專利名稱：溶血性尿毒綜合癥與出血性腸炎快速診斷試劑的制作方法
一.概述大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)俗稱大腸桿菌，寄居于正常人體及哺乳動(dòng)物的腸道，是人體的正常菌群，對(duì)人體無(wú)害，也廣泛存在于自然環(huán)境中。但有若干種大腸桿菌能引起人的疾病，統(tǒng)稱為病原性大腸桿菌(Pathogenic E.coli)，其中有一類能產(chǎn)生Vero細(xì)胞毒素，稱為產(chǎn)Vero細(xì)胞毒素大腸桿菌(Verocytoxin-producing E.coli，VTEC)。Vero細(xì)胞毒素是致病的主要毒性物質(zhì)，廣泛存在于許多血清型中，但O157:H7幾乎是唯一能引起出血性腸炎的VTEC，到目前為止也唯有O157:H7大腸桿菌能引起大規(guī)模的出血性腸炎爆發(fā)流行，因此將能產(chǎn)生Vero細(xì)胞毒素的大腸桿菌O157:H7稱為腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)。EHEC O157:H7引起的出血性腸炎常并發(fā)溶血性尿毒綜合癥(Hemolytic uremicsyndrome，HUS)，臨床上的主要表現(xiàn)為腎功能衰竭，嚴(yán)重威脅人的生命。
二.診斷現(xiàn)狀出血性腸炎根據(jù)臨床癥狀和體癥不易確診，大多數(shù)開(kāi)始癥狀并不嚴(yán)重，出血不多，容易誤診，特別是散發(fā)病例更易忽視。確診出血性腸炎主要依靠細(xì)菌學(xué)診斷，從腹瀉糞便中分離細(xì)菌。一旦分離到大腸桿菌O157:H7即可確診出血性腸炎，隨后發(fā)生的HUS的病因也可清楚。在大多數(shù)情況下，由于EHEC排菌期短，排菌量少以及其他技術(shù)條件的限制而沒(méi)有分離到病原菌，診斷不明確，目前臨床上尚沒(méi)有滿意的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。
三.發(fā)明的技術(shù)原理1.出血性腸炎病者血清中存在H7抗體大腸桿菌具有菌體(O)抗原，莢膜(K)抗原與鞭毛(H)抗原。O與K抗原均為多糖，免疫原性差，不易刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，而H抗原是蛋白質(zhì)，具有良好的免疫原性。根據(jù)作者的研究，H抗原引起抗體效價(jià)常是O，K抗原的20-160倍，在EHEC O157:H7感染引起出血性腸炎時(shí)，在O，K抗原尚未引起明顯抗體的情況下，H抗原即可產(chǎn)生與凝集原起可見(jiàn)反應(yīng)的H抗體。在病程早期病者血清中大腸桿菌H7抗體的出現(xiàn)為出血性腸炎的免疫學(xué)診斷指標(biāo)提供了可能。
2.H7抗原的特異性根據(jù)作者研究，大腸桿菌的鞭毛抗原十分特異，與其他腸桿菌科細(xì)菌沒(méi)有交叉，大腸桿菌有H1-H56的53個(gè)H抗原(標(biāo)準(zhǔn)中缺了三個(gè))，具有H7抗原的大腸桿菌占大腸桿菌的0.1％-0.2％，而引起出血性腸炎的大腸桿菌目前主要為O157:H7一個(gè)血清型。這就為病人血清中的H7抗體作為免疫學(xué)診斷指標(biāo)的特異性提供了依據(jù)。
3.H7抗原的凝集特性在具體測(cè)定方法(下述)中，使用了非O157的H7菌種作為診斷原，避免了血清中萬(wàn)一出現(xiàn)的O157抗體的干擾。另外使用的H7抗原，雖為全菌體，含有O、K抗原，應(yīng)用H7在50℃，2小時(shí)內(nèi)即發(fā)生凝集，而O，K抗原的凝集則需16小時(shí)以上，而予以區(qū)別；而且H凝集呈特殊的棉花團(tuán)樣絮狀，而有別于O，K抗原的顆粒樣或片狀凝集。H抗原的凝集特性為本發(fā)明的快速特異提供保證。
四.技術(shù)方法1.菌種選擇使用具有H7抗原的非O157菌種，常用為U5/41株，抗原式1:1:7；F8188/41株，抗原式19ab:？:7；14097株，抗原式153:-:7；和3219-54株，抗原式18ac:77(B21):7。
2.鞭毛抗原誘導(dǎo)主要增進(jìn)鞭毛發(fā)育，在0.15％-0.3％瓊脂U形管中誘導(dǎo)傳代各2代。
3.鞭毛H7抗原的制備三角瓶營(yíng)養(yǎng)肉水100ml在37℃孵箱放置過(guò)夜，次日將鞭毛誘導(dǎo)的U形管中的菌種接種于預(yù)熱的三角瓶營(yíng)養(yǎng)肉水中，37℃靜止培養(yǎng)6小時(shí)后，加入甲醛溶液使其最終濃度為0.5％，經(jīng)殺菌試驗(yàn)合格后即可使用。
4.H7抗原分裝H7抗原可盛于適宜直徑的透明的玻璃管狀容器內(nèi)，無(wú)菌分裝，每管0.9ml，蓋蓋或封口。透明塑料管輕，在水浴時(shí)易漂浮，如能固定亦可使用；圓底安瓿也可代用。最佳為長(zhǎng)7.5cm，外徑1.2cm的有蓋圓底玻璃管。
5.使用啟開(kāi)H7管(如為封口安瓿，啟開(kāi)口后可敞開(kāi)口使用)，加入病者疑視血清0.1ml，混勻，置50℃靜止水浴2小時(shí)，期間不能觸動(dòng)試管，影響凝集形成。因此建議在此期間不必提取試管觀察，2小時(shí)后輕輕取出，見(jiàn)有白色絮狀凝集，上部液體清澄，即為H7陽(yáng)性，可診斷HUS或出血性腸炎。如無(wú)凝集，液體仍為渾濁，即為陰性。如在出血性腸炎早期，陰性者可三天后再抽血重測(cè)一次。
腸出血性大腸桿菌O157:H7引起的人出血性腸炎常并發(fā)溶血性尿毒綜合癥，臨床上的主要表現(xiàn)為腎功能衰竭，嚴(yán)重威脅人的生命。目前臨床上尚沒(méi)有滿意的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。
本發(fā)明利用患有出血性腸炎時(shí)，機(jī)體對(duì)大腸桿菌的菌體抗原，莢膜抗原尚未引起明顯抗體的情況下，鞭毛(H)抗原即可產(chǎn)生與凝集原起可見(jiàn)反應(yīng)的H抗體。在病程早期病者血清中大腸桿菌H7抗體作為出血性腸炎的早期免疫學(xué)診斷指標(biāo)；也利用大腸桿菌的鞭毛抗原的特異性，與其他腸桿菌科細(xì)菌沒(méi)有交叉，具有H7抗原的大腸桿菌僅占大腸桿菌的0.1％-0.2％，而引起出血性腸炎的大腸桿菌目前主要為O157:H7一個(gè)血清型。這就為病人血清中的H7抗體作為免疫學(xué)診斷指標(biāo)的特異性提供了依據(jù)；同時(shí)使用了非O157的H7大腸桿菌菌種作為診斷原，避免了血清中萬(wàn)一出現(xiàn)的O157抗體的干擾，也利用大腸桿菌H抗原的凝集特性，雖然使用的H7抗原為全菌體，含有O、K抗原，但在50℃，2小時(shí)內(nèi)僅H抗原發(fā)生凝集，而O，K抗原的凝集則需16小時(shí)以上，而予以區(qū)別；而且H凝集呈特殊的棉花團(tuán)樣絮狀，而有別于O，K抗原的顆粒樣或片狀凝集。H抗原的凝集特性為本發(fā)明的快速特異提供保證。
具體技術(shù)方法是使用具有H7抗原的非O157的大腸桿菌菌種；鞭毛抗原U形管軟瓊脂誘導(dǎo)，增進(jìn)鞭毛發(fā)育；鞭毛H7抗原的制備，采用37℃靜止培養(yǎng)6小時(shí)，加入0.5％甲醛殺菌；H7抗原可盛于適宜直徑的透明的玻璃管狀容器內(nèi)，無(wú)菌分裝，每管0.9ml，蓋蓋或封口。最佳為長(zhǎng)7.5cm，外徑1.2cm的有蓋圓底玻璃管；使用時(shí)，啟開(kāi)H7抗原管，加入病者疑視未稀釋血清0.1ml，混勻，置50℃靜止水浴2小時(shí)，見(jiàn)有白色絮狀凝集，上部液體清澄，即為H7陽(yáng)性，可診斷HUS或出血性腸炎。如無(wú)凝集，液體仍為渾濁，即為陰性。如在出血性腸炎早期，陰性者可三天后再抽血重測(cè)一次。
權(quán)利要求
1.患者血清中大腸桿菌H7抗體作為HUS和出血性腸炎免疫學(xué)診斷指標(biāo)。如在本專利后出現(xiàn)以H7抗體為HUS和出血性腸炎的免疫學(xué)診斷指標(biāo)的任何試驗(yàn)和方法都認(rèn)為與本發(fā)明有關(guān)。
2.本發(fā)明采用非O157的H7大腸桿菌菌種作為抗原來(lái)源。
3.本發(fā)明使用單管凝集方法，出現(xiàn)絮狀凝集可判定為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。使用具有H7抗原的非0157的大腸桿菌菌種；鞭毛抗原U形管軟瓊脂誘導(dǎo)，增進(jìn)鞭毛發(fā)育；鞭毛H7抗原的制備，采用37℃靜止培養(yǎng)6小時(shí)，加入0.5％甲醛殺菌；H7抗原可盛于適宜直徑的透明的玻璃管狀容器內(nèi)，無(wú)菌分裝，每管0.9ml，蓋蓋或封口。最佳為長(zhǎng)7.5cm，外徑1.2cm的有蓋圓底玻璃管；使用時(shí)，啟開(kāi)H7抗原管，加入病者疑視未稀釋血清0.1ml，混勻，置50℃靜止水浴2小時(shí)，見(jiàn)有白色絮狀凝集，上部液體清澄，即為H7陽(yáng)性，可診斷HUS或出血性腸炎。如無(wú)凝集，液體仍為渾濁，即為陰性。如在出血性腸炎早期，陰性者可三天后再抽血重測(cè)一次。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1501083SQ0214870
公開(kāi)日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2002年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日
發(fā)明者楊正時(shí) 申請(qǐng)人:楊正時(shí)