專利名稱：一種羥基自由基的測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種羥基自由基的測定方法，具體的說就是利用異丙醇捕獲羥基自由基(·OH)生成丙酮的反應，然后采用氣相色譜/氫火焰離子化檢測器(GC/FID)法間接測定羥基自由基。
背景技術：
雖然國內外已建立了多種測定自由基的方法，但除少數幾種(如電子自旋共振能譜法、激光熒光光譜法和長光程吸收光譜法)可直接測定自由基外，大多數方法都屬于間接測定法。由于自由基的高度活潑性、濃度低和存在的壽命短，即使屬于直接測定方法，其干擾因素也不少，無論是定性還是定量，都有待于進一步提高其可靠性(徐向榮等，《生物化學與生物物理進展》，1999，26，67)。測定羥基自由基的間接法又稱清除劑法或捕獲劑法，即以各種簡單有機物作為PtOH自由基的捕獲劑與PtOH自由基發(fā)生反應，測定反應的產物，根據生成產物的量、速率推算PtOH自由基生成的量、速率。目前尚沒有統(tǒng)一的捕獲劑，一般研究所選擇的清除劑為苯、異丙醇、叔丁醇、苯甲酸等，生成的產物分別是苯酚、丙酮、叔丁基二醇和羥基苯甲酸，對這些產物的測定方法一般為發(fā)光光度法和液相色譜法；若用甲酸和二甲亞砜作清除劑，則產物為二氧化碳和甲烷氣，采用氣相色譜法測定。
在國外，自由基的測定主要是采用電子自旋共振法和液相色譜法；而國內受儀器條件和經費的限制，有相當一部分工作是用分光光度法來測定自由基。這種間接測定自由基的方法干擾大，影響準確度的因素非常多而復雜，有的方法所測得的物質是否是自由基反應的產物都還有待于確證。大氣化學中，常使用激光熒光光譜和長光程吸收光譜方法；在生命科學領域，電子自旋共振法仍屬于相對可靠的方法。但不普及而且價格昂貴。在化學、生物、環(huán)境科學等領域的自由基研究中，需要準確、簡單、價廉、易得的實用檢測方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種羥基自由基的測定方法，這種方法準確、簡單、價廉、易得。
本發(fā)明提供的技術方案是一種羥基自由基的測定方法，將捕獲劑異丙醇加入待測體系，使得其中含有異丙醇的濃度為體系中羥基自由基產生物濃度的10～100倍；在pH值為1～7，異丙醇與待測體系中的羥基自由基反應生成丙酮，采用氣相色譜/氫火焰離子化檢測器法測定生成的丙酮濃度，然后將測得的丙酮濃度換算成羥基自由基的濃度。
上述異丙醇與待測體系中的羥基自由基的反應溫度不超過80℃下。
上述氣相色譜以3～5％(聚乙二醇與載體的重量百分比)的聚乙二醇(PEG)為色譜固定液，聚乙二醇的分子量為6000～20000。
上述色譜固定液以硅藻土(Chromsob)為載體。
本發(fā)明利用捕獲劑和捕獲反應對活性自由基間接測定來研究自由基。異丙醇捕獲·OH生成丙酮的反應如下 根據自由基反應研究結果捕獲反應的效率為86.7％，因此 因此通過測定丙酮可以間接測定·OH的濃度。
本發(fā)明可檢測濃度范圍為0～580μmol/L的羥基自由基，檢測限可達0.5μmol/L(進樣量10μL)。結果與國外報道用液相色譜法測定的結果相一致(Hislop，K.A.and Bolton，T.R.，Environ.Sci.Technol.，1999，33，3119)，但分析時間大大縮短，僅需2min。
本發(fā)明首次利用這一捕獲反應，采用聚乙二醇為色譜固定液，GC/FID法，無需衍生化就能夠很好實現產物丙酮與捕獲劑異丙醇良好分離，快速測定生成的丙酮，實現羥基自由基的準確、簡單、價廉、快速的定量測定。
圖1為本發(fā)明的典型色譜分離效果圖；圖2和圖3為丙酮色譜分析的標準曲線圖；圖4為本發(fā)明測定的不同pH下Fe3+/草酸鹽配合物體系中羥基自由基的濃度關系圖；圖5為本發(fā)明測定的Fe3+/草酸鹽配比在9/30～90/600范圍的Fe3+/草酸鹽配合物體系中羥基自由基的濃度關系圖。
具體實施例方式
本發(fā)明測定羥基自由基的主要步驟如下1)將捕獲劑異丙醇加入待測體系，使得其中含有異丙醇的濃度為體系中羥基自由基產生物(來源)濃度的10～100倍；2)體系產生羥基自由基的方法可以多種多樣，如化學的、物理的和生物的，具體條件因具體體系而改變，但捕獲反應應控制體系pH值為1～7，溫度不超過80℃。3)清除反應完成后，用氣相色譜儀/氫火焰離子化檢測器法測定生成的丙酮濃度。氣相色譜條件如表1所列。
表1丙酮分析的氣相色譜條件參數 設置色譜柱2m不銹鋼填充柱3～5％PEG/ChromsobW(PEG分子量6000～20000)柱溫 80℃進樣口溫度150℃載氣 N242ml/min檢測器FID(氫火焰離子化檢測器)檢測器溫度150℃進樣體積 10μL丙酮和異丙醇的保留時間分別為0.94min和1.42min。典型的色譜分離圖如圖1所示。樣品定量分析采用外標法(即標準曲線法)。丙酮濃度范圍在0～20μmol/L時，A＝65+65.8×C；20～500μmol/L時，A＝900+95.9×C；其中A表示色譜峰面積，C表示丙酮濃度(μmol/L)。標準曲線如圖2和圖3所示。同一樣品進樣分析3次，峰面積誤差小于4.9％。
實施例對紫外光照射下含三價鐵離子(Fe3+)水溶液中·OH的生成進行測定。配制Fe3+/草酸鹽(Ox)配比為11.1/120.5μmol/L的水溶液，加入異丙醇使得其濃度為1mmol/L，調節(jié)溶液pH為3.0，將該溶液分裝入8支10ml比色管，放入光反應支架，進行光照。每隔10min取一支比色管，用GC/FID測定溶液中生成的丙酮。在表1所示的氣相色譜條件下(聚乙二醇分子量為20000)，利用圖2和圖3獲得的標準曲線對樣品中的丙酮進行定量分析。結果為光照80min后，·OH生成濃度為68.2μmol/L，絕對量為0.682μmol；若上述溶液中不加入草酸鹽，則·OH生成濃度僅為8.1μmol/L，絕對量為0.081μmol；而在不加光照或不加Fe3+條件下進行上述實驗，沒有檢測到·OH。
本發(fā)明實施可隨具體反應體系變化而改變，如上述實施例中體系為Fe3+/草酸鹽配合物體系，可在pH值為2～6，Fe3+/草酸鹽配比在9/30～90/600很寬范圍的條件下測定·OH，結果以·OH生成速率表示，如圖4和圖5所示。圖4是在pH值為2～6條件下測定Fe3+/草酸鹽配合物體系中的羥基自由基，當pH＝3.5時，體系中的羥基自由基產生速率最高，而較高的pH值不利于羥基自由基的生成；圖5是Fe3+/草酸鹽配比在9/30～90/600很寬范圍的條件下測定羥基自由基，從圖中可以看出Fe3+/草酸鹽配比高有利于體系中的羥基自由基產生速率提高，而過高的Fe3+/草酸鹽配比對于羥基自由基生成量的增加并不明顯。
權利要求
1.一種羥基自由基的測定方法，將捕獲劑異丙醇加入待測體系，使得其中含有異丙醇的濃度為體系中羥基自由基產生物濃度的10～100倍；在pH值為1～7，異丙醇與待測體系中的羥基自由基反應生成丙酮，采用氣相色譜/氫火焰離子化檢測器法測定生成的丙酮濃度，然后將測得的丙酮濃度換算成羥基自由基的濃度。
2.根據權利要求1所述的測定方法，其特征是異丙醇與待測體系中的羥基自由基的反應溫度不超過80℃下。
3.根據權利要求1或2所述的測定方法，其特征是氣相色譜以重量百分比3～5％的聚乙二醇為色譜固定液，聚乙二醇的分子量為6000～20000。
4.根據權利要求3所述的測定方法，其特征是色譜固定液以硅藻土為載體。
全文摘要
一種羥基自由基的測定方法，將捕獲劑異丙醇加入待測體系，使得其中含有異丙醇的濃度為體系中羥基自由基產生物濃度的10～100倍；在pH值為1～7，異丙醇與待測體系中的羥基自由基反應生成丙酮，采用氣相色譜/氫火焰離子化檢測器法測定生成的丙酮濃度，然后將測得的丙酮濃度換算成羥基自由基的濃度。本發(fā)明利用異丙醇捕獲羥基自由基生成丙酮的反應，然后采用氣相色譜/氫火焰離子化檢測器法間接測定羥基自由基。該方法可檢測濃度范圍為0～580μmol/L的羥基自由基，檢測限可達0.5μmol/L(進樣量10μL)；實現了羥基自由基準確、簡單、快速、高效、低成本的測定。
文檔編號G01N30/02GK1412553SQ0214775
公開日2003年4月23日 申請日期2002年11月28日 優(yōu)先權日2002年11月28日
發(fā)明者吳峰, 鄧南圣, 張琳, 鄧琳 申請人:武漢大學