專利名稱：納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片涉及的是一種肝炎基因芯片，特別是一種檢測肝炎突變的基因芯片。
生物芯片在生物檢測、醫(yī)學(xué)檢驗、藥物篩選和基因序列分析上有著極其重要的意義。例如在生物學(xué)中，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，特別是舉世矚目的人類基因組計劃實施以酸、蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)呈指數(shù)增長。而下世紀(jì)最富挑戰(zhàn)性的工作就是人劃完成后，即在后基因時代，我們?nèi)绾芜\(yùn)用大量的生物分子信息服務(wù)于人類社會，并使醫(yī)學(xué)、治療產(chǎn)生根本革命。在醫(yī)學(xué)中，“系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞層次上的第二階段醫(yī)學(xué)”正在向“基因水平上的，DNA-RNA一蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)與核酸相互作用，以及它們與環(huán)境相互作用水平上的第三階段醫(yī)學(xué)”轉(zhuǎn)化。這種在分子層次上進(jìn)行的基因診斷與基因臺療，將根本地認(rèn)識疾病產(chǎn)生的根源，并將有希望根本認(rèn)識和治療包括癌癥在內(nèi)的重大疾病。這些生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的根本變革，一個根本的前提是基因序列的測定和分析。能否有效快速地進(jìn)行基因測序與分析，將影響到人類基因組計劃的實施，從而影響生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。傳統(tǒng)基因測序所采用的方法包括化學(xué)反應(yīng)、凝膠電泳法、圖像處理等一系列繁雜的步驟，這些方法花費(fèi)時間較長，且操作繁復(fù)，尤其在大規(guī)模測序方面費(fèi)時，并且不適宜便攜化快速測序。在對傳統(tǒng)基因測序方法進(jìn)行改進(jìn)的過程中，以基因芯片為代表的生物芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。生物芯片技術(shù)是將生命科學(xué)研究中所涉及的許多不連續(xù)的分析過程，如樣品制備，化學(xué)反應(yīng)和分析檢測等通過采用微電子，微機(jī)械等工藝集成到芯片中，使之連續(xù)化，集成化，微型化和自動化。這一技術(shù)的成熟和應(yīng)用將在下世紀(jì)的疾病診斷和治療、新藥開發(fā)、司法鑒定、食品和環(huán)境監(jiān)測等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域帶來一場革命，為生物信息的獲取及分析提供雖有力的手段。
生物芯片(基因芯片)近年來一直是國際上的一個研究熱點，并正以驚人的速度向前發(fā)展。國際上已經(jīng)有多家公司進(jìn)入生物芯片領(lǐng)域，研究出把PCR與DNA陣列集成的生物芯片。這些系統(tǒng)通常在芯片上制備出一個PCR微反應(yīng)池，通過控制微反應(yīng)的溫度循環(huán)，進(jìn)行基因擴(kuò)增，接著將擴(kuò)增后的基因引入雜交池中，與固相微陣列探針雜交，進(jìn)行檢測。Affymetrix公司則把PCR微反應(yīng)池進(jìn)一步制成微流體通道。盡管已有將PCR技術(shù)芯片檢測合為一體的報導(dǎo)，但其特點是整個PCR過程在一個微反應(yīng)池中進(jìn)行。因而需對器件的同一部位反復(fù)地升溫、降溫，這將無法對PCR結(jié)合進(jìn)行動態(tài)跟蹤和定量分析。而且目前升溫、降溫需一定時間，延長了工作時間。
基因芯片(DNA Chip)是生物技術(shù)與微電子芯片融合的結(jié)晶，是由固定于固相載體(如硅片、玻璃、塑料等)表面的核苷酸陣列構(gòu)成的一種新型微型器件。它集成了基因探針，通過與被檢測基因的堿基序列進(jìn)行互補(bǔ)匹配，實現(xiàn)核酸序列的分子識別。由于其快速、微量、準(zhǔn)確的應(yīng)用優(yōu)點，正在成為新一代的自動化醫(yī)學(xué)檢驗工具。肝炎病毒的高突變率導(dǎo)致藥物療效不高，并且使病情加重。通過設(shè)計針對突變基因的探針，與被檢測基因的堿基序列進(jìn)行互補(bǔ)匹配，可快速、微量、準(zhǔn)確地檢測到突變基因，指導(dǎo)臨床診斷和治療。美國affymetrix公司于二十世紀(jì)八十年代末至90年代初，率先開展了這方面的研究。1992年，該公司運(yùn)用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，誕生了世界上第一塊基因芯片。同時，探針的熒光標(biāo)記，激光共聚焦掃描和計算機(jī)分析等技術(shù)也隨之發(fā)展。1995年，第一塊以玻璃為載體的基因芯片(微矩陣)在美國Stanford大學(xué)誕生，這標(biāo)志著基因芯片技術(shù)步入了廣泛研究和應(yīng)用的時期。東南大學(xué)吳健雄實驗室成功地開發(fā)了分子印章原位合成高密度基因芯片技術(shù)，標(biāo)志著國內(nèi)高密度基因芯片研究和應(yīng)用的開端。
病毒性肝炎是我國感染率和發(fā)病率最高的傳染病。據(jù)估計，乙型肝炎病毒攜帶者有1.2億，其中有癥狀者約占1/10，約1/4患者轉(zhuǎn)為慢性，3％患者轉(zhuǎn)變?yōu)楦窝缀蟾斡不?。原發(fā)性肝癌中90％以上由病毒性肝炎所引起。本病至今尚缺乏特效治療方法，因此早期診斷和病情監(jiān)測就尤為重要。
傳統(tǒng)檢測乙型肝炎通過兩對半檢測，檢測五項指標(biāo)后判定是否有乙型肝炎感染，檢測肝功能五項指標(biāo)判定肝損傷程度。乙型肝炎治療相關(guān)基因位點突變無法檢測，從而影響了具體用藥；在另一方面，對于乙型肝炎流行病調(diào)查及其流行病學(xué)研究缺乏足夠的證據(jù)，如果采用測序方法對多位點突變進(jìn)行乙型肝炎流行病調(diào)查，不僅費(fèi)用高，而且在國內(nèi)無法進(jìn)行推廣。
現(xiàn)知歐美國家多數(shù)HCV-I型感染，而亞洲國家以II型為主，III型次之。Okomoto報告日本慢性丙型肝炎患者和健康獻(xiàn)血員主要為II型感染，分別占59.3％和82.4％，而血友病人約50％為I型感染，原因是應(yīng)用輸入美國進(jìn)口凝因子VIII。Wang氏報告我國北京慢性丙型肝炎患者86.2％為II型感染，III型感染為13.8％。而新疆病人III型感染卻占50％，說明不同型HCV具有一定的地區(qū)和人群分布特征。此外不同基因型感染引起臨床過程和干擾素治療反應(yīng)亦表現(xiàn)不同，如III型感染臨床癥狀較重，有引起嚴(yán)懲肝病傾向II型(Simmonds 1b)感染對干擾素治療不敏感效果差。III型感染(Simononds 2a)用干擾素治療效果好。
在鑒定肝損傷后又檢測不到乙型肝炎后，醫(yī)學(xué)診斷要求對其它肝炎病毒進(jìn)行檢測。對于多種肝炎病毒檢測方法是不同的，一般使用的是酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測病毒特異性蛋白的抗體，依賴病毒基因翻譯的病毒特異性蛋白滯后于病毒的體內(nèi)感染與復(fù)制，不能反映真實的病毒生存狀態(tài)，另一方面，在病毒停止復(fù)制或體內(nèi)的清除過程中，這些病毒特異性蛋白往往還要生存一段時間，這種診斷結(jié)果的滯后性給臨床治療帶來不利影響。由此給診斷提出了新的課題，我們針對酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測及PCR檢測的缺點及不足提出了使用基因芯片檢測多種肝炎病毒及其突變，使之能夠直接檢測到肝炎病毒的種類和突變類型，以指導(dǎo)臨床治療。
PCR技術(shù)主要是作為一種選擇性體外基因擴(kuò)增方法，由于在經(jīng)25～35輪循環(huán)后就可使DNA擴(kuò)增106倍，多年來在科研和醫(yī)學(xué)檢驗中得到廣泛的應(yīng)用。但由于PCR存在假陽性等缺陷，自98年6月起已被國家衛(wèi)生部禁止用于臨床診斷。其主要原因有其一是，PCR過程中諸多實驗條件(引物的設(shè)計與選擇，材料配比，反應(yīng)時間，溫度，循環(huán)周期)等造成的不穩(wěn)定因素導(dǎo)致產(chǎn)生PCR的錯誤擴(kuò)增；其二是，PCR過程的后續(xù)電泳檢測方法可判斷是不是得到特定長度的片段，而無法確定其具體序列；其三，PCR反應(yīng)產(chǎn)物形成氣溶膠中所含有的DNA在擴(kuò)增后極易在電泳凝膠形成假陽性條帶，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果的不可靠性。
感染性病原體診斷芯片就是將待測病原體的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，將從病人血清中抽提出病原體的DNA或RNA經(jīng)擴(kuò)增標(biāo)記螢光后與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號由掃描儀掃描，再經(jīng)計算機(jī)分析，判斷陰陽性。診斷芯片區(qū)別于其他檢測手段的優(yōu)越性在于(1)檢測樣品為各類致病基因片段，提高了檢測效率；(2)因無需機(jī)體免疫反應(yīng)，能及早診斷，且待測樣品用量較少；(3)診斷芯片技術(shù)是DNA雜交技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的分子診斷方法，有極高的靈敏度、特異性和可靠性；(4)自動化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
在疾病診斷方面，已有一些單一疾病基因診斷芯片產(chǎn)品上市，例如美國的Affymetrix公司已利用基因芯片進(jìn)行愛滋病(HIV)的研究工作，并有商業(yè)化的GeneChipHIVPRT診斷芯片上市，用于愛滋病的早期診斷。但芯片技術(shù)在疾病診斷上的應(yīng)用尚處于起步階段，還未大面積推廣，在血站的血液檢測，肝炎病毒是血液檢測的常規(guī)項目，但現(xiàn)有的檢測手段無法在同一時間內(nèi)通過一次實驗確診上述四種疾病，檢測成本高而效率比較低。為此，開發(fā)研究一種用于多種感染性疾病診斷的基因芯片，對多種感染性疾病的進(jìn)行準(zhǔn)確、高效的早期診斷已成為當(dāng)務(wù)之急。
納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片包括固相基片、手臂分子、寡核酸探針。固相基片，如玻片、硅片等；固相基片表面修飾了手臂分子，如N，N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、APTES，戊二醛，手臂分子是以共價鍵結(jié)合到固相基片上；在點樣后，氨基修飾的寡核酸探針固定在修飾了手臂分子的固相基片上，圖中表示兩個點固定了不同的探針，寡核酸探針是以共價鍵結(jié)合到手臂分子上；寡核酸探針包括檢測寡核酸探針和質(zhì)量控制寡核酸探針。
本實用新型的基因芯片檢測是分為三個檢測層次a.檢測病毒有無；b.對病毒進(jìn)行分亞型；c.檢測有意義的突變(如抗藥性、免疫逃逸、癌變性等)。
對甲型肝炎HAV、乙型肝炎HBV、丙型肝炎HCV、丁型肝炎HDV、戊型肝炎HEV、庚型肝炎HGV、TTV分別尋找其共有序列，分別設(shè)計探針，合成后固定的玻片的制成肝炎基因芯片中檢測甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、TTV的探針。本實用新型的目的之二是檢測是否存在多種肝炎感染，由于基因突變檢測與乙型肝炎傳播途徑有密切相關(guān)性，本實用新型的可是用于此類相關(guān)各種基因突變亞種、亞型的檢測與鑒定。
一般來說，每個病毒靶基因選擇有2-4個核酸保守區(qū)序列，每個突變區(qū)、基因型及亞型決定區(qū)根據(jù)診斷和鑒定需要選擇適當(dāng)數(shù)量的探針，其中每個突變區(qū)至少要有兩個探針，即一個是野生型，一個是突變型；這樣在同一檢測芯片上有多種檢測寡核酸探針和質(zhì)量控制寡核酸探針，而合成的寡核酸探針通過手臂分以共價鍵連接在化學(xué)修飾了的固相基片上形成探針陣列。能與目的基因雜交的多聚核苷酸，長度在幾個堿基到幾十個堿基；所謂的檢測核酸探針是指化學(xué)合成的多種肝炎的保守區(qū)、與疾病相關(guān)的突變區(qū)、基因型及亞型的互補(bǔ)的寡聚核苷酸，突變區(qū)的探針包括野生型和突變型探針，基因型及亞型決定區(qū)的探針包括多種基因型和多種亞型探針；而在制作芯片時使用的手臂分子是指具有雙活性基團(tuán)的長鏈有機(jī)化合物；質(zhì)量控制探針至少包括二種探針，即陽性對照，陰性對照。陰性對照用于檢測雜交信號錯誤或污染，陽性對照用于檢測是否正常雜交；使用的固相基片包括多種方法處理的玻片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜等。
按照此法設(shè)計制作的基因芯片，可用于一種或幾種感染性病毒的診斷、檢測、流行病調(diào)查，可用于快速檢測病毒性肝炎的發(fā)病原因，查明感染病毒及與疾病相關(guān)的基因突變，以便臨床醫(yī)生能夠及時得到治療、監(jiān)測病情的目的。在另一方面，由于此類芯片可用檢測基因突變，因此，對臨床治療有直接的指導(dǎo)作用。
質(zhì)量控制核酸探針分陽性對照，陰性對照。陰性對照用于檢測雜交信號錯誤或樣品是否污染，陽性對照用于檢測雜交是否正常和檢測信號是否正常；配備有多組針對芯片所需診斷、檢測、流行病調(diào)查的感染性疾病病毒靶基因的高特異性的擴(kuò)增引物，其設(shè)計原則為每一個引物必須在人肝炎病毒靶基因的高特異性部位，而每對引物擴(kuò)增產(chǎn)物常常包含一個或多個突變部位；每一特異性引物必定能夠擴(kuò)增GENEBANK中所有同種病毒的基因片斷。
固相基片以雙活性基團(tuán)的長鏈有機(jī)化合物進(jìn)行表面修飾，常用的雙活性基團(tuán)的長鏈有機(jī)化合物試劑有N，N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、三羥甲基氨基硅烷(APTES)、戊二醛、多聚賴氨酸，可采用它們中的一種或者它們的二種組合。本實用新型的優(yōu)點(1)檢測樣品為各類致病基因片段，提高了檢測效率；(2)因無需機(jī)體免疫反應(yīng)，能及早診斷，且待測樣品用量較少；(3)診斷芯片技術(shù)是DNA雜交技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的分子診斷方法，有極高的靈敏度、特異性和可靠性；(4)自動化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
(5)肝炎是多種原因發(fā)病，僅致病病毒就有八種之多，要確定患者的致病原因，常規(guī)方法要使用多種檢測手段，而基因芯片方法不僅簡單方便，而且所需儀器設(shè)備數(shù)量少。
(6)一種檢測多種肝炎的檢測型基因芯片，可用于一種或幾種感染性病毒的診斷、檢測、流行病調(diào)查，可用于快速檢測病毒性肝炎的發(fā)病原因，查明感染病毒及與疾病相關(guān)的基因突變，以便臨床醫(yī)生能夠及時得到治療、監(jiān)測病情的目的。在另一方面，由于此類芯片可用檢測基因突變，因此，對臨床治療有直接的指導(dǎo)作用。
(7)通過標(biāo)記了生物素或地高辛的核酸與芯片進(jìn)行雜交，納米金標(biāo)記的親和素或地高辛抗體與芯片作用后，使用銀染方法顯色后讀取信號，此信號可用基因芯片掃描儀進(jìn)行掃描、直接觀察或用普通掃描儀進(jìn)行掃描。


圖1是納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片示意圖。
圖2是納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片結(jié)構(gòu)使用狀態(tài)示意圖。
參照附圖3納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片使用后，用生物素標(biāo)記引物的基因擴(kuò)增產(chǎn)物4與納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片雜交后，用納米金標(biāo)記的親合素5與芯片反應(yīng)，用銀染方法，銀顆粒與納米金結(jié)合形成可見的銀沉積層一銀粒子層6。圖3其中一點有雜交體存在，另一點沒有形成雜交。
權(quán)利要求1.用于納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片，其特征在于芯片納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片包括固相基片、手臂分子、寡核酸探針；固相基片表面修飾了手臂分子，手臂分子是以共價鍵結(jié)合到固相基片上；氨基修飾的寡核酸探針固定在修飾了手臂分子的固相基片上，以共價鍵結(jié)合到手臂分子上；通過標(biāo)記了生物素或地高辛的核酸與芯片進(jìn)行雜交，納米金標(biāo)記的親和素或地高辛抗體與芯片作用后，用銀染方法，銀顆粒與納米金結(jié)合形成可見的銀沉積層—銀粒子層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片，其特征在于每種病毒甲型肝炎HAV、乙型肝炎HBV、丙型肝炎HCV、丁型肝炎HDV、戊型肝炎HEV、庚型肝炎HGV、TTV的靶基因選擇有2-4個核酸保守區(qū)序列作為檢測病毒有無的寡核酸探針，而對每個突變區(qū)、基因型及亞型決定區(qū)根據(jù)診斷和鑒定需要選擇適當(dāng)數(shù)量的寡核酸探針，其中每個突變區(qū)至少要有兩個探針，即一個是野生型，一個是突變型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片，其特征在于固相基片包括多種方法處理的玻片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片，其特征在于質(zhì)量控制核酸探針分陽性對照，陰性對照，陰性對照用于檢測雜交信號錯誤或樣品是否污染，陽性對照用于檢測雜交是否正常和檢測信號是否正常。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片，其特征在于固相基片以雙活性基團(tuán)的長鏈有機(jī)化合物進(jìn)行表面修飾，常用的雙活性基團(tuán)的長鏈有機(jī)化合物試劑有N，N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、三羥甲基氨基硅烷(APTES)、戊二醛、多聚賴氨酸，可采用它們中的一種或者它們的二種組合。
專利摘要本實用新型納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片涉及的是一種肝炎基因芯片，特別是一種檢測肝炎突變的基因芯片。用于納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片，其特征在于芯片納米金標(biāo)記銀染肝炎檢測型基因芯片包括固相基片、手臂分子、寡核酸探針；固相基片表面修飾了手臂分子，手臂分子是以共價鍵結(jié)合到固相基片上；氨基修飾的寡核酸探針固定在修飾了手臂分子的固相基片上，以共價鍵結(jié)合到手臂分子上；通過標(biāo)記了生物素或地高辛的核酸與芯片進(jìn)行雜交，納米金標(biāo)記的親和素或地高辛抗體與芯片作用后，用銀染方法，銀顆粒與納米金結(jié)合形成可見的銀沉積層－銀粒子層，用于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、TTV同時進(jìn)行檢測。
文檔編號G01N33/576GK2560946SQ0222116
公開日2003年7月16日 申請日期2002年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月11日
發(fā)明者劉全俊, 趙偉, 陸祖宏, 劉偉 申請人:劉全俊, 趙偉, 陸祖宏