專利名稱：測(cè)定硫酸軟骨素的組合物及測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定硫酸軟骨素的組合物及測(cè)定方法。具體地說(shuō)，涉及一種測(cè)定硫酸軟骨素、及以硫酸軟骨素為原料的制劑中硫酸軟骨素含量的組合物及測(cè)定方法。
硫酸軟骨素(chondroitin sulfate CS)是由動(dòng)物喉骨、鼻中骨、氣管等軟骨組織中提取制備的粘多糖類藥物。近年來(lái)，硫酸軟骨素作為一種新型藥用活性成分，在醫(yī)藥制劑、醫(yī)學(xué)材料、日化產(chǎn)品(化妝品、生發(fā)劑)、保健品等領(lǐng)域的廣泛運(yùn)用越來(lái)越引起人們的重視。硫酸軟骨素溶解于水，為一種具粘性的無(wú)色透明液體。硫酸軟骨素含量的測(cè)定方法現(xiàn)有技術(shù)中主要有高效液相色譜法和分光光度法(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(二部)第六冊(cè)(生化藥品第一分冊(cè))。1998138-139.)，這些方法均須經(jīng)水解、衍生等反應(yīng)后再定量測(cè)定，操作繁鎖，靈敏度也不高。
本發(fā)明的目的是提供能夠克服上述現(xiàn)有技術(shù)的弊端，且具有高靈敏、選擇性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確的測(cè)定硫酸軟骨素的組合物及測(cè)定方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用萘基二苯甲烷類染料作顯色劑，在磷酸一磷酸二氫鹽緩沖介質(zhì)中，非離子表面活性劑作穩(wěn)定劑，分光光度法測(cè)定樣本中硫酸軟骨素的含量。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1.測(cè)定硫酸軟骨素的組合物制備稱取萘基二苯甲烷類染料精制品(熱水精制，80℃烘干、恒重)0.100克于1升燒杯中，加水600毫升，加磷酸二氫鉀(A.R)27.2克，移入磷酸(A.R)8.0毫升，加非離子表面活性劑0.4克，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌4小時(shí)后，轉(zhuǎn)入1升量瓶中，用蒸溜水稀釋至刻度，搖勻。
2.硫酸軟骨素的測(cè)定方法(1).樣品溶液的配制準(zhǔn)確稱取試樣(105℃，2小時(shí)烘干，恒重。)0.200克于250ml燒杯中，加入蒸餾水300ml，試樣經(jīng)攪拌溶解后轉(zhuǎn)入500ml量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。再將上述溶液稀釋10倍后備用。
(2).硫酸軟骨素含量的測(cè)定用5.00ml的胖肚移液管移取測(cè)定硫酸軟骨素的組合物于50ml量瓶中，搖勻。加入蒸餾水20ml和上述配制的樣品溶液10.00ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。5分鐘后，1cm皿，試劑空白作參比，570nm處測(cè)定溶液的吸光度。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的進(jìn)一步描述本方法的原理是利用硫酸軟骨素雙糖結(jié)構(gòu)單元上硫酸酯陰離子基團(tuán)與萘基二苯甲烷類陽(yáng)離子染料在酸性介質(zhì)中發(fā)生締合反應(yīng)生成締合物。萘基二苯甲烷類染料在酸性介質(zhì)中呈黃綠色，萘基二苯甲烷類染料與硫酸軟骨素的締合物呈藍(lán)紫色。試劑空白作參比，各締合物吸收峰波長(zhǎng)570～580nm。
水溶液的酸度對(duì)硫酸軟骨素雙糖結(jié)構(gòu)上的羧基和硫酸酯基團(tuán)離解平衡產(chǎn)生影響，對(duì)試樣中可能存在的共存物離解平衡及萘基二苯甲烷類染料色光產(chǎn)生影響。試驗(yàn)了介質(zhì)酸度對(duì)萘基二苯甲烷類染料與硫酸軟骨素締合反應(yīng)的影響。同時(shí)，對(duì)萘基二苯甲烷類染料與鹽酸氨基葡萄糖、D-葡萄糖酸鈉、牛血清白蛋白的締合情況進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在堿性和中性介質(zhì)中締合物與萘基二苯甲烷類染料的吸收光譜差異不大；在酸性水溶液中萘基二苯甲烷類染料呈黃綠色，而萘基二苯甲烷類染料與硫酸軟骨素締合物呈藍(lán)紫色。鹽酸氨基葡糖和D-葡萄糖酸鈉對(duì)萘基二苯甲烷類染料的吸收光譜不產(chǎn)生影響。高濃度牛血清白蛋白(Albumin，Bovine，簡(jiǎn)稱AB)與萘基二苯甲烷類染料有輕微的締合作用。
離子型顯色劑和硫酸軟骨素均溶于水，而締合物的水溶性則大大降低，締合物緩慢朝玻璃器皿壁遷移吸附。為了增加締合物在水中的穩(wěn)定性，對(duì)表面活性劑進(jìn)行了選擇。非離子表面活性劑山梨醇酐脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基酚醚均具有穩(wěn)定作用，在組合物中加入非離子表面活性劑吸光度至少穩(wěn)定半小時(shí)。
采用摩爾比法和連續(xù)變化法測(cè)定萘基二苯甲烷類染料和硫酸軟骨素的雙糖結(jié)構(gòu)摩爾比，測(cè)定結(jié)果表明締合物的組成為2∶1。
按硫酸軟骨素的測(cè)定方法繪制工作曲線，回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍分別為A＝0.0933C(ug/ml)-0.002(r＝0.9999，0.0～4.0ug/ml)。
締合物吸光系數(shù)達(dá)93.3L·g-1·cm-1是標(biāo)準(zhǔn)方法的9倍。
3ug/ml硫酸軟骨素溶液的吸光度，相對(duì)誤差小于±5％，允許共存物的濃度(ug/ml)K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、NO3-、SO42-、H2PO4-、NH4+、Fe3+、Cl-、Br-、Ac-、鹽酸氨基葡糖、D-葡萄糖酸鈉(100上限未做)；F-(10)；I-(10)牛血清白蛋白(2)。由此可以看出，共存物對(duì)測(cè)定結(jié)果不產(chǎn)生影響。
運(yùn)用本發(fā)明對(duì)來(lái)樣進(jìn)行了測(cè)定(n＝3)。用標(biāo)準(zhǔn)加入法在試樣(配置0.100g/500ml儲(chǔ)備液)中加入硫酸軟素標(biāo)樣(Sigma)做回收試驗(yàn)(n＝8)，測(cè)定結(jié)果列于表1。
表1樣品分析結(jié)果樣品 本法 標(biāo)準(zhǔn)法CS加入量測(cè)得總量 回收率 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(％) (％) (mg/500ml) (mg/500ml) (％) (％) (％)1 84.2 83.1 75.0157.9 98.3 1.72 83.0 82.3 50.0132.3 98.4 1.53 90.1 88.3 25.0115.4 101.22.2測(cè)定結(jié)果表明本發(fā)明提供的測(cè)定硫酸軟骨素的組合物及測(cè)定方法，具有高靈敏、選擇性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.測(cè)定硫酸軟骨素的組合物，組合物組成包括萘基二苯甲烷類染料、磷酸、磷酸二氫鹽、非離子表面活性劑和水，其特征在于所述組成的重量百分比(W％)為萘基二苯甲烷類染料 0.005-0.04磷酸 0.10-4.0磷酸二氫鹽0.3-10非離子表面活性劑 0.002-0.02蒸餾水 余量
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定硫酸軟骨素的組合物，其特征還在于所述萘基二苯甲烷類染料為商品化堿性染料或試劑，可以列舉的有堿性艷藍(lán)BO(C.I.42595)、堿性艷藍(lán)B(C.I.44045)、堿性艷藍(lán)R(C.I.44040)和夜藍(lán)NB(C.I.44085)，經(jīng)提純后使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定硫酸軟骨素的組合物，其特征還于所述非離子表面活性劑為山梨醇酐脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基酚醚中的一種或多種組合。
4.測(cè)定硫酸軟骨素的測(cè)定方法，其特征在于將組合物加入硫酸軟骨素的水溶液后，試劑空白作參比，分光光度法測(cè)定溶液的吸光度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定硫酸軟骨素的組合物及測(cè)定方法，組合物組成包括萘基二苯甲烷類染料、磷酸、磷酸二氫鹽、非離子表面活性劑和水，測(cè)定方法將組合物加入硫酸軟骨素水溶液中，試劑空白作參比，分光光度法測(cè)定溶液的吸光度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)須對(duì)試樣進(jìn)行水解等預(yù)處理，大大減化了操作步驟、靈敏度高(表觀吸光系數(shù)高達(dá)93.3L/g·cm)、操作簡(jiǎn)便、快速、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)G01N21/25GK1419119SQ0215124
公開(kāi)日2003年5月21日 申請(qǐng)日期2002年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者施文健 申請(qǐng)人:施文健