yàn)檢疫部門所關(guān)注的問題。
目前已有的檢測β2-受體興奮劑的方法包括酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜/質(zhì)譜法(GC/MS)。其中酶聯(lián)免疫分析法速度快、靈敏度高(檢出限可達(dá)0.1μg/l)，但由于存在較高的假陽性率，只能用作篩選方法[參見“酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測克侖特羅時假陽性問題的探討”一文，載于《檢驗(yàn)檢疫科學(xué)》，2000，10(1)41-43]；高效液相色譜法準(zhǔn)確性較好，但靈敏度較低(檢出限僅為1mg/l)，限制了該法在實(shí)際檢測中的應(yīng)用[參見“家畜及飼料中克侖特羅等β-興奮劑的檢測與確證技術(shù)的近況”一文，載于《現(xiàn)代商檢科技》，1998，8(5)52-56]；目前多采用GC/MS法作為確證方法，但該法采用固相萃取(SPE)對樣品進(jìn)行前處理，操作過程繁瑣，需要大量有機(jī)溶劑[參見Determinationof clenbuterol in bovine urine using gas chromatography-mass spectrometry followingclean-up on an ion-eschange resin，1999，72867-73]?，F(xiàn)有檢測方法的局限性和不足，在一定程度上限制了對包括克侖特羅在內(nèi)的β2-受體興奮劑的有效監(jiān)測。因此，尋找一種速度快、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、假陽性率低、操作簡單、有機(jī)溶劑消耗少的檢測β2-受體興奮劑的新方法，是該領(lǐng)域當(dāng)前所共同面臨的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法及其在鹽酸克侖特羅檢測中的應(yīng)用，使其具有速度快、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、假陽性率低、操作簡單、有機(jī)溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，以克服現(xiàn)有檢測方法的不足。
本發(fā)明提供的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法依次包括以下步驟a.將待檢測的生物樣品經(jīng)葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶酶解，使其中所含結(jié)合狀態(tài)的β2-受體興奮劑變?yōu)橛坞x態(tài)；b.以固相微萃取方法對樣品中的β2-受體興奮劑進(jìn)行萃取；c.將萃取后的固相微萃取纖維立即進(jìn)行衍生化反應(yīng)；d.將吸附了待測物后經(jīng)衍生化反應(yīng)的固相微萃取纖維插入氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)進(jìn)樣器中解析，質(zhì)譜采用電子轟擊(Electron Impact Ion Source，EI)電離方式；采用選擇離子檢測方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面積定量，用SIM所得峰面積對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品中β2-受體興奮劑的濃度。
本發(fā)明快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑方法的具體實(shí)施方法是1.酶解，即步驟a
生物樣品需要經(jīng)葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶的酶解，因攝入生物體內(nèi)的β2-受體興奮劑部分會與葡萄糖醛酸或硫酸根結(jié)合以結(jié)合物的形式存在，親水性強(qiáng)，不能被SPME纖維有效地萃取，酶解使這部分結(jié)合狀態(tài)的β2-受體興奮劑變?yōu)橛坞x態(tài)，更易于被SPME纖維所吸附。尿樣需用乙酸調(diào)節(jié)pH值到5.2，加入β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶于37℃水浴中孵育1小時；組織樣(肝臟、肺、肌肉組織等)經(jīng)絞碎、勻漿后，用乙酸調(diào)節(jié)pH值到5.2，加入β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶于37℃水浴中孵育1小時，然后過濾。
2.萃取，即步驟b取8ml待測樣品(尿樣或組織樣濾液)于潔凈10ml萃取小瓶中(預(yù)先放入磁力攪拌子)，在攪拌(磁力攪拌子)狀態(tài)下直接用SPME裝置進(jìn)行萃取。通過試驗(yàn)(如正交試驗(yàn))確定溶液最佳pH值、最佳鹽濃度、最佳萃取溫度及最佳萃取時間，以獲得最大萃取量。萃取時間選擇萃取達(dá)到平衡的時間(即待測物在固相涂層/液相之間分配達(dá)到平衡狀態(tài)的時間)，如果平衡時間過長也可以選擇非平衡點(diǎn)萃取，但此時要獲得較好的重現(xiàn)性需控制萃取時間嚴(yán)格一致。pH值的選擇應(yīng)使待測物在溶液中呈中性分子形式，而非帶電荷的離子形式，這樣易于被SPME纖維吸附，β2-受體興奮劑多為堿性物質(zhì)，因而在堿性條件下多以中性分子形式存在，有較大萃取量。在溶液中加鹽(NaCl或Na2SO4)可提高溶液的離子強(qiáng)度，從而提高β2-受體興奮劑的固相涂層/液相分配系數(shù)，可增加萃取量。
3.衍生，即步驟cβ2-受體興奮劑的衍生多用硅烷化試劑，硅烷化試劑遇水會發(fā)生反應(yīng)，采用頂空氣相衍生化(Headspace Derivazation，HSD)方式可避免衍生劑與水溶液直接接觸，同時也避免了纖維與衍生劑液體的直接接觸，防止衍生劑對纖維涂層造成損害。萃取后的SPME纖維立即插入預(yù)先封有5μl衍生劑的小瓶(體積為2ml)中，將纖維暴露于衍生劑氣相頂空中，于60℃衍生反應(yīng)10min。衍生反應(yīng)時間和溫度需經(jīng)優(yōu)化，以使衍生反應(yīng)進(jìn)行完全。
4.解析測定，即步驟d將吸附了待測物的纖維插入GC/MS的進(jìn)樣器中，于270℃解析3min。解析溫度和解析時間需經(jīng)優(yōu)化，以使解析完全；離子化采用電子轟擊(Electron Impact Ion Source，EI)電離或化學(xué)離子化；采用選擇離子檢測方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面積定量，用SIM所得峰面積對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品中β2-受體興奮劑的濃度。
當(dāng)所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，其固相微萃取方法是使用帶有聚丙烯酸酯(PA)涂層纖維萃取頭的固相微萃取裝置，以直接法，即將纖維萃取頭直接插入樣品中進(jìn)行萃取；所說的衍生化反應(yīng)是以N，O-雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)為衍生劑，采用頂空衍生法進(jìn)行衍生化反應(yīng)；所說的選擇離子檢測方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。
本發(fā)明將衍生化固相微萃取(Solid phase microextraction，SPME)技術(shù)與氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用同時檢測一種或多種β2-受體興奮劑，其原理是利用待測物對活性固體表面(SPME纖維表面的涂層)有一定的吸附親和力，使其從樣品中分離，并富集于SPME纖維上；再將纖維置于衍生劑的氣相頂空中進(jìn)行衍生化反應(yīng)；最后于GC/MS系統(tǒng)中檢測。該方法克服原有方法假陽性率高、靈敏度低、前處理操作過程繁瑣，需要大量有機(jī)溶劑的缺點(diǎn)，可有效應(yīng)用于家畜尿樣及組織(如肝臟、腎臟、肌肉、視網(wǎng)膜等)樣品中β2-受體興奮劑殘留量的檢測，具有操作簡單、分析快速、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、所需有機(jī)溶劑少、經(jīng)濟(jì)、無毒害、無污染等優(yōu)點(diǎn)，可同時測定一種或多種β2-受體興奮劑。本方法還可用于法醫(yī)鑒定中人類尿樣、發(fā)樣中β2-受體興奮劑的分析及家畜尿樣及組織樣品中抗生素類藥物的分析。
本發(fā)明方法的樣品的萃取、衍生、進(jìn)樣過程全部在纖維上完成，操作簡單；單個樣品的分析時間小于2小時，檢測快速，克服原有GC/MS法操作繁瑣，檢測時間長的缺點(diǎn)；采用質(zhì)譜作檢測器，分析準(zhǔn)確度高，克服了ELISA法假陽性率高的缺點(diǎn)；且該方法有較高的靈敏度，檢出限可達(dá)0.25μg/l，克服了HPLC法靈敏度低的問題。
下面通過對本發(fā)明方法在檢測β2-受體興奮劑克侖特羅中的應(yīng)用，對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。


圖1為尿液中克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為實(shí)施例中1號樣品的SIM色譜圖及質(zhì)譜圖；圖3為實(shí)施例中2號樣品的SIM色譜圖及質(zhì)譜圖；圖4為實(shí)施例中3號樣品的SIM色譜圖及質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明方法在檢測豬尿樣品中鹽酸克侖特羅(俗稱“瘦肉精”)殘留量中的應(yīng)用。
取豬尿樣品三份，各10ml，用乙酸調(diào)節(jié)pH值到5.2，分別加入100μlβ-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶(30U/ml)，震蕩，于37℃水浴中孵育1小時。
再用pH值為9濃度為0.1M的硼酸緩沖溶液稀釋尿樣(按1∶3的比例)，稀釋的目的是防止加鹽后樣品產(chǎn)生渾濁，或者用過濾的方法除去渾濁。加入10.0g氯化鈉，使其濃度為0.25g/ml，取8ml到萃取瓶中(預(yù)先放入磁力攪拌子)，蓋上瓶塞，插入SPME裝置，推出纖維，于40℃攪拌狀態(tài)下萃取30min。SPME纖維選擇的是商用聚丙烯酸酯(PA)涂層纖維，涂層厚度為85μm(購自美國Supelco公司)。
萃取后的SPME纖維立即插入預(yù)先封有5μl衍生劑(N，O-雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺，BSTFA)的小瓶(體積為2ml)中，將纖維暴露于衍生劑氣相頂空中，于60℃衍生反應(yīng)10min。
將吸附了待測物的纖維插入GC/MS的進(jìn)樣器中，解析3min。GC/MS條件如下色譜柱DB-5MS，25m×0.25mm ID，0.25μm膜厚；載氣氦氣，恒定線速度40cm/s；進(jìn)樣口溫度270℃，無分流進(jìn)樣；柱溫程序初始溫度120℃，保持1min，然后以10℃/min的速度升溫，溫度升至280℃時保持1min；色譜-質(zhì)譜接口溫度270℃；離子源溫度200℃；電子能量70eV；溶劑延遲5min；質(zhì)譜采用電子轟擊(EI)電離方式；采用選擇離子檢測方式(SIM)，以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。見附圖2、3、4。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，取一定量經(jīng)檢測無克侖特羅的豬尿樣品，添加鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)，用乙酸調(diào)節(jié)pH值到5.2，按1ml尿樣加10μl酶溶液的比例分別加入適量β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶(30U/ml)，震蕩，于37℃水浴中孵育1小時，用pH值為9濃度為0.1M的硼酸緩沖溶液按1∶3稀釋，稀釋后克侖特羅濃度分別為2μg/l、5μg/l、20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l，加入適量氯化鈉，使其濃度為0.25g/ml。取8ml到萃取瓶中，按上述SPME方法進(jìn)行萃取、衍生、解析進(jìn)樣，按上述GC/MS條件進(jìn)行檢測，以峰面積對鹽酸克侖特羅濃度繪制工作曲線，如附圖1所示。
實(shí)際樣品定量時，用SIM所得峰面積對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出樣品中鹽酸克侖特羅的濃度。表1為上述3份樣品的測定結(jié)果，每份樣品平行測定三次取平均值。因尿樣經(jīng)過稀釋，其原始濃度為所測濃度的4倍。
表1 SPME-HSD-GC/MS檢測實(shí)際尿樣的結(jié)果樣品1 樣品2樣品31 2 3 1 2 3 1 2 3峰面積 101347 111138 116666 20163 22578 25113 86052 79183 96470C188.87 97 101.56 21.62 23.62 25.72 76.2 70.51 84.83C95.80 23.6577.18C2383.21 94.61308.72C1稀釋后尿樣中克侖特羅的濃度(μg/l)C稀釋后尿樣中克侖特羅的濃度均值(μg/l)C2原始尿樣中克侖特羅的濃度(μg/l)用傳統(tǒng)SPE-GC/MS方法測定此三份樣品，與SPME-HSD-GC/MS方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。經(jīng)t檢驗(yàn)，兩種檢測方法結(jié)果的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表2 兩種方法檢測實(shí)際尿樣中克侖特羅濃度的結(jié)果比較(單位μg/l)樣品號SPE-GC/MSSPME-HSD-GC/MS1390.67 383.21285.68 94.613330.52 308.72該方法在2μg/l～200μg/l范圍內(nèi)線性良好(r＝0.9982)，檢出限為0.25μg/l，方法的精密度良好RSD＜10％，加標(biāo)回收率在95％～107％之間。
本發(fā)明方法(SPME-HSD-GC/MS法)檢測一批樣品的時間只需2小時，較傳統(tǒng)的SPE-GC/MS法(5小時)大大節(jié)約時間；SPME-HSD-GC/MS法所需衍生劑的量很少(5μl)，而傳統(tǒng)的SPE-GC/MS法需100μl；采用質(zhì)譜作檢測器，保留了準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，且檢出限可達(dá)0.25μg/l，靈敏度高。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特征在于依次包括以下步驟a.將待檢測的生物樣品經(jīng)葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶酶解，使其中所含結(jié)合狀態(tài)的β2-受體興奮劑變?yōu)橛坞x態(tài)；b.以固相微萃取方法對樣品中的β2-受體興奮劑進(jìn)行萃取；c.將萃取后的固相微萃取纖維立即進(jìn)行衍生化反應(yīng)；d.將吸附了待測物后經(jīng)衍生化反應(yīng)的固相微萃取纖維插入氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)進(jìn)樣器中解析，離子化，采用選擇離子檢測方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面積定量，用SIM所得峰面積對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品中β2-受體興奮劑的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特征在于，當(dāng)所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的固相微萃取方法是使用帶有聚丙烯酸酯(PA)涂層纖維萃取頭的固相微萃取裝置，以直接法，即將纖維萃取頭直接插入樣品中進(jìn)行萃取。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特征在于，當(dāng)所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的衍生化反應(yīng)是以N，O-雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)為衍生劑，采用頂空氣相衍生化(Headspace Derivazation，HSD)方式進(jìn)行衍生化反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特征在于，當(dāng)所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的離子化是電子轟擊(Electron ImpactIon Source，EI)電離方式。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特征在于，當(dāng)所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的離子化采用的是電子轟擊(ElectronImpact Ion Source，EI)電離方式。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或5所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特征在于，當(dāng)所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的選擇離子檢測方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特征在于，當(dāng)所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的選擇離子檢測方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特征在于，當(dāng)所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的選擇離子檢測方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法在克侖特羅檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供的快速檢測生物樣品中β
文檔編號G01N30/06GK1487294SQ02139138
公開日2004年4月7日 申請日期2002年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月30日
發(fā)明者梁亞莉, 胡小鐘, 殷斌志, 嚴(yán)志剛, 余建新, 林雁飛, 劉紅衛(wèi) 申請人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院