專利名稱：一種個(gè)體化特異性免疫細(xì)胞功能測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及生物機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能測(cè)定方法。尤其涉及個(gè)體化特異性細(xì)胞免疫功能的監(jiān)測(cè)方法學(xué)。特別涉及器官移植受者的特異性針對(duì)相應(yīng)供者移植物的細(xì)胞免疫功能監(jiān)測(cè)，排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)，免疫用藥方案的調(diào)整；以及腫瘤患者機(jī)體特異性抗腫瘤免疫功能的評(píng)估和抗腫瘤治療方案的制定等。此外，應(yīng)用該方法原理選用不同特異性抗原、疫苗、藥物等可引起抗體免疫功能發(fā)生變化物質(zhì)作為刺激原可建立相應(yīng)的各種方法。
二、技術(shù)背景正常生物機(jī)體免疫系統(tǒng)由體液免疫和細(xì)胞免疫所組成，二者之間的精確配合和相互調(diào)節(jié)在維持正常機(jī)體生命機(jī)能和抗疾病免疫中發(fā)揮著極其重要的作用。各種淋巴細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的中心作用近年來(lái)受到廣泛地關(guān)注。T淋巴細(xì)胞作為生物機(jī)體抗疾病免疫和排斥免疫的“軸心”概念得到了普遍的認(rèn)同。
隨著人類對(duì)生物機(jī)體免疫機(jī)制理解的不斷深化，近年來(lái)尤其是在特異性免疫識(shí)別應(yīng)答機(jī)制方面的研究，取得了重要進(jìn)展。特異性免疫應(yīng)答的前提條件是特異性免疫識(shí)別，而特異性免疫識(shí)別又取決“雙信號(hào)”機(jī)制的完整性。組成“雙信號(hào)”識(shí)別的物質(zhì)基礎(chǔ)是由MHC基因的表達(dá)產(chǎn)物MHC分子和特異性多肽復(fù)合物組成特異性識(shí)別的第一信號(hào)；而協(xié)同刺激因子(B7家族；B7-1；B7-2等)、細(xì)胞粘附因子(CD40等)則組成免疫識(shí)別的第二信號(hào)。生物體抗疾病免疫或抗移植物排斥免疫的激發(fā)、活化、調(diào)節(jié)以及免疫耐受的產(chǎn)生與上述“雙信號(hào)”系統(tǒng)的完整性有著極其密切的關(guān)聯(lián)。外來(lái)抗原(非已抗原)或移植抗原成分進(jìn)入生物體后，首先通過(guò)抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells；APC)的作用，將非已抗原降解為特異性多肽與相應(yīng)的MHC分子組裝形成MHC-特異性多肽復(fù)合物并提呈于細(xì)胞表面，然后與膜上的協(xié)同刺激因子，細(xì)胞粘附因子等共同被特定T淋巴細(xì)胞克隆特異性受體(T Cell Receptor；TCR)以及協(xié)同刺激因子受體(CD28等)所識(shí)別、結(jié)合；從而特異性地激活T淋巴細(xì)胞及其亞群，誘發(fā)生物機(jī)體全面的特異性免疫應(yīng)答。通過(guò)MHC-I-多肽復(fù)合物誘導(dǎo)激活的CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞形成細(xì)胞毒性細(xì)胞(Cytotexic T Lympholytes；TCL)或稱殺傷性T細(xì)胞對(duì)感染外來(lái)抗原(如病毒等)的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞或器官移植供者細(xì)胞等產(chǎn)生直接的特異性殺傷作用；而MHC-II-多肽復(fù)合物誘導(dǎo)、活化的CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞或稱輔助性T淋巴細(xì)胞(T Helper；TH)可通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子強(qiáng)化或調(diào)節(jié)CTL的特異性殺傷作用和其他免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞活化)功能；同時(shí)可刺激B淋巴細(xì)胞增殖，分化成槳細(xì)胞分泌特異性抗體啟動(dòng)體液免疫應(yīng)答。綜上所述，可獲得以下重要結(jié)論1、T細(xì)胞尤其是CD4陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞在完整生物機(jī)體免疫系統(tǒng)中具有“軸心”作用；2、生物機(jī)體的特異性免疫識(shí)別是特異性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)和前提條件；3、“雙信號(hào)”識(shí)別機(jī)制的完備與否決定著特異性免疫應(yīng)答的性質(zhì)(即特異性免疫“耐受”或“攻擊”效應(yīng))。
人類對(duì)生物免疫系統(tǒng)理解、認(rèn)識(shí)的深化，推動(dòng)了實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展；而新的多樣化免疫學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，又給免疫學(xué)基礎(chǔ)理論研究帶來(lái)了多角度分析觀測(cè)工具，從而進(jìn)一步促進(jìn)了免疫學(xué)理論的完善和科學(xué)性，并作為臨床免疫學(xué)的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。近年來(lái)，各國(guó)免疫學(xué)工作者建立了多種檢測(cè)生物機(jī)體免疫學(xué)功能的方法和技術(shù)。其主要包括各種以測(cè)定特異性抗體產(chǎn)生為特征的體液免疫功能檢測(cè)方法和測(cè)定各類免疫細(xì)胞數(shù)目活性、增殖等指標(biāo)的細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法。后者可分為以下幾類1.免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)通過(guò)細(xì)胞特異性染色和非特異性染色技術(shù)，在顯微鏡下對(duì)各類免疫細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。
2.免疫組化方法通過(guò)抗體特異性染色(如免疫酶學(xué)或免疫熒光染色技術(shù))觀察各類免疫細(xì)胞的組織分布特征。
3.流式細(xì)胞儀方法是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種高靈敏度、高效率的細(xì)胞分析儀器。其將免疫熒光技術(shù)與流式細(xì)胞技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合；可對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行多色熒光標(biāo)記分類，高速計(jì)數(shù)；又可通過(guò)測(cè)定細(xì)胞膜表面標(biāo)志的變化，細(xì)胞周期變化、細(xì)胞分裂增殖對(duì)免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行測(cè)定。
4.3H-TdR摻入細(xì)胞增殖方法為一種經(jīng)典的同位素標(biāo)記胸腺嘧啶核苷測(cè)定DNA含量的方法，作為測(cè)定淋巴細(xì)胞分化增殖的指標(biāo)。
5.51Cr-釋放試驗(yàn)是另一種傳統(tǒng)、經(jīng)典的同位素測(cè)定免疫殺傷細(xì)胞活性的高靈敏度方法。
6.混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)屬于3H-TdR摻入細(xì)胞增殖方法的一種特殊類型。其特點(diǎn)是將一個(gè)生物個(gè)體(通常為器官移植供者)淋巴細(xì)胞滅活使其喪失繁殖能力后作為一種刺激物與另一生物個(gè)體(受者)的淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)3-7天；以3H-TdR摻入技術(shù)測(cè)定受檢樣品中混合淋巴細(xì)胞的DNA合成情況；以此評(píng)估受者免疫細(xì)胞對(duì)供者淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。該方法靈敏度高，但操作過(guò)程復(fù)雜，需要較長(zhǎng)時(shí)間出結(jié)果和使用放射性同位素等缺點(diǎn)。
7.延遲過(guò)敏反應(yīng)皮膚試驗(yàn)(Delayed-Type Hypersensitivity；DTH)應(yīng)用少量特異性抗原皮下注射，誘發(fā)機(jī)體T細(xì)胞依賴性巨噬細(xì)胞激活免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)。在24-28小時(shí)后觀察注射部位的紅疹出現(xiàn)及大小；估測(cè)受檢者對(duì)相對(duì)抗原的特異性細(xì)胞免疫功能。該方法具有一定特異性，但結(jié)果判定困難，沒有嚴(yán)格的量化標(biāo)準(zhǔn)。
8.細(xì)胞內(nèi)ATP測(cè)定淋巴細(xì)胞受抗原刺激活化后，細(xì)胞內(nèi)ATP水平增加，在體外反應(yīng)系統(tǒng)中，ATP和蟲熒光素酶在Mg、O2的共同作用下催化蟲熒光素，生成氧化蟲熒光素并釋放波光為562mm的光能；通過(guò)對(duì)這種光能的測(cè)定判定免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)。該方法靈敏度高，但不穩(wěn)定。受影響因素多，不易標(biāo)準(zhǔn)化。
9.穿刺活檢技術(shù)屬于一種侵入性檢測(cè)方法，需經(jīng)穿刺獲得病人的生物組織標(biāo)本。這種方法常用于判定器官移植后，器官移植受者對(duì)移植物的免疫排斥反應(yīng)。是當(dāng)前移植后免疫排斥監(jiān)測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
10.CFSE流式測(cè)定細(xì)胞分裂增殖該技術(shù)需先將受檢免疫細(xì)胞進(jìn)CFSE熒光染色標(biāo)記，然后在加入刺激物的條件下進(jìn)行4天細(xì)胞培養(yǎng)，繼以免疫熒光抗體標(biāo)記待測(cè)細(xì)胞(雙熒光標(biāo)記)。然后對(duì)雙熒光標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行流式測(cè)定分析，根據(jù)CFSE染色強(qiáng)度和熒光峯判定相應(yīng)受檢細(xì)胞的分裂增殖情況。
11.MHC分子四聯(lián)體特異性反應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)方法是新近發(fā)展的一種檢測(cè)生物體特異性免疫細(xì)胞群體的流式細(xì)胞分析技術(shù)。利用分子重組技術(shù)表達(dá)帶生物素(Biotin)的MHC分子與抗生物素-PE(Avidin-PE)聯(lián)接形成帶有4個(gè)MHC分子的“四聯(lián)體”，并利用特異性多肽加載在MHC分子上。通過(guò)特異性免疫識(shí)別機(jī)制，相應(yīng)的MHC-多肽特異性TCR可對(duì)MHC分子一多肽進(jìn)行特異性識(shí)別和結(jié)合。結(jié)合免疫細(xì)胞的熒光抗體分類技術(shù)，在流式細(xì)胞儀上對(duì)各類T細(xì)胞上的PE熒光進(jìn)行分析測(cè)定，實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性反應(yīng)T細(xì)胞的檢測(cè)。該方法中的MHC分子四聯(lián)體制備復(fù)雜、成本高，難以應(yīng)用于常規(guī)檢測(cè)。
上述方法在實(shí)際應(yīng)用中具有各自優(yōu)缺點(diǎn)，但存在的最大不足是在絕大多數(shù)情況下， 以上方法只是對(duì)機(jī)體非特異性和特異性免疫的混合測(cè)量，不能有效的反映生物機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫功能，特別是個(gè)體化特異性免疫活性。在器官移植免疫和抗腫瘤免疫中，受者對(duì)相應(yīng)供者器官的特異性排斥免疫功能監(jiān)測(cè)以及腫瘤患者對(duì)其腫瘤細(xì)胞的特異性抗腫瘤免疫功能監(jiān)測(cè)具有十分重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
相關(guān)專利文獻(xiàn)1、Walter，et al.
Mutant MHC Class I MoleculesUS Patent6248，564；20012、Wier；Majorie L.
Methods for measurement of lymphocyte function US Patent5,773,232；1998三、發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有各種細(xì)胞免疫測(cè)定方法的主要問題，根據(jù)免疫學(xué)T細(xì)胞特異性識(shí)別機(jī)制的特點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新的個(gè)體化特異性的細(xì)胞免疫功能測(cè)定方法。在器官移植應(yīng)用中，將器官移植供者的組織細(xì)胞成分作為個(gè)體特異性抗原或利用MHC(HLA)分子抗原庫(kù)，與供者免疫細(xì)胞共同溫育以激活相應(yīng)供者各類免疫細(xì)胞，然后對(duì)免疫細(xì)胞活化的各種標(biāo)志進(jìn)行測(cè)定?？煞从称鞴僖浦彩苷邔?duì)移植物的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)功能，從而達(dá)到對(duì)移植物排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以及為臨床免疫抑制治療提供科學(xué)依據(jù)。
器官移植中的排斥反應(yīng)可根據(jù)排斥反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間和免疫學(xué)特征分為超急性、急性、慢性排斥反應(yīng)。超急性排斥反應(yīng)主要由受者體內(nèi)已存在的抗供者HLA分子抗體和補(bǔ)體引起的體液免疫反應(yīng)和其他炎性反應(yīng)性細(xì)胞及因子所共同參與導(dǎo)致的急性血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管堵塞、凝血。
而急性、慢性排斥反應(yīng)主要由受者針對(duì)供者移植物的細(xì)胞免疫所介導(dǎo)。通過(guò)供者特異性抗原直接或間接提呈機(jī)制，受者體內(nèi)針對(duì)供者的T細(xì)胞(供者抗原特異性反應(yīng)T細(xì)胞克隆)通過(guò)T淋巴細(xì)胞受體(T Cell Receptor；TCR)和其它細(xì)胞表面受體特異性地識(shí)別MHC-供者抗原多肽復(fù)合物和結(jié)合協(xié)同刺激因子，繼而活化增殖，誘發(fā)受者抗移植物的特異性排斥反應(yīng)。由于這種排斥反應(yīng)具有明顯的個(gè)體特異性，且主要以供者細(xì)胞表面MHC分子作為識(shí)別對(duì)象和標(biāo)志；因此，以供者細(xì)胞及其細(xì)胞提取物或包括供者M(jìn)HC分子的抗原庫(kù)作為體外細(xì)胞免疫測(cè)定的特異性刺激原具有理論上的合理性。這種供者特異性刺激原包含了供者抗原或移植物抗原的全部信息，尤其是供者細(xì)胞膜上的MHC分子是引起供者抗原特異性反應(yīng)T細(xì)胞特異性識(shí)別機(jī)制中的關(guān)鍵抗原成分。本發(fā)明特別強(qiáng)調(diào)在檢測(cè)受者特異性抗供者排斥免疫反應(yīng)的檢測(cè)方法中使用供者細(xì)胞或細(xì)胞提取物或MHC分子抗原庫(kù)作為個(gè)體化特異性刺激原的重要性。實(shí)驗(yàn)表明對(duì)于受者的免疫細(xì)胞，供者的亞細(xì)胞成分或MHC分子具有與全細(xì)胞類同的免疫原刺激特性，二者均可特異性地激活受者機(jī)體的供者抗原特異性反應(yīng)T細(xì)胞發(fā)生分化增殖效應(yīng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定受者免疫細(xì)胞(經(jīng)供者特異性抗原或MHC分子刺激后)的活化標(biāo)志，可反映受者免疫細(xì)胞對(duì)供者移植物的特異性排斥功能，從而達(dá)到對(duì)排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并為臨床免疫治療用藥提供參考指標(biāo)。
在特異性細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法學(xué)中，另一突出問題是由于多種因素可直接或間接影響受檢樣品中免疫細(xì)胞的反應(yīng)活性，而導(dǎo)致免疫細(xì)胞的非特異性激活從而使結(jié)果分析判定困難。本發(fā)明特別強(qiáng)調(diào)在檢測(cè)中設(shè)置空白對(duì)照和自身對(duì)照以排除非特異性活化信號(hào)的干擾。
空白對(duì)照設(shè)置不加入任何刺激原，其反映受檢免疫細(xì)胞在沒有刺激原狀態(tài)下的功能狀況，用以排除上述非特異性、個(gè)體特異性抗原以外的未知刺激因素的影響。
自身抗原對(duì)照使用受檢生物個(gè)體的細(xì)胞或亞細(xì)胞成分作用自身對(duì)照抗原刺激物(通常使用外周有核細(xì)胞制成)，其制備方法和使用量與供者特異性抗原完全相同。這種自身抗原對(duì)照可較好的反映非供者特異性性抗原所導(dǎo)致的影響因素。
個(gè)體化特異性抗原管以器官移植供者的細(xì)胞或亞細(xì)胞成分或包括供者M(jìn)HC分的MHC分子抗原庫(kù)作為刺激原，可反映器官移植受者機(jī)體的供者移植物特異性反應(yīng)細(xì)胞免疫功能。
綜合分析上述三者檢測(cè)結(jié)果及其相互差異、關(guān)系可對(duì)受檢個(gè)體的特異性細(xì)胞免疫功能做出客觀合理的評(píng)估。
器官移植受者的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的免疫學(xué)分析一、器官移植前器官移植受者在接受移植前，其體內(nèi)的供者特異性反應(yīng)T淋巴細(xì)胞處在“靜息”狀態(tài)或稱非致敏狀態(tài)；此時(shí)若以MHC型別不完全相符的供者特異性抗原在體外刺激受者免疫細(xì)胞可誘發(fā)緩慢而強(qiáng)度較弱(相對(duì)移植后)的免疫細(xì)胞活化，這種情況相當(dāng)免疫系統(tǒng)與非已抗原的第一次接觸。根據(jù)供者與受者的MHC(HLA)相符合程度；受者的細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度也存在不同差異。即供者M(jìn)HC(HLA)與受者M(jìn)HC(HLA)的符合率越高則受者免疫細(xì)胞的活化程度越低，移植后發(fā)生排斥反應(yīng)的發(fā)生幾率也越低；反之，則排斥反應(yīng)的發(fā)生幾率將增加。因此在器官移植前，本發(fā)明所述及的方法可作為器官移植供者選擇的科學(xué)依據(jù)。
二、器官移植后理論上，當(dāng)器官移植受者接受MHC(HLA)不相符合或部分符合的器官移植后或當(dāng)移植受者免疫細(xì)胞接觸到供者細(xì)胞后，其通過(guò)特異性免疫識(shí)別機(jī)制接受非已抗原刺激并發(fā)生相應(yīng)的活化反應(yīng)，直致排斥反應(yīng)發(fā)生并持續(xù)。因此，在器官移植后的任一時(shí)間，對(duì)受者免疫細(xì)胞功能的測(cè)定與移植前的非致敏狀態(tài)存在實(shí)質(zhì)性差異；即測(cè)定對(duì)象是已經(jīng)被供者特異性抗原致敏的免疫細(xì)胞，測(cè)定結(jié)果反映了受者免疫細(xì)胞致敏后的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。這種情況類似于非已抗原成分與免疫細(xì)胞第二次或多次接觸時(shí)所產(chǎn)生的反應(yīng)。其具有反應(yīng)快速、強(qiáng)烈、持續(xù)性等特點(diǎn)。因此，在體外對(duì)受者特異性細(xì)胞免疫功能測(cè)定時(shí)可相應(yīng)縮短溫育刺激時(shí)間，快速獲得結(jié)果。
三、免疫抑制治療的影響由于生物機(jī)體免疫反應(yīng)性遺傳學(xué)上的個(gè)體差異、供者與受者M(jìn)HC(HLA)型別符合程度的不同、以及免疫抑制治療的藥物不一樣和用藥劑量的差別等諸多因素影響，會(huì)導(dǎo)致對(duì)受者免疫細(xì)胞功能測(cè)定結(jié)果分析、評(píng)估的復(fù)雜性。因此，測(cè)定結(jié)果是上述各因素的綜合表現(xiàn)形式。本發(fā)明強(qiáng)調(diào)對(duì)器官移植受者的特異性免疫細(xì)胞功能進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤測(cè)定；特別強(qiáng)調(diào)移植前后和免疫用藥前后的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。對(duì)受者特異性細(xì)胞免疫功能狀態(tài)做出具有科學(xué)依據(jù)的正確判斷。為免疫抑制治療的用藥選擇、劑量調(diào)整和個(gè)體化治療方案設(shè)計(jì)提供客觀的參考指標(biāo)。
特異性抗腫瘤免疫功能測(cè)定根據(jù)上述相同原理和方法學(xué)基礎(chǔ)，以腫瘤患者自身腫瘤細(xì)胞或亞細(xì)胞成分；或任何其它與患者腫瘤細(xì)胞具有共同抗原成分的其它腫瘤細(xì)胞(如同類腫瘤細(xì)胞等)；或同類腫瘤抗原庫(kù)作為特異性腫瘤抗原刺激物，與腫瘤患者自身免疫細(xì)胞在體外進(jìn)行溫育刺激，然后對(duì)相應(yīng)各類T淋巴細(xì)胞或其它免疫細(xì)胞的激活標(biāo)志物或增殖功能進(jìn)行測(cè)定，可反映腫瘤患者的抗腫瘤特異性細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，為抗腫瘤免疫治療和病情預(yù)后及轉(zhuǎn)歸提供科學(xué)依據(jù)。
在免疫藥物的篩選、評(píng)估和臨床治療效果的監(jiān)測(cè)領(lǐng)域；利用本發(fā)明所述及的方法，在檢測(cè)中增設(shè)藥物加特異性刺激物加受檢樣品免疫細(xì)胞測(cè)定管；或/和直接以免疫藥物為刺激物(或抑制物或調(diào)節(jié)物)與免疫細(xì)胞共同溫育，可獲得免疫藥物對(duì)相應(yīng)個(gè)體細(xì)胞免疫功能的效應(yīng)程度等有關(guān)資料。
在免疫疫苗研究領(lǐng)域，直接將疫苗作為特異性刺激物，或/和其它特異性抗原刺激物共同作為刺激原，在疫苗接種前后對(duì)相應(yīng)生物個(gè)體進(jìn)行特異性細(xì)胞免疫功能進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可用于對(duì)疫苗作用及效價(jià)的評(píng)估。
本發(fā)明所述及受檢樣品的免疫細(xì)胞定義為所有直接或間接參與生物機(jī)體免疫反應(yīng)的任何細(xì)胞，尤其是指T淋巴細(xì)胞及其亞群、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及APC細(xì)胞等。根據(jù)實(shí)際需要，在檢測(cè)前可采用適當(dāng)方法(如免疫磁珠分選、免疫親和技術(shù)分選、免疫共沉淀分選，梯度密度分離等)對(duì)上述各類免疫細(xì)胞及其亞群分離免疫，然后分別進(jìn)行功能測(cè)定；或先以特異性抗原刺激混合免疫細(xì)胞群體，然后用上述方法分選細(xì)胞，對(duì)某一特定細(xì)胞群體進(jìn)行功能測(cè)定，如T淋巴細(xì)胞(CD3+)；CTL(CD8+)，TH(CD4+)，NK細(xì)胞(CD16+，或/和CD56+)，B淋巴細(xì)胞(CD19+或CD20+)等。
體外生物檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)是采取最為接近生物體生理內(nèi)環(huán)境的反應(yīng)系統(tǒng)，其能最為客觀地反映檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性。這在體外測(cè)定生物體免疫功能狀態(tài)的方法中尤其重要。生物機(jī)體的免疫功能狀態(tài)是各種免疫細(xì)胞相互聯(lián)系(Communication)、作用(Interaction)、接觸(Contaction)、調(diào)節(jié)(Regulation)的綜合體現(xiàn)。因此，在體外檢測(cè)某細(xì)胞群體免疫功能時(shí)，應(yīng)盡可能保證其它直接或間接影響該群體某種特定免疫功能的細(xì)胞共存于同一測(cè)定體系中，以避免檢測(cè)結(jié)果的片面性和不客觀性。例如，在檢測(cè)某生物體T淋巴細(xì)胞功能時(shí)，應(yīng)保留相應(yīng)的抗原提呈細(xì)胞存在于同一檢測(cè)系統(tǒng)之中，從而保證T淋巴特異性識(shí)別系統(tǒng)的完整性；另外，在測(cè)定NK細(xì)胞或B細(xì)胞免疫功能的反應(yīng)體系中應(yīng)包含T淋巴細(xì)胞。因此，本發(fā)明著重強(qiáng)調(diào)使用原始樣品作為測(cè)定對(duì)象。原始樣品定義為直接來(lái)自生物體經(jīng)最少處理或不經(jīng)任何處理的含免疫細(xì)胞的體液樣品，其主要包括全外周血、全骨髓、去除紅細(xì)胞的有核細(xì)胞混合群體、腹腔液、胸腔液或經(jīng)離心后獲取的腹腔液、胸腔液、腦脊液所含的混合細(xì)胞組分。
四、發(fā)明小結(jié)本發(fā)明提出了一種以特異性抗原作為刺激物測(cè)定生物機(jī)體細(xì)胞免疫功能的方法。這種新方法學(xué)設(shè)計(jì)具有顯著的個(gè)體化特異性。其主要特征如下1、使用具有個(gè)體化特異性抗原作為誘導(dǎo)活化特定生物個(gè)體特異性免疫細(xì)胞的刺激物在器官移植受者細(xì)胞免疫功能測(cè)定中，以相應(yīng)的器官供者細(xì)胞或亞細(xì)胞成分作為特異性刺激原，對(duì)受者體內(nèi)供者移植物抗原特異反應(yīng)性免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行測(cè)定。用于對(duì)移植前器官移植供者的選擇，在移植后可對(duì)針對(duì)移植物排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)；動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)受者特異性細(xì)胞免疫功能，可為免疫抑制治療提供用藥參考。
將腫瘤患者自腫瘤細(xì)胞或其亞細(xì)胞成分作為特異性抗原刺激物，可對(duì)患者體內(nèi)潛在的抗腫瘤特異性免疫功能進(jìn)行測(cè)定，為腫瘤治療提供客觀的科學(xué)依據(jù)。2、使用多價(jià)通用性、特異性抗原庫(kù)作為誘導(dǎo)活化任一生物個(gè)體特異性免疫細(xì)胞的刺激物1)利用混合MHC分子或HLA分子作為多價(jià)、通用性、特異性抗原器官移植供者、受者之間的MHC或HLA的符合程度是導(dǎo)致移植物排斥反應(yīng)發(fā)生的決定性因素。在移植排斥免疫應(yīng)答中，受者T淋巴細(xì)胞主要通過(guò)對(duì)自身或供者M(jìn)HC分子和供者M(jìn)HC(HLA)多肽復(fù)合物的特異性識(shí)別機(jī)制活化產(chǎn)生抗移植物免疫應(yīng)答(Indirect or Direct Recognition；間接或直接識(shí)別)。因此，制備包括全部或部分MHC分子或HLA分子的混合體系作為多價(jià)、通用性、特異性抗原可對(duì)所有或部分生物群體進(jìn)行特異性細(xì)胞免疫功能測(cè)定。
利用包含所有生物MHC(HLA)I類分子的MHC-I類分子庫(kù)(MHC-IMolecules Bank)作為刺激原，可對(duì)任一生物個(gè)體CTL(CD8+)的功能進(jìn)行測(cè)定。
利用包含所有生物的MHC(HLA)II類分子的MHC-II類分子庫(kù)(MHC-II moleculesBank)?？蓪?duì)任一生物個(gè)體CD4+T淋巴細(xì)胞的功能進(jìn)行測(cè)定。
同理，利用上述MHC(HLA)I類和II類分子的混合體系(MHC(HLA)I/II類分子庫(kù))，可對(duì)生物體總T淋巴細(xì)胞功能進(jìn)行測(cè)定。
上述三種MHC分子庫(kù)在與某一特定生物個(gè)體免疫細(xì)胞群體進(jìn)行溫育或共培養(yǎng)時(shí)，存在于反應(yīng)系統(tǒng)中的APC細(xì)胞可將MHC分子提呈給相應(yīng)的特定T淋巴細(xì)胞群體(CTL，TH1，TH2等)，誘導(dǎo)其活化。如果受檢免疫細(xì)胞是第一次接觸這些非已MHC(HLA)分子；在設(shè)定時(shí)間內(nèi)它們的活化程度、反應(yīng)強(qiáng)度則相對(duì)低而弱；若檢測(cè)系統(tǒng)中的受檢免疫細(xì)胞曾經(jīng)被MHC(HLA)分子庫(kù)中的部分I類或II類分子(器官移植物具有的MHC分子)所致敏(第二次或多次接觸)，則那些被致敏的免疫細(xì)胞會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速活化，其活化的程度和反應(yīng)較為強(qiáng)烈。這在器官移植排斥反應(yīng)中尤其顯著。在臨床器官移植實(shí)踐中，移植手術(shù)完成后，移植受者免疫細(xì)胞被相應(yīng)的非已MHC(HLA)分子所致敏而處在高敏感狀態(tài)。在體外反應(yīng)系統(tǒng)中，免疫細(xì)胞再次遭遇MHC(HLA)分子庫(kù)中與移植供者相同的MHC(HLA)分子而迅速發(fā)生活化反應(yīng)并被測(cè)量。因此，根據(jù)移植前后，移植受者免疫細(xì)胞對(duì)包括在MHC(HLA)分子庫(kù)中與移植供者相同的MHC(HLA)分子的反應(yīng)性，可判斷受者免疫細(xì)胞的特異性抗移植物排斥反應(yīng)的有無(wú)和強(qiáng)度。
2)多種同類腫瘤細(xì)胞或腫瘤共同抗原庫(kù)作為多價(jià)、通用性抗原如前所述，利用腫瘤患者自身的腫瘤細(xì)胞或亞細(xì)胞成分可制備個(gè)體化特異性刺激原，可用于對(duì)相應(yīng)個(gè)體的特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫功能進(jìn)行測(cè)定。但在臨床實(shí)踐中，有許多腫瘤患者由于種種原因而不能獲得其自身的腫瘤細(xì)胞而不能進(jìn)行個(gè)體化特異性腫瘤抗原制備，給測(cè)定帶來(lái)一定困難。因此，針對(duì)這種情況，本發(fā)明強(qiáng)調(diào)使用多種同類腫瘤細(xì)胞制備多價(jià)腫瘤抗原(腫瘤抗原庫(kù))；或使用腫瘤共同抗原作為免疫細(xì)胞的刺激物對(duì)相應(yīng)患者的抗腫瘤細(xì)胞免疫功能進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明首次在機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能測(cè)定方法學(xué)中引入MHC(HLA)分子庫(kù)和腫瘤抗原庫(kù)作為免疫刺激原的概念。其主要意義在于制備多價(jià)廣譜具有通用性的抗原刺激物，用于任一特定生物個(gè)體的特異性細(xì)胞免疫功能測(cè)定。對(duì)于整個(gè)生物群體而言，上述MHC(HLA)分子庫(kù)或腫瘤抗原庫(kù)具有廣譜通用性特點(diǎn)；而對(duì)于某一特定生物個(gè)體又具有其特異性。這是因?yàn)椋趯?duì)某一特定生物個(gè)體的特異性細(xì)胞免疫功能測(cè)定中，其已經(jīng)處在致敏狀態(tài)的免疫細(xì)胞(這些細(xì)胞曾接受相應(yīng)移植物或腫瘤抗原的刺激)，通過(guò)特異性識(shí)別機(jī)制對(duì)MHC(HLA)分子庫(kù)或腫瘤抗原庫(kù)中的某些特異性抗原分子(器官移植供者M(jìn)HC分子或腫瘤共同抗原成分)進(jìn)行識(shí)別，從而賦予這種檢測(cè)方法以個(gè)體特異性。3、分類測(cè)定各種免疫細(xì)胞群體的功能狀態(tài)
利用各種分離技術(shù)，如特異性抗體磁顆粒分離技術(shù)，雙色或多色熒光標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)等?？稍谔禺愋钥乖碳で盎虼碳ず髮?duì)各類免疫細(xì)胞及其亞群進(jìn)行純化或分類測(cè)定。如總T淋巴細(xì)胞、CTL(CD8+)，TH(CD4+)NK細(xì)胞(CD16+，CD56+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+或CD20+)、APC細(xì)胞(CD80+/CD83+/CD86+/HLA-DR+)功能的選擇性測(cè)定等。4、免疫細(xì)胞活化信號(hào)測(cè)量的多樣性各種免疫細(xì)胞接受上述特異性抗原刺激后，活化的免疫細(xì)胞可發(fā)生下列主要細(xì)胞生物學(xué)變化酶學(xué)改變(如蛋白酪氨酸激酶；PTKs；Ras-MAP激酶；ZAP-70激酶等)，離子濃度改變(Ca++濃度)、膜受體改變(IL-2受體等)、特異性配體表達(dá)(CD40配體；CD40L)，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度增加；NK-KB，NFAT， AP-1，F(xiàn)as激活表達(dá)、各種CD分子表達(dá)(CD69，CD25，CD71，CD95，CD40等)，MHC分子表達(dá)(MHC-I類分子，MHC-II類分子)，各種細(xì)胞因子表達(dá)(IL-2，IL-4，IL-12，INFr等)，DNA合成增加(3H-TdR摻入增加)、細(xì)胞增殖及數(shù)目增加(CFSE染色流式測(cè)定)，CTL細(xì)胞毒性殺傷功能增強(qiáng)(51Cr-釋放試驗(yàn)，MTT試驗(yàn)等)。通過(guò)對(duì)上述任何一種細(xì)胞生物學(xué)變化的測(cè)量，可建立多種抗原特異性細(xì)胞免疫功能的測(cè)定方法。5、合理的空白對(duì)照、自身抗原對(duì)照設(shè)置和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方案在對(duì)樣品免疫細(xì)胞功能進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，本發(fā)明除提出設(shè)置不加任何刺激物的空白對(duì)照樣品外，著重強(qiáng)調(diào)設(shè)置自身抗原對(duì)照樣品。自身抗原對(duì)照主要是利用自身細(xì)胞或亞細(xì)胞成分(通常為外周血有核細(xì)胞或溶解物等)制備而成；但亦可采用無(wú)關(guān)細(xì)胞系(受檢免疫細(xì)胞不對(duì)此發(fā)生活化反應(yīng)或允許范圍內(nèi)的微弱反應(yīng))的細(xì)胞、亞細(xì)胞成分。這種自身抗原對(duì)照和空白對(duì)照可完好地反映非特異性抗原所產(chǎn)生背景信號(hào)(Background Signals)，另一方面也有助于對(duì)受檢樣品中免疫細(xì)胞的非特異性功能狀態(tài)進(jìn)行分析；而比較空白對(duì)照、自身抗原對(duì)照、特異性抗原刺激樣品三者測(cè)量結(jié)果，分析三者結(jié)果之間的數(shù)量關(guān)系；對(duì)測(cè)量結(jié)果或受檢生物個(gè)體的特異性細(xì)胞免疫功能狀態(tài)可作出符合客觀實(shí)際的解釋和科學(xué)判斷。
舉例一、個(gè)體化特異性抗原制備(一)全細(xì)胞抗原刺激物制備1.抽取器官移植供者和受者外周靜脈血各5-10ml，分別置于兩支抗凝管中；2.在上述管中加入適量RBC裂解液、裂解RBC，離心去除RBC裂解碎片；3.收集有核細(xì)胞成分并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使上述兩管細(xì)胞具有相同的細(xì)胞濃度；4.使用放射性照射或裂霉素處理有核細(xì)胞，使其喪失分裂活性。制備成個(gè)體化特異性全細(xì)胞抗原刺激物，用于受者免疫細(xì)胞功能測(cè)定；5.由相應(yīng)器官移植受者制備的細(xì)胞抗原將作為檢測(cè)方法中的自身抗原對(duì)照刺激物；由相應(yīng)器官移植供者制備的細(xì)胞抗原將作為檢測(cè)方法中的個(gè)體化特異性刺激物(二)亞細(xì)胞抗原刺激物制備1.同方法(一)中步驟1-3；2.使用反復(fù)凍融法裂解有核細(xì)胞成分；即在0℃以下凍結(jié)細(xì)胞，然后在常溫或37℃融解，反復(fù)1-5次；或使用超聲破碎法或勻漿方法，裂解上述細(xì)胞，制備亞細(xì)胞抗原；3.由上述制備獲得的亞細(xì)胞抗原將分別作為自身對(duì)照和個(gè)體化特異性刺激物用于分析測(cè)定；4.上述亞細(xì)胞抗原成分可置低溫(＜20℃)保存，供動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)分析多次使用。(三)MHC(HLA)分子純化制備1.同方法(一)中步驟1-3；2.用含有去垢劑的適當(dāng)緩沖液溶解有核細(xì)胞，經(jīng)離心等方法去除細(xì)胞核成分，保留含有MHC(HLA)分子的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿可溶性組份。
3.使用抗MHC(HLA)I類或/和II類分子抗體的親和層析柱，分離純化相應(yīng)的MHC(HLA)I類或/和II類分子組分。
4.利用SDS-PAGE技術(shù)鑒定上述純化成分的分子量；利用抗MHC(HLA)分子抗體Western Blot技術(shù)(免疫印跡技術(shù))對(duì)純化物進(jìn)行特異性純度鑒定；5.測(cè)定上述純化物的蛋白濃度，置低混保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜跈z測(cè)。(四)血小板MHC(HLA)I類分子制備1.同方法(一)中步驟1；2.常規(guī)離心分離獲得相應(yīng)的血漿組分。
3.進(jìn)一步制取血小板。血小板可作為MHC(HLA)I類分子抗原刺激物直接用于檢測(cè)免疫細(xì)胞功能或進(jìn)一步純化獲得血小板提取物或MHC(HLA)I類分子。
4.利用勻漿或超聲破碎技術(shù)或血小板溶解液裂解血小板，去除不含MHC(HLA)分子的有形成分。保留含MHC(HLA)I類分子組分直接用于檢測(cè)。
5.利用MHC(HLA)I類分子抗體的新和層析柱，對(duì)步驟4獲得的血小板溶解物進(jìn)行MHC(HLA)I類分子純化；
6.同方法(三)中的步驟4-5。
(五)MHC分子庫(kù)制備1.利用多個(gè)(100±個(gè)體)已知MHC(HLA)型別生物體的外周血有核細(xì)胞、或/和血小板，或表達(dá)MHC分子的細(xì)胞系、或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(表達(dá)特定已知的MHC(HLA)分子型別)作為MHC(HLA)分子庫(kù)制備來(lái)源，以滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)上對(duì)各類MHC(HLA)型別的要求(理論上覆蓋100％的生物群體)。
2.根據(jù)方法3、方法4所提供的方法對(duì)MHC(HLA)I類、II類分子進(jìn)行純化、鑒定；可分別獲得MHC(HLA)I類分子庫(kù)(覆蓋目前已知的全部I類分子型別)；MHC(HLA)II類分子庫(kù)(覆蓋目前已知的全部MHC(HLA)II類分子型別)；全MHC(HLA)分子庫(kù)(包括全部MHC(HLA)I類II類分子型別)。
3.上述三種MHC(HLA)分子庫(kù)可根據(jù)測(cè)定需要分別加以選用。如利用MHC(HLA)I類分子庫(kù)檢測(cè)CD8+的CTL細(xì)胞功能；利用MHC(HLA)II類分子檢測(cè)CD4的TH的細(xì)胞功能等。
4.除上述MHC(HLA)分子庫(kù)外，對(duì)于其它MHC型別；如少數(shù)MHC(Minor MHC)分子庫(kù)也可利用上述提供的原理、方法進(jìn)行制備，用于測(cè)定生物體的某些其它免疫功能。二、腫瘤特異性抗原制備(一)自身腫瘤特異性抗原制備1.由外科手術(shù)中切除的患者自身腫瘤組織剪成碎塊或活檢腫瘤組織，用酶學(xué)消化，梯度密度離心等技術(shù)制成單個(gè)腫瘤細(xì)胞懸液；2.經(jīng)滅活處理的血液腫瘤細(xì)胞可直接用作特異性抗原刺激物；3.同時(shí)制備腫瘤患者外周血滅活的有核細(xì)胞作為自身抗原對(duì)照；4.上述細(xì)胞可使用前述的凍融法，去垢劑裂解法、勻漿、超聲裂解法將腫瘤細(xì)胞制成亞細(xì)胞成分作為檢測(cè)方法中的特異性刺激物；(二)多價(jià)腫瘤抗原庫(kù)制備1.根據(jù)現(xiàn)有各種腫瘤組織學(xué)來(lái)源、分類方法；可利用來(lái)自多個(gè)個(gè)體的同類腫瘤或多個(gè)同類腫瘤細(xì)胞系作為多價(jià)腫瘤抗原制備的來(lái)源。如腺癌類、鱗癌類、各類白血病細(xì)胞、黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞等；2.利用上述方法(一)中所提供的方法，可制備成不同種類腫瘤的抗原庫(kù)，通過(guò)腫瘤共同抗原識(shí)別機(jī)制，利用相應(yīng)各類腫瘤抗原庫(kù)對(duì)某一特定腫瘤患者的特異性抗腫瘤免疫功能進(jìn)行測(cè)定。三、個(gè)體化特異性細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法學(xué)由于本發(fā)明屬于一種個(gè)體化特異性細(xì)胞免疫功能檢測(cè)的方法學(xué)技術(shù)平臺(tái)；根據(jù)發(fā)明中提出的方法學(xué)原理、技術(shù)路線可衍生出多種相應(yīng)的檢測(cè)方法，所必需強(qiáng)調(diào)的是這些方法不可能在本發(fā)明中一一列舉。因此，僅列一種方法學(xué)技術(shù)平臺(tái)描述“個(gè)體化特異性細(xì)胞免疫學(xué)功能檢測(cè)方法學(xué)”，詳見附圖
一。
權(quán)利要求
1.一種用于監(jiān)測(cè)器官移植受者、腫瘤患者免疫細(xì)胞功能的個(gè)體化特異性方法。其主要包括以下內(nèi)容1)制備個(gè)體化特異性抗原和自身對(duì)照抗原；2)制備MHC(HLA)分子庫(kù)；制備腫瘤抗原庫(kù)；3)以上述抗原刺激活化受檢樣品中的免疫細(xì)胞；4)以適當(dāng)分離和/或分類方法對(duì)特異性免疫細(xì)胞的各種活化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量。
2.權(quán)利要求1中的個(gè)體化特異性抗原解釋為器官移植供者的任何組織或細(xì)胞及其相應(yīng)提取物和腫瘤患者自身腫瘤的腫瘤細(xì)胞及其相應(yīng)提取物。
3.權(quán)利要求2中的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞解釋為經(jīng)過(guò)各種體外處理或不經(jīng)過(guò)任何處理所獲得的供者任何生物細(xì)胞；或腫瘤患者自身的腫瘤細(xì)胞；包括具有或不具有生物活性增殖功能的細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1中的個(gè)體化特異性抗原進(jìn)一步解釋為經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、酶學(xué)等方法對(duì)上述組織、細(xì)胞處理后所獲得的復(fù)合組分或單一組分。
5.權(quán)利要求1中的個(gè)體化特異性抗原可來(lái)源于某特定生物個(gè)體或一個(gè)以上生物個(gè)體的組織細(xì)胞及其細(xì)胞成分。
6.權(quán)利要求1中的MHC(HLA)分子庫(kù)解釋為包括目前全部或部分已知的MHC(HLA)分子的混合分子庫(kù)；如MHC(HLA)I類分子庫(kù)；MHC(HLA)II類分子庫(kù)；MHC(HLA)I類和II類分子的混合分子庫(kù)。
7.權(quán)利要求6中的MHC(HLA)分子庫(kù)進(jìn)一步解釋為通過(guò)各種方法、技術(shù)，以各種生物細(xì)胞、生物材料作為來(lái)源所制備獲得。如親和層析技術(shù)，層析技術(shù)DNA重組技術(shù)、DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)方法以及其它各種理化方法等。
8.權(quán)利要求1中的MHC(HLA)腫瘤抗原庫(kù)解釋為包括某一類腫瘤(如腺癌類、黑色素細(xì)胞瘤類等)共同抗原的腫瘤抗原，或包括所有腫瘤共同抗原的腫瘤抗原庫(kù)。上述腫瘤抗原庫(kù)可由一種或一種以上的同類腫瘤或/和不同類腫瘤，或由來(lái)自同一腫瘤組織細(xì)胞或不同腫瘤組織細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)生物個(gè)體，或細(xì)胞系制備而成。包括化學(xué)合成、生物合成；但必需包含一種或一種以上可被受檢生物個(gè)體免疫細(xì)胞所能特異性識(shí)別并發(fā)生相應(yīng)生物學(xué)反應(yīng)的腫瘤抗原成分。
9.權(quán)利要求10中的MHC(HLA)腫瘤抗原庫(kù)進(jìn)一步解釋為全細(xì)胞腫瘤抗原庫(kù)，亞細(xì)胞腫瘤抗原庫(kù)或腫瘤抗原單一或多種純化組分所組成的腫瘤抗原庫(kù)。
10.權(quán)利要求9中的MHC(HLA)進(jìn)一步解釋為通過(guò)任何物理、生化、化學(xué)合成方法、生物學(xué)方法、常層析方法、免疫親和層析方法、離心、梯度密度離心、沉淀等各種方法制備而成。
11.權(quán)利要求10中的抗原刺激解釋為以權(quán)利要求1-10中的個(gè)體化特異性抗原或MHC(HLA)分子庫(kù)，或腫瘤抗原庫(kù)中的抗原與相應(yīng)受試樣品中的免疫細(xì)胞在體外共同溫育或培養(yǎng)30分鐘以上，完成對(duì)免疫細(xì)胞的刺激活化過(guò)程。
12.權(quán)利要求1中的受檢樣品解釋為接受相應(yīng)器官移植供者的受者或任一移植受者和腫瘤特異性抗原制備來(lái)源腫瘤患者或任一腫瘤患者的外周全血、骨髓、各種生物體液如關(guān)節(jié)液、胸腔液、腹腔液、髓脊液等；但其至少包含一種與免疫功能有關(guān)的活性細(xì)胞成分。
13.權(quán)利要求1中的免疫細(xì)胞解釋為直接或間接參入免疫學(xué)生物反應(yīng)的任何細(xì)胞個(gè)體或群體；如各類淋巴細(xì)胞及其亞群(T、B淋巴細(xì)胞；輔助性T淋巴細(xì)胞(TH0；TH1；TH2)、記憶性T、B淋巴細(xì)胞、抑制性T淋巴細(xì)胞等)；NK細(xì)胞；各種抗原提呈細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞；間質(zhì)細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、纖維細(xì)胞)、血小板、紅細(xì)胞、各種骨髓細(xì)胞、各種干細(xì)胞；各種免疫細(xì)胞前體細(xì)胞等。
14.權(quán)利要求1中的細(xì)胞分離分類方法解釋為可將混合細(xì)胞群體中某特定細(xì)胞群體(如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、CD4陽(yáng)性細(xì)胞，CD8陽(yáng)性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、血小板等)加以純化、分類的任何物理、生化、免疫學(xué)、生物學(xué)等方法。
15.權(quán)利要求1中的細(xì)胞分離分類方法進(jìn)一步解釋為離心、密度梯度離心、自然沉降、非特異性吸附、固相吸附、免疫磁珠吸附、聚苯乙烯微珠免疫吸附、聚苯乙烯微孔板吸附，以及使用單或多標(biāo)記技術(shù)(如單或多色熒光標(biāo)記)在相應(yīng)儀器(如流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡等)上可對(duì)各種免疫細(xì)胞進(jìn)行分類鑒別的任何方法。
16.權(quán)利要求1中的活化指標(biāo)解釋為免疫細(xì)胞經(jīng)過(guò)刺激激活、活化后產(chǎn)生的任何直接、間接的生物學(xué)改變和生物學(xué)產(chǎn)物，并可被體外直接或間接測(cè)量手段所檢測(cè)的各種信號(hào)。
17.權(quán)利要求1中的活化指標(biāo)進(jìn)一步解釋為細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞數(shù)目變化、細(xì)胞酶學(xué)變化、細(xì)胞內(nèi)離子濃度變化、細(xì)胞內(nèi)外受體變化、細(xì)胞膜通透性變化、細(xì)胞吞噬功能變化、細(xì)胞活化標(biāo)志蛋白表達(dá)(如CD分子CD69，CD25，CD71，CD95，MHC-I分子，MHC-II分子等)；細(xì)胞內(nèi)能量變化(如ATP、AMP濃度變化等)、細(xì)胞分泌各種生物因子變化(IL-2，IL-12，TNF；INFr；IL-4等)、細(xì)胞核變化(細(xì)胞核數(shù)目、DNA含量變化等)；細(xì)胞功能變化(殺傷功能、吞噬功能、粘附功能等)、細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度變化等。
18.權(quán)利要求1中的檢測(cè)方法解釋為能夠?qū)?quán)利要求17中活化指標(biāo)進(jìn)行相應(yīng)測(cè)量的任何檢測(cè)方法，其主要包括但不限于下列方法ELISA，細(xì)胞ELISA(Cellular ELISA)；ELISPOT；發(fā)光檢測(cè)方法(生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、時(shí)間延遲發(fā)光等)；熒光檢測(cè)方法(熒光測(cè)定儀、熒光顯微鏡計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法等)；同位素檢測(cè)(如51Cr釋放、3H-TdR摻入等)、細(xì)胞涂片染色檢測(cè)、細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞色素(MTT)檢測(cè)等。
19.權(quán)利要求1中的特異性抗原可來(lái)源權(quán)利要求2、3中所述的細(xì)胞及細(xì)胞提取物；也可來(lái)源于其他一個(gè)或一個(gè)以上生物個(gè)體的細(xì)胞；但至少必需含有一種能夠活化受檢樣品中特異性免疫細(xì)胞的成分，并可用于評(píng)價(jià)受檢個(gè)體的特異性免疫反應(yīng)細(xì)胞的功能狀態(tài)(如受者對(duì)供者組織器官、細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)細(xì)胞功能；腫瘤患者抗腫瘤特異性免疫反應(yīng)細(xì)胞功能)。
20.權(quán)利要求1中的特異性抗原必須至少包括一種或一種以上與相應(yīng)移植物共有的抗原成分或至少一種與腫瘤患者自身腫瘤細(xì)胞的共有抗原成分；并能特異性地刺激、活化移植物受者或腫瘤患者的抗移植物特異性免疫或腫瘤特異性免疫細(xì)胞。
21.本發(fā)明特別強(qiáng)調(diào)在特異性細(xì)胞免疫功能測(cè)定分析中設(shè)置自身抗原的對(duì)照刺激物，其具體方法為以與制備相應(yīng)個(gè)體化、特異性抗原相同的方法制備受檢個(gè)體的細(xì)胞或細(xì)胞提取作為自身陰性對(duì)照，在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下，分別對(duì)同一樣品中免疫細(xì)胞進(jìn)行溫育、刺激、活化直至獲得最終結(jié)果。并結(jié)合特異性抗原刺激管(孔)和自身抗原對(duì)照管(孔)；無(wú)抗原刺激管(孔)的結(jié)果進(jìn)行綜合分析和評(píng)價(jià)。
22.權(quán)利要求1中的個(gè)性化、特異性抗原和MHC(HLA)分子庫(kù)；腫瘤抗原庫(kù)和自身對(duì)照抗原可一次性制備、儲(chǔ)存用于不同時(shí)間采集的同一生物個(gè)體樣品的多次檢測(cè)；也可在不同時(shí)間多次適時(shí)制備而成。
全文摘要
根據(jù)細(xì)胞免疫學(xué)中T淋巴細(xì)特異性識(shí)別、激活、效應(yīng)機(jī)制原理，結(jié)合器官移植免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)的特點(diǎn)，本發(fā)明建立了一種具有個(gè)體化特異性免疫細(xì)胞功能檢測(cè)方法。該方法以器官移植供者的特異性抗原成分(全細(xì)胞Ag，細(xì)胞提取物Ag，純化的細(xì)胞Ag，HLA分子)；或MHC(HLA)分子庫(kù)；或腫瘤患者自身的腫瘤細(xì)胞Ag成分或含自身腫瘤抗原的腫瘤抗原庫(kù)作為個(gè)體化特異性刺激物與相應(yīng)的器官受者或腫瘤患者的免疫細(xì)胞溫育培養(yǎng)；繼而通過(guò)對(duì)器官受者或腫瘤患者免疫細(xì)胞及其亞群進(jìn)行分離或分類并同時(shí)對(duì)相應(yīng)免疫細(xì)胞的活化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量，借以評(píng)估器官移植供者特異性抗原反應(yīng)性免疫細(xì)胞、腫瘤患者特異性抗原反應(yīng)性免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)。上述測(cè)定方法學(xué)具有顯著的個(gè)體化、特異性特征；并同時(shí)具有廣譜通用性；可廣泛應(yīng)用于器官移植中特異性免疫排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)以及腫瘤患者特異性抗腫瘤免疫功能的評(píng)價(jià)；作為免疫治療性用藥方案的重要參考指標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N33/566GK1444043SQ0215854
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2002年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月25日
發(fā)明者陳格, 劉向軍 申請(qǐng)人:帕弗瑞生物技術(shù)(北京)有限公司